rapid identification of the principal yeasts of …techmicrobio.eu/documentation_fabricants/biorad...

FONGISCREEN® 4H 5650410 TESTS

RAPID IDENTIFICATION OF THE PRINCIPAL YEASTSOF MEDICAL IMPORTANCE

IVD

1- CLINICAL VALUEIn view of the incresing incidence of fungal infections over recent years,essentially due to the frequent use of topical antibacterial agents, broadspectrum antibiotics and invasive techniques (catheters, parenteralnutrition), microbiology laboratories are increasingly frequently asked tolook for yeasts in pathological specimens.A rapid and precise diagnosis is sometimes necessary in order to commenceappropriate treatment, especially in immunodepressed subjects.Fongiscreen® 4H, a system based on the study of the enzymatic profile,satisfies this demand as it is able to identify, within 4 hours: Candidaalbicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, yeasts which representabout 90% of the isolates and Cryptococcus neoformans. It also guidesthe diagnosis of other yeasts whose identification is completed bystudying sugar utilisation with the AUXACOLOR® 2 kit (code 56513).

2- PRINCIPLE OF THE TESTThe test is based on the use of dehydrated substrates by prerformedfungal enzymes, resulting in a colour change either spontaneously or afteraddition of a revelator reagent.NATURE OF THE TESTS USED

• TTZ mediumThis medium contains Triphenyltetrazolium (TTZ). The reduction of TTZresults in the formation of a more or less intense pink colour, dependingon the species.

• PAP mediumThis medium contains an enzymatic substrate allowing detection ofproline aminopeptidase activity.

• Urea + Trehalose medium (Ur./tre)This medium allows the detection of urease activity, reflected byalkalinisation of the medium with a colour change from green to blue ofthe pH indicator (Bromothymol Blue). The metabolism of trehalose resultsin acidification with colour change of the indicator from green to yellow.

• BGL mediumThis medium contains an enzymatic substrate : p. Nitrophenyl-N-Acetyl-B-D-Galactosaminide, allowing demonstration of galactosaminidase. This

2

test is more sensitive than the germtube test for the identification ofC. albicans (variable sensitivity according to different authors).

• AGL mediumIt allows the detection of a-glucosidase activity.

• HAP mediumIt allows the detection of L-Histidine aminopeptidase activity.The BGL and AGL tests are performed in an acidic medium. Reading ofthe result requires revelation using an alkaline reagent (BGL/AGLreagent).The HAP test is read after revelation with the HAP reagent.The test is read after incubation for 4 hours at 37°C without CO2.

3- COMPOSITION OF THE KITFONGISCREEN® 4H includes:• Microplate : 10 individually packaged 6-well microplates (diagram of

the microplate is indicated on the label).• Suspension medium : 10 ready for use suspension media (1 ml)• 1 vial of AGL/BGL reagent (3 ml)• 1 vial of HAP reagent (2ml)• 10 micropipettes• 10 adhesive filmsEach microplate is individually packaged under seal-foiled aluminum bagwith an adhesive film and a dessicant.

DIAGRAM OF THE MICROPLATE

3

BGL AGL HAP

TTZ PAP Ur./tre

FONGISCREEN® 4H

Patient : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Date : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Precautions of use / Health and safety instructions:This kit contains dangerous reagents.• 3 ml vial of AGL/BGL reagent containing 4% of NaOH 1N.

R 34 : Causes burns.S 26-37/39-45 : In case of contact with eyes, rinseimmediately with plenty of water and seek medical advice.Wear suitable gloves and eye/face protection. In case ofaccident or i f you feel unwell, seek medical adviceimmediately (show the label where possible).

• 2 ml vial of HAP reagent containing 66,5% of 95° ethanol .R 11 : Highly flammable.S 7-16 : Keep container tightly closed. Keep away from sources of

ignition - No smoking.

4- STORAGEReagents, stored at +2 - 8°C, are stable until the expiry date indicated onthe label (even once open).

5- MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED• Opacity control 6 Mac Farland: code 56499• Incubator at 37°C

6- PROCEDURE

A)INOCULATION OF THE MICROPLATE• Using a pure and fresh culture on Sabouraud,

Sabouraud Chloramphenicol, and/or Gentamicinmedium with a sufficient quantity of yeasts toobtain an opacity greater than that of the opacitycontrol (code 56499) : in practice, 4 to 5 loops ifpossible.

• Important : the opacity of the suspension must beat least equal to that of the opacity control

• which defines the minimum level of turbidity.• Homogenise the suspension using the micropipette

(or vortex if necessary), by aspirating andexpelling the contents of the vial several times.

4

. . .. . . .

. . . .. . .

TTZ PAP Ur./tre

BGL AGL HAP

100 µ

l or

3 d

rops

Suspension medium

C - Corrosive

• Collect the inoculum with the micropipette and distribute 3 drops(100 µl) into each of the wells of the microplate.

• Cover the microplate with adhesive and incubate for 4 hours at 37°C.

B) READING OF THE RESULTS• Remove the adhesive.• Read the TTZ, PAP, Urea/trehalose results.• Add 2 drops of BGL/AGL reagent into the BGL and AGL wells.

- read the BGL test immediately- for the AGL test, the colour develops over 15 to 30 seconds.

• Add 2 drops of HAP reagent to the HAP well. The colour develops over15 to 30 seconds.

TABLE OF RESULTS

* The colour change to blue (alkalinisation of the medium) is associatedwith metabolism of urea (Urea(+), Trehalose(+) or (-) strains); if a strain isboth Urea(+) and Trehalose(+), alkalinisation is predominant (change toblue). The colour change to yellow (acidification of the medium) isassociated with the metabolism of Trehalose (Trehalose(+), Urea(-) strains.

5

TESTS NEGATIVE POSITIVE PROCEDURE

TTZ COLOURLESS PALE PINK or DIRECT READING (without addition of reagents)DARK PINK

depending on the species

PAP COLOURLESS YELLOW

UR./TRE GREEN BLUE (alkalinisation) or YELLOW

(acidification)depending on the species

BGL COLOURLESS YELLOW Add 2 drops of BGL/AGL reagent. The colour appears immediately (i.e. read immediately)

AGL COLOURLESS YELLOW Add 2 drops of BGL/AGL reagent.The colour develops over 15 to 30 seconds.

HAP COLOURLESS YELLOW Add 2 drops of HAP reagent.The colour develops over 15 to 30 seconds.

7- INTERPRETATION OF THE RESULTS• Compare the profile obtained with the specific profiles (cf. Table A);

the discriminant features are indicated in bold letters.• If the profile is different, consider the PAP and urea tests and refer to

the corresponding paragraphs.

a) Legends+ : positive test- : negative test+/- : variable test+(-) : positive test in at least 90% of cases-(+) : negative test in at least 90% of cases

b) Specific profiles

TABLE A

(1) Only a frankly positive test (yellow) immediately identifies Candidatropicalis.

In the case of a doubtful result (greenish colour) or negative result, theidentity of the strain must be confirmed (differential diagnosis with certainstrains of AGL + Saccharomyces cerevisiae).(2) A pale yellow discolouration may sometimes be observed.

6

TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP

+/- + Green or Yellow + + +/- Candida albicans

+ - Yellow (1) -(+)(2) + +(-) Candida tropicalis

+/- - Yellow - - + Candida glabrata

+/- - Blue - +(-) - Cryptococcus neoformans

c) Other profiles

1- PAP+ and Urea- species

yellow green or yellow

2- PAP- and Urea- species

colourless green

7

TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Species

+/- + Green or Yellow - +/- +/- Candida parapsilosisCandida lusitaniaeCandida guilliermondiiCandida famata

+/- + Green or Yellow - - +/- Candida zeylanoidesCandida inconspicua

TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Additional Speciesobservations

+/- - Green - - +(-) / Candida pseudotropicalisCandida inconspicuaCandida rugosa

+/- - Green - - +(-) Dry appearance Candida kruseiof colonies

+/- - Green - - +(-) Arthrospores Geotrichum species

+/- - Green - +/- +(-) / Saccharomyces

cerevisae

3- Urea+ and HAP+ species

blue yellow

A positive test generally corresponds to a yellow colour on the BGL andAGL tests; an orange or pink colour may be observed with Trichosporoncutaneum, and is specific to this species.In addition, colonies of T. cutaneum have a filamentous appearance.

8- PERFORMANCESAccording to studies from Pasteur Institut in Paris and Broussais hospital inParis, FONGISCREEN® 4H allows identification in four hours ofC. albicans, C. glabrata, C. tropicalis and C. neoformans and orientationof the diagnosis for other yeasts.A retrospective clinical study has been established on a panel of 146strains, representing 23 species of yeasts. FONGISCREEN® 4H permits todetect 100% of C. albicans strains (18 tested strains), C. glabrata (24strains), and C. neoformans (11 strains) and 94% of C. tropicalis strains(18 tested strains). For these 4 strains, specificity of the test was 100%.Other yeast species can be classified in 3 groups, according to adistinctive, but not specific, profil of the species (for 99% of the strains).

8

TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Additional Speciesobservations

capsula pigment arthros-ation -pores

Crypto- -coccus

+ - - species

Rhodo+/- +/- Blue +/- +/- + -torula

- + - species

Tricho-sporon

- - + cutaneum

{

9- LIMITS OF THE PROCEDURE• BGL test sometimes takes a very pale yellow color difficult to interpret,

in particular for C. tropicalis strain.• Some rare strains of C. tropicalis Trehalose (-) can be wrongfully

identified as S. cerevisiae.

10-QUALITY CONTROL OF THE MANUFACTURERAll manufactured reagents are prepared according to our Quality System,starting from reception of raw material to the final commercialization ofthe product. Each lot is submitted to quality control assessments and isonly released to the market, after conforming to pre-defined acceptancecriteria. The records relating to production and control of each single lotare kept within Bio-Rad.

11-REFERENCESSee French version.

9


IDENTIFICATION RAPIDE DES PRINCIPALES LEVURESD’INTÉRÊT MÉDICAL

IVD

1- INTÉRÊT CLINIQUEEtant donné la recrudescence des infections fongiques ces dernières années,dues notamment à l'utilisation fréquente de topiques antibactériens,d'antibiotiques à large spectre et de techniques invasives (cathéters, nutritionparentérale), la recherche des levures dans les produits pathologiques estde plus en plus demandée au laboratoire.Un diagnostic rapide et précis est parfois nécessaire en vue d'instaurer untraitement adapté, surtout chez les sujets immunodéprimés.Fongiscreen® 4H, système fondé sur l'étude d'un profil enzymatique, répond àcette demande puisqu'il permet d'identifier en 4 heures : Candida albicans,Candida glabrata, Candida tropicalis, levures qui représentent environ90 % des isolements, et Cryptococcus neoformans. Il permet aussi uneorientation pour le diagnostic d'autres levures dont l'identification seraalors complétée par l'étude de l'assimilation des sucres avec la galerieAUXACOLOR® 2 (code 56513).

2- PRINCIPEIl repose sur l'utilisation de substrats deshydratés par les enzymes fongiquespréformées, ce qui se traduit par un changement de couleur, soitspontanément, soit après addition d'un réactif révélateur.

NATURE DES TESTS UTILISÉS

• Milieu TTZCe milieu contient du Triphényltétrazolium (TTZ).La réduction du TTZ se traduit par l'apparition d'une coloration rose plusou moins intense en fonction de l'espèce.

• Milieu PAPIl contient un substrat enzymatique permettant de détecter l'activité prolineaminopeptidase.

• Milieu Urée + Tréhalose (Ur. / tre)Ce milieu permet de détecter l'activité uréasique qui se traduit par unealcalinisation du milieu avec virage du vert au bleu de l'indicateur de pH(Bleu de Bromothymol). Le métabolisme du tréhalose entraîne lui, uneacidification avec virage de l'indicateur du vert au jaune.

12

13

• Milieu BGLIl contient un substrat enzymatique : le P.Nitrophényl-N-Acétyl-B-D-Galactosaminide permettant la mise en évidence de la galactosaminidase.La sensibilité de ce test est supérieure à celle du test de germination pourl'identification de C. albicans (sensibilité variable selon les auteurs).

• Milieu AGLIl permet de détecter l'activité α - glucosidase.

• Milieu HAPIl permet de détecter l'activité L-Histidine amino peptidase. Les tests BGL et AGL sont réalisés en milieu acide. La lecture du résultatnécessite une révélation à l'aide d'un réactif alcalin (réactif BGL/AGL). Letest HAP est lu après révélation à l'aide du réactif HAP. La lecture est réalisée après incubation pendant 4 heures à 37°C sans CO2.

3- COMPOSITION DU COFFRETFONGISCREEN® 4H comprend :• Microplate : 10 microplaques de 6 cupules sous emballage individuel

(le schéma des 16 cupules est reproduit sur une étiquette).• Suspension medium :10 milieux de suspension de 1 ml• 1 flacon réactif AGL/BGL de 3 ml• 1 flacon réactif HAP de 2 ml• 10 micropipettes• 10 adhésifsChaque microplaque est conditionnée sous sachet individuel enaluminium avec un adhésif et un sachet déshydratant.

Schéma de la microplaque

BGL AGL HAP

TTZ PAP Ur./tre

FONGISCREEN® 4H

Patient : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Date : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Précautions d’utilisation / Consignes d’hygiène et de sécurité :Ce kit contient des réactifs classés dangereux.• Un flacon de 3 ml de réactif AGL/BGL contenant 4% de NaOH 1N.

R 34 : provoque des brûlures.S 26-37/39-45 : En cas de contact avec les yeux, laverimmédiatement et abondamment avec de l'eau et consulter unspécialiste. Porter des gants appropriés et Porter un appareilde protection des yeux/du visage. En cas d'accident ou demalaise consulter immédiatement un médecin (si possible luimontrer l'étiquette).

• Un flacon de 2 ml de réactif HAP contenant 66,5% d’éthanol à 95°.R 11 : Facilement inflammable.S 7-16 : Conserver le récipient bien fermé. Conserver à l'écart de touteflamme ou source d'étincelles - Ne pas fumer.

4- CONSERVATIONLes réactifs, conservés à +2-8°C, sont stables jusqu'à la date de péremptionindiquée sur le coffret (y compris après ouverture).

