purificaciÓn analÍtica y preparativa de las proteÍnas

PURIFICACIÓN ANALÍTICA Y PREPARATIVA

DE LAS PROTEÍNAS HIDROFÓBICAS

DEL SURFACTANTE PULMONAR

Tesis de Grado de la Licenciatura en Bioquímica

Bach. Rosina Toledo Gallo

Tutores:

Dr. Leonel Malacrida

Dr. Arturo Briva

MONTEVIDEO, FEBRERO 2015

Tesis de Licenciatura en Bioquímica – Rosina Toledo Gallo PÁGINA 1

A la memoria de Armando Gallo, de quien aprendí que vale la pena el esfuerzo y sacrificio por

conquistar la verdadera vocación.


CONTENIDO

ABREVIATURAS__________________________________________________________________ 3

RESUMEN_______________________________________________________________________6

1 - FUNDAMENTOS Y ANTECEDENTES________________________________________________ 7

1.1 Características generales del surfactante pulmonar: _________________________________________ 7

1.2 Composición del surfactante pulmonar: ___________________________________________________ 9

Fracción lipídica: _______________________________________________________________________ 9

Fracción proteica: _____________________________________________________________________ 13

1.3 Formación y almacenamiento del surfactante pulmonar: ____________________________________ 19

Estructuras del SP y procesamiento de sus proteínas hidrofóbicas: _____________________________ 19

Reciclaje y reservorio de SP: _____________________________________________________________ 23

Secreción del SP: ______________________________________________________________________ 24

1.4 Funciones de las proteínas hidrofóbicas: _________________________________________________ 26

1.5 Importancia biológica: ________________________________________________________________ 27

1.6 Antecedentes: ______________________________________________________________________ 31

2- OBJETIVOS ___________________________________________________________________32

2.1Objetivos específicos__________________________________________________________________ 32

3 - MATERIALES Y MÉTODOS_______________________________________________________33

4 – RESULTADOS ________________________________________________________________39

4.1 Purificación de las proteínas hidrofóbicas del surfactante y del tejido pulmonar_______________39

4.2 Purificación analítica y preparativa de SP-B y SP-C________________________________________46

5- DISCUSIÓN___________________________________________________________________60

6 – CONCLUSIONES______________________________________________________________68

7 – PERSPECTIVAS A FUTURO______________________________________________________70

8 – AGRADECIMIENTOS________________________________________________________________71

9 - ANEXO______________________________________________________________________72

10 – BIBLIOGRAFÍA_______________________________________________________________74


ABREVIATURAS

ABC-A3: Proteína transportadora tipo cassette A3.

ACN: Acetonitrilo

AMPc: Adenosín monofosfato cíclico

Arg: Arginina

-ME: -mercaptoetanol

CBs: Cuerpos compuestos

CD: Dicroismo Cirlcular

CHAPS: 3-[(3-colamidopropilo) dimetilamonio]-1-propano

CRD: Dominio de reconocimiento a carbohidratos

Cys: Cisteína

DOPC: Dioleoilfosfatidilcolina

DPPC: Dipalmitoilfosfatidilcolina

EPOC: Enfermedad obstructiva crónica

FTIR: Transformada de Fourier infrarojo

Glu: Glutamato

Ile: Isoleucina

INF-: Interferón gamma

l-bis-PA: ácido bifosfatídico…. corroborar

L: Fase líquido-cristalino

L: Fase gel


Le: Fase líquido-expandida

Lo: Fase líquido-ordenada

LB: cuerpos lamelares

LBA: lavado bronqueoalveolar

Leu: Leucina

Lys: Lisina

lyso-PC: lisofosfatidilcolina

MPM: Marcador de peso molecular

MVB: cuerpos multivesiculares

N/m: Newton/metro – unidad de tensión superficial

NMR: Resonancia magnética nuclear

PAP: Proteinosis alveolar pulmonar

PC: Fosfatidilcolina

PE: fosfatidiletanolamida

PG: Fosfatidilglicerol

PI: Fosfatidilinositol

PKA: Proteína quinasa A

PKC: Proteína quinasa C

PL: Fosfolípidos

PMT: Fotomultiplicador

POPC: Palmitoleoilfosfatidilcolina

POPS: Palmitoleoilfosfatidilserina

PPPC: palmitoleoil-palmitoil-fosfatidilcolina

PS: fosfatidilserina

RE: Retículo endoplasmático


SDR: Síndrome de distrés respiratorio

SDRA: Síndrome de distrés respiratorio agudo

SDRI: Síndrome de distrés respiratorio en infantes

SDS: Dodecil-sulfóxido sódico

SM: esfingomielina

SP: Surfactante pulmonar

SP-A: Proteína del surfactante A

SP-B: Proteína del surfactante B

SP-BSTD: Proteína del surfactante B purificada

SP-C: Proteína del surfactante C

SP-CSTD: Proteína del surfactante C purificada

SP-D: Proteína del surfactante D

Tm: Temperatura de transición

TM: Mielina tubular

Trp: Triptófano

Val: Valina


RESUMEN El surfactante pulmonar (SP) es una compleja mezcla de lípidos y proteínas que recubre el

epitelio alveolar evitando su colapso durante el ciclo respiratorio. Esta mezcla logra disminuir la

tensión superficial a valores cercanos a 0 N/m al final de la espiración. Para esto además es

imprescindible la presencia de un grupo de proteínas hidrofóbicas denominadas SP-B y SP-C.

Además, el surfactante cumple funciones relativas a la inmunidad innata, para lo cual es necesario

la presencia de proteínas hidrofílicas denominadas SP-A y SP-D.

SP-B y SP-C son fundamentales para la dinámica del surfactante, ya que colaboran con su

reciclaje y el desempeño de sus funciones biofísicas. Se ha visto que la ausencia de SP-B genera el

síndrome del distrés respiratorio en recién nacidos. Por otra parte, se ha observado que la

ausencia de SP-C se vincula con el desarrollo de múltiples patologías respiratorias.

En nuestro país aproximadamente un 10% de los niños nacen prematuros, por lo cual necesitan

de terapia de rescate con surfactante exógeno para poder sobrevivir. Pese a varias décadas de

investigación en el diseño de mejores surfactante pulmonares exógenos, todavía no se ha logrado

resolver completamente el problema. Una de las estrategias para el diseño de surfactante

pulmonar exógeno ha sido la extracción de material de origen animal y el enriquecimiento con las

proteínas hidrofóbicas del SP. Desafortunadamente los métodos de purificación y separación de

estas proteínas en la actualidad se encuentran limitados por la incapacidad de separar

preparativamente a SP-B de SP-C. Por este motivo y dada la gran importancia de estas proteínas

en la función del surfactante pulmonar, resulta imprescindible contar con un método

cromatográfico para la separación de las mismas a escala analítica y preparativa.


1. FUNDAMENTOS Y ANTECEDENTES

1.1 Características generales del surfactante pulmonar:

La respiración es el proceso fisiológico por el cual se produce el intercambio gaseoso en el

epitelio alveolar entre O2 proveniente de la atmósfera y CO2 producto del metabolismo celular. En

los mamíferos, este proceso involucra las vías aéreas superiores e inferiores, las cuales derivan en

los pulmones que es donde efectivamente tiene lugar el intercambio gaseoso. El aire ingresa al

organismo a través de las vías aéreas superiores, las que incluyen las fosas nasales, faringe y

laringe; y continúa su recorrido por la tráquea que se bifurca a nivel pulmonar para formar los

bronquios. Éstos se ramifican múltiples veces generando los bronquiolos que finalizan en

estructuras de tamaño micrométrico denominadas alvéolos, los cuales están rodeados de

capilares. En este espacio se produce el contacto íntimo entre el aire que llega al espacio alveolar y

el CO2 que llega a la circulación pulmonar, que permite, a partir de la diferencia en las presiones

parciales de los gases, el intercambio gaseoso. El alvéolo posee mayoritariamente un epitelio

mono-estratificado plano que está compuesto fundamentalmente por neumocitos de tipo I, pero

además posee neumocitos de tipo II (células cuboides y polarizadas) y macrófagos. El lumen de

estas estructuras está revestido por una fina capa de agua denominada hipofase o fluido epitelial,

donde se encuentra el surfactante pulmonar para finalmente adsorberse en la interfase

aire/liquido y llevar adelante su función (figura 1)

El surfactante pulmonar (SP) es una mezcla compleja de lípidos y proteínas que se sintetiza en

neumocitos de tipo II, donde además de ser producido es almacenado en estructuras subcelulares

que se conocen como cuerpos lamelares (LBs). Se han descripto a los LBs como estructuras multi-

membranosas con enzimas lisosomales que mantienen un pH ácido (menor a 6.10), y cuyo fin es el

procesamiento y almacenamiento del SP en forma de bicapas concéntricas.1


Figura 1: Ubicación anátomo-fisiológica del surfactante pulmonar. CL:cuerpos lamelares. MT: mielina tubular.

