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Randomly amplified polymorphic DNA-PCR法 に よ る

Burkholderia cepaciaの 院 内 分 離 株 の 伝 播 の解 析

1)杏 林大学医学部付属病院中央臨床検査部

2)杏 林大学保健学部臨床微生物学教室

3)杏 林大学医学部付属病院高度救命救急センター

岡崎 充 宏1)森 田 耕 司2)河 内菜穂 子1)荒 木 光 二1)

吉 沢 美枝3)和 田 博 志2)柴 田 幹 良2)渡 辺 登2)

江 上 照 夫1)古 谷 信 滋1)金 森 政 人2)島 崎 修 次3)

内村 英正1)

(平成9年12月8日 受付)

(平成10年3月13日受理)

Key words : Burkholderia cepacia, RAPD-PCR method , intrahospital transmission

要 旨

本 学付 属病 院 にお いて1995年11月 か ら1996年9月 の期 間 中 に,13人 の入 院患者 の臨床材 料 か ら28株 の

Bzarkholderia cepaciaを 検 出 した.本 菌 の28株 中24株(85 .7%)が 喀痰 由来 で あった.こ れ らの うち1996

年1月 か ら2月 の間 に,集 中的 に8人 の患 者 か ら20株 が 分離 され,環 境 か らは,同 時 期 に高度 救命 救急

セ ンタ ー(TCC)に お いて使 用 され てい たネ ブ ライザ ー薬 液 と蛇 管 の出 口部 分 か らそれ ぞれ1株 が分離

された.わ れ われ は環境 由来2株 を含 む30菌 株 につ い てrandomly amplified polymorphic DNA -PCR

(RAPD-PCR)法 によ るDNAの 解 析 お よび各種 同定 キ ッ ト(IDテ ス ト・NF-18 , API20NE,お よびNeg

Combo 4J)に よる生化 学的性 状 を指標 とした表 現型 別 を行 った.

各種 同定 キ ッ トを用 いた本 菌 の表現 型別 に よ る解析 は,菌 株 間 の疫学 的 な関係 を見 いだ せ なか った.

それ に対 し,RAPD-PCR法 に よって型別 した本 菌30菌 株 は,主 要 な5つ のDNAパ タ ー ンに 区別 され

た.そ の中で 集 中的 に分 離 され た期 間中 に,TCCか ら転床 した2名 の患者 由来株 を含 む臨床 材料 由来20

株 のDNAパ ター ンは環境 由来2株 と同一 で あ った.こ れ らの結果 か ら,わ れ われ はTCCを 汚染 源 とす

る小規 模 な院 内伝播 が発 生 した ことを推 測 した.ま た,RAPD-PCRに よるDNAの 解析 は,本 菌 の院内

伝 播 の疫学 的調 査 に有 効 な方 法で あ る こ とが示 され た.

緒 言

Burkholderia cepacia (B. cepacia)は 欧 米 に お

け るcysticfibrosisお よび本 邦 で の免 疫 抑 制 を伴

う患 者 に,重 篤 な 日和 見 感 染 症 を惹 起 す る重 要 な

起 因 菌 の一 つ と して 注 目 さ れ て い る1)～4).また,本

菌 は抗 菌 薬 や 消 毒 薬 の 多 く に耐 性 で あ る こ と か

ら5)～7),汚 染 した 医 療 器 具 や 医 療 ス タ ッ フ の手 を

介 して,大 規模な院内流行を引き起 こすことが知

られている8)～10).こうした院内流行の拡大防止に

は,流 行株の汚染ルー トの早期の解明が必要であ

り,迅 速 にかつ正確 に流行株の型 を特定すること

が重要である.

本菌の表現型別法の一つには,市 販 されている

各種同定キットを用いた生化学的な性状を指標 と

する型別がある.そ の操作性が簡便であるため検

査室に導入 されているが,本 菌の型別の解析性が

劣ることがあ り,疫 学的調査への応用は限界 にな

別刷請求先:(〒181-8611)三 鷹市新川6-20-2

杏林大学医学部付属病院 中央臨床検査部

微生物検査室 岡崎 充宏

感染症学雑誌 第72巻 第7号

RAPDに よ るB. cepaciaの 院 内 分離 株 の 解析 689

りつつある11).近年,本 菌の遺伝子を基礎 とした分

子生物学的手法 による型別法は再現性および解析

性が極めて優れていることか ら,疫 学的調査への

応用 に有効であることが報告されている12)13).