5- MATÉRIEL NÉCESSAIRE NON FOURNI• Opacity control 6 Mac Farland : code 56499 • Etuve à 37°C.

6- MODE OPÉRATOIREA) INOCULATION DE LA MICROPLAQUE• A partir d'une culture pure et fraîche sur milieu

Sabouraud, ou Sabouraud Chloramphénicol, et/ouGentamicine, ensemencer le milieu de suspensionavec une quantité de levures suffisante pour obtenirune opacité supérieure au témoin d'opacité(Opacity control 6 Mac Farland, code 56499) enpratique 4 à 5 öses si possible.

• Important : L'opacité de la suspension doit être aumoins égale à celle du témoin d'opacité qui définitle seuil de turbidité minimum.

• Homogénéiser la suspension à l'aide de la micro-pipette (ou vortexer si nécessaire) en aspirant et enrefoulant à plusieurs reprises le contenu du flacon.

14

. . .. . . .

. . . .. . .

TTZ PAP Ur./tre

BGL AGL HAP

100 µ

l ou

3 g

out

tes

Milieu de suspension

C - Corrosif

• Prélever l'inoculum avec la micropipette et distribuer 3 gouttes (100 µl)dans chacune des cupules de la microplaque.

• Recouvrir la microplaque avec l'adhésif et incuber 4 heures à 37°C.

B) LECTURE DES RÉSULTATS• Décoller l'adhésif• Lire les tests TTZ, PAP, Urée/tréhalose• Ajouter 2 gouttes de réactifs BGL/AGL dans les cupules BGL et AGL.

- lire le test BGL immédiatement- pour le test AGL, la coloration se développe en 15 à 30 secondes.

• Ajouter 2 gouttes du réactif HAP dans la cupule HAP; la coloration sedéveloppe en 15 à 30 secondes.

TABLEAU DES RÉSULTATS

* Le virage au bleu (alcalinisation du milieu) est associé au métabolismede l’urée (souches urée(+), Tréhalose(+) ou (-)); si une souche est à la foisurée(+) et Tréhalose(+), l’alcalinisation se manifeste prioritairement(virage au bleu). Le virage au jaune (acidification du milieu) est associéau métabolisme du Tréhalose (souche Tréhalose(+), urée(-)).

15

TESTS NÉGATIFS POSITIFS PROCÉDURE

TTZ INCOLORE rose pale ou LECTURE DIRECTE (sans addition de réactifs)rose franc

selon l’espèce

PAP INCOLORE JAUNE

UR./TRE VERT BLEU (alcalinisation)ou JAUNE

(acidification) selon espèce

BGL INCOLORE JAUNE Ajouter 2 gouttes du réactif BGL/AGL La coloration apparaît immediatement(ne pas différer la lecture)

AGL INCOLORE JAUNE Ajouter 2 gouttes du réactif BGL/AGL La coloration se developppe en 15 à 30 secondes.

HAP INCOLORE JAUNE Ajouter 2 gouttes du réactif HAPLa coloration se developpe en 15 à 30 secondes.

16

7- INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS• Comparer le profil obtenu avec les profils spécifiques (cf. tableau A),

les caractères discriminants apparaissant en caractères gras.• Si le profil est différent, considérer les tests PAP et urée et se référer

aux paragraphes correspondants.

a) Légendes+ : test positif- : test négatif+/- : test variable+(-) : test positif dans au moins 90 % des cas-(+) : test négatif dans au moins 90 % des cas

b) Profils spécifiques

tableau A

(1) Seul un test franchement positif (jaune) permet de conclure immédiatementà Candida tropicalis.Dans le cas d'un résultat douteux (coloration verdâtre) ou négatif, il estnécessaire de confirmer l'identité de la souche (diagnostic différentielavec certaines souches de Saccharomyces cerevisiae AGL+).(2) On peut parfois observer un léger voile jaune pâle.


+/- + Vert ou Jaune + + +/- Candida albicans

+ - Jaune (1) -(+)(2) + +(-) Candida tropicalis

+/- - Jaune - - + Candida glabrata

+/- - Bleu - +(-) - Cryptococcus neoformans

c) Autres profils

1- Espèces PAP + et Urée -

jaune vert ou jaune

2- Espèces PAP - et Urée -

jaune vert ou jaune

17

TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Espèces

+/- + Vert ou Jaune - +/- +/- Candida parapsilosisCandida lusitaniaeCandida guilliermondiiCandida famata

+/- + Vert ou Jaune - - +/- Candida zeylanoidesCandida inconspicua

TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Observations EspècesComplément.

+/- - Vert - - +(-) / Candida pseudotropicalisCandida inconspicuaCandida rugosa

+/- - Vert - - +(-) Aspect sec Candida kruseides colonies

+/- - Vert - - +(-) Arthrospores Geotrichum species

+/- - Vert - +/- +(-) / Saccharomycescerevisae

3- Espèces Urée + et HAP +

bleu jaune

Un test positif se traduit par une coloration généralement jaune des testsBGL et AGL avec Trichosporon cutaneum, on peut observer une colorationorange ou rose, spécifique de cette espèce.De plus, les colonies de T. cutaneum apparaissent filamenteuses.

8- PERFORMANCESD’après des études réalisées à l’Institut Pasteur de Paris et à l’hôpital Broussaisà Paris, la galerie FONGISCREEN® 4H permet d’identifier en 4 heures,C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis et C. neoformans et d’orienter lediagnostic pour d’autres levures.Une étude clinique rétrospective a été réalisée à l’aide d’un panelconstitué de 146 souches, représentant 23 espèces de levures. La galerieFONGISCREEN® 4H a permis d’identifier 100% des souches de C. albicans(18 souches testées), C. glabrata (24 souches), et C. neoformans (11 souches)et 94% des souches de C. tropicalis (18 souches testées). Pour ces 4 espèces,la spécificité du test est de 100%.Les autres espèces de levures peuvent être classées en 3 groupes, selonun profil caractéristique de l’espèce (pour 99 % des souches), mais nonspécifique.

18

TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Observations Espècescomplément.

capsule pigment arthros-ation -pores

Crypto- coccus

+ - - species

Rhodo+/- +/- Bleu +/- +/- + -torula

- + - species

Trichosporon

- - + cutaneum

{

9- LIMITES D'UTILISATION• Le test BGL a parfois une coloration jaune très pâle difficile à

interpréter, en particulier pour la souche C. tropicalis.• Quelques rares souches de C. tropicalis Tréhalose (–) peuvent être

faussement identifiées comme S. cerevisiae.

10-CONTRÔLE QUALITÉ DU FABRICANTTous les produits fabriqués et commercialisés par la société Bio-Rad sontplacés sous un système d'assurance qualité de la réception des matièrespremières jusqu'à la commercialisation des produits finis. Chaque lot deproduit fini fait l'objet d'un contrôle de qualité et n'est commercialisé ques'il est conforme aux critères d'acceptation. La documentation relative àla production et au contrôle de chaque lot est conservée par le fabricant.

11-RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES1. BH. COOPER, M. SILVA-HUTNER. Yeasts of Medical Importance.

Manual of Clinical Microbiology. Fourth edition. 1985, 526-5412. A.M. FREYDIERE AND R. GUINET. Rapid methods for identification of

the most frequent clinical yeasts. Rev. Iberoam. Micol. 1997. 14:85-893. A.M. FREYDIERE AND R. GUINET. New developments in yeast and

yeast-like organisms identification methods accessible to a clinicalmicrobiology laboratory. (soumis à Clin. Microbiol. Rev.)

4. H. FRICKER-HIDALGO, B. LEBEAU, V. LACASSAGNE, P.KERVROEDAN, P. AMBROISE-THOMAS, AND R. GRILLOT.Identification rapide de Candida albicans, Candida tropicalis,Candida glabrata, Cryptococcus neoformans par Fongiscreen® 4H.Evaluation sur 191 souches de levures. J. Mycol. Med. 1993. 3:103-106.

5. R. GRILLOT. Les mycoses humaines : démarche diagnostique. Elsevier,Paris. 1996.

6. W. KELLEY. Rapid Identification of Candida albicans, abstr. C-337,p.384. Abstr 86th Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 1986. AmericanSociety for Microbiology. Washington D.C.

7. V. LAVARDE, M. COHEN, O. RONIN, P. KERVROEDAN, B. DUPONT.1991. Abstr.1233, p.105 - 5th European Congress of ClinicalMicrobiology and Infectious Diseases/Oslo

19

8. J.P. LEPARGNEUR, A. BOUCAYS. M.D. LINAS, J.P. SEGUELA. Profilenzymatique de levures d’intérêt médical - Essais préliminaires. Bull.Soc. Fr. Mycol. Méd., 1985, XIV, N°2, p. 227-230.

9. M. MALLIE, B. MONTES, J.C. LEBECQ, J.M. BASTIDE. Etude du profilenzymatique de quelques levures. Bull. Soc. Fr. Mycol. Méd., 1989,XVIII, N°1, p. 103-108.

20

FONGISCREEN® 4H 5650410 PRUEBAS

IDENTIFICACIÓN RÁPIDA DE LAS PRINCIPALESLEVADURAS DE INTERÉS MEDICO

IVD

1- INTERÉS CLINICOHabida cuenta de la recrudescencia de las infecciones fúngicas durante losúltimos años, concretamente debidas a la frecuente utilización de tópicosantibacterianos, antibióticos de amplio espectro y técnicas invasivas(catéteres, nutrición parenteral), la búsqueda de levaduras en los productospatológicos es cada vez más solicitada en laboratorio. A veces esnecesario un diagnóstico rápido y preciso a fin de instaurar un tratamientoapropiado, sobre todo en los sujetos inmunodeficientes. FONGISCREEN® 4H, un sistema basado en el estudio de un perfilenzimático, responde a esta demanda ya que permite identificar en 4 horas :Candida albicans, Candida glabrata. Candida tropicalis, levaduras querepresentan un 90% aproximadamente de los aislamientos y Cryptococcusneoformans. También permite una orientación para el diagnóstico de otraslevaduras, cuya identificación se completará mediante el estudio de laasimilación de los azúcares con el estuche AUXACOLOR®2 (56513)

2- PRINCIPIO DELA PRUEBAEl prueba se basa en la utilización de sustratos deshidratados por lasenzimas fúngicas preformadas lo cual, se manifiesta por un cambio de colorya sea espontáneamente o bien, después de añadir un reactivo revelador.

TIPO DE PRUEBAS UTILIZADAS

• Medio TTZEste medio contiene Trifeniltetrazolio (TTZ).La reducción del TTZ se evidencia por la aparición de una coloraciónrosa mas o menos intensa en función de la especie.

• Medio PAPContiene un sustrato enzimático que permite detectar la actividad prolinaamoniopeptidasa.

• Medio Urea + Trehalosa (Ur. / tre)Este medio permite detectar la actividad de ureasa que se manifiesta poruna alcalinización del medio con viraje del indicador de pH del verde alazul (Azul de Bromotimol). El metabolismo de la trehalosa origina unaacidificación con viraje del indicador de verde al amarillo.

• Medio BGLContiene un sustrato enzimático: el p. Nitrofenil-N-Acetil-B-D galactosaminida

22

que permite la puesta en evidencia de la galactosaminidasa. Lasensibilidad de esta prueba es superior a la de la prueba de germinaciónpara la identificación de C. albicans (sensibilidad variable según losautores).

• Medio AGLPermite detectar la actividad a-glucosidasa.

• Medio HAPPermite detectar la actividad L-Histidina aminopeptidasaLas pruebas BGL y AGL se realizan en medio ácido. La lectura delresultado precisa un revelado con un reactivo alcalino (reactivo BGL/AGL).La prueba HAP se lee después de revelado con el reactivo HAP.La lectura se realiza después de la incubación durante 4 horas a 37°Csin CO2.

3- COMPOSICIÓN DE LA CAJAFONGISCREEN® 4H contiene :• Microplate : 10 microplacas de 6 pocillos en embalaje individual (el

diagrama de la microplaca está indicado en la etiqueta)• Suspension medium : 10 medios de suspensión, listos para su empleo (1ml)• 1 frasco reactivo AGL/BGL (3 ml)• 1 frasco reactivo HAP (2 ml)• 10 adhesivos• 10 micropipetasCada microplaca está envasada individualmente en una bolsa sellada dehoja de aluminio con una película adhesiva y un desecante.

ESQUEMA DE LA MICROPLACA

23

BGL AGL HAP

TTZ PAP Ur./tre

FONGISCREEN® 4H

Patient : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Date : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

24

Precauciones de utilización / Recomendaciones de higiene y seguridad :Este estuche contiene reactivos peligrosos.• 1 frasco reactivo AGL/BGL (3 ml) que contiene 4% de NaOH 1N.

R 34 : Provoca quemaduras.S 26-37/39-45 : En caso de contacto con los ojos, lávenseinmediata y abundantemente con agua y acúdase a un médico.Úsense guantes adecuados y protección para los ojos/la cara.En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente almédico (si es posible, muéstresele la etiqueta).

• 1 frasco reactivo HAP (2 ml) que contiene 66,5% de etanol al 95° .R 11 : Fácilmente inflamable.S 7-16 : Manténgase el recipiente bien cerrado. Conservar alejado de

toda llama o fuente de chispas - No fumar.

4- CONSERVACIÓNLos reactivos conservados a +2-8°C son estableshasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta(incluso una vez abiertos).

5- MATERIAL NECESARIO NONSUMINISTRADO• Opacity control 6 Mac Farland: código 56499• Incubador a 37°C

6- MODO OPERATIVO

A) INOCULACION DE LA MICROPLACA• A partir de un cultivo puro y fresco en medio de

Sabouraud, o Sabouraud + cloranfenicol, y/oGentamicina, sembrar el medio de suspensióncon una cantidad de levaduras suficiente paraobtener una opacidad superior al testigo deopacidad (Opacity control 6 Mac Farland,código 56499), en la práctica de 4 a 5 dosis sifuera posible.

• Importante : La opacidad de la suspensión debe serequivalente como múnimo a la del testigo deopacidad que define el umbral mínimo de turbidez.

. . .. . . .

. . . .. . .

