实验七

应用 PCR-RFLP 进行 ABO 血型分型

一、实验目的

1. 学习 RFLP 分子标记的特点及应用；2. 学习应用 PCR-RFLP 进行 ABO 血型分型的原理和方

法。

二、实验原理

1. RFLP (restriction fragment length polymorphism)

限制性片段长度多态性

DNA 序列中的某个碱基的差异，使所在位点的 DNA 序列产生（或缺失）某种限制性内切酶的位点。这样，利用该限制性内切酶消化此 DNA 时，便会产生不同长度的限制性片段。因此，在同种生物的不同个体中会出现不同长度的限制性片段类型，即限制性片段多态性。

In a RFLP, alleles may differ in the presence or absence of a cleavage site in the DNA.

In this example, the a allelelacks a restriction site that is present in the DNA of the A allele.

RFLP alleles are codominant（共显性）

2. ABO 血型基因型检测的原理

ABO 血型是人类发现的第一个血型系统 , 作为一种遗传标记，是研究人类种族起源、亲缘关系的一个重要指标，在临床输血、 法医物证检验等领域也有着重要意义。

ABO 血型鉴定可采用血清学和家系调查的方法。

1990 年 Yamamoto 等克隆了糖基转移酶基因 , 使 ABO 血型基因型的检测成为可能。

人类 ABO 血型的遗传由单基因（ ABO gene ）控制，该基因位于 9 号染色体长臂 (9q34) ，包含 7 个外显子，大小 18kb 以上。

由三个等位基因组成 :

i, IA, 和 IB.

• H 抗原是 ABO 血型抗原产生的一个必需前体。• A allele 编码一个糖基转移酶 glycosyltransferase ，能将 α-N- 乙酰

半乳糖胺 Acetylgalactosamine 结合到 H 抗原的 D-galactose （半乳糖） 末端，从而产生 A 抗原 .

• B allele 编 码 一 个 糖 基 转 移 酶 glycosyltransferase ， 能 将 α-D-

galactose 连接到 H 抗原的 D-galactose （半乳糖） 末端，从而产生 B 抗原。

• O allele 的 exon 6 由于包含一个缺失，使酶丧失活性。 O allele 与 A allele 的差异在于单一核苷酸的缺失— 261 位置的鸟嘌呤缺失 ，引起移码突变 ，使翻译产生的酶失活 ， H 抗原不变，所以在红细胞膜上没有Ａ，Ｂ 抗原的产生。

应用 PCR - RF LP 技术进行 ABO 基因分型

利用 2 对特异引物扩增 2 个不同的 DNA 片段

引物 1 5′-TGGGCGTGGAG ATCCTG AC-3′

引物 2 5′-GCACCGACCCCCCG AAGA-3′

引物 3 5′-G ACCGCACGCCTCTCTCCA-3′

引物 4 5′-ACCTTTCCCATCT ACCCTCT-3′

利用引物 1 和 2 ， 基因 A 、 B 或 O 都可以扩增出 165bp 的片

段；

只有 B 基因的扩增产物中包含限制性内切酶 Alu I 的酶切位点。

用限制性内切酶 Alu I 消化扩增产物，可切成不同大小片段，即

165bp ， 119bp 和 46bp ，（ 46bp 在琼脂糖凝胶电泳中观察不

到）。

119bp 片段为纯合的 BB 基因型 , 165bp /119bp 混合片段为含

B 基因的 AB 、 BO 基因型 , 165bp 片段为不含 B 基因的

AA 、 AO 或 OO 基因型。。

利用引物 3 和引物 4 扩增的片段为 296 (295) bp 。

用 Kpn I(5’- GGT AC↓C - 3’ ) 消化此扩增片段，可酶切成不同长度 DNA 片段 , 即 296bp 、 246bp 和 49bp 的 DNA 片段 (49bp

的 DNA 片段太小 , 琼脂糖凝胶电泳结果无法观察到 ) 。

296bp 片段为不含 O 基因的 AA 、 AB 或 BB 基因型 , 296bp

/246bp 混合片段为含 O 基因的 AO 、 BO 基因型 , 246bp 片段为纯合的 OO 基因型。

基因1 ， 2 引物产物

Alu I

3,4 引物产物 kpn I

A 165 296

B 119+46 296

O 165 246+49

三、实验材料

1 ．实验材料：口腔黏膜细胞、带毛囊的头发

2 ．实验试剂和用品：

DNA 释放液： 10 mg/ml 蛋白酶 K

PCR 反应液：包括特异性引物、 dNTP 混合液、 10×PCR 反应缓

冲液、 Taq 酶、无菌水

3. 其它用具：

牙签， 1.5 ml 离心管， 0.2 ml PCR 反应管，吸头，移液枪

四、实验步骤

1. 基因组模板的制备

1 ）以毛囊细胞为材料：取带毛囊的头发 3根，将带毛囊的一端插入DNA提取液中，发梢部分剪去 , 盖上 Eppendorf 管盖。

2 ）加入 60 µl DNA 释放液，头发插入后，涡旋片刻，离心片刻。

3 ）将样品放入 55℃ 水浴中处理 30 分钟，中间取出 Vortex 一次。

3 ） 30 分钟后取出 Vortex ，离心片刻。

4 ） 94 ℃ 处理 10 分钟。

2. PCR 扩增

总体积 20l

PCR 反应液 15 l

DNA模板 5 l

PCR 反应液中已包含 PCR 反应缓冲液、 dNTP 、 Taq 酶、引物。 同一个模板做 2 组 PCR 反应，分别以引物 1 ， 2 或引物 3 ， 4 。

PCR 扩增程序

预变性： 94 5min℃

变性： 94 30s ℃

退火： 57 ℃ （引物 1 ， 2 ） 50s

或 52 ℃ （引物 3 ， 4 ） 50s

延伸： 72 30s ℃ 重复 35cycles

72 15min℃

3. PCR 产物的酶切

引物 P1 /P 2 扩增的 DNA 特异片段用限制性内切酶 Alu I 消化，引物 P 3 /P 4 的扩增产物用 Kpn I 酶切 。

反应体系： 15 μl 37℃ 酶切 过夜 PCR 产物 5 μl

10 ×buffer 1.5 μl

限制酶 0.5 μl

H2O 8 μl

4. 酶切产物的电泳及 ABO 基因型分析

将酶切产物在 3% 的琼脂糖凝胶中电泳 ,经 EB 染色在 UV 凝胶成像系统中观察结果并拍照相。

　M 为 100bp DNA Ladder; 1 ～ 6 为引物 3 和引物 4 扩增的特异片段 ;7 ～ 12 为引物 1 和引物 2 扩增的片段。

ABO 基因 PCR 扩增产物的电泳结果

AA AO AB

BB BO OO

作业

1.根据电泳结果，推测自己的血型及基因型。

2.根据全班的结果，统计基因频率及基因型频率。