El SP es secretado a la hipofase en forma de LBs, donde sufre transformaciones que le permiten

posteriormente adsorberse a la interfase aire/agua como una monocapa. Dada su capacidad

tensoactiva el SP logra evitar el colapso alveolar durante el ciclo inspiración-espiración al disminuir

la tensión superficial a valores cercanos a 0 mN/m. Además de los componentes lipídicos otras dos

proteínas presentes en el surfactante pulmonar son imprescindibles para llevar adelante dicha

función, estas son denominadas SP-B y SP-C. El surfactante pulmonar desempeña también un rol

inmunológico al intervenir en la respuesta innata frente a agentes patógenos. Es capaz de

mantener la permeabilidad epitelial en las pequeñas vías aéreas y potencia el movimiento ciliar en

la mucosa para remover los contaminantes indeseados.2 Este rol inmunitario, esencial para

mantener la esterilidad del ambiente, es llevado a cabo por las proteínas SP-A y SP-D. Si bien estas

proteínas no activan al sistema del complemento ante la presencia de agentes patógenos, si


actúan como opsoninas al reconocer patrones moleculares de los patógenos, lo que estimula

indirectamente la fagocitosis mediante la regulación de receptores fagocíticos. Al mismo tiempo,

SP-A y SP-D logran la agregación de patógenos que en ciertos casos favorece su eliminación.3 Se ha

visto que ratones knock-out para el gen de las proteínas SP-A y SP-D son más susceptibles a

infecciones respiratorias.4 Por otra parte, se ha observado que ratones knock-out para la proteína

SP-B, presentan un fenotipo letal, mientras que la ausencia de SP-C se relaciona con un aumento

de patologías respiratorias.5 Estos antecedentes evidencian la importancia de la presencia de las

proteínas asociadas del SP, que junto con los lípidos logran cumplir con todas las funciones del SP

de manera eficiente.

1.2 Composición del surfactante pulmonar:

Fracción lipídica:

La composición lipídica del SP varía según la especie, pero pese a esto su relación lípido/proteína

se mantiene en proporciones 9:1, para la mayoría de las especies de mamíferos. En mamíferos la

porción lipídica está compuesta fundamentalmente por fosfatidilcolina (PC) (80% de los

fosfolípidos totales), de la cual el componente mayoritario es la dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC,

60% aproximadamente), responsable mayoritaria de las funciones tensoactivas del SP. En el caso

de mamíferos heterotermos que viven en bajas temperaturas se ha visto que los niveles de DPPC

disminuyen para darle lugar a palmitoleoilpalmitoilfosfatidilcolina (PPPC) 6.

La fracción lipídica posee además fosfatidilglicerol (PG, 10%) y en menor proporción

fosfatidilinositol (PI, 2%). El porcentaje relativo de ambos fosfolípidos (PL) varía

considerablemente según las especies y estadios del crecimiento para los mamíferos; pero aún se

desconocen los efectos de dichas variaciones en la funcionalidad del surfactante 7,8,9. El SP también

presenta en baja concentración fosfatidiletanolamina (PE), ácido liso-bis-fosfatídico (l-bis-PA),

esfingomielina (SM), fosfatidilserina (PS), liso-fosfatidilcolina (liso-PC), cardiolipina y

colesterol.2,10,11 La cardiolipina cumple un rol en la homeostasis pulmonar, y si bien se encuentra

en valores muy bajos en el SP sus niveles aumentan en el lavado bronqueoalveolar (LBA) de


pacientes con neumonía, por lo que se puede utilizar como señal de daño extracelular.11 El

colesterol es fundamental para la dinámica del las membranas del surfactante, ya que a la

concentración en que se encuentra en el SP (20% molar de PL totales) permite la segregación de

fases líquida-ordenada (Lo) y líquida-desordenada (Ld), lo que influye en la movilidad y dinámica de

los fosfolípidos que la conforman.12 Los niveles de colesterol y PL varían con la dieta y cambios

ambientales, lo cual se cree se asocia a la adaptabilidad del SP en diversas circunstancias.13

Los fosfolípidos son sintetizados de novo por los neumocitos tipo II en el retículo endoplasmático

(RE), donde mediante la reacción de Kennedy se forma la PC. Parte de la misma dará lugar a la

formación de liso-PC y de DPPC. Ésta última también puede ser sintetizada mediante la acción

enzimática de fosfolipasa A2, peroxirredoxina 6 y lisofosfatidilcolina aciltransferasa.11,14 El PG es la

tercer especie lipídica mayoritaria del SP, y se sintetiza a partir de ácido fosfatídico por la acción de

la glicerofosfato fosfatidiltransferasa y la fosfatidilglicerolfosfatasa. El PG cumple funciones

relacionadas a la adsorción del SP en la superficie alveolar, pero además colabora en la regulación

de la respuesta inmune innata y ante las infecciones virales.15,16 Respecto al PI se cree que

participa en la estabilización de la monocapa del surfactante.11

Asociado a los niveles de saturación/insaturación de la fosfatidilcolina y otros fosfolípidos

menores, así como la presencia de colesterol, las membranas del SP en forma de

bicapa/monocapa adquieren la organización supramolecular en diferentes arreglos o fases en

equilibrio termodinámico (figura 2). Es importante denotar que a bajas temperaturas

(temperaturas por debajo de la temperatura de transición de fase, Tm, melting temperature) y en

ausencia de colesterol, las membranas se encuentran en una fase gel (L). Para el caso del SP, dado

el porcentaje de colesterol, las membranas se encuentran en el estado líquido-ordenado Lo, en la

cual los fosfolípidos se encuentran con restricción difusional pero no rotacional (figura 2-a). Para

temperaturas por encima de la Tm se produce un cambio de fase, donde la membrana logra

alcanzar nuevos grados de libertad lo que se conoce como una fase líquido-cristalina (L) o

también conocida como Ld. En ésta fase los lípidos poseen mayor capacidad difusional y rotacional

que en la fase anterior (Lo).17


Figura 2: a) esquema de la difusión lipídica en membranas biológicas. b) Estados físicos. Tm: Temperatura de melting.

Imágenes modificadas de Eeman et al.18

Las membranas no solo pueden sufrir transiciones de fase por temperatura, sino que además

puede darse por compresión, fuerza iónica, pH y actividad de agua. Para el caso de las monocapas

del SP, es posible identificar la transición de fases por el grado de compresión que tienen los

lípidos que la componen. Remedando las fases de la materia, cuando en una interfase aire/agua se

depositan lípidos a una concentración tal que no pueden interaccionar entre ellos, estos no

pueden responder con ningún cambio en la tensión por la compresión. A este estado se lo conoce

como fase gas. Continuando con la compresión, luego de esta etapa, se logra una respuesta en la

tensión donde los lípidos mantienen un estado de baja compactación sin limitaciones en la

movilidad difusional y rotacional, esta fase se denomina líquido-expandida (Le) (esta fase es

análoga a la fase L en bicapas). Posteriormente, con el aumento en la compresión se alcanza un

estado mucho más compacto que restringe la capacidad difusional entre las moléculas del PL que

la componen, lo que se conoce como fase líquido-condensada (Lc, análoga a la fase L en las

bicapas). Durante la transición Le/Lc en el SP se han identificados dominios de membrana con

características similares a Lo/Ld, lo que sucede a una compresión de 30 mN/m. Esta coexistencia de

fases (figura 3) se genera debido a la composición lipídica del SP, y fundamentalmente se piensa


que es debido a la proporción entre fosfolípidos saturados e insaturados y el nivel de

colesterol.19,20,21

Como se mencionó anteriormente, la presencia de colesterol modula la fluidez de la membrana;

y dependiendo de los niveles y la saturación de los PL es posible generar un nuevo estado líquido-

ordenado (Lo). Esta fase tiene características de viscosidad e hidratación particulares y que se

asocian con la capacidad del colesterol de interaccionar con las cadenas hidrocarbonadas de los

fosfolípidos.6

Figura 3: Arreglos supramoleculares de las membranas del SP propuestos y su interacción con las proteínas específicas

del surfactante. CRD: Dominio de reconocimiento de carbohidratos. (Extraído de Pérez-Gil)6


Fracción proteica:

La fracción proteica constituye entre el 8-10% del peso en el surfactante pulmonar, y está

compuesta por cuatro proteínas conocidas como SP-A, SP-B, SP-C y SP-D. La SP-A es la proteína

más abundante del SP, tiene carácter hidrofílico y pertenece a la familia de las lectinas

dependientes de Calcio (colectinas).7 Esta glicoproteína, es sintetizada en los neumocitos tipo II y

en las células Clara bronquioalveolares, y se secreta en el último trimestre de gestación.22 Se

produce inicialmente como una preproteína de 248 residuos aminoacídicos y 28 kDa

aproximadamente, aunque su tamaño y carga varían según la especie. Esta proteína es blanco de

numerosas modificaciones co- y post-traduccionales, dentro de las cuales se incluyen la

glicosilación, carboxilación, sulfatación, hidroxilación y acetilación.23 La secreción de esta proteína

se da de forma constitutiva, y se encuentra altamente regulada por glucocorticoides, AMPc,

insulina e INF- entre otros24; pero también puede ser secretada a través de los LBs una vez que

éstos fueron endocitados con el fin de ser reciclados.25

SP-A posee cuatro dominios estructurales: un segmento corto N-terminal de 20 residuos

aminoacídicos, un dominio tipo colágeno rico en residuos de Prolina, una región “cuello”, y un

dominio de reconocimiento de carbohidratos CRD.26 Muchos de los residuos de Prolina sufren

hidroxilaciones, lo que permite que esta proteína forme enlaces disulfuro y se asocie de forma

estable como trímero. Ésta y otras modificaciones le permiten obtener su estructura final de

octadecámero formado por seis trímeros de aproximadamente 700kDa (figura 4, a y b). 26,24 SP-A

cumple un rol esencial en la defensa innata, ya que participa en la eliminación de

microorganismos, y asimismo tiene efectos pro y antiinflamatorios.27,28 Además de sus funciones

como colectina esta proteína es capaz de potenciar la adsorción lipídica que llevan a cabo las

proteínas hidrofóbicas, proteger la monocapa superficial epitelial de la inhibición por proteínas,

regular la recaptación y secreción del surfactante por los neumocitos de tipo II, y contribuir en el

desempaquetamiento de los LB a través de la conversión de las estos en la mielina tubular

(TM).6,25,29


Figura 4: Estructura de las proteínas hidrofílicas del SP. a) Dominios presentes en las proteínas pertenecientes a la

familia de las colectinas. b) Estructura multimérica de SP-A, en la que se muestra la unión de seis trímeros mediante el

dominio rico en colágeno. c) Estructura multimérica de SP-D. 4 subunidades de SP-D se unen mediante los dominios N-

terminal para formar su estructura final de dodecámero (Modificada de Haczku et al)30

SP-D es una proteína hidrofílica de 43 kDa, sintetizada constitutivamente por los neumocitos tipo

II y por las células Clara bronquioalveolares. En ciertas especies es sintetizada también por células

epiteliales y de la submucosa de las glándulas asociadas a la tráquea y a los bronquios.31 Al igual

que SP-A pertenece a la familia de las colectinas, y posee la misma estructura supramolacular con

los siguientes dominios: uno de tipo colágeno rico en residuos de Prolina, un dominio corto N-

terminal, uno conector o “cuello”, y un dominio globular de unión a carbohidratos dependiente de

calcio. El dominio CRD le permite unirse a diversos ligandos y cumplir así con su un rol en la

inmunidad innata frente a agentes patógenos. Los ligandos a los que se une preferentemente son

azúcares complejos que contienen glucosa, inositol y manosa entre otros; y el hecho de que

reconozca inositol en particular le permite a esta proteína interaccionar con lípidos, a través del

reconocimiento de PI presente en el SP.32

Se presenta en forma de dodecámero (con cuatro unidades triméricas) (figura 4, c), pero se ha

visto que la proporción de los oligómeros varía según la especie. En especial en el humano, SP-D se

ha encontrado como un tetrámero con las subunidades vinculadas mediante las regiones N-

terminales.31,32


Esta proteína es capaz de detectar virus (como influenza A), bacterias (Gram negativas y

positivas) y hongos, lo cual es crucial para promover su eliminación sin activar la respuesta inmune

secundaria.4,31 En las células que han sido infectadas potencia la fagocitosis y la eliminación de los

agentes patógenos, y al mismo tiempo potencia la respuesta oxidativa a la unión microbicida.32

Esta proteína tiene grandes similitudes con SP-A, no solamente en su estructura sino también en

sus funciones. Sin embargo tiene características particulares que permiten diferenciarlas. Ambas

proteínas hidrofílicas son capaces de formar estructuras tubulares en el surfactante pulmonar,

pero las formadas por SP-D son más largas y homogéneas que la mielina tubular formada por SP-A.

Otra diferencia clave es la posibilidad de SP-D en interaccionar con PI, dado que este PL se

encuentra enriqueciendo los surfactantes pulmonares de mamíferos. Esta interacción hace posible

la formación de un segundo tipo de estructuras tubulares que se conocen como arreglos

tubulares, para cuya formación es fundamental la presencia de SP-B.33

SP-B es sintetizada por los neumocitos tipo II así como por las células Clara en el segundo

trimestre de gestación en el humano. Se produce inicialmente como una pre-pro-proteína de 381

aminoácidos y su tamaño es variable según la especie; pero pese a esto se ha visto que

aproximadamente el 67% de los residuos aminoacídicos son conservados.34 Los primeros 23

aminoácidos del extremo N-terminal corresponden a una secuencia señal que media la

translocación de SP-B al lumen del RE. La escisión co-traduccional del péptido señal genera una

pro-proteína con una región N-terminal (residuos 24-200), una porción madura (201-279) y una

región C-terminal (280-381) que luego es sometida a sucesivas glicosilaciones.24,35 El

procesamiento de la pro-SP-B se da en el compartimiento distal del aparato de Golgi, donde

también ocurre el procesamiento de los cuerpos multivesiculares (MVBs) que madurarán a LBs.36

La proteína SP-B en su forma madura está compuesta por 79 aminoácidos con un alto contenido

de aminoácidos hidrofóbicos que permiten clasificarla dentro de la familia de las saponinas, y los

aminoácidos cargados que posee le otorgan una carga neta positiva (+5).37 El elevado número de

residuos hidrofóbicos le otorgan a la SP-B la posibilidad de estar asociada a fosfolípidos en el

surfactante. Posee tres puentes disulfuro intramoleculares invariables en las distintas especies y

uno intermolecular en la Cys48, el cual hace que esta proteína pueda formar homodímero con una

masa aproximada de 17.4 kDa. Si bien es su forma más común, se ha encontrado también en

forma de trímero.38,35,39,40 Varios estudios de dicroísmo circular, infrarrojo y resonancia magnética


nuclear han revelado que mayoritariamente SP-B posee estructura de -hélice, y que la

5proporción de estas estructuras varían según el entorno en que se encuentre la proteína (figura

5-a).26,40 SP-B posee cuatro -hélices anfipáticas que le permiten insertarse en las membranas

mediante la interacción con las cabezas de los fosfolípidos y las regiones hidrofóbicas que la

componen, lo que resulta fundamental para que cumpla sus funciones (figura 5 b, c y d). El enlace

disulfuro intermolecular que permite la formación del dímero se genera inmediatamente después

o incluso durante la maduración de la proteína, y le brinda resistencia a la degradación

proteolítica.41

Figura 5: Estructura propuesta para SP-B y funciones asociadas. a) Estructura de SP-B en forma de homodímero, donde

se aprecian las -hélices presentes en la misma. b) Se muestra la posible interacción del homodímero con membranas.

c) Se señala la acción de SP-B durante la adsorción de bicapas a la monocapa del SP. d) Se muestra la acción de esta

proteína durante la compresión, mientras que en e) se señala su acción durante la expansión de la membrana del SP.