TTZ PAP Ur./tre

BGL AGL HAP

100 µ

l o 3

gota

s

Medio de suspensión

C - Corrosivo

• Homogeneizar la suspensión con la micropipeta (o utilizar el vortex si fuertenecesario) aspirando y expulsando varias veces el contenido del frasco.

• Extraer el inóculo con la micropipeta y distribuir 3 gotas (100 µl) encada una de los pocillos de la microplaca.

• Cubrir la microplaca con el adhesivo e incubar 4 horas a 37°C.

B) LECTURA DE LOS RESULTADOSDespegar el adhesivo• Leer ls pruebas TTZ, PAP, Urea/trehalosa.• Añadir 2 gotas de reactivos BGL/AGL en los pocillos BGL y AGL.

- Leer la prueba BGL inmediatamente- Para la prueba AGL, la coloración se desarrolla en 15 a 30 segundos.

• Añadir 2 gotas del reactivo HAP en la cúpula HAP ; la coloración sedesarrolla en 15 a 30 segundos.

TABLA DE RESULTADOS

* El viraje al azul (alcalinización del medio) esta asociado con elmetabolismo de la urea (cepas urea (+), Trehalosa (+) o (-)), si una cepaes a la vez Urea (+) y Trehalosa (+), la alcalinización se manifiestaprioritariamente (viraje al azul). El viraje al amarillo (acidificación del

25

PRUEBA NEGATIVOS POSITIVOS PROCEDIMIENTO

TTZ INCOLORO ROSA CLARO o LECTURA DIRECTA (sin adición de reactivos)ROSA FUERTE

según la especie

PAP INCOLORO AMARILLO

UR./TRE VERDE AZUL (alcalinización)o AMARILLO (acidificación) según especie

BGL INCOLORO AMARILLO Añadir 2 gotas del reactivo BGL/AGL.La coloración aparece inmediatamente (realizar la lectura inmediatamente)

AGL INCOLORO AMARILLO Añadir 2 gotas del reactivo BGL/AGL.La coloración se desarrolla en 15 a 30 segundos.

HAP INCOLORO AMARILLO Añadir 2 gotas del reactivo HAP.La coloración se desarrolla en 15 a 30 segundos.

medio) esta asociado con el metabolismo de la Trehalosa (cepasTrehalosa (+), urea (-)).

7- INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS• Comparar el perfil obtenido con los perfiles específicos (ver cuadro A),

los caracteres discriminantes aparecen en negrilla.• Si el perfil es diferente, considerar las pruebas PAP y Urea y remitirse a

los apartados correspondientes.

a) Textos+ : prueba positiva+ : prueba positiva- : prueba negativa+/- : prueba variable+(-) : prueba positiva en al menos un 90% de los casos-(+) : prueba negativa en al menos un 90% de los casos

b) Características específicas

TABLA A

(1) Sólo una prueba claramente positiva (amarillo) permite concluirinmediatamente en Candida tropicalis.En caso de resultados dudoso (coloración verdosa) o negativo, esnecesario confirmar la identidad de la cepa (diagnóstico diferencial conciertas cepas de Saccharomyces cerevisiae AGL+).(2) A veces puede observarse una ligera coloración amarillo claro.

26


+/- + Verde o amarillo + + +/- Candida albicans

+ - Amarillo (1) -(+)(2) + +(-) Candida tropicalis

+/- - Amarillo - - + Candida glabrata

+/- - Azul - +(-) - Cryptococcus neoformans

c) Otras características

1- Especies PAP+ y Urea-

amarillo verde o amarillo

2- Especies PAP- y Urea-

incolora verde o amarillo

27

TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP ESPECIES

+/- + Verde o amarillo - +/- +/- Candida parapsilosisCandida lusitaniaeCandida guilliermondiiCandida famata

+/- + Verde o amarillo - - +/- Candida zeylanoidesCandida inconspicua

TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP OBSERVACIONES ESPECIESCOMPLEMENTARIAS

+/- - Verde - - +(-) / Candida pseudotropicalisCandida inconspicuaCandida rugosa

+/- - Verde - - +(-) Aspecto seco Candida kruseide colonias

+/- - Verde - - +(-) Artrosporas Geotrichum species

+/- - Verde - +/- +(-) / Saccharomyces cerevisae

3- ESPECIES UREA + Y HAP +

azul amarillo

Una prueba positiva también se manifiesta por una coloración amarillade las pruebas BGL y AGL; con Trichosporon cutaneum, puedeobservarse una coloración naranja o rosa, específica de esta especie. Además, las colonias de Trichosporon cutaneum aparecen filamentosas.

8- ESPECIFICACIONESSegún los estudios del Instituto Pasteur de París y del hospital Broussaisde París, FONGISCREEN® 4H permite la identificación en cuatro horasde C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis y C. neoformans, así como laorientación diagnóstica de otras levaduras.Un estudio clínico retrospectivo ha establecido un grupo de 146 cepasque representan 23 especies de levaduras. FONGISCREEN® 4H permitedetectar el 100% de las cepas de C. albicans (18 cepas sometidas aprueba), C. glabrata (24 cepas), y C. neoformans (11 cepas) y el 94%de C. tropicalis strains (18 cepas sometidas a prueba). La especificidadde la prueba fue del 100% para estas 4 cepasOtras especies de levaduras se pueden clasificar en 3 grupos, deacuerdo con características distintivas, pero no específicas, de lasespecies (para el 99% de las cepas).

28

TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP OBSERVACIONES ESPECIEScomplementarias

cápsula pigment artros-ación -poras

- Cryptococcus+ - -

+/- +/- Azul +/- +/- + Rhodoorula- + -

Trichosporoncutaneum

- - +

{

9- LÍMITES DE LA PRUEBA• La prueba BGL a veces adquiere un color amarillo claro difícil de

interpretar, sobre todo con la cepa C. tropicalis.• Algunas cepas raras de C. tropicalis Trehalosa (-) se pueden identificar

erróneamente como S. cerevisiae.

10- CONTROL DE CALIDAD DEL FABRICANTETodos los reactivos fabricados se elaboran conforme a nuestro sistema decalidad, que se extiende desde el momento de recepción de las materiasprimas hasta la comercialización del producto.Cada lote se somete a exámenes de control de calidad y únicamente seautoriza su introducción en el mercado tras cumplir los criterios deaceptación predefinidos.Bio-Rad conserva los expedientes relativos a la producción y el control decada uno de los lotes.

11- BIBLIOGRAFIAVéase la versión francesa.

29


TESTKIT FÜR DIE SCHNELLE IDENTIFIZIERUNG DERWICHTIGSTEN, KLINISCH BEDEUTSAMEN HEFEN

IVD

1- KLINISCHES INTERESSEDurch die in den letzten Jahren steigende Zahl von Pilzinfektionen, diehauptsächlich auf die häufige Anwendung von lokalen oder Breitband-Antibiotika sowie von invasiven Techniken (Katheter, Parenteralernährung)zurückzuführen ist, müssen in den mikrobiologischen Labors immerhäufiger Hefebestimmungen an pathologischem Untersuchungsmaterialdurchgeführt werden. In manchen Fällen ist eine schnelle und präzise Diagnose erforderlich,damit, vor allem bei immunsupprimierten Patienten, rasch mit einergeeigneten Therapie begonnen werden kann.FONGISCREEN® 4H ist speziell für diese Fälle geeignet: basierend aufder Untersuchung des Enzymprofils ermöglicht dieser Test innerhalbvon 4 Stunden den Nachweis der in 90% aller Fälle isolierten HefenCandida albicans, Candida glabrata und Candida tropicalis, sowie denNachweis von Cryptococcus neoformans. Er liefert darüber hinaus eineOrientierungshilfe für die Identifizierung anderer Hefen, die anschließendim Zuckerassimilationstest mit dem AUXACOLOR® 2-System (Code 56513)genauer bestimmt werden können.

2- TESTPRINZIPDas Testprinzip beruht auf der Verwendung dehydrierter Substrate durchdie jeweils vorhandenen Pilzenzyme. Spontan oder nach Zusatz einesEntwicklungsreagenzes tritt ein Farbumschlag auf.

ENTHALTENE TESTS

• TTZ-NährbodenDieser Nährboden enthält Triphenyltetrazolium (TTZ). Bei Reduktion von TTZtritt je nach Spezies eine mehr oder weniger intensive Rosafärbung auf.• PAP-NährbodenEnthält ein Enzymsubstrat zum Nachweis der Prolinaminopeptidase-Aktivität.

• Harnstoff + Trehalose-Nährboden (Ur./Tre)Ermöglicht den Nachweis der Ureaseaktivität durch die Alkalisierung desNährbodens mit Farbumschlag des pH-Indikators von grün nach blau(Bromthymolblau). Der Trehalosemetabolismus bewirkt eine Ansäuerungmit Indikatorumschlag von grün nach gelb.• BGL-NährbodenEnthält das Enzymsubstrat p-Nitrophenyl-N-Acetyl-ß-D-Galactosamid zum

32

Nachweis der Galactosamidase. Dieser Test für den Nachweis vonC.albicans ist empfindlicher als der Keimschlauchtest (unterschiedlicheEmpfindlichkeitsangaben je nach Autor).

• AGL-NährbodenZum Nachweis der a-Glucosidase-Aktivität.

• HAP-NährbodenZum Nachweis der L-Histidinaminopeptidase-Aktivität.Die Tests BGL und AGL werden im sauren Bereich durchgeführt. ZurAblesung der Ergebnisse muss als Farbentwickler ein alkalisches Reagenz(BGL/AGL-Reagenz) zugesetzt werden.Der HAP-Test wird nach Entwicklung durch das HAP-Reagenz abgelesen.Die Testauswertung erfolgt nach 4-stündiger Inkubation bei 37°C (ohne CO2).

3- ZUSAMMENSETZUNG DER TESTPACKUNGFONGISCREEN® 4H enthält :• Microplate : 10 einzeln verpackte Mikroplatten mit je 6 Vertiefungen

(Schema der Mikroplatte siehe Etikett).• Suspension medium : 10 gebrauchsfertige Suspensionslösungen (1 ml)• 1 Fläschchen mit AGL/BGL-Reagenz (3 ml)• 1 Fläschchen mit HAP-Reagenz (2 ml)• 10 Mikropipetten• 10 KlebestreifenJede Mikroplatte ist einzeln in einem versiegelten Aluminiumbeutel mitKlebefolie und Trockenmittel verpackt.

SCHEMA DER MIKROPLATTE

33

BGL AGL HAP

TTZ PAP Ur./tre

FONGISCREEN® 4H

Patient : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Date : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Vorsichtsmaßnahmen / Gesundheits- und Sicherheitsvorschriften:Diese Testpackung enthält gefährliche Reagenzien.• 3 ml-Fläschchen mit AGL/BGL-Reagenz mit 4% NaOH 1N.

R 34: Verursacht Verätzungen.S 26-37/39-45: Bei Berührung mit den Augen sofort gründlichmit Wasser abspülen und Arzt konsultieren. Bei der Arbeitgeeignete Schutzhandschuhe und Schutzbrille/Gesichtsschutztragen. Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt zuziehen (wennmöglich, dieses Etikett vorzeigen).

• 2 ml-Fläschchen HAP-Reagenz mit 66,5% 95° Ethanol. R 11: Leichtentzündlich.S 7-16: Behälter dicht geschlossen halten. Von Zündquellen fernhalten -

Nicht rauchen.

4- LAGERUNGAlle Reagenzien sind bis zu dem auf dem Etikett angegebenenVerfallsdatum stabil, wenn sie bei +2 - 8°C gelagert werden (selbst nachder Öffnung).

5- ZUSÄTZLICH WERDEN BENÖTIGT• Opacity control 6 Mac Farland: Kat.Nr. 56499• Inkubator bei 37°C

6- ARBEITSANLEITUNG

A)BEIMPFUNG DER MIKROPLATTE• Ausgehend von einer reinen und frischen Kultur auf

Sabouraud-Nährboden bzw, Sabouraud +Chloramphenicol und/oder Gentamycin wird dasSuspensionsmedium mit einer Hefemenge beimpft,ausreichend um eine Suspensionsdichte zu erhalten,deren Trübung stärker als die des Trübungsstandards(Opacity control 6 Mac Farland, Kat.Nr. 56499)ist: erfahrungsgemäß entspricht dies etwa 4-5Impfösen.

• WICHTIG : Die Trübung der Suspension mussmindestens der des Trübungsstandards entsprechen,da dieser nur die minimale Trübungsgrenze definiert.

34

. . .. . . .

. . . .. . .

TTZ PAP Ur./tre

BGL AGL HAP

100 µ

l oder

3 T

ropfe

n

Suspensionmedium

C - Ätzend

• Die Suspension mit der Mikropipette durch mehrmaliges Ansaugen undZurückfließen des Fläschcheninhalts homogenisieren (wenn nötig, mitdem Vortex mischen).

• Das Inoculum mit der Mikropipette entnehmen und 3 Tropfen (100 µl)in jede Vertiefung der Mikroplatte pipettieren.

• Die Mikroplatte mit dem Klebestreifen bedecken und 4 Stunden bei37°C inkubieren.

2. ABLESEN DER ERGEBNISSE• Den Klebestreifen abziehen• Die Tests TTZ, PAP, Harnstoff/Trehalose ablesen.• Jeweils 2 Tropfen BGL/AGL-Reagenz in die Vertiefungen BGL und AGL geben.

- den BGL-Test sofort ablesen- bei dem AGL-Test tritt der Farbumschlag nach 15 bis 30 Sekunden auf.

• 2 Tropfen HAP-Reagenz in die HAP-Vert iefung geben; derFarbumschlag tritt nach 15 bis 30 Sekunden auf.

ERGEBNISTABELLE

* Der Farbumschlag nach Blau (Alkalisierung des Nährbodens) ist aufden Harnstoffmetabolismus zurückzuführen (Stämme: Harnstoff (+),

35

TESTS NEGATIV POSITIV DURCHFÜHRUNG

TTZ FARBLOS HELLROSA oder DIREKT ABLESEN (ohne Reagenzienzusatz)KRÄFTIGES ROSA je nach Spezies

PAP FARBLOS GELB

UR./TRE GRÜN BLAU (Alkalisierung) oder GELB (Säuerung)

je nach Spezies

BGL FARBLOS GELB 2 Tropfen BGL/AGL-Reagenz zusetzen.Der Farbumschlag tritt sofort ein (sofort ablesen)

AGL FARBLOS GELB 2 Tropfen BGL/AGL-Reagenz zusetzen. Der Farbumschlag tritt nach 15 bis 30 Sekunden ein.