今回,わ れわれは本院において1995年11月 から

1996年9月 の問に分離 された,臨 床材料および環

境 由来 のB. cepaciaをDNA解 析 の一つで ある

randomly amplified polymorphic DNA-PCR

(RAPD-PCR)法 および日常検査に導入 している

各種同定キッ トを用いた表現型別にて解析 し,こ

れ らの型別による本菌の伝播経路などの疫学調査

への有効性について検討 した.

材料 と方法

1. 供試菌株

1995年11月 か ら1996年9月 までの間に,本 院に

入院中の13人 の患者の臨床材料か ら分離 された

B. cepacia28菌 株お よび1996年1月 か ら2月 に

わた り,本 菌が高度救命救急センター(TCC)の

6名 の入院患者から集中的に分離された ときに,

本病棟で使用されていたネブライザーの薬液 〔以

下のものを含有:塩 酸プロムヘキシン(日 本べー

リンガーインゲルハイム),チ ロキサポール(日 本

商事),滅 菌生理食塩水および滅菌蒸留水(共 に大

塚製薬)〕とネブライザーの蛇管から分離 された2

菌株 を,RAPD-PCR法 によるDNAパ ターンか

らの型別および各種同定キットによる表現型別に

供試 した.

2. RAPD-PCR法 に よ るB. cepaciaのDNA

パターンを指標 とした型別

B. cepaciaの 全DNAの 抽出はStaufferら14)の

方法に準 じて行い,SDSで 溶菌後にフェノール,

エーテルで抽 出 した.そ の後 エタノール沈澱 に

よってDNAを 回収 した.今 回使用した2種 類の

プライマーは,わ れわれのグループがAeromonas

sobriaの ヘモリシン遺伝子 を検出する目的で自家

設計 した15).本 プライマーは通常のPCRの 条件

のうち,ア ニー リング温度を42℃ で行った結果,

種々の細菌のRAPD-PCRに 使用できる可能性 を

認 めた16).

なお,プ ライマーの名称 はRPKHM1お よび

RPKHM2に 改称 し,以 下 の通 りRPKHM1:

5'-AAGCCGGTGAGTTATCTGGCC-3'お よ び

RPKHM2:5'ーCGTAACCGGACTGGGGCGT-

GT-3'と して自家設計 した.増 幅 はザイモ リアク

ターII(ATTO,東 京)を 用い,940C5分 間の前熱

変性の後,熱 変性94℃,30秒,ア ニー リング42℃,

30秒,伸 長反応72℃,30秒 を35サ イクル繰返 し,

最終伸長反応 を72℃,5分 間行った.増 幅 した産

物 は10～20%濃 度勾配ポ リアクリルア ミドゲルに

て電気泳動 により分析 し,エ チジウムブロマイ ド

を用いた染色によって検出 した.

3. 各種同定 キットによる型別

同定キッ トは,IDテ ス ト・NF-18「 ニッスイ」

(ID-18,日 水製薬,東 京),API20NE(API,日 本

ビオメ リュー ・バイテック,東 京),お よびNeg

Combo 4J(NC4J,デ イ ド,ア メリカ)を 使用し,

全 ての供試菌株をそれぞれのキットに添付 してあ

る説明書に準拠 し同定 した.各 供試菌株はその同

定結果から,生 化学的性状の表現型を数値分類で

示 し型別された.

成 績

1. 本院においてB. cepaciaが 分離 された月別

の新規患者件数

本院 にお けるB. cepaciaの 分離件数 を調査す

る前の1年 間は,全 ての病棟から分離例を認めな

かった.本 菌は1995年11月 に呼吸器内科病棟の1

人 の患者,1996年1月31日 か ら2月 にか けて,

TCCの 入院患者6人 お よびTCCか ら転床 した

心臓内科 と脳外科病棟の患者1人 ずつから分離 さ

れた.そ の後,6月 までは分離例が無 く,7月 に

3人 および9月 に1人 から分離された(Fig.1).

特に2月 における本菌の分離された新規患者数は

7人(全 体 の約54%)で あり,突 発的に多 くの患

者がこの月に集中していた.ま た,こ の月の7人

の全ての患者に同じネブライザー薬液 を使用して

いたことが分かった.

2. 臨床材料別におけるB. cepaciaの 分離菌株

数

臨床材料毎における本菌の分離菌株数は,喀 痰

か ら28株中24株(85.7%)と 最 も多 く分離された.