(Extraído de Serrano et al).7


La forma dimérica de la SP-B interacciona con membranas uniéndose a ellas y además de

promover el acercamiento entre membranas cercanas, también promueve la formación de

estructuras no lamelares. Se propone que la proteína en su forma madura se asocia con las

vesículas internas de los MVBs y promueve la fusión de las vesículas, lo cual podría facilitar la

multi-lamelaridad de los LBs.29 El extremo C-terminal de pro-SP-B es procesado durante la

maduración de la proteína y parece ser determinante en el tamaño de los LBs.35 Se han

identificado que mutaciones en la región C-terminal del péptido pueden causar síndrome de

distrés respiratorio letal. Se cree que las mutaciones podrían ocasionar alteraciones en el

procesamiento de la pro-proteína en el aparato de Golgi.37

SP-C se ha encontrado presente únicamente en mamíferos, siendo actualmente la proteína más

hidrofóbica del proteoma 42. Se cree que evolutivamente se ha desarrollado en los sistemas

respiratorios para superar el problema de las elevadas tensiones superficiales a las que se

encuentran sometidos los alvéolos de estos animales, y que es necesario que sean disminuidas

para evitar su colapso.7,10 SP-C se produce en los neumocitos tipo II en el segundo trimestre de

embarazo como una pro-proteína de 197 aminoácidos y 21 kDa, que posteriormente es clivada en

sucesivos pasos para generar una pequeña proteína transmembrana de tan solo 35 residuos

aminoacídicos y aproximadamente 3.5kDa.43 Su secuencia posee en la región N-terminal

aminoácidos hidrofílicos con cargas positivas, y a continuación una región rica en Val, Ile, Leu

(altamente conservada en las distintas especies44) lo que la transforman en una proteína

altamente hidrofóbica. Esta región abarca desde el residuo aminoacídico 9 al 34, y en ella se

genera una estructura -hélice muy estable que le permite incluirse en membranas, como una

proteína con un pase transmembrana (figura 6). La actividad de esta proteína es estrictamente

dependiente de la presencia de su estructura en -hélice, ya que la longitud de la misma se ajusta

perfectamente con el ancho de una bicapa de DPPC, siendo muy importante para que tenga lugar

la rápida adsorción del surfactante.2, 44,45 La presencia de residuos de Arg y Lys en su secuencia le

otorga una carga neta positiva que permite su interacción con las cabezas polares de los

fosfolípidos; y a su vez determinan la orientación transmembrana de SP-C madura.46,47


Figura 6: Modelo de la SP-C, y su interacción con monocapa y bicapa. Tomado de Johansson et al.48

El procesamiento de proSP-C comienza en el RE, donde la proSP-C es traducida y translocada. La

proSP-C posee tres regiones, un péptido N-terminal de 23 aminoácidos, la porción de SP-C madura

y un péptido C-terminal de 138 aminoácidos. El dominio hidrofóbico (que constituye la porción

madura) tiene dos funciones, una es actuar como dominio de anclaje a la membrana, y la otra es

actuar como péptido señal para que se produzca la inserción de la proteína en la membrana.46 La

región N-terminal se encuentra en la cara citosólica, mientras que la región C-terminal se ubica en

la cara al luminal del retículo. La presencia de un puente disulfuro intramolecular en este último

segmento permite el correcto plegamiento de dicha región y procesamiento de proSP-C.37,43 La

proSP-C es clivada cuatro veces. En primera instancia se procesa la región C-terminal en dos pasos,

lo cual genera dos péptidos de 16 y 7 kDa. Luego de la inserción en la membrana, proSP-C es

transportada a los MVBs donde la SP-B madura coopera para que se escinda la región N-terminal

en dos pasos. La región N-terminal de SP-B tiene gran importancia ya que se cree que puede

intervenir en el proceso de maduración y plegamiento de SP-C.49

Durante la maduración de la SP-C en la región trans del aparato de Golgi la proteína es di-

palmitoilada en los residuos de Cys 5 y 6. En ciertas especies se ha hallado SP-C tripalmitoilada en

el residuo 11-Lys45 y así como la forma monopalmitoilada (perro y visón44), pero ambas en bajas

proporciones. La presencia de los palmitoilos favorece la estabilización de la -hélice, y al


encontrarse en la región N-terminal de SP-C madura favorece la interacción con otras membranas

y genera la posibilidad de interaccionar con bicapas.40 Así, se ha visto que la palmitoilación de esta

proteína es capaz de potenciar la re-expansión de la membrana surfactante (debido a dicha

interacción) y aumentar su estabilidad, fundamentalmente a altas presiones donde su rol es

crucial para mantener las asociaciones entre la mono/bicapas del surfactante.12,50 La

palmitoilación de SP-C permite además estabilizar el contenido de colesterol en las capas del

surfactante al promover la interacción de ciertas proteínas con los dominios de la membrana ricos

en colesterol. Se ha visto que en ausencia de palmitoilaciones se podrían generar colapsos antes

de lograr alcanzar el valor mínimo de tensión superficial, al verse imposibilitada SP-C de mantener

la asociación entre las membranas en los estados de mayor presión de la capa interfacial.12 La

palmitoilación también permite que la región N-terminal de SP-C madura inmersa en una

membrana pueda interaccionar con otra membrana o con otras regiones de la misma bicapa

lipídica; por lo que esta modificación postraduccional es clave para los diversos roles de SP-C.12,

37,51

1.3 Formación y almacenamiento del surfactante pulmonar:

Estructuras del SP y procesamiento de sus proteínas hidrofóbicas:

Ambas proteínas hidrofóbicas del SP comparten la misma vía de transporte luego que son

sintetizadas. En seguida a la translocación en la membrana del RE, ambas proteínas en su forma

inmadura son transportadas hacia los cuerpos lamelares (LBs) mediante el compartimiento distal

del aparato de Golgi, cuerpos multivesiculares (MVBs) y cuerpos compuestos (CBs). Los MVBs son

organelos con múltiples vesículas unilamelares que están enriquecidos en lípidos saturados y en

las proteínas hidrofóbicas del SP en su estado inmaduro. Los mismos, en un estadío más avanzado

de maduración se transforman en CBs que posteriormente se transformarán en los LBs nacientes

(figura 7). Como fue previamente mencionado, los LBs poseen un pH ácido y enzimas proteolíticas

que son responsables de que SP-B y SP-C sufran los procesos de clivaje que dan lugar a las

proteínas en su forma madura.6,35 El transporte de los lípidos del surfactante a través de estos

organelos se ve facilitado por la presencia del transportador en forma de cassette de unión a ATP


A3 (ABC-A3), que transporta DPPC, PC y PG desde el RE hacia los LBs.6,36,52 La presencia de este

transportador es clave ya que interviene activamente en la formación de los LBs; y se ha visto que

su ausencia no solo afecta a la formación de los mismos sino que también repercute en la

secreción del SP hacia la superficie alveolar, generando fallas respiratorias.53

Una vez formados, los LBs poseen una estructura multilamelar característica, con membranas

empaquetadas muy estrechamente de forma concéntrica (figura 8). Mediante la recepción de

estímulos y por vías de secreción reguladas, son direccionados hacia la membrana plasmática a

través del transporte por actina y otros componentes del citoesqueleto. Una vez que se

encuentran allí son secretados al exterior celular donde liberan al surfactante almacenado, y junto

con la acción de SP-A, SP-B y Calcio generarán la TM.

Figura 7: Vía de síntesis de los cuerpos lamelares (LBs) y de procesamiento de SP-B y SP-C. Ambas proteínas son

procesadas en el RE y el aparato de Golgi, donde emergen en pequeñas vesículas denominadas cuerpos

multivesiculares (MVBs). Dichas vesículas sufren cambios en su contenido y se transforman en cuerpos compuestos y

finalmente en LBs. El material contenido en los LBs es secretado a la superficie alveolar y es re-capturado con el fin de

reciclarse o degradarse. (Extraído de Beers & Mulugeta).43


La TM es la estructura en forma de cuadrícula que adopta el surfactante una vez que se halla en

el espacio alveolar. Se genera al intersectarse dos conjuntos de bicapas lipídicas antes de que se

forme la monocapa en la hipofase aire-líquido. Cada cuadrícula de TM está formada por bicapas

que emergen de dos o más LBs diferentes, y a su vez cada LB participa en la formación de dos

cuadrículas de TM (figura 8).54,55,56

Figura 8: Formación de la mielina tubular (TM) en el espacio alveolar a partir de la secreción de las membranas

almacenadas en los cuerpos lamelares. En la esquina inferior izquierda se tiene un acercamiento de la estructura en

forma de TM. (Tomado de Goerke et al).2

Para la formación de TM es necesaria la presencia de DPPC, PG, SP-A, SP-B y Ca2+. Mediante el

dominio CRD, SP-A interacciona con las cabezas aniónicas de los fosfolípidos que conforman las

membranas empaquetadas en los LBs (como PG), para poder curvar la membrana y así formar la

cuadrícula; aunque también se cuestiona que este comportamiento esté favorecido por

interacciones laterales SP-A/SP-A.6 Si bien no hay suficiente información acerca de cómo se


fusionan las bicapas cuando se intersectan, se cree que ocurre con la acción de SP-B, ya sea

mediante interacciones SP-B/membranas o SP-B/SP-B; y por ello es imprescindible la presencia de

esta proteína para la formación de esta estructura (figura 9).6,57

Si bien la mielina tubular es una estructura muy importante en la dinámica del SP, su ausencia no

resulta fatal, por lo que no es imprescindible para la función respiratoria normal.7