HAP FARBLOS GELB 2 Tropfen HAP-Reagenz zusetzen. Der Farbumschlag tritt nach 15 bis 30 Sekunden ein.

Trehalose (+) oder (-)); ist ein Stamm gleichzeitig Harnstoff (+) undTrehalose (+), dominiert die Alkalisierung: Farbumschlag nach blau. EineGelbfärbung (Ansäuerung des Nährbodens) steht im Zusammenhang mitdem Trehalose-Metabolismus (Stämme: Trehalose (+), Harnstoff (-)).

7- AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE• Vergleich des gefundenen Testprofils mit den spezifischen Profilen der

Tabelle A. Die für die Identifizierung entscheidenden Merkmale sindjeweils fett gedruckt.

• Lässt sich das ermittelte Testprofil keinem der in der Tabelle Aaufgeführten Profile zuordnen, sind für eine orientierende Bestimmungdie Testergebnisse des PAP- bzw. Harnstoff tests mit denentsprechenden Ergebnissen der unter c) aufgeführten Tabellen zuvergleichen.

a) Zeichenerklärung+ : positiver Test- : negativer Test+/- : variables Testergebnis+(-) : in mindestens 90% der Fälle positiver Test-(+) : in mindestens 90% der Fälle negativer Test

b) Spezifische Profile

TABELLE A

(1) Nur ein deutlich positives (gelb) Testergebnis gestattet den sofortigenRückschluss auf das Vorhandensein von Candida tropicalis. Wenn dasErgebnis zweifelhaft (grünliche Färbung) oder negativ ist, muss eineBestätigung der Stammidentität (Differentialdiagnose mit bestimmten AGL+ Stämmen von Saccharomyces cerevisiae) vorgenommen werden.(2) Manchmal ist ein leichter, hellgelber Schleier zu beobachten.

36


+/- + Grün oder Gelb + + +/- Candida albicans

+ - Gelb (1) -(+)(2) + +(-) Candida tropicalis

+/- - Gelb - - + Candida glabrata

+/- - Blau - +(-) - Cryptococcus neoformans

c) Andere Profile

1- PAP+ und Harnstoff - Spezies

gelb grün oder gelb

2- PAP - und Harnstoff - Spezies

farblos grün

37

TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Spezies

+/- + GRÜN ODER GELB - +/- +/- Candida parapsilosisCandida lusitaniaeCandida guilliermondiiCandida famata

+/- + GRÜN ODER GELB - - +/- Candida zeylanoidesCandida inconspicua

TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Zusätzliche SpeziesBEOBACHTUNGEN

+/- - GRÜN - - +(-) / Candida pseudotropicalisCandida inconspicuaCandida rugosa

+/- - GRÜN - - +(-) Trockenes Aussehen Candida kruseider Kolonien

+/- - GRÜN - - +(-) Arthrosporen Geotrichum-Spezies

+/- - GRÜN - +/- +(-) / Saccharomyces cerevisae

3- HARNSTOFF + und HAP + SPEZIES

blau gelb

Ein positiver Test zeichnet sich im Allgemeinen durch Gelbfärbung derTests BGL und AGL aus. Bei Trichosporon cutaneum kann eine für dieseSpezies spezifische orange oder rosa Färbung beobachtet werden.Darüber hinaus sehen die Trichosporon cutaneum Kolonien ”faserig“ aus.

8- TESTEIGENSCHAFTENGemäß Studien des Pasteur-Instituts in Paris und im Broussais-Hospital inParis ermöglicht FONGISCREEN® 4H innerhalb von vier Stunden dieIdentifizierung von C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis undC. neoformans und gibt eine Orientierungshilfe für die Diagnose andererHefen.Eine retrospektive klinische Studie wurde mit einem Panel von 146Stämmen von 23 Hefespezies durchgeführt. Mit FONGISCREEN® 4Hwurden 100% von C. albicans (18 getestete Stämme), C. glabrata (24Stämme) und C. neoformans (11 Stämme) und 94% von C. tropicalis (18getestete Stämme) nachgewiesen. Für diese 4 Stämme lag die Spezifitätdes Tests bei 100%.

38

TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Zusätzliche SpeziesBeobachtungen

Kapseln pigment Arthro-rung -sporen

Cryptoc- -occus

+ - - -Spezies

Rhodoorula+/- +/- Blue +/- +/- + -Spezies

- + -

Tricho-sporon

- - + -cutaneum

{

Andere Hefespezies können nach einem charakteristischen, aber nichtspezifischen Profil der Spezies (für 99% der Stämme) in 3 Gruppeneingeteilt werden.

9- GRENZEN DES TESTS• Der BGL-Test nimmt gelegentlich eine sehr hellgelbe Farbe an, die nur

schwer interpretierbar ist, insbesondere für C. tropicalis-Stämme.• Manche seltenen Stämme von C. tropicalis Trehalose (-) können

fälschlicherweise als S. cerevisiae identifiziert werden.

10-QUALITÄTSKONTROLLE DES HERSTELLERSAlle Reagenzien unterliegen unserem Qualitätssicherungssystem, vomRohstoffeingang bis zur Vermarktung der Produkte. Jede fertigeProduktionscharge wird einer Qualitätskontrolle unterzogen und nur dannfür den Markt freigegeben, wenn sie den vorgegebenenAbnahmekriterien entspricht. Die Produkt- und Kontrolldokumentationjeder einzelnen Charge wird bei Bio-Rad aufbewahrt.

11-LITERATURSiehe Französische Version.

39

FONGISCREEN® 4H 5650410 TEST

IDENTIFICAZIONE RAPIDA DEI PRINCIPALI LIEVITI DIRILEVANZA MEDICA

IVD

1- INTERESSE CLINICOA causa dell’aumentata incidenza delle infezioni micotiche nel corsodegli ultimi anni, dovute essenzialmente all’impiego frequente di farmaciantibatterici per uso topico, di antibiotici ad ampio spettro e di tecnicheinvasive (cateteri, alimentazione parenterale), ai laboratori di analisimicrobiologiche viene sempre più di frequente richiesto di identificare ilieviti presenti nei campioni patologici.Una diagnosi rapida e precisa si rende talvolta necessaria per avviare untrattamento adeguato, specialmente in soggetti immunodepressi.Fongiscreen® 4H, un metodo basato sullo studio del profilo enzimatico,soddisfa questa richiesta in quanto è in grado di identificare, entro 4 ore :la Candida albicans, la Candida glabrata e la Candida tropicalis, lievitiche rappresentano il 90% circa degli isolati e il Cryptococcusneoformans. Il test consente inoltre di dirigere la diagnosi di altri lievitiche saranno completamente identificabili attraverso lo studio dell’utilizzodegli zuccheri mediante il kit AUXACOLOR® 2 (codice 56513).

2- PRINCIPIO DEL TESTIl test si basa sull’uso di substrati deidratati mediante enzimi funginipreformati, che danno origine a un cambiamento di colore spontaneo oin seguito all’aggiunta di un reagente rivelatore.NATURA DEI TEST IMPIEGATI• Terreno TTZ Questo terreno di coltura contiene trifeniltetrazolio (TTZ). La riduzione diTTZ comporta l’apparizione di un colore rosa più o meno intenso,secondo le specie.• Terreno PAPQuesto terreno contiene un substrato enzimatico che consente larivelazione dell’attività della prolina aminopeptidasi.• Terreno Urea + Trealosio (Ur./tre)Questo terreno consente la rivelazione dell’attività dell’ureasi, riflessadall’alcalinizzazione del terreno con un cambiamento di colore dal verdeal blu dell'indicatore di pH (blu di bromotimolo). Il metabolismo deltrealosio causa l'acidificazione con un cambiamento di coloredell’indicatore da verde a giallo.• Terreno BGLQuesto terreno di coltura contiene un substrato enzimatico,

42

il p. Nitrofenil-N-acetil-B-D-galattosamina, che consente di dimostrare lapresenza di galattosaminidasi. Questo test è più sensibile del test difilamentazione (germ tube test) per l’identificazione della C. albicans (acausa, secondo certi autori, della sensibilità variabile).

• Terreno AGLConsente la rivelazione dell’attività dell’á-glucosidasi

• Terreno HAPConsente la rivelazione dell’attività della L-istidina aminopeptidasiI test su BGL e AGL sono eseguiti in un terreno acido. Per la lettura deirisultati è necessario procedere alla rivelazione mediante un reagentealcalino (reagente BGL/AGL).La lettura del test HAP è possibile dopo la rivelazione con il reagente HAP.La lettura del test viene eseguita dopo un’incubazione di 4 ore a 37°C inassenza di CO2.

3- COMPOSIZIONE DEL KITFONGISCREEN® 4H comprende:• Microplate : 10 micropiastre da 6 pozzetti confezionate singolarmente

(lo schema di composizione della micropiastra è indicato sull’etichetta). • Suspension medium : 10 mezzi di sospensione pronti per l’uso (1 ml)• 1 fiala di reagente AGL/BGL (3 ml)• 1 fiala di reagente HAP (2ml)• 10 micropipette• 10 pellicole adesiveCiascuna micropiastra è confezionata singolarmente in un sacchettofoderato di alluminio contenente una pellicola adesiva e un essiccante.

SCHEMA DI COMPOSIZIONE DELLA MICROPIASTRA

43

BGL AGL HAP

TTZ PAP Ur./tre

FONGISCREEN® 4H

Patient: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Date: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Precauzioni per l’uso / Istruzioni per la salute e la sicurezza:Il presente kit contiene reagenti pericolosi.• Una fiala di reagente AGL/BGL da 3 ml contiene il 4% di NaOH 1 N.

R 34: Provoca ustioni.S 26-37/39-45: In caso di contatto con gli occhi, lavareimmediatamente e abbondantemente con acqua e consultareun medico. Usare guanti adatti e proteggersi gli occhi/lafaccia. In caso di incidente o di malessere consultareimmediatamente il medico (se possibile, mostrargli l'etichetta).

• Una fiala di reagente HAP da 2 ml contiene il 66,5% di etanolo a 95°. R 11: Facilmente infiammabile.S 7-16: Conservare il recipiente ben chiuso. Conservare lontano da

fiamme e scintille - Non fumare.

4- CONSERVAZIONEI reagenti, conservati a +2-8°C, sono stabili fino alla data di scadenzaindicata sulla targhetta (anche dopo l’apertura)

5- MATERIALE NECESSARIO NON FORNITO• Opacity control 6 Mac Farland: codice 56499• Incubatore con termostato a 37°C

6- PROCEDURA

A)INOCULAZIONE DELLA MICROPIASTRA• Mediante una coltura pura e fresca su terreno con

Sabouraud, Sabouraud Chloramphenicol, e/oGentamicina e una quantità di lieviti sufficiente aottenere un'opacità superiore all’opacità dicontrollo (Opacity control 6 Mac Farland, codice56499): in pratica 4 - 5 anse, se possibile.

• Importante: l’opacità della sospensione deve esserealmeno uguale a quella dell’opacità di controllo chedefinisce il livello minimo di torbidezza.

• Omogeneizzare la sospensione mediante lamicropipetta (o vortex se necessario), aspirando edespellendo numerose volte il contenuto della fiala.

44

. . .. . . .

. . . .. . .

TTZ PAP Ur./tre

BGL AGL HAP

100 µ

l o 3

gocc

e

Mezzi do sospensione

C - Corrosivo

• Raccogliere l’inoculo con la micropipetta e dispensare 3 gocce (100 µl)in ciascun pozzetto della micropiastra.

• Coprire la micropiastra con un foglio adesivo e incubare per 4 ore a 37 °C.

B) LETTURA DEI RISULTATI• Rimuovere l’adesivo.• Leggere i risultati del TTZ, PAP e Urea/trealosio.• Aggiungere 2 gocce di reagente BGL/AGL nei pozzetti BGL e AGL.

- leggere immediatamente il test BGL- per il test AGL, il colore si rivela in 15 - 30 secondi.

• Aggiungere 2 gocce di reagente HAP nel pozzetto HAP. Il colore sirivela in 15 - 30 secondi.

TABELLA DEI RISULTATI

* Il fatto che il colore diventi blu (alcalinizzazione del terreno) èassociato con il metabolismo dell’urea (ceppi di Urea (+), Trealosio (+)oppure (-)); se un ceppo è sia Urea (+) sia Trealosio (+), l’alcalinizzazione èpredominante (colorazione blu). Il fatto che il colore diventi giallo(acidificazione del terreno) è associato con il metabolismo del Trealosio(ceppi di Trealosio (+), Urea (-)).

45

TEST NEGATIVO POSITIVO PROCEDURA

TTZ INCOLORE ROSA CHIARO o LETTURA DIRETTA (senza aggiunta di reagenti)ROSA SCURO

secondo le specie

PAP INCOLORE GIALLO

UR./TRE VERDE BLU (alcalinizzazione)o GIALLO

(acidificazione)secondo la specie

BGL INCOLORE GIALLO Aggiungere 2 gocce di reagente BGL/AGL. Il colore si manifesta immediatamente (cioè lettura immediata)

AGL INCOLORE GIALLO Aggiungere 2 gocce di reagente BGL/AGL.Il colore si rivela in 15 - 30 secondi.

HAP INCOLORE GIALLO Aggiungere 2 gocce di reagente HAP.Il colore si sviluppa in 15 - 30 secondi.

7- INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI• Confrontare il profilo ottenuto con i profili specifici (vedere Tabella A);

gli aspetti discriminanti sono indicati in grassetto.• Se il profilo è diverso, considerare i test PAP e urea e fare riferimento

ai relativi paragrafi.

a) Legende+ : test positivo- : test negativo+/- : test variabile+(-) : test positivo in almeno il 90% dei casi-(+) : test negativo in almeno il 90% dei casi

b) Profili specifici

TABELLA A

(1) Soltanto un test chiaramente positivo (giallo) consente di identificareimmediatamente la Candida tropicalisIn caso di risultato dubbio (colore verdastro) o negativo, si dovràprocedere alla conferma dell’identità del ceppo (diagnosi differenzialecon certi ceppi di AGL + Saccharomyces cerevisiae).(2) A volte è possibile osservare una scoloritura giallo pallido.