残 りの4株 は血液,中 心静脈 カテーテルの先端

チップ,膿,お よび咽頭分泌物か らそれぞれ1株

平成10年7月20日

690 岡崎 充宏 他

Fig. 1 The epidemiology of B. cepacia in the Kyorin University Hospital .

Month of isolation

ず つ 分 離 され た.

3. RAPD-PCR法 のDNAお よ び 各 キ ッ ト に

よ る表 現 型 を 指標 と した 型 別 の解 析

RAPD-PCR法 に よ る供 試 菌 株 のDNAパ タ ー

ン は,2種 類 の プ ラ イ マ ー を 同 時 に使 用 した 結 果,

主 要 な5つ の型 を示 した(Fig.2).さ ら に これ ら

の パ タ ー ン の 中 のR3は,約300bpの 分 子 量 の

DNAの 有 無 に よ り2つ の パ タ ー ン(R3aお よ び

R3b)に 区 別 さ れ た(Table 1) .な お,結 果 に は

示 し て い な い が,1種 類 の み の プ ラ イ マ ー

(RPKHM1)を 使 用 した 時 のDNAパ タ ー ン は,

R1お よびR2の2つ の 型 し か得 られ な か っ た .

これ らの主 要 な5つ のDNAパ タ ー ンか らの 解

析 は,1996年1月 か ら2月 に か け てTCCを 中 心

に 分 離 され た20菌 株 のDNAパ ター ン が ネ ブ ラ イ

ザ ー 由 来 の2菌 株 と一 致 した.ま た,そ の 期 間 以

外 の 菌 株 のDNAパ タ ー ン は,そ れ ら20菌 株 の パ

タ ー ン と異 っ た(Table 1).本 方 法 に よ るDNA

解 析 の再 現 性 は,供 試 菌 株 を繰 返 し3回 行 った 結

果,各 菌 株 のDNAパ タ ー ンが3回 と も一 致 し,安

定 し て い た.

一 方,各 キ ッ トに よ る表 現 型 別 の 解 析 は,ID-18

とAPIで は そ れ ぞ れ1お よび2パ タ ー ン を示 し,

ネ ブ ラ イ ザ ー 由 来 株 のパ ター ン は 臨 床 材 料 由 来 株

と一 致 し た.ま た,NC4Jで は11パ タ ー ン を 示 した

が,患 者Cか ら数 回 に わ た っ て分 離 され た6菌 株

の 中 で4パ タ ー ンが 認 め られ た(Table 1) .

Fig. 2 RAPD profiles of B. cepacia isolates. Lane

1, isolate showed RAPD profile R1 from patient a

(respiratory ward) ; lane 2, isolate showed RAPD

profile R2 from patient b (TCC) ; lane 3, isolate

showed RAPD profile R3 from patient j (thoracic

surgery ward) ; lane 4, isolate showed RAPD

profile R4 from patient i (TCC) ; lane 5, isolate

showed RAPD profile R5 from patient m (respi-

ratory ward) ; lane M,ƒÓ •~174/Hinf I digest for

DNA size marker. Numbers on the left are in

base pairs.

感染症学雑誌 第72巻 第7号

RAPDに よ るB.cepaciaの 院 内分 離 株 の解 析 691

Table 1 Origins and phenotypic and genotypic characteristics of the B. cepacia isolates

考 察

院内流行の疫学的調査は,流 行株の特定や伝播

経路の追跡調査のために,従 来か ら各種同定キッ

トを使用して菌の生化学的表現 を指標 とした型別

が行われている.し か しながら,B.cePaciaの 表

現型別 による解析 は限界に成 りつつあることが報

告 されている11).今回,わ れわれの検査室で導入 し

ている菌の同定キットを使用 した本菌の表現型別

は,ID-18で は1パ ターンのみ,APIで は2パ ター

ンを示 した.こ れらの結果からの解析では,本 院

での調査期間を通 じてほぼ同一型の菌株による院

内での伝播であることが示唆される.し かしなが

ら,そ れぞれの分離菌株の関連性や伝播経路の追

跡 を行うためには,こ れだけのパターンでは限界

で あり,よ り詳細 な鑑別が必要であることが分

かった.

近年,パ ルスフィール ドゲル電気泳動(PFGE)

や リボタイピングを用いた菌のDNAパ ターンか

らの型別は,再 現性および解析性に優れているた

め本菌の疫学的調査に有効であることが報告され

ている12)13).RAPD-PCRも 同様な方法であ り,緑

膿菌や黄色ブドウ球菌の院内流行 における菌の伝

播 の解 析 に本 方 法 が効 果 的 で あった17)～19).