Figura 9: Modelo propuesto para las funciones de SP-B y SP-A en la formación de la TM. Se plantean interacciones

entre SP-A/SP que forman la estructura de cuadrícula, al mismo tiempo que SP-B mantiene la unión entre las

membranas que interaccionan con SP-A. (Pérez-Gil).6


Reciclaje y reservorio de SP:

A medida que fue avanzando el conocimiento respecto al surfactante y su funcionalidad, se

propuso la existencia de un “reservorio” de SP cercano a la membrana apical de los neumocitos

tipo II, ubicado justo por debajo de la monocapa (espacio conocido como hipofase). Este

reservorio permite que el SP tenga una dinámica muy activa en los ciclos inspiración-espiración,

siendo el responsable de albergar el SP durante la exclusión en la espiración y su re-inserción

durante la inspiración. Se ha demostrado que para que se desempeñe esta función de forma

rápida y eficiente es necesario que el SP permanezca en extrema proximidad a la monocapa, para

lo cual se necesita que esté presente SP-C. Esta proteína se encuentra vinculada a la mantención

del reservorio del material tensoactivo, ya que sus palmitoilos permiten que exista un estrecho

contacto entre las bicapas de la hipofase y la monocapa en el proceso de inclusión y exclusión de

material. La forma dimérica de SP-B también está involucrada en la mantención del reservorio

pero de forma menos activa que SP-C (figura 10).52,58

Figura 10: Rol de la SP-B y SP-C durante el ciclo de compresión/expansión de las membranas del SP durante el ciclo

respiratorio. Se puede observar cómo se da la exclusión de material durante la compresión y cómo la presencia de las

proteínas hidrofóbicas del SP favorecen el proceso. Durante la expansión se puede ver como se vuelve a expandir la

membrana del SP también mediado por la acción proteínas (Extraído de Pérez-Gil & Weaver).52


Durante el ciclo respiratorio el surfactante presente en la monocapa sufre procesos de

compresión/exclusión/re-inserción del material tensoactivo. Durante la compresión, la monocapa

se enriquece en material altamente tensoactivo (DPPC) y se excluye el material de escasa

capacidad a través de la función de las proteínas hidrofóbicas. Particularmente, SP-B promueve la

formación de curvaturas negativas para la eliminación del SP, y SP-C ofrece la posibilidad de que

este material permanezca adherido a la monocapa. Esto es crucial durante el ciclo inspiratorio

donde la interfase se expande y es necesario cubrir los espacios moleculares que quedaron

disponibles para que no se forme una fase gas y con esto el colapso alveolar. El material

tensoactivo que queda en la hipofase vuelve a ser endocitado gracias a que tiene lugar la

formación de pequeñas vesículas (que forman los pequeños agregados del SP), que pueden ser

internalizadas por los neumocitos tipo II para que tenga lugar el reciclaje.37 La re-internalización

ocurre mediante la activación por SP-A y su receptor P63 de elevada afinidad en estas células a

través de endosomas59 Este proceso es dependiente de clatrina, aunque se sabe que el reciclaje de

ciertos componentes del SP se da de manera independiente a este sistema.11,60 Otra parte del

surfactante pulmonar en la hipofase es degradado por los macrófagos presentes en el epitelio

alveolar, aunque los mecanismos por lo que se procede a la degradación o reciclaje del SP aún no

son del todo claros. Es importante destacar que ambos procesos son dependientes de la especie y

edad del individuo.61

Secreción del SP:

La secreción de SP a través de los LBs involucra tres vías de señalización relacionadas entre sí, las

cuales conducen a su liberación hacia el espacio alveolar. Los receptores celulares involucrados en

las cascadas de señalización son los receptores -adrenérgicos, receptores purinérgicos P2Y2 y

receptores de Adenosina A2B. Una de las vías implica la activación de la proteína quinasa C (PKC),

que a través de una cascada en la que ATP y UTP participan como activadores de la fosfolipasa C-

3 que logra la formación de inositol-3-fosfato y diacilglicerol. Este último es el responsable de

activar a la PKC para que tenga lugar la fosforilación proteica. Por otro lado la vía adenilato ciclasa

es activada mediante los receptores -adrenérgicos y su traducción intracelular esta acoplada a la

proteína G. La adenilato ciclasa genera AMPc, el cual actúa como segundo mensajero y activa a la

proteína quinasa A (PKA) como efector de la señalización. La liberación de Ca2+ intracelular

constituye el tercer mecanismo de señalización involucrado en la liberación de los LBs, el Ca2+


activa a las proteín-quinasas dependientes de calmodulina y generan la señal para la liberación.62

La vía más potente involucra a la PKC, aunque se ha identificado que la activación conjunta

además de la liberación de Ca2+ y la PKA producen la secreción de surfactante con mayor potencia.

Los procesos que ocurren luego de la activación de PKC son complejos y aún no están elucidados

por completo, pero se cree que la activación de esta enzima está en íntima relación con la

activación de Calcio, y en forma conjunta provocan la liberación del SP a partir de los LBs.62

La ventilación pulmonar favorece la secreción del surfactante debido al estiramiento que sufre el

tejido pulmonar; ya que logra que los neumocitos tipo I liberan ATP al espacio alveolar y este

actúe como molécula de acción parácrina en los receptores purinérgicos de los neumocitos tipo II

para promover la secreción.63,64 Tanto el estiramiento como la acción parácrina del ATP son

capaces de activar la vía de secreción dependiente de Ca2+ en los neumocitos tipo II y así provocar

la liberación de los LBs. Durante el parto, la síntesis de lípidos del surfactante así como su

secreción también se ven incrementadas, lo que se cree que es debido a la estimulación de los

receptores adrenérgicos.60,62,65

El SP puede ver afectada su función debido a la capacidad inhibitoria de algunas sustancias

endógenas y exógenas. Ejemplo de esto son la presencia de proteínas plasmáticas, ácidos grasos

libres y especies reactivas de oxígeno. Además, los niveles altos de colesterol, lisofosfolípidos,

contaminantes presentes en el aire, proteasas y fosfolipasas, son muy importantes en el

agravamiento y/o desarrollo de la patología respiratoria.66


1.4 Funciones de las proteínas hidrofóbicas:

Las proteínas hidrofóbicas del surfactante son co-responsables de la actividad tensoactiva del SP

y por consiguiente de evitar el colapso alveolar. Tanto SP-B como SP-C son capaces de interactuar

con fosfolípidos aniónicos, lo que favorece la formación y estabilización de la monocapa durante el

ciclo respiratorio. En forma conjunta, SP-B y -C son capaces de favorecer el enriquecimiento de la

monocapa del surfactante con DPPC.26

SP-B permite la interacción entre dos bicapas lipídicas o bien entre una bicapa y una monocapa;

siendo capaz de transferir lípidos de una membrana a la otra, y de excluir PG de la monocapa

durante el estado de mayor compresión para lograr disminuir la tensión superficial.38,67 SP-B

interviene en la formación de los LBs, influyendo en el tamaño de los mismos. Si esta proteína no

está presente los LBs sufren deficiencias y se genera una acúmulo de MVBs.6,68 SP-B también

interviene en la formación de la mielina tubular en colaboración con la SP-A y en presencia de

DPPC, Calcio y PG.67 Esta proteína tiene un rol importante en el procesamiento de SP-C, lo que se

ha esclarecido al observar que ratones knock-out para el gen de SP-B acumulan proSP-C en los

cuerpos MVBs.