46


+/- + Verde o giallo + + +/- Candida albicans

+ - Giallo (1) -(+)(2) + +(-) Candida tropicalis

+/- - Giallo - - + Candida glabrata

+/- - Blu - +(-) - Cryptococcus neoformans

c) Altri profili

1- SPECIE PAP+ E UREA

giallo verde o giallo

2- SPECIE PAP- E UREA

incolore verde

47

TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Specie

+/- + Verde o giallo - +/- +/- Candida parapsilosisCandida lusitaniaeCandida guilliermondiiCandida famata

+/- + Verde o giallo - - +/- Candida zeylanoidesCandida inconspicua

TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Osservazioni Specieaggiuntive

+/- - verde - - +(-) / Candida pseudotropicalisCandida inconspicuaCandida rugosa

+/- - verde - - +(-) Apparizione di Candida kruseicolonie a secco

+/- - verde - - +(-) Artrospore specie Geotrichum

+/- - verde - +/- +(-) / Saccharomyces cerevisae

3- SPECIE UREA+ E HAP+

blu giallo

Un test positivo corrisponde generalmente a una colorazione gialla suitest BGL e AGL; una colorazione arancione o rosa si può osservare per ilTrichosporon cutaneum ed è specifica di questa specie. Inoltre, le coloniedi T. cutaneum hanno un aspetto filamentoso.

8- PRESTAZIONIIn base agli studi condotti dall’Istituto Pasteur di Parigi e dall’ospedaleBroussais di Parigi, il FONGISCREEN® 4H consente in quattro ore diidentificare la C. albicans, la C. glabrata, la C. tropicalis e la C. neoformanse di orientare la diagnosi di altri lieviti.Uno studio clinico retrospettivo è stato condotto su un panel di 146 ceppirappresentanti di 23 specie di lieviti. FONGISCREEN® 4H consente dirivelare il 100% dei ceppi di C. albicans (18 ceppi testati), C. glabrata(24 ceppi) e C. neoformans (11 ceppi) e il 94% di ceppi di C. tropicalis(18 ceppi testati). Per questi 4 ceppi, la specificità dei test è risultata del100%.Altre specie di lievito possono essere classificate in 3 gruppi, secondo unprofilo distintivo, ma non specifico, delle specie (per il 99% delle specie).

48

TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Osservazioni Specie

capsula pigment Artros-azione -pore

Specie - Cryptococ

+ - - -cus

Specie +/- +/- Blu +/- +/- + Rhodoorula

- + -

Trichosporon cutaneum

- - +

{

9- LIMITI DELLA PROCEDURA• Il test BGL assume a volte una colorazione gialla molto chiara difficile

da interpretare, in particolare per il ceppo di C. tropicalis. • Alcuni rari ceppi di C. tropicalis Trealosio (-) possono essere

erroneamente interpretati come S. cerevisiae

10-CONTROLLO DI QUALITA DEL PRODUTTORETutti i reagenti sono prodotti in base al nostro sistema di assicurazione diqualità a cominciare dal ricevimento delle materie prime fino alladistribuzione del prodotto finito. Ciascun lotto è sottoposto a controllo diqualità ed è immesso sul mercato solo quando è conforme ai criteri diaccettazione. I dati relativi alla produzione e al controllo di ogni singololotto sono conservati negli archivi Bio-Rad.

11-BIBLIOGRAFIAVedere la versione francese.

49


IDENTIFICAÇÃO RAPIDA DOS PRINCIPAIS FUNGOSCLINICAMENTE IMPORTANTES

IVD

1- IMPORTANCIA CLINICAPerante a crescente incidência de infecções a fungos nos últimos anos,essencialmente devida à utilização frequente de agentes antibacterianosde aplicação tópica, antibióticos de largo espectro e técnicas invasivas(cateteres, alimentação por via parentérica), os laboratórios demicrobiologia são cada vez mais solicitados para detectar a presença defungos em amostras patológicas.Um diagnóstico rápido e preciso torna-se, por vezes, necessário, para dar inícioao tratamento apropriado, em especial no caso de indivíduos imunodeprimidos. Fongiscreen® 4H, um sistema baseado no estudo do perfil enzimático,vem satisfazer esta necessidade, visto ser capaz de identificar, no prazode 4 horas: Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis,fungos que representam cerca de 90% dos isolados, e Cryptococcusneoformans. Este sistema permite ainda orientar o diagnóstico de outrosfungos cuja identificação será completada pela análise da utilização deaçúcar, com o dispositivo AUXACOLOR® 2 (ref. 56513).

2- PRINCIPIO DO TESTEO teste baseia-se na utilização de substratos desidratados por enzimasfúngicos pré-formados, o que resulta numa alteração de cor espontâneaou mediante adição de um reagente de revelação.

NATUREZA DOS TESTES UTILIZADOS

• Meio TTZ Este meio contém Trifeniltetrazólio (TTZ). A redução de TTZ resulta na formaçãode uma coloração rosa mais ou menos intensa, consoante as espécies.

• Meio PAP Este meio contém um substrato enzimático que permite a detecção daactividade prolina aminopeptidase.

• Meio Ureia + Trealose (Ur./tre)Este meio permite a detecção da actividade urease, reflectida pelaalcalinização do meio, com uma alteração da cor verde para azul noindicador de pH (Azul de Bromotimol). O metabolismo da trealose resulta emacidificação, com alteração de cor do indicador, de verde para amarelo.

• Meio BGL Este meio contém um substrato enzimático: p. Nitrofenil-N-Acetil-B-D-

52

Galactosaminide, que permite a demonstração da galactosaminidase.Este teste é mais sensível do que o teste de tubo germinativo paraidentificação de C. albicans (sensibilidade variável, de acordo comdiferentes autores).

• Meio AGL Permite a detecção da actividade a-glucosidase.

• Meio HAP Permite a detecção da actividade L-Histidina aminopeptidase.Os testes BGL e AGL são realizados em meio acídico. A leitura doresultado requer revelação, utilizando um reagente alcalino (reagenteBGL/AGL).O teste HAP é lido após revelação com o reagente HAP.O teste é lido após incubação durante 4 horas a 37°C sem CO2.

3- COMPOSIÇÃO DO DISPOSITIVOFONGISCREEN® 4H inclui:• Microplate : 10 microplacas de 6 poços, em embalagem individual (o

diagrama da microplaca está indicado na etiqueta).• Suspension medium : 10 meios de suspensão prontos a utilizar (1 ml).• 1 frasco de reagente AGL/BGL (3 ml)• 1 frasco de reagente HAP (2ml)• 10 micropipetas• 10 fitas adesivasCada microplaca é apresentada em embalagem individual, num saco dealumínio hermeticamente fechado, com uma fita adesiva e umdessecante.

DIAGRAMA DA MICROPLACA

53

BGL AGL HAP

TTZ PAP Ur./tre

FONGISCREEN® 4H

Patient : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .date : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Precauções / Advertências e Instruções de segurança:Este dispositivo contém reagentes perigosos.• Frasco de 3 ml de reagente AGL/BGL contendo 4% de NaOH 1N.

R 34: Provoca queimaduras.S 26-37/39-45: Em caso de contacto com os olhos, lavarimediata e abundantemente com água e consultar umespecialista. Usar luvas e equipamento protector para osolhos/face adequados. Em caso de acidente ou deindisposição, consultar imediatamente um médico (sepossível, mostrar-lhe o rótulo).

• Frasco de 2 ml de reagente HAP contendo 66,5% de etanol a 95°. R 11: Facilmente inflamável.S 7-16: Manter o recipiente bem fechado. Manter afastado de qualquerchama ou fonte de ignição – Não fumar.

4- ARMAZENAMENTOConservados à temperatura de +2 - 8°C, os reagentesmantêm-se estáveis até ao termo do prazo de validadeindicado na etiqueta (mesmo depois de abertos).

5- MATERIAL NECESSARIO NÃO FORNECIDO• Opacity control 6 Mac Farland: código 56499• Incubadora a 37°C

6- PROCEDIMENTO

A)INOCULAÇÃO DA MICROPLACA• Utilizar uma cultura pura e fresca em meio

Sabouraud, Sabouraud Cloramfenicol, e/ouGentamicina, com uma quantidade de fungossuficiente para se obter uma opacidade superior àdo controlo de opacidade (Opacity control 6 MacFarland, código 56499): na prática, 4 a 5 arcos, sepossível.

• Importante: a opacidade da suspensão deveráser, pelo menos, igual à do controlo de opacidadeque define o nível mínimo de turvação.

54

. . .. . . .

. . . .. . .

TTZ PAP Ur/Tre.

BGL AGL HAP

100 µ

l ou

3 g

ota

s

meio de suspensão

C - Corrosivo

• Homogeneizar a suspensão utilizando a micropipeta (ou vortex, senecessário), aspirando e expelindo o conteúdo do frasco, váriasvezes.

• Recolher o inóculo com a micropipeta e distribuir 3 gotas (100 µl) emcada um dos poços da microplaca.

• Cobrir a microplaca com fita adesiva e incubar durante 4 horas a37°C.

B) LEITURA DOS RESULTADOS• Retirar a fita adesiva.• Ler os resultados de TTZ, PAP, Ureia/trealose.• Adicionar 2 gotas de reagente BGL/AGL nos poços de BGL e AGL.

- proceder imediatamente à leitura do teste BGL - quanto ao teste AGL, a cor é revelada nos próximos 15 a 30

segundos.• Adicionar 2 gotas de reagente HAP no poço HAP. A cor é revelada

nos próximos 15 a 30 segundos.

TABELA DE RESULTADOS

* A alteração de cor para azul (alcalinização do meio) está associadaao metabolismo da ureia (estirpes Ureia(+), Trealose(+) ou (-); se uma

55

TESTES NEGATIVO POSITIVO PROCEDIMENTO

TTZ INCOLOR ROSA PÁLIDO ou LEITURA DIRECTA (sem adição de reagentes)ROSA ESCURO,

consoante as espécies

PAP INCOLOR AMARELO

UR./TRE VERDE AZUL (alcalinização) ou AMARELO (acidificação),

consoante as espécies

BGL INCOLOR AMARELO Adicionar 2 gotas de reagente BGL/AGL. A cor surge imediatamente(ou seja, leitura imediata).

AGL INCOLOR AMARELO Adicionar 2 gotas de reagente BGL/AGL.A cor revela-se nos próximos 15 a 30 segundos.

HAP INCOLOR AMARELO Adicionar 2 gotas de reagente HAP.A cor revela-se nos próximos 15 a 30 segundos.

estirpe for simultaneamente Ureia(+) e Trealose(+), predomina aalcalinização (alteração para azul). A alteração de cor para amarelo(acidificação do meio) está associada ao metabolismo da Trealose(estirpes Trealose(+), Ureia(-) ).

7- INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS• Comparar o perfil obtido com os perfis específicos (ver Tabela A); os

valores discrepantes são indicados a cheio.• Se o perfil for diferente, proceder aos testes de PAP e ureia e reportar-

se aos parágrafos correspondentes.

a) Legendas+ : teste positivo- : teste negativo+/- : teste variável+(-) : teste positivo em pelo menos 90% dos casos-(+) : teste negativo em pelo menos 90% dos casos

b) Perfis específicos

TABELA A

(1) Só um teste francamente positivo (amarelo) permite identificarimediatamente Candida tropicalis.No caso de um resultado duvidoso (cor esverdeada) ou de um resultadonegativo, a identidade da estirpe deverá ser confirmada (diagnósticodiferencial com certas estirpes de AGL + Saccharomyces cerevisiae).(2) Por vezes, pode observar-se uma descoloração para amarelo pálido.

56


+/- + Verde ou Amarelo + + +/- Candida albicans

+ - Amarelo (1) -(+)(2) + +(-) Candida tropicalis

+/- - Amarelo - - + Candida glabrata

+/- - Azul - +(-) - Cryptococcus neoformans

c) Outros perfis

1- Amostras PAP+ e Ureia-

amarelo verde ou amarelo

2- Amostras PAP- e Ureia-

incolor verde

57

TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Espécies

+/- + Verde ou Amarelo - +/- +/- Candida parapsilosisCandida lusitaniaeCandida guilliermondiiCandida famata

+/- + Verde ou Amarelo - - +/- Candida zeylanoidesCandida inconspicua

TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Observações Espéciesadicionais

+/- - Verde - - +(-) / Candida pseudotropicalisCandida inconspicuaCandida rugosa

+/- - Verde - - +(-) Aspecto seco Candida kruseidas colónias

+/- - Verde - - +(-) Artrosporos Espécies Geotrichum

+/- - Verde - +/- +(-) / Saccharomyces cerevisae

3- Amostra Ureia+ e HAP+

azul amarelo

Um teste positivo corresponde geralmente a uma coloração amarela nostestes BGL e AGL; poderá observar-se uma coloração laranja ou rosacom Trichosporon cutaneum, e é específica desta espécie.Além disso, as colónias de T. cutaneum apresentam um aspecto filamentoso.

8- DESEMPENHOSDe acordo com os estudos realizados pelo Instituto Pasteur em Paris e peloHospital Broussais em Paris, FONGISCREEN® 4H permite a identificação, emquatro horas, de C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis e C. neoformans,bem como a orientação do diagnóstico de outros fungos.Um estudo clínico retrospectivo foi realizado num painel de 146 estirpes,representando 23 espécies de fungos. FONGISCREEN® 4H permitedetectar 100% das estirpes de C. albicans (18 estirpes testadas),C. glabrata (24 estirpes) e C. neoformans (11 estirpes) e 94% dasestirpes de C. tropicalis (18 estirpes testadas). Para estas 4 estirpes, aespecificidade do teste foi de 100%.As outras espécies de fungos podem ser classificadas em 3 grupos, deacordo com um perfil distintivo, mas não específico das espécies (para99% das estirpes).

58

TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Observações EspéciesAdicionais

cápsula pigment artros-ação -poros

Espécies - Crypto

+ - - -coccus

Espécies +/- +/- Azul +/- +/- + Rhodo

- + - -orula

Tricho-sporon

- - + cutaneum

{

9- LIMITES DO METODO• O teste BGL adquire, por vezes, uma coloração amarela muito clara

que se torna difícil de interpretar, em particular no caso da estirpeC. tropicalis .