RAPD.PCR法 の操作性 はPFGEに 比 し,簡 単か

っ短時間に結果を得ることがで きるため19),わ れ

われはRAPD-PCRが 検査室 に適 した方法である

ことを考慮し,本 方法 により本菌 を型別すること

を試みた.そ の結果,本 菌30菌 株 は主要な5つ の

平成10年7月20日

692 岡崎 充宏 他

DNAパ ターンに型別 された.そ の中で1996年1

月か ら2月 にかけて,集 中的に分離 された臨床材

料由来20株 のDNAの 型は,TCCの ネブライザー

由来2株 と同一であった.そ れに対 して,そ の期

間以外に分離された菌株8株 のDNAパ ターンと

は異ることが分かった.こ れ らのことは,TCCの

ネブライザー薬液が本菌の最初の汚染源 として,

TCC内 で同一菌株による小規模な伝播が発生 し

た ことを示唆 した.さ らに,そ の5カ 月後に分離

された菌株のDNAの 型は,伝 播 した菌株 とは異

なることか ら,TCCに おける一連の同一菌 株 によ

る伝播 は終息 したことが推測された.ま た,興 味

あることに心臓内科の入院患者cと 脳外科病棟の

入院患者fか らの分離菌株のDNAパ ター ンは,

TCCに 入院中の患者由来株 とネブライザー由来

株のパターンと一致 した.そ こでこれ ら2名 の患

者の病棟の転床を追跡 した ところ,最 初の入院病

棟 はTCCで あ り,そ の入院 中に同 じネブ ライ

ザー薬液 を受けていたことが判明した.以 上のこ

とか ら,今 回のRAPD-PCRよ り得 られた5つ の

DNAパ ターンの解析か ら,患 者間の関連性 を明

らかにし,伝 播 した菌株の追跡調査が可能であっ

た.

今後われわれは本院 において これ らの5つ の

DNAパ ターンを示す以外の菌株が,院 内流行 を

引き起 こさない とも限らないため,さ らにB.ce-

paciaの 菌 株 を収 集 し,RAPD-PCRを 用 い て

DNAパ ターンを決定 して行 きたい.こ うした調

査は本院 においてB.cepaciaが 院内流行 した と

き,流 行拡大防止対策 を迅速に行 うために有効で

あると考 える.

謝辞 稿を終えるに当たり,御協力を頂きました本院中

央臨床検査部微生物検査室の皆様に深謝致します.

文 献1) Beryl JR, David EH : Pneumonia and se-

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RAPDに よ るB.cOPaciaの 院 内 分離 株 の 解析 693

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Analysis of Transmission of Burkholderia cePacia Isolates in an Intrahospitalby Randomly Amplified Polymorphic DNA-PCR Method

Mitsuhiro OKAZAKI1), Koji MORITA2), Naoko KOCHI1), Koji ARAKI1),

Mie YOSHIZAWA3), Hiroshi WADA2), Mikiyoshi SHIBATA2),

Noboru WATANABE2), Teruo EGAMI1), Nobushige FURUYA1),Masato KANAMORI2), Shuji SHIMAZAKI3)

& Hidemasa UCHIMURA1)1)Department of Clinical Laboratories, Kyorin University Hospital

2)Department of Microbiology, Kyorin University School of Health Sciences

3)Trauma and Critical Care Center , Kyorin University Hospital

Strains of Burkholderia cepacia isolated in our hospital from November 1995 to September

1996 were classified with randomly amplified polymorphic DNA-PCR (RAPD-PCR) and conven-

tional biochemical tests (ID test •E NF-18, API2ONE, and Neg Combo 4J kit), and intrahospital

isolates of B. cepacia were analysed. During the period 28 strains from inpatients and 2 from

medical apparatus were isolated. Twenty four of 28 (85.7%) were from sputum. In 1996 from

January to February, 20 strains were detected from 8 inpatients, and two strains were from the

nebulizers at the Trauma and Critical Care Center (TCC). With typing of B. cepacia by conven-

tional methods no epidemiological relations among isolates were found. However, DNA patterns

of original isolates from the nebulizers at TCC by RAPD-PCR were identical with those of

isolates in sputa from patients in other wards who had stayed at TCC, indicating that TCC was

an initial source of transmission and the strain was transmitted with the patients to the wards.

These results suggest that RAPD-PCR method might be an useful tool to analyse an

epidemiological survey for intrahospital transmission of isolate.

平成10年7月20日