SP-C se caracteriza por favorecer en gran medida la reinserción de los fosfolípidos del

surfactante una vez que fueron excluidos de superficie alveolar durante la espiración. A su vez esta

proteína interviene en la formación del reservorio del SP y permite que los mismos se mantengan

unidos a la interfase cuando la compresión es máxima. El reservorio es clave para que se produzca

la re-inserción de fosfolípidos durante la expansión de la monocapa, y para que tenga lugar la

exclusión de material durante la compresión de la misma. Las palmitoilaciones de SP-C potencian

la re-expansión y la estabilización de la monocapa que se ha adsorbido en el espacio alveolar; y al

mismo tiempo estas palmitoilaciones permiten que SP-C contrarreste los efectos adversos que el

colesterol puede llegar a tener en la membrana surfactante.12

Ambas proteínas hidrofóbicas son capaces de promover el enriquecimiento de DPPC en la

monocapa al excluir el material no tensoactivo, aunque SP-B lo hace de forma más eficaz.10,26,39 SP-

B también resulta más efectiva que SP-C en el intercambio de fosfolípidos de la membrana, ya que


excluye a los fosfolípidos más fluidos de la misma y favorece la presencia de DPPC en los estados

más comprimidos. Como se mencionó anteriormente, si bien SP-C tiene un rol fundamental y

esencial en la reinserción de material a partir de los reservorios de SP, SP-B colabora también con

ello.12 Estudios recientes han mostrado que ambas proteínas hidrofóbicas son capaces de formar

poros en la membrana, generando cambios en la permeabilización de la misma y el intercambio de

material, haciendo que la misma sea permeable a pequeñas moléculas polares.67 Por lo tanto,

estas dos proteínas conjuntamente son capaces de favorecer la adsorción de la capa interfacial de

SP, purificarla al enriquecerla con DPPC, estabilizarla y generar su re-expansión luego de la

espiración.69

Si bien SP-A es una proteína hidrofílica, cumple funciones tensoactivas relacionadas con SP-B y

SP-C. SP-A es capaz de favorecer la formación de la capa superficial del surfactante una vez que

éste ha sido secretado al espacio alveolar, aunque las proteínas hidrofóbicas lo hacen de forma

más efectiva y rápida.10,24 SP-A también coopera con SP-B en el enriquecimiento selectivo de la

monocapa en DPPC, únicamente si SP-B está presente.58 También vale destacar que SP-A se cree

que es esencial para formar la TM.

Las funciones conjuntas de SP-B como de SP-C permiten acelerar la formación de la monocapa, la

expansión y la reabsorción de la misma, y así protegen al alvéolo del colapso en el ciclo

respiratorio. Estas funciones en su conjunto hacen de estas proteínas elementos claves en la

dinámica del surfactante pulmonar.

1.5 Importancia biológica:

Tanto SP-B como SP-C han demostrado ser esenciales para una correcta función del surfactante

pulmonar. Las terapias con surfactantes exógenos han tenido mejores resultados cuando además

de la mezcla lipídica poseen ambas proteínas hidrofóbicas. Estas terapias son altamente utilizadas

en bebés prematuros, cuyo surfactante propio no ha podido desarrollarse (total o parcialmente) y

por tanto necesitan de la administración de uno exógeno para sobrevivir.


SP-B es esencial para la vida y el correcto funcionamiento del SP. Su ausencia total resulta letal

para los recién nacidos debido a que se afecta la homeostasis pulmonar, ocasiona una

disminución de la tensión superficial indebida; genera también un aumento de pro-SP-C en el

espacio alveolar y defectos en los LBs que perjudican la composición fosfolipídica del SP.70

Respecto a SP-C, se ha visto que no es esencial para la supervivencia de neonatos, ya que para

ratones knock-out en el gen de SP-C no se ha visto afectada la función pulmonar, la estructura de

los LBs o la TM; pero se ha correlacionado su ausencia con el desarrollo de enfermedades

respiratorias en diversos grados.5,12 SP-C posee varias isoformas que se cree pueden estar

vinculadas a diferentes patologías respiratorias. Por ejemplo, se ha encontrado que los pacientes

con proteinosis alveolar presentan la isoforma mono o no-palmitoilada.45 Estos hallazgos permiten

inferir una relación entre las diferentes isoformas de SP-C y la fisiopatología asociada. Si bien SP-C

no es esencial en el momento del nacimiento, sus funciones hacen que ésta cumpla un rol crucial

en la mantención del funcionamiento del surfactante.

El síndrome de distrés respiratorio (SDR) es una enfermedad compleja que se caracteriza

principalmente por la presencia de edema pulmonar, colapso alveolar e hipoxia. En niños se

conoce como síndrome de distrés respiratorio en infantes (SDRI), y suele generarse en los

neonatos por inmadurez gestacional y deficiencias en el surfactante. Esta carencia afecta a las

funciones que son desempeñadas por el SP y fundamentalmente aquellas que lleva a cabo SP-B ya

que la disminución de la presencia de esta proteína genera efectos drásticos. Mutaciones en el

extremo N-terminal y C-terminal de SP-B impiden su maduración y plegamiento. Especialmente las

mutaciones en el extremo C-terminal de SP-B impiden que esta proteína se pliegue correctamente

y genera la retención de la misma en el RE imposibilitando su procesamiento. Ambas mutaciones

terminan afectando las funciones de SP-B, entre ellas se destaca el procesamiento de SP-C.37 La

deficiencia de SP-B por tanto resulta letal ya que no permite que se disminuya la tensión

superficial en el ciclo respiratorio, y por tanto se genera colapso alveolar. SDRI también puede

generarse por fallas en el transportador ABCA3, debido a que éste está involucrado en el

almacenamiento de los fosfolípidos y proteínas en los LBs.6 Como consecuencia de esta deficiencia

no solo se ve afectado el procesamiento de SP-C, sino también la formación de los LBs y TM,

ocasionando finalmente el incremento en la tensión superficial.


En neonatos la falla pulmonar también se puede generar por la aspiración de meconio en el

momento del parto, debido a que los altos niveles de colesterol y sales biliares presentes generan

inhibición de la funcionalidad SP. La inhibición también se ve favorecida por la obstrucción en las

vías aéreas que genera la aspiración ya que provoca la inflamación de las mismas. Los

componentes inflamatorios compiten por el espacio interfacial con el SP desplazando a éste y

disminuyendo así su funcionalidad.71

El síndrome de distrés respiratorio agudo (SDRA) en adultos presenta inhibición en la

funcionalidad del SP debido a la infiltración de proteínas y material del plasma sanguíneo. En este

síndrome, como en SDRI, hay variaciones en el perfil lipídico normal del SP y en el nivel de sus

proteínas, siendo incapaz de disminuir la tensión superficial en el alvéolo de forma eficiente, entre

otros factores. Además se ha visto que el aumento de la presencia de colesterol en el SP puede

jugar un rol crucial en el desarrollo de esta enfermedad.72,73

Dado que en SDR los niveles de síntesis y liberación de SP se ven afectados, la terapia que se

aplica es la utilización de SP exógenos; que si bien resulta útil (pero no óptima) para neonatos, no

ha sido completamente efectiva en adultos que padecen esta patología. Esto se debe a que

pacientes con SDRA, además de la inhibición del SP poseen disfunción vascular, daño celular y

daño oxidativo, lo que junto con la presencia de edema dificulta la performance del SP exógeno

para tratar este síndrome; al mismo tiempo que la administración en adultos no es adecuada.74

La proteinosis alveolar pulmonar (PAP) se caracteriza por la acumulación de SP, no debido al

aumento en la producción del mismo sino a interferencias en su recaptación. Este defecto se debe

a que SP-C no posee los grupos palmitoilos asociados, y provoca que forme fibras amiloides

impidiendo que pueda cumplir su función relevante al reciclaje del SP.51,75,76 En PAP se ha

encontrado a su vez que los niveles de síntesis de PG están disminuidos mientras que los de PI se

encuentran aumentados así como los niveles de SP-D.33

Los componentes del humo de tabaco afectan la funcionalidad del SP y se han demostrado los

efectos que tiene por sobre el surfactante. Es posible identificar niveles disminuidos de DPPC,

mientras que genera la acumulación de PE y SM. En el humo de tabaco pueden encontrarse

radicales libres, toxinas y oxidantes que pueden alterar al SP impidiendo la correcta función de sus


componentes. Afecta la capacidad de disminuir la tensión superficial, el reservorio de surfactante,

la dinámica de liberación y recaptación del mismo. Al mismo tiempo los componentes del tabaco

generan la oxidación de lípidos, SP-B y SP-C, y disminuyen los niveles de SP-A, B y D en

humanos.77,78

El surfactante y su actividad se han visto afectados también en diversas patologías respiratorias,

tales como asma, neumonía y la enfermedad obstructiva crónica (EPOC) entre otras. En pacientes

con asma se observó que el surfactante se encuentra en una forma menos funcional debido a una

disminución de los grandes agregados de SP. Durante la inflamación que tiene lugar en los casos

agudos de esta enfermedad, la presencia de proteínas, especies reactivas de oxígeno y otros

compuestos favorecen la disfunción del SP, lo que podría favorecer la obstrucción de las vías

aéreas.79 Respecto a la neumonía, el SP ve afectada su funcionalidad debido a una disminución en

los niveles de SP-A, PC y PG; mientras que en EPOC se ve afectada la función de mantener libre de

patógenos el espacio alveolar, de disminuir la tensión superficial y de disminuir la adhesividad de

las pequeñas vías aéreas, favoreciendo a esta patología.73,80

La terapia con surfactante exógenos se ha utilizado en pacientes con diversas patologías

respiratorias tales como SDRI, SDRA, ALI entre otros; con el fin de suplantar la ausencia o

deficiencia del SP endógeno. Se han utilizado surfactantes de origen sintético (ALEC, Exosurf) pero

dada su pobre performance se han desarrollado surfactantes de origen orgánico que han

mejorado ampliamente su acción (Survanta, Alveofact, CLSE, Curosurf entre otros). La adición de

las distintas clases de fosfolípidos presentes en el SP endógeno junto con las proteínas

hidrofóbicas del mismo mostró ser indispensable para obtener un mejor resultado en la terapia de

las distintas patologías.81 Se han observado diferencias notorias entre estos últimos relativas a la

disminución de la tensión superficial y a la resistencia a la inhibición. Se vio que Survanta (utilizado

actualmente en nuestro país) es el surfactante que menos disminuye la tensión superficial

(alcanzando valores de 4mN/m).72

Fundamentalmente para SDRI se ha visto que la terapia con SP exógeno mejora la funcionalidad

pulmonar, disminuye la severidad del síndrome y las pérdidas pulmonares de aire así como el

enfisema intersticial pulmonar, lo cual aumenta la sobrevida del paciente.82 Sin embargo aún

existen aspectos que deben mejorarse, tales como la administración. Usualmente se aplica la

instilación intratraqueal como método de administración; la cual si bien es útil no permite que la


terapia sea del todo eficaz. El edema y la inflamación impiden que el SP exógeno alcance

efectivamente la superficie alveolar, y por dicho motivo actualmente se está intentando aplicar al

mismo mediante aerosol.83,84

Además de las limitaciones en la administración, la terapia tiene también como limitación la

composición de cada mezcla comercial, ya que se utiliza una única preparación para las diferentes

patologías. Un mayor estudio en la terapia con surfactante exógeno puede ser útil no únicamente

para mejorar su performance en pacientes con SDR, sino también para desarrollar su potencial uso

en aquellos con asma, neumonía, EPOC, PAP y fumadores entre otros; aunque son necesarias

exhaustivas investigaciones en esta área para haya una utilización de SP adecuada para cada

patología.

1.6 Antecedentes:

Debido a la gran importancia que tienen SP-B y SP-C en la dinámica del SP, se han buscado

estudiar de forma más exhaustiva; aunque dada su complejidad esto se ha visto dificultado.

Crustedt et al 85 en 1987 desarrollaron un método para la purificación de estas proteínas utilizando

una cromatografía de exclusión molecular en una columna Sephadex LH-60 y como fase móvil

Cloroformo:Metanol (1:1) + 5% HCl 0.1M. Posteriormente, en 1988, Arjomaa et al 86 desarrollaron

un método para la purificación de SP-C utilizando HPLC en fase reversa en una columna C4,

utilizando acetato de amonio (pH 6.5) y luego un gradiente lineal de 1-propanol 0-80%. Más

recientemente, Bünger et al 87 en el año 2000 desarrollaron un método más rápido que los

anteriores para lograr la purificación deseada; en el cual utilizaron una columna C4 y una fase

móvil compuesta por Cloroformo:Metanol:TFA 0.1M (95:95:10). Sin embargo este método no

logra una separación satisfactoria entre ambas proteínas, por lo que la separación óptima entre

SP-B y SP-C mediante HPLC en fase reversa continúa siendo un desafío.

Dada la gran relevancia tanto SP-B como SP-C creemos que es sumamente relevante incursionar

en su estudio, ya que un mejor conocimiento de las mismas, de forma conjunta e individual, puede

permitirnos vincularlas con diversas patologías respiratorias e intentar así buscar soluciones

prácticas y eficaces.


2. OBJETIVOS:

El objetivo principal planteado es lograr la purificación de las proteínas hidrofóbicas del surfac-

tante pulmonar (SP-B y SP-C) a escala analítica y preparativa.

Como objetivos específicos se plantean:

1) Procesamiento de tejido y LBA porcino y obtención de las fracciones lipoproteicas ricas en pro-

teínas hidrofóbicas.

2) Purificación de los componentes proteicos hidrofóbicos (SP-B y SP-C) de las fracciones lipídicas.

3) Purificación por cromatografía del alta performance de la SP-B y SP-C.

4) Identificación de SP-B y SP-C purificadas mediante electroforesis y espectrometría de masa.


3. MATERIALES Y MÉTODOS:

Obtención del surfactante pulmonar

Para obtener la fracción proteica del surfactante pulmonar se utilizaron dos estrategias; la

primera fue la purificación de las proteínas hidrofóbicas del LBA de porcinos88 y la segunda fue a

partir de pulmones porcinos obtenidos inmediatamente luego de la faena en frigorífico.

La primer estrategia que se llevó a cabo constó de la instilación intratraqueal de suero fisiológico

(NaCl 140mM; 1L/Kg de pulmón), y el LBA obtenido se filtró y se centrifugó por 5 minutos 1000g y

4°C. El sobrenadante obtenido fue nuevamente filtrado y se almacenó en freezer a -20°C.

Para llevar a cabo la segunda estrategia, los pulmones porcinos fueron lavados con suero

fisiológico (NaCl, 140 mM) y almacenados en freezer a -80°C. El tejido pulmonar se troceó de

manera manual para luego ser disgregado con un homogeinizador Potter-Elvehjem a 3000 rpm y

4°C. Por cada Kg de tejido pulmonar se agregó para el homogeneizado 1 litro de suero fisiológico.

Posteriormente el disgregado se filtró por gasa y se centrifugó durante 5 minutos a 1000xg y 4°C,

luego de lo cual el sobrenadante fue conservado en freezer a -20°C hasta su utilización.

Extracción orgánica del tejido procesado y del LBA:

Con el fin de obtener la fracción hidrofóbica del tejido pulmonar se realizó una extracción

orgánica según el método propuesto por Bligh & Dyer 89. En el mismo, por cada mililitro de

muestra se agregan 3.75 ml de Cloroformo:Metanol en relación 1:2 (v/v) y se agita vigorosamente

por 60 segundos; posteriormente se le añaden 1.25 ml de Cloroformo y 1.25 ml de agua destilada

lo cual genera dos fases visualmente distinguibles. Es necesario agitar vigorosamente la mezcla

durante 30 minutos a 37ºC para favorecer el reparto moléculas hidrofóbicas a la fracción

clorofórmica. Luego la mezcla se centrifuga por 5 minutos a 1000 rpm y temperatura ambiente, lo

que genera un sistema de dos fases donde la inferior (correspondiente a la fase orgánica) es

recogida y secada. De esta manera, al recoger dicha fase se recolecta la porción hidrofóbica del

tejido pulmonar que contiene lípidos y las proteínas hidrofóbicas del surfactante pulmonar. La


fracción clorofórmica obtenida fue secada bajo atmósfera de nitrógeno, y resupendida en una

mezcla de Cloroformo:Metanol (1:1; v/v) y se almacenó a -20°C.

Purificación de las proteínas SP-B y SP-C mediante HPLC:

Las proteínas SP-B y SP-C fueron purificadas del resto de los componentes lipídicos (fosfolípidos y

lípidos neutros como el colesterol) a partir de una cromatografía de exclusión molecular Sephadex

LH-20 para moléculas orgánicas. Se utilizó un sistema cromatográfico resistente a solventes

orgánicos que fue optimizado en la Unidad de Bioquímica y Proteómica Analítica del Institut

Pasteur de Montevideo, donde se empacó una columna de vidrio, de 100cm x 0.9cm (Volumen: 57

cm3) con plungers resistentes a los solventes utilizados. La fase móvil utilizada fue

Cloroformo:Metanol en relación 1:1 con 5% HCl 0.1N; la cual fue bombeada con una bomba LKB

Bromma modelo 2150 HPLC Plump a un flujo de 1 ml/min y a temperatura ambiente. Para la

detección de las moléculas de interés se utilizó un detector UV Spectra 100 de Thermo con una

absorbancia de 240nm, mientras que la sensibilidad del detector y registrador fueron de 100mV

en una escala de 1mm/min y 1 AUFs. Para inyectar las muestras se utilizó una válvula Rehodyne

7125 con un loop de 1.5 ml, intentando utilizar el volumen máximo del loop en cada inyección.

Para mejorar la pureza de las proteínas el primer pico de cromatografía (correspondiente a las

proteínas de interés) luego de colectado y concentrado fue re-purificado en iguales condiciones,

con lo cual se logró mejorar la pureza de las proteínas de interés, eliminando restos de fosfolípidos

y colesterol presentes en la muestra.

Identificación de SP-B y SP-C:

Para corroborar la purificación conjunta de SP-B y SP-C en la fracción del extracto orgánico

obtenido de LBA y tejido pulmonar, se recurrió a realizar electroforesis en gel de poliacrilamida en

gradiente pre-hecho de NuPAGE® Bis-Tris Precast Gels (Life Technologies), con un porcentaje de

entrecruzamiento de 4-12%. El voltaje utilizado para todas las corridas electroforéticas fue de

200mV y el amperaje fue de 20mA.

Las muestras fueron preparadas según protocolo recomendado por Laemmli et al 90, el cual


propone la evaporación casi total del solvente de la muestra. Para los geles realizados se secaron

aproximadamente 50l de las fracciones recolectadas a partir de la columna LH-20 las cuales

fueron concentradas previamente; y se le añadieron 20l buffer de carga diseñado para nuestro

sistema de proteínas hidrofóbicas (ver composición en la Tabla 1). En el caso que las muestras

fueron tratadas con condiciones no reductoras, al buffer que se diseñó anteriormente se excluyó el

agregado de DTT. Para algunos casos particulares también se adicionaron al buffer de carga 5 l del

agente reductor -mercaptoetanol (-ME), el cual tuvo como objetivo mejorar las condiciones de

corrida. Para todos los geles se utilizó un marcador de peso molecular (MPM) General Electric, (GE)

con un patrón de pesos moleculares de 97, 66, 45, 30, 21.1 y 14.4 KDa.

Tabla 1: Composición del buffer de carga utilizado para sembrar las muestras en el gel de poliacrilamida.

Stacking buffer 4x 0.125 M 12.50%

Glicerol 50% 20.00%

Azul de bromofenol 1.00%

DTT 1M (*) 10.00%

SDS 20% 25.00%

CHAPS 10% 25.00%

H2O dd (csp) 6.50 %

(*) DTT se adicionó únicamente al buffer de carga del primer gel en gradiente.

Para revelar los geles se utilizó el método de Azul de Coomassie, propuesto por Fazekas et al.91

Se realizó una solución de fijación compuesta por Etanol 95%, agua destilada y ácido acético en

proporciones 50:40:10 (v/v), y se incubó gel a temperatura ambiente durante 30 minutos en

agitación constante. Posteriormente el gel se incubó con la solución de tinción de Azul de

Coomasie y Etanol 95% en proporciones 80:20 (v/v), a temperatura ambiente y con agitación

durante la noche. El proceso de lavado requirió de tres enjuagues con agua destilada durante 30

minutos en agitación, y posteriormente se escaneó.


Los geles en los que se sembraron proteínas marcadas fluorescentemente fueron revelados

utilizando un sistema de escaneo Typhon FLA 9500 de General Electric. Los sets de filtros de

excitación y emisión utilizados fueron de 532nm y 685nm con un filtro LPG; y los datos fueron

obtenidos mediante el software Typhoon FLA 9500 v1.0 y procesados con el software ImageQuant

TL v8.1. Para ello se utilizó una lámpara halógena, y utilizando filtros correspondientes se escaneó

la imagen.

Para confirmar la identidad de las proteínas que se observaron en los geles, las bandas de interés

fueron cortadas y digeridas “in gel” con la enzima tripsina; para luego eluir los péptidos y analizar

las masas usando un espectrómetro de masa. Como protocolo de extracción se utilizó una mezcla

de ácido fórmico:ACN:Isopropanol:H2O en proporciones 50:25:15:10 (v:v) a 4°C por 1hr.92,93 Luego

de extraídos los péptidos se incubaron con la matriz para espectrometría de masas ácido -ciano-

4-hidroxicinámico (CHCA), y se sembraron en la placa. Para los experimentos de espectrometría de

masas se utilizó el equipo MALDI TOF/TOF Analizer 4800 y la técnica utilizada fue de ionización

inducida por láser asistida por matriz y tiempo de vuelo (MALDI-TOF-TOF).

Purificación de SP-B y de SP-C mediante RP-HPLC:

Con el objetivo del desarrollo de un nuevo método cromatográfico se realizó una cromatografía

de fase reversa en un sistema de cromatografía de alta performance (RP-HPLC), en la que se utilizó

una columna C4 Phenomenex y dimensiones 150 x 2.00 mm y poro de 300 A. Para la puesta a

punto del método desarrollado se utilizaron proteínas marcadas fluorescentemente con la sonda

Alexa-530 y Alexa-660 (proteínas provistas por el Prof. Pérez-Gil, de aquí en adelante

denominadas SP-BSTD y SP-CSTD). Las concentraciones del stock de cada proteína fueron de 58g/ml

(7.2M) para SP-BSTD y 67g/ml (16.7M) para SP-CSTD. La temperatura a la cual se realizaron todas

las corridas fue 23°C y el flujo utilizado fue de 0.5ml/min.

La detección de las proteínas se siguió mediante la medición de absorbancia a 240nm, 280nm

(en todas las corridas realizadas), 530nm y 670nm con un detector de arreglo de diodos (DAD,

Agilent 1100) y con un detector de fluorescencia con ex=530nm y em=570nm para SP-BSTD.


Para realizar la purificación de SP-BSTD se utilizó como fase móvil una mezcla Metanol+TFA 0.1%:

Agua+TFA 0.1% en relación 80:20, a 23°C y con un flujo de 0.5ml/min. Posteriormente se aplicó un

gradiente de 80% a 100% de MeOH + TFA 0.1%. Para realizar la curva de calibración para esta

proteína se excitó la sonda a ex= 540 nm y se midió su emisión a em= 570 nm. Las

concentraciones inyectadas fueron de 58, 11.6, 5.8 y 2.32 l/ml. Además se utilizaron las columnas

C8 (100 x 4.6 mm y tamaño de poro 5m) y C18 (100 x 4.6 mm y tamaño de poro de 3 m) con el

fin de estudiar la resolución y eficiencia cromatográfica, manteniendo la fase móvil y el gradiente y

aplicando un flujo fue de 1.25ml/min, a 23°.

La purificación de SP-C se realizó mediante la columna C4 Phenomenex (anteriormente utilizada)

aplicando un flujo de 0.5 ml/min a 23°. La fase móvil utilizada estaba compuesta por

Metanol:Cloroformo (1:1) y 5% de TFA 0.1M, según el método propuesto por Bünger et al 87. La

curva de calibración se realizó inyectando 67, 26.8, 13.4 y 6.7l/ml de SP-CSTD, y las corridas se

monitorearon mediante la absorbancia de la sonda a 670nm.

Con el fin de obtener un patrón característico de elusión de ambas proteínas presentes en una

misma muestra a escala analítica, se realizó una mezcla en iguales proporciones de SP-BSTD y SP-

CSTD, y se inyectó en la columna C4 con un flujo de 0.5ml/min y 23°C empleando el método

propuesto por Bünger et al87. Como se vio anteriormente, el método de Bünger et al no aportó

suficiente capacidad resolutiva para separar de manera adecuada a ambas proteínas, por lo cual

ha sido necesario el desarrollo de un nuevo método. Inicialmente se comenzó con una fase móvil

compuesta por Metanol y agua con 0.1% de TFA y fue necesario variar las proporciones de ambos

solventes así como el gradiente entre estos. Además también fue necesario un segundo gradiente

de cloroformo/metanol.

A continuación se describe un detalle de los principales parámetros cromatográficos modificados

para llegar el método propuesto. En primera instancia se utilizó como fase móvil inicial a una

mezcla Metanol+0.1%TFA + H2O+0.1%TFA en proporciones 90:10 (v/v), a lo que le siguió un

gradiente lineal a 100% de Metanol+0.1%TFA (5 minutos) el cual se mantuvo durante 5 minutos y

luego se aplicó un gradiente lineal a 100% de Cloroformo+0.1%TFA (en 5 minutos). Para finalizar se

aplicó un gradiente lineal de Metanol+0.1%TFA (en dos minutos) (ver gradientes y cromatogramas

en Anexo III). Posteriormente a esto se variaron las proporciones de Metanol/agua 0.1% TFA a

85:15 y 80:20 (v/v) (ver gradientes y cromatogramas en Anexo III)


Además de variar las proporciones de Metanol+0.1% TFA:Agua+0.1% TFA, se modificaron los

tiempos de gradiente Metanol+0.1% TFA:Agua+0.1% TFA (figura A.III) y finalmente se incluyó

período de cromatografía isocrática de