• Algumas estirpes raras de C. tropicalis Trealose (-) podem sererradamente identificadas como S. cerevisiae.

10-CONTROLO DA QUALIDADE DE FABRICOTodos os reagentes fabricados são preparados de acordo com o nossoSistema de Qualidade, desde a recepção das matérias primas até àcomercialização final do produto. Cada lote é submetido a um controlode qualidade, sendo lançado no mercado apenas quando emconformidade com os critérios de aceitação predefinidos. Os registosrelativos à produção e controlo de cada lote são arquivados pela Bio-Rad.

11-REFERENCIA BIBLIOGRAFICASVeja a versão francesa.

59

FONGISCREEN® 4H 5650410 TEST

SNABB IDENTIFIERING AV HUVUDSAKLIGAJÄSTSVAMPAR AV MEDICINSK BETYDELSE

IVD

1- KLINISK BETYDELSEMot bakgrund av den ökade förekomsten av svampinfektioner de senasteåren, främst pga. den frekventa användningen av topiska antibakteriellamedel, antibiotika med brett spektrum samt invasiva tekniker (katetrar,parenteral nutrition), ombeds allt oftare mikrobiologiska laboratorier attsöka efter jästsvampar i patologiska prover.En snabb och precis diagnos är ibland nödvändig för att kunna påbörjaen lämplig behandling, särskilt hos patienter med nedsatt immunförsvar.Fongiscreen® 4H, ett system baserat på studien av den enzymatiskaprofilen, tillgodoser det här behovet då systemet inom 4 timmar kanidentifiera Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis,jästsvampar som representerar cirka 90 % av isolaten och Cryptococcusneoformans. Systemet är även ti l l hjälp vid diagnos av andrajästsvampar, vars identifiering slutförs genom att studera sockerintag medAUXACOLOR® 2-kitet (kod 56513).

2- TESTPRINCIPTestet är baserat på användningen av dehydrerade substrat av utfördasvampenzymer, vilket resulterar i en färgändring, spontant eller eftertillsats av ett framkallningsreagens.

TYPER AV TEST SOM ANVÄNDS

• TTZ-mediumDetta medium innehåller trifenyltetrazolium (TTZ). Minskningen av TTZresulterar i bildandet av en mer eller mindre intensiv rosa färg, beroendepå proverna.

• PAP-mediumDetta medium innehåller ett enzymatiskt substrat som möjliggör detektionav aktivitet hos prolin-aminopeptidas.

• Urea + Trehalos-medium (Ur./tre)Detta medium möjliggör detektion av ureasaktivitet, reflekterat avalkalisering av mediet med en färgändring från grönt till blått på pH-indikatorn (bromtymolblått). Metabolismen av trehalos resulterar iförsurning med färgändring av indikatorn från grönt till gult.

• BGL-mediumDetta medium innehåller ett enzymatiskt substrat: p. nitrofenyl-N-acetyl-B-

62

D-galactosaminid, och möjliggör påvisande av galaktosaminidas. Testetär mer sensitivt än germtube-testet för identifiering av C. albicans(varierande sensitivitet enligt olika författare).

• AGL-mediumDetta medium möjliggör detektion av aktivitet hos a-glukosidas.

• HAP-mediumDetta medium möjl iggör detekt ion av aktivi tet hos L -his t idin-aminopeptidas.BGL- och AGL-test utförs i ett surt medium. Avläsning av resultatet kräverframkallning med hjälp av ett alkaliskt reagens (BGL-/AGL-reagens).HAP-testet avläses efter framkallning med HAP-reagens.Testet avläses efter inkubering i 4 timmar i 37 °C utan CO2.

3- TESTETS BESTÅNDSDELARFONGISCREEN® 4H omfattar:• Microplate : 10 separat förpackade mikroplattor med vardera 6

brunnar (diagram för mikroplattan visas på etiketten).• Suspension medium : 10 suspensionsmedel, färdiga att använda (1 ml)• 1 vial med AGL/BGL-reagens (3 ml)• 1 vial med HAP-reagens (2ml)• 10 mikropipetter• 10 självhäftande folierVarje mikroplatta är separat förpackad i en försluten foliebelagdaluminiumpåse med självhäftande folie och torkmedel.

DIAGRAM FÖR MIKROPLATTAN

63

BGL AGL HAP

TTZ PAP Ur./tre

FONGISCREEN® 4H

Patient : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Date : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Försiktighetsåtgärder/hälso- och säkerhetsinstruktioner:Detta test innehåller farliga reagenser.• Vial med 3 ml AGL/BGL-reagens innehållande 4 % NaOH 1N.

R 34: Frätende.S 26-37/39-45: Vid kontakt med ögonen, spola genast medmycket vatten och kontakta läkare. Använd lämpligaskyddshandskar samt skyddsglasögon eller ansiktsskydd. Vidolycksfall, il lamående eller annan påverkan kontaktaomedelbart läkare. Visa om möjligt etiketten.

• Vial med 2 ml HAP-reagens innehållande 66,5 % 95-procentig etanol. R 11: Mycket brandfarligt.S 7-16: Förpackningen förvaras väl tillsluten. Förvaras åtskilt frånantändningskällor - Rökning förbjuden.

4- FÖRVARINGReagenserna är stabila till angivet utgångsdatum på etiketten, om deförvaras vid +2-8°C (gäller även öppnad förpackning).

5- NÖDVÄNDIGT MATERIAL SOM EJ INGÅR• Opacity control 6 Mac Farland: kod 56499• Inkubator, 37°C

6- FÖRFARANDE

A) INOKULERING AV MIKROPLATTAN• Använd en ren och färsk odling på Sabouraud,

Sabouraud kloramfenikol och/eller Gentamicin-medium med en tillräcklig kvantitet av jästsvamparför att erhålla en opacitet större änopacitetskontrollen (Opacity control 6 Mac Farland,kod 56499): i praktiken 4 till 5 öglor om möjligt.

• Viktigt: opaciteten hos suspensionen måste varaminst lika med opacitetkontrollen

• vilket definierar lägsta nivån av grumlighet.• Homogenisera suspensionen med mikropipetten

(eller vortexa om det behövs) genom att suga uppoch tömma vialens innehåll upprepade gånger.

64

. . .. . . .

. . . .. . .

TTZ PAP Ur./tre

BGL AGL HAP

100

µl e

ller 3

dro

ppar

suspensionsmedel

C - Frätende

• Samla upp inokulatet med mikropipetten och fördela 3 droppar (100 µl)i varje brunn på mikroplattan.

• Täck mikroplattan med självhäftande folie och inkubera i 4 timmar i 37 °C.

B) AVLÄSA RESULTATEN• Ta bort den självhäftande folien.• Läs resultaten för TTZ, PAP, Urea/trehalos.• Tillsätt 2 droppar BGL/AGL-reagens i BGL- och AGL-brunnarna.

- BGL-testet avläses omedelbart- hos AGL-testet utvecklas färgen under 15 till 30 sekunder.

• Tillsätt 2 droppar HAP-reagens till HAP-brunnen. Färgen utvecklas under15 till 30 sekunder.

RESULTATTABELL

* Färgändringen till blått (alkalisering av mediet) är associerad medmetabolism av urea (urea(+), trehalos(+) eller (-)-stammar). Om en stam ärbåde urea(+) och trehalos(+) är alkalisering dominerande (ändring tillblått). Färgändringen till gult (försurning av mediet) är associerad medmetabolism av trehalos (trehalos(+), urea(-)-stammar.

65

TEST NEGATIVT POSITIVT FÖRFARANDE

TTZ FÄRGLÖST LJUST ROSA eller DIREKT AVLÄSNING (utan tillsats av reagenser)MÖRK ROSA

beroende på proverna

PAP FÄRGLÖST GULT

UR./TRE GRÖNT BLÅTT (alkalisering) eller GULT (försurning)

beroende på proverna

BGL FÄRGLÖST GULT Tillsätt 2 droppar BGL/AGL-reagens. Färgen visas omedelbart (dvs. läs av omedelbart)

AGL FÄRGLÖST GULT Tillsätt 2 droppar BGL/AGL-reagens.Färgen utvecklas under 15 till 30 sekunder.

HAP FÄRGLÖST GULT Tillsätt 2 droppar HAP-reagens.Färgen utvecklas under 15 till 30 sekunder.

7- UTVÄRDERING AV RESULTATEN• Jämför den erhållna profilen med de specifika profilerna (tabell A). De

utmärkande punkterna anges med fetstil.• Om profilen är annorlunda ska du ta hänsyn till PAP- och ureatesten

och referera till motsvarande avsnitt.

a) Teckenförklaring+ : positivt test- : negativt test+/- : variabelt test+(-) : positivt test i minst 90 % av fallen-(+) : negativt test i minst 90 % av fallen

b) Specifika profiler

TABELL A

(1) Endast ett klart positivt test (gult) identifierar omedelbart Candidatropicalis.Vid ett tveksamt resultat (grönaktig färg) eller ett negativt resultat måstestammens identitet bekräftas (differentialdiagnos med särkilda stammar avAGL + Saccharomyces cerevisiae).(2) En svagt gul missfärgning kan ibland observeras.

66


+/- + Grönt eller gult + + +/- Candida albicans

+ - Gult (1) -(+)(2) + +(-) Candida tropicalis

+/- - Gult - - + Candida glabrata

+/- - Blått - +(-) - Cryptococcus neoformans

c) Övriga profiler

1- PAP+ och ureaprover

gult grönt eller gult

2- PAP- och ureaprover

färglöst grönt

67

TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Prover

+/- + Grönt eller gult - +/- +/- Candida parapsilosisCandida lusitaniaeCandida guilliermondiiCandida famata

+/- + Grönt eller gult - - +/- Candida zeylanoidesCandida inconspicua

TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Övriga Proverobservationer

+/- - Grönt - - +(-) / Candida pseudotropicalisCandida inconspicuaCandida rugosa

+/- - Grönt - - +(-) Kolonier med Candida kruseitorrt utseende

+/- - Grönt - - +(-) Artrosporer Geotrichum species

+/- - Grönt - +/- +(-) / Saccharomycescerevisae

3- Urea+ och HAP+ -prover

blått gult

Ett positivt test motsvarar vanligtvis en gul färg på BGL- och AGL-test. Enorange eller rosa färg kan observeras med Trichosporon cutaneum, ochär specifikt för dessa prover.Vidare har kolonier av T. cutaneum ett trådlikt utseende.

8- TESTRESULTATEnligt studier från Pasteur Institut i Paris och Broussais-sjukhuset i Parismöjliggör FONGISCREEN® 4H identifiering inom fyra timmar avC. albicans, C. glabrata, C. tropicalis och C. neoformans samt enorientering av diagnosen för andra jästsvampar.En retrospektiv klinisk studie har utförts på en panel bestående av 146stammar som representerar 23 prover av jästsvampar. FONGISCREEN®

4H gör det möjligt att upptäcka 100 % av C. albicans (18 testadestammar), C. albicans (24 stammar) och C. albicans (11 stammar) samt94 % av C. albicans (18 testade stammar). För dessa fyra stammar varspecificiteten för testet 100 %.Övriga jästprover kan klassificeras i tre grupper enligt en distinkt, dock ejspecifik, profil hos proverna (för 99 % av stammarna).

68

TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Övriga Proverobservationer

kapsel pigment artros-aering -porer

Crypto- coccus

+ - - -prover

Rhodo+/- +/- Blått +/- +/- + -orula

- + - -prover

Trichosporon

- - + cutaneum

{

9- TESTETS BEGRÄNSNINGAR• BGL-testet antar ibland en mycket ljust gul färg som är svårtolkad,

särskilt för C. tropicalis-stam.• Vissa sällsynta stammar av C. tropicalis-trehalos (-) kan felaktigt

identifieras som S. cerevisiae

10- TILLVERKARENS KVALITETSKONTROLLAlla reagenser t i l lverkas och prepareras i enl ighet med vårtkvalitetssystem, från mottagandet av råmaterial til l den slutligamarknadsföringen av produkten. Varje parti genomgår en kvalitetskontrolloch släpps endast ut på marknaden om det överensstämmer medfördefinierade acceptanskriterier. Handlingar som beskriver produktionoch kontroll av varje enskilt parti sparas hos Bio-Rad.

11- REFERENSERSe den franska versionen.

69


HURTIG IDENTIFIKATION AF PRIMÆRE GÆRARTERAF MEDICINSK VIGTIGHED

IVD

1- KLINISK VÆRDII betragtning af den øgede udbredelse af svampeinfektioner i løbet af deseneste år, grundlæggende på grund af den hyppige brug af aktuelleantibakterielle stoffer, bredspektrede antibiotika og invasive teknikker(katetre, parenteral ernæring), bliver mikrobiologiske laboratorier stadigtoftere bedt om at lede efter gærarter i patologiske prøver.En hurtig og præcis diagnose er ofte nødvendig for at iværksætte denrette behandling, især hos personer med nedsat immunforsvar.Fongiscreen® 4H er et system, der er baseret på undersøgelsen af denenzymatiske profil, og som opfylder dette behov, idet testen kanidenficere følgende inden for 4 timer: Candida albicans, Candidaglabrata, Candida tropicalis, gærarter, der repræsenterer ca. 90 % afisolaterne og Cryptococcus neoformans. Det styrer også diagnosen forandre gærarter, hvis identifikation opnås ved at studere sukkerforbrugetmed AUXACOLOR® 2-sættet (kode 56513).

2- ANALYSEPRINCIPTesten er baseret på brugen af dehydrerede substrater ved hjælp afpræformede svampeenzymer, hvilket resulterer i en farveændring entenspontant eller efter tilsætning af en afsløringsreagens.

KARAKTERISTIKA FOR DE ANVENDTE TESTS

• TTZ-mediumDette medium indeholder Triphenyltetrazolium (TTZ). Reduktionen af TTZ resultereri dannelsen af en mere eller mindre lyserød farve, afhængigt af arterne.

• PAP-mediumDette medium indeholder et enzymatisk substrat, der muliggørkonstatering af prolin aminopeptidase-aktivitet.

• Urea + Trehalose-medium (Ur./tre)Dette medium muliggør konstatering af urea-aktivitet, som afspejles ialkalinisering af mediet med en farveændring fra grøn til blå i pH-indikatoren (Bromothymolblå). Metabolismen i trehalose resulterer isyredannelse med en farveændring af indikatoren fra grøn til gul.

• BGL-mediumDette medium indeholder et enzymatisk substrat: p. Nitrophenyl-N-Acetyl-B-D-Galactosaminid som muliggør påvisning af galactosaminidase.

72

Denne test er mere sensitiv end bakterierørtesten til identifikation afC. albicans (variabel sensitivitet ifølge forskellige forfattere).

• AGL-mediumDet muliggør konstatering af a-glucosidaseaktivitet.

• HAP-mediumDet muliggør konstatering af L-Histidin aminopeptidaseaktivitet.BGL- og AGL-testene udføres i et surt medium. Aflæsning af resultaternekræver afsløring ved hjælp af en alkalisk reagens (BGL/AGL-reagens).HAP-testen aflæses efter afsløring med HAP-reagensen.Testen aflæses efter inkbation i 4 timer ved 37°C uden CO2.

3- SÆTTETS SAMMENSÆTNINGFONGISCREEN® 4H indeholder:• Microplate : 10 enkel tpakkede mikroplader med 6 brønde

(mikropladens diagram er angivet på etiketten).• Suspension medium : 10 brugsklare suspensionsmidler (1 ml)• 1 flaske AGL/BGL-reagens (3 ml)• 1 flaske HAP-reagens (2 ml)• 10 mikropipetter• 10 selvklæbende filmHver mikroplade er pakket for sig i en forseglet aluminiumspose medselvklæbende film og tørremiddel.

MIKROPLADENS DIAGRAM

73

BGL AGL HAP

TTZ PAP Ur./tre

FONGISCREEN® 4H

Patient : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Date : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Forholdsregler for brug/Sundheds- og sikkerhedsmæssige instruktioner:Dette sæt indeholder farlige reagenser.• 3 ml flaske med AGL/BGL-reagens, der indeholder 4% NaOH 1N.

R 34: Ætsningsfare.S 26-37/39-45: Kommer stoffet i øjnene, skylles straksgrundigt med vand og læge kontaktes. Brug egnedebeskyttelseshandsker og briller/ansigtsskærm under arbejdet.Ved ulykkestilfælde eller ved ildebefindende er omgåendelægebehandling nødvendig. Vis etiketten, hvis det er muligt.

• 2 ml flaske HAP-reagens, der indeholder 66,5 % 95° ethanol. R 11: Meget brandfarlig.S 7-16: Emballagen skal holdes tæt lukket. Holdes væk fraantændingskilder – Rygning forbudt.

4- OPBEVARINGReagenserne er stabile indtil udløbsdatoen påetiketten, hvis de opbevares ved +2 – 8°C (også nårde har været åbnet en enkelt gang).

5- KRÆVET MATERIALE, DER IKKEMEDFØLGER• Opacity control 6 Mac Farland: kode 56499• Inkubator ved 37°C

6- PROCEDURE

A) INOKULATION AF MIKROPLADEN• Brug af en ren og frisk kultur på medierne

Sabouraud, Sabouraud Chloramphenicol og/ellerGentamicin med en tilstrækkelig mængde gær til atopnå en opacitet, der ligger over resultatet fraopacitetskontrollen (Opacity control 6 Mac Farland,kode 56499): i praksis 4 – 5 udstrygningsløkker,hvis det er muligt.

• Vigtigt: suspensionens opacitet skal mindst svare tilresultatet i opacitetskontrollen, som definerer detminimale niveau for turbiditeten.

74

. . .. . . .

. . . .. . .

TTZ PAP Ur/Tre.

BGL AGL HAP

100 µ

l elle

r 3 d

råber

suspensionsmidler

C - Ætsende

• Homogenisér suspensionen ved hjælp af mikropipetten (eller bland deni Vortex-mixeren, hvis det er nødvendigt) ved at suge indholdet afflasken op og presse det ud flere gange.

• Indsaml podestoffet med mikropipetten og fordel 3 dråber (100 µl) i deenkelte brønde på mikropladen.

• Tildæk mikropladen med selvklæbende film, og inkubér i 4 timer ved 37°C.

B) AFLÆSNING AF RESULTATERNE• Fjern den selvklæbende film.• Aflæs resultaterne for TTZ, PAP, Urea/trehalose.• Tilsæt 2 dråber BGL/AGL-reagens i BGL- og AGL-brøndene.

- aflæs straks BGL-testen- for AGL-testen udvikles farven i løbet af 15 – 30 sekunder.

• Tilsæt 2 dråber HAP-reagens i HAP-brønden. Farven udvikles i løbet af15 – 30 sekunder.

TABEL OVER RESULTATER

* Når farven ændres til blå (alkalinisering af mediet), er det forbundetmed metabolismen i urea (stammerne Urea (+), Trehalose (+) eller (-)).Hvis en stamme er både Urea (+) og Trehalose (+), er alkaliniseringfremherskende (ændring til blåt). Når farven ændres til gul (syredannelse

75

TESTS NEGATIV POSITIV PROCEDURE

TTZ FARVELØS LYSERØD eller DIREKTE AFLÆSNING PINK, afhængigt (uden tilsætning af reagenser)

af arterne.

PAP FARVELØS GUL

UR./TRE GRØN BLÅ (alkalinisering)eller GUL

(syredannelse),afhængigt af arterne.

BGL FARVELØS GUL Tilsæt 2 dråber BGL/AGL-reagens. Farven vises straks (dvs. aflæses straks).

AGL FARVELØS GUL Tilsæt 2 dråber BGL/AGL-reagens.Farven udvikles i løbet af 15 – 30 sekunder.

HAP FARVELØS GUL Tilsæt 2 dråber HAP-reagens.Farven udvikles i løbet af 15 – 30 sekunder.

i mediet), er det forbundet med metabolismen i Trehalose (stammerneTrehalose (+) og Urea (-)).

7- FORTOLKNING AF RESULTATERNE• Sammenlign den opnåede profil med de specifikke profiler (jf. Tabel A).

De varierende karakteristiska er angivet med fed skrift.• Hvis profilen er forskellig, skal du overveje PAP- og ureatests. Læs de

tilsvarende afsnit.

a) Forklaringer+ : positiv test- : negativ test+/- : variabel test+(-) : positiv test i mindst 90 % af tilfældene-(+) : negativ test i mindst 90 % af tilfældene

b) Specifikke profiler

(1) Kun en udelukkende positiv test (gul) identificerer straks Candidatropicalis.I tilfælde af et tvivlsomt resultat (grønlig farve) eller et negativt resultat,skal stammens identitet bekræftes (forskellige diagnoser for bestemtestammer af AGL + Saccharomyces cerevisiae).(2) Af og til kan der observeres en lysegul affarvning.

76


+/- + Grøn eller gul + + +/- Candida albicans

+ - Gul (1) -(+)(2) + +(-) Candida tropicalis

+/- - Gul - - + Candida glabrata

+/- - Blå - +(-) - Cryptococcus neoformans

c) Andre profiler

1- PAP+ og Urea- arter

gul grøn eller gul

2- PAP- og Urea- arter

farveløs grøn

77

TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Arter

+/- + Grøn eller gul - +/- +/- Candida parapsilosisCandida lusitaniaeCandida guilliermondiiCandida famata

+/- + Grøn eller gul - - +/- Candida zeylanoidesCandida inconspicua

TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Supplerende Arterobservationer

+/- - Grøn - - +(-) / Candida pseudotropicalisCandida inconspicuaCandida rugosa

+/- - Grøn - - +(-) Kolonierne Candida kruseivirker tørre

+/- - Grøn - - +(-) Arthrosporer Geotrichum-arter

+/- - Grøn - +/- +(-) / Saccharomycescerevisae

3- Urea+ og HAP+ -arter

blå gul

En positiv test svarer generelt til en gul farve ved BGL- og AGL-tests. Derkan observeres en orange eller pink farve ved Trichosporon cutaneum,hvilket kun gælder for disse arter.Derudover kan kolonier af T. cutaneum have et filamentøst udseende.

8- YDEEVNEIfølge undersøgelser fra Pasteur Institut i Paris og Broussais-hospitalet iParis muliggør FONGISCREEN® 4H identifikation på fire timer afC. albicans, C. glabrata, C. tropicalis og C. neoformans og orienteringaf diagnosen for andre gærarter.Der blev udført en retrospektiv, klinisk undersøgelse på et panel af 146stammer, som repræsenterede 23 gærarter. FONGISCREEN® 4H gør detmuligt at konstatere 100 % af stammerne for C. albicans (18 testedestammer), C. glabrata (24 stammer) og C. neoformans (11 stammer) og94 % af C. tropicalis-stammerne (18 testede stammer). For disse 4stammer var testens specificitet 100 %.Andre gærarter kan klassificeres i 3 grupper ifølge en særskilt, men ikkespecifik, profil for arterne (for 99 % af stammerne).

78

TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Supplerende Arterobservationer

kapsel pigment arthros-formet -ering -porer

Crypto- coccus

+ - - -arter

Rhodo+/- +/- Blå +/- +/- + -orula

- + - -arter

Tricho-sporon

- - + cutaneum

{

9- PROCEDURENS BEGRÆNSLINGER• BGL-testen får af og til en meget lys gul farve, som er svær at fortolke,

især for C. tropicalis-stammen.• Nogle sjældne stammer for C. tropicalis Trehalose (-) kan blive

identificeret forkert som S. cerevisiae.

10- PRODUCENTENS KVALITETSKONTROLAlle producerede reagenser fremstilles ifølge vores kvalitetssikringssystem,lige fra modtagelsen af råmaterialerne ti l markedsføringen afslutproduktet. Hvert parti gennemgår kvalitetskontrol og markedsføres kun,hvis det opfylder de foruddefinerede kvalitetskriterier. Dokumentationvedrørende produktion og kontrol af hvert parti opbevares inden forvirksomheden.

11- REFERENCERSe den franske version.

79

FONGISCREEN® 4H 56504 10 TESZT

GYORSTESZT PATOGÉN ÉLESZTŐGOMBÁK AZONOSÍTÁSÁRA

1- KLINIKAI JELENTŐSÉG A gombás fertőzések utóbbi években tapasztalható felszaporodására való tekintettel, amely szükségképpen az éppen divatos antibakteriális szerek, széles spektrumú antibiotikumok és invazív technikák (katéterek, parenteralis táplálás) gyakori használatával függ össze, a mikrobiológiai laboratóriumoknak egyre gyakrabban kell élesztőkre vizsgálnia a klinikai mintákat. A gyors és pontos diagnózis olykor éppen azért szükséges, hogy meg lehessen kezdeni a megfelelő kezelést, különösen akkor, ha immunszupprimált betegről van szó. A Fongiscreen® 4H, egy, az enzimprofil vizsgálatára alapuló rendszer eleget tesz ennek a követelménynek, mivel 4 órán belül képes identifikálni a Candida albicans-t, a Candida glabrata-t, a Candida tropicalis-t, olyan élesztőket, amelyek az izolátumok nagyjából 90%-át teszik ki, valamint a Cryptococcus neoformans-t. Egyéb élesztők diagnózisát is elősegíti, amelyek identifikálásához még cukorhasznosítást is kell vizsgálni AUXACOLOR® 2 kittel (kódszám 56513).

2- A TESZT ALAPELVE A teszt dehidrált szubsztrátok prerformált gombaenzimekkel történő bontásán alapul, ami vagy spontán, vagy valamely előhívó anyaggal történő kezelés után színváltozást okoz. A TESZT ÖSSZETEVŐI • TTZ közeg Ez a közeg trifenil-tetrazóliumot (TTZ) tartalmaz. A TTZ redukálása erősebb vagy gyengébb rózsaszínt eredményez, a kérdéses fajtól függően. • PAP közeg Ez a közeg enzim szubsztrátot tartalmaz, s detektálható vele a prolin-aminopeptidáz aktivitás. • Urea + trehalóz közeg (Ur./tre) Ezzel a közeggel detektálható az ureáz aktivitás. A közeg lúgossá válik, s a pH-indikátor (brómtimolkék) zöldből kékbe csap át. A trehalóz átalakulása savasodást okoz, s az indikátor zöldből sárga színűre vált át. • BGL közeg Ez a közeg enzim szubsztrátot tartalmaz, a p-nitrofenil-N-acetil-B-D-galaktózaminidot, amellyel kimutatható a galaktózaminidáz. Ez a teszt érzékenyebb, mint a C.albicans identifikálására használt csíratömlő teszt (amelynek a különböző szerzők szerint változó az érzékenysége). • AGL közeg Ezzel kimutatható az �-glükozidáz aktivitás. • HAP közeg Ezzel kimutatható az L-hisztidin-aminopeptidáz aktivitás. A BGL és az AGL tesztet savas közegben végezzük. Az eredmény leolvasásához lúgos előhívószert kell használnunk (BGL/AGL reagens). A HAP tesztet a HAP reagenssel történő előhívás után olvassuk le. A tesztet 4 órán át tartó, 37°C-os, CO2.-mentes atmoszférában végzett inkubálás után olvassuk le.

3- A KIT ÖSSZETÉTELE A FONGISCREEN® 4H az alábbiakat tartalmazza:

• 10 külön-külön csomagolt, 6-tesztlyukas mikrolemez (a mikrolemez kiosztása a címkén látható). • 10 felhasználásra kész szuszpendáló közeg (1 ml) • 1 fiola AGL/BGL reagens (3 ml) • 1 fiola HAP reagens (2ml) • 10 mikropipetta • 10 öntapadó fólia. Mindegyik mikrolemeznek önálló csomagolása van a hegesztett alufólia csomagoláson belül, saját öntapadó fóliával, és nedvszívóval. A MIKROLEMEZ KIOSZTÁSA

Kezelési és munkavédelmi előírások: A kit veszélyes reagenseket tartalmaz.

• A 3 ml-es, AGL/BGL reagenst tartalmazó fiola 66,5%-ban 95°-os etanolt tartalmaz.

R 34 : Égési sérüléseket okoz. S 26-37/39-45 : Ha szembe kerül, azonnal mossuk ki bő vízzel, és forduljunk

orvoshoz. Viseljünk megfelelő védőkesztyűt, védőszemüveget vagy arcmaszkot. Balesetkor, vagy ha rosszul érezzük magunkat, azonnal forduljunk orvoshoz (ha lehetséges, mutassuk fel az anyag címkéjét). • A 2 ml-es, HAP reagenst tartalmazó fiola 4%-ban 1N nátrium-hidroxidot tartalmaz.

R 11 : Erősen tűzveszélyes. S 7-16 : Tartsuk szorosan lezárva az edényt. Tartsuk távol tüzet okozó veszélyforrásoktól. Tilos a dohányzás.

4- TÁROLÁS A +2 - 8°C között tárolt reagensek a címként feltüntetett szavatossági ideig stabilak (felbontás után is).

5- A VIZSGÁLATHOZ SZÜKSÉGES, DE NEM SZÁLLÍTOTT ESZKÖZÖK • 1 MacFarland egységnek megfelelő denzitású standard: kódszám 56499 • 37°C-os inkubátor

6- HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ A) A MIKROLEMEZ BEOLTÁSA • Egy Sabouraud, chloramphenicolos és/vagy gentamicines Sabouraud

táptalajon tenyésztett tiszta, friss kultúrából vegyünk elegendő mennyiségű élesztőt, hogy a denzitási kontrollnál (kódszám 56499) nagyobb denzitású szuszpenziót kapjunk. A gyakorlatban ez legyen 4 - 5 kacsnyi, ha lehetséges. Fontos: a szuszpenzió denzitása legyen legalább akkora, mint a kontrollé, amely a minimális turbiditást adja meg.

• Egy mikropipettával (vagy vortex keverővel, ha szükséges) homogenizáljuk a szuszpenziót a fiola tartalmának többszöri fölszívásával és visszaengedésével.

• Mikropipettával szívjuk fel az inokulumot, és 3-3 cseppnyit (100 µl) mérjünk be a mikrolemez mindegyik tesztlyukába.

• Öntapadó fóliával fedjük le a mikrolemezt, és inkubáljuk 4 órán át, 37°C-on. B) AZ EREDMÉNYEK LEOLVASÁSA • Vegyük le az öntapadó fóliát. • Olvassuk le a TTZ, PAP, Urea/trehalóz eredményeket. • Adjunk 2 cseppnyi BGL/AGL reagenst a BGL és AGL tesztlyukakhoz.

- a BGL tesztet azonnal olvassuk le, - az AGL teszt esetében 15 -- 30 másodpercet kell várni a szín

kifejlődéséig. • Adjunk 2 cseppnyi HAP reagenst a HAP tesztlyukhoz. A szín 15 -- 30 másodperc múlva

fejlődik ki. EREDMÉNYTÁBLÁZAT TESZTEK NEGATÍV POZITÍV ELJÁRÁS

TTZ SZÍNTELEN HALVÁNY RÓZSASZÍN, vagy

SÖTÉT RÓZSASZÍN, a speciestől függően

PAP SZÍNTELEN SÁRGA

ÚR./TRE ZÖLD KÉK (lúgosodás) vagy SÁRGA

(savasodás), a speciestől függően(*)

KÖZVETLEN LEOLVASÁS (reagens hozzáadása nélkül)

BGL SZÍNTELEN SÁRGA Adjunk hozzá 2 csepp BGL/AGL reagenst. A szín azonnal megjelenik (vagyis azonnal leolvasható)

AGL SZÍNTELEN SÁRGA Adjunk hozzá 2 csepp BGL/AGL reagenst. A szín 15 -- 30 másodperc múlva jelenik meg.

HAP SZÍNTELEN SÁRGA Adjunk hozzá 2 csepp HAP reagenst. A szín 15 -- 30 másodperc múlva jelenik meg.

* Az átcsapás kékbe (a közeg lúgosodása) a karbamid átalakításával függ össze (Urea(+), Trehalóz(+) vagy (-) törzsek); ha egy törzs egyszerre Urea(+) és Trehalóz(+), akkor a lúgosodás dominál (átcsapás kékbe). Az átcsapás sárgába (a közeg savasodása) a trehalóz átalakításával függ össze (Trehalóz(+), Urea(-) törzsek).

7- AZ EREDMÉNYEK KIÉRTÉKELÉSE • Hasonlítsuk össze a kapott profilt a specifikus profilokkal (l. A táblázat); a

megkülönböztető tulajdonságokat félkövér betűkkel szedtük • Ha a profil ettől különbözik, akkor vizsgáljuk meg a PAP és urea tesztet, és nézzük át a

megfelelő bekezdéseket. a) Jelmagyarázat + : pozitív teszt - : negatív teszt +/- : változó teszt +(-) : pozitív teszt az esetek legalább 90%-ában -(+) : negatív teszt az esetek legalább 90%-ában b) Specifikus profilok A TÁBLÁZAT

TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Species +/- + Zöld vagy sárga + + +/- Candida albicans + - Sárga (1) - (+) (2) + (-) Candida tropicalis

+/- - Sárga - - + Candida glabrata +/- - Kék - +(-) - Cryptococcus neoformans

(1) Csak egyértelműen pozitív teszt (határozott sárga szín) identifikálja azonnal a Candida tropicalis-t. Ha kétséges az eredmény (zöldes szín), vagy negatív, akkor a törzs azonosságát konfirmálni kell (differenciáldiagnózis AGL + Saccharomyces cerevisiae egyes törzseivel). (2) Halványsárga elszíneződést is meg lehet olykor figyelni. c) Egyéb profilok 1- PAP+ és Urea- fajok sárga zöld vagy sárga

TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Species

+/- + Zöld vagy sárga - +/- +/- Candida parapsilosis Candida lusitaniae Candida guilliermondii Candida famata

+/- + Zöld vagy sárga - - +/- Candida zeylanoides Candida inconspicua

2- PAP- és Urea- faj színtelen zöld TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP További megfigyelések Species +/- - Zöld - - +(-) / Candida pseudotropicalis

Candida inconspicua Candida rugosa

+/- - Zöld - - +(-) Száraz kinézetű telepek Candida krusei +/- - Zöld - - +(-) Arthrospórák Geotrichum spp +/- - Zöld - +/- +(-) / Saccharomyces

cerevisae 3- Urea+ és HAP+ faj kék sárga TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP További megfigyelések Species

tok pigmentáció arthrospórák

- + - - Cryptococcus spp

+/- +/- +/- +/- + - + - Rhodoorula spp

Kék

- - + Trichosporon cutaneum

A pozitív eredmény általában azt jelenti, hogy sárga színt kapunk a BGL és az AGL tesztben, narancssárga vagy rózsaszín figyelhető meg a Trichosporon cutaneum-nál, és ez specifikus erre a fajra. Ráadásul a T.cutaneum telepeinek fonalas a szerkezetük.

8- MINŐSÉG A párizsi Pasteur Intézet és a Broussais kórház vizsgálatai szerint a FONGISCREEN® 4H-val négy óra alatt identifikálható a C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis és a C. neoformans, és egyéb élesztőkre nézve is tájékoztató adatokat nyerhetünk ennyi idő alatt. Egy 146 törzsből álló, 23 élesztő speciest reprezentáló panelen retrospektív klinikai vizsgálatot végeztek. A FONGISCREEN® 4H-val ki lehet mutatni az összes C. albicans törzset (18 vizsgált törzs), az összes C. glabrata-t (24 törzs), és az összes C. neoformans-t (11 törzs), valamint a C. tropicalis törzsek 94%-át (18 vizsgált törzs). E négy törzsre nézve 100%-os volt a teszt specificitása. A többi élesztőfajt 3 csoportba sorolhatjuk egy jól megkülönböztethető, de nem specifikus species profil szerint (ez a törzsek 99%-ára érvényes).

9- AZ ALKALMAZÁS KORLÁTAI • A BGL teszt olykor nagyon halvány sárga színt produkál, amely nehezen értelmezhető,

különösen a C. tropicalis törzs esetében. • A C. tropicalis egyes, ritkán előforduló törzseinél a Trehalose (-) eredményt tévesen, S.

cerevisiae–ként lehet identifikálni.

10- A GYÁRTÓNÁL FOLYÓ MINŐSÉGELLENŐRZÉS Az összes termékünk a saját minőségellenőrző rendszerünk szerint készült, a nyersanyag átvételétől kezdve a termék forgalmazásáig. Minden egyes gyártási sorozat minőségét ellenőrizzük, és csak akkor hozzuk forgalomba, ha az megfelel az előre felállított kritériumoknak. Minden sorozat gyártási és minőségellenőrzési jegyzőkönyve megtalálható a Bio-Radnál.

11- HIVATKOZÁSOK 1. BH. COOPER, M. SILVA-HUTNER. Yeasts of Medical Importance. Manual of Clinical

Microbiology. Fourth edition. 1985, 526-541 2. A.M. FREYDIERE AND R. GUINET. Rapid methods for identification of the most frequent

clinical yeasts. Rev. Iberoam. Micol. 1997. 14:85-89 3. A.M. FREYDIERE AND R. GUINET. New developments in yeast and yeast-like organisms

identification methods accessible to a clinical microbiology laboratory. (soumis à Clin. Microbiol. Rev.)

4. H. FRICKER-HIDALGO, B. LEBEAU, V. LACASSAGNE, P. KERVROEDAN, P. AMBROISE-THOMAS, AND R. GRILLOT. Identification rapide de Candida albicans, Candida tropicalis, Candida glabrata, Cryptococcus neoformans par Fongiscreen® 4H. Evaluation sur 191 souches de levures. J. Mycol. Med. 1993. 3:103-106.

5. R. GRILLOT. Les mycoses humaines : démarche diagnostique. Elsevier, Paris. 1996. 6. W. KELLEY. Rapid Identification of Candida albicans, abstr. C-337, p.384. Abstr 86th

Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 1986. American Society for Microbiology. Washington D.C.

7. V. LAVARDE, M. COHEN, O. RONIN, P. KERVROEDAN, B. DUPONT. 1991. Abstr.1233, p.105 - 5th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases/Oslo

8. J.P. LEPARGNEUR, A. BOUCAYS. M.D. LINAS, J.P. SEGUELA. Profil enzymatique de levures d’intérêt médical - Essais préliminaires. Bull. Soc. Fr. Mycol. Méd., 1985, XIV, N°2, p. 227-230.

9. M. MALLIE, B. MONTES, J.C. LEBECQ, J.M. BASTIDE. Etude du profil enzymatique de quelques levures. Bull. Soc. Fr. Mycol. Méd., 1989, XVIII, N°1, p. 103-108.

- CE jelzés

(Európai direktíva 98/79/CE az in vitro diagnosztikai célú orvosi eszközökről)

- Csak in vitro diagnosztikai felhasználásra! - Katalógusszám

- Gyártó - Meghatalmazott Képviselet

- Gyártási szám - Szavatossági idő

- Tárolási hőmérsékleti határok - Lásd a használati utasítást

A tesztleírás az Európai Direktíva által előírt egyéb idegen nyelveken a Bio-Rad helyi képviseleteinél megtalálható.

82

- CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices)- Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnosticin vitro)

- Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro)- EG Markierung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika)- Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro)- Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnósticoin vitro)

- CE-märkning (Europa direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter lör in vitro-diagnostik)- CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik)

- For in vitro diagnostic use - Catalogue number- Pour diagnostic in vitro - Référence catalogue- Para diagnóstico in vitro - Número de catálogo- In vitro-Diagnostikum - Bestellnummer- Per uso diagnostico in vitro - Numero di catalogo- Para uso em diagnóstico in vitro - Número de catálogo- In vitro diagnostik - Katalognummer- In vitro diagnose - Katalognummer

- Manufacturer - Authorised Representative- Fabricant - Représentant agréé- Fabricante - Representante autorizado- Hersteller - Bevollmächtigter- Produttore - Distributore autorizzato- Fabricante - Representante Autorizado- Tillverkad av - Auktoriserad representant- Fremstillet af - Autoriseret repræsentant

- Batch code - Expiry date YYYY/MM/DD- Code du lot - Date de peremption AAAA/MM/JJ- Código de lote - Estable hasta AAAA/MM/DD- Chargen-Bezeichnung - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT- Codice del lotto - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG- Código do lote - Data de expiração AAAA/MM/DD- Batch nr. - Utgångsdatum År/Månad/Dag- Batchkoden - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD

- Storage temperature limitation - Consult Instruction for use- Limites de températures de stockage - Consulter le mode d'emploi- Temperatura limite - Consulte la instrucción para el uso- Lagerungstemperatur - Siehe Gebrauchsanweisung- Limiti di temperatura di conservazione - Consultare le istruzioni per uso- Limites de temperatura de armazenamento - Consulte o folheto informativo- Temperaturbegränsning - Se instruktionsanvisning vid användning- Temperaturbegrænsning - Se instruktion før brug

LOT

IVD

i

EC REP

REF

83

The other languages which are required in conformity to the EuropeanDirective can be obtained from your local Bio-Rad agent.

Les autres langues requises par la Directive Européenne sont disponiblesauprès de votre représentant Bio-Rad local.

Los otros idiomas que se requiren para la conformidad de la DirectivaEuropea puede ser obtenida en su oficina local Bio-Rad.

Die anderen Sprachen, die in Übereinstimmung mit der europäischen IVDDirektive benötigt werden, erhalten Sie über Ihre lokale Bio-RadNiederlassung.

Le altre lingue che sono richieste in conformità con le Direttive Europeepossono essere ottenute dal locale agente Bio-Rad.

As restantes línguas, obrigatórias em conformidade com a DirectivaEuropeia, podem ser obtidas através da subsidiária Bio-Rad mais próximade si.

Övriga språk som krävs i enlighet med EG-direktivet kan erhållas från dinlokala Bio-Rad-representant.

De øvrige sprog som kræves i henhold til EU direktiv kan fås vedhenvendelse til den lokale Bio-Rad leverandør.

84

Bio-Rad3, boulevard Raymond Poincaré92430 Marnes-la-Coquette FranceTel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 10/2003Fax.: +33 (0) 1 47 41 91 33 code: 8xxxxxx

rapid identification of the principal yeasts of …techmicrobio.eu/documentation_fabricants/biorad...

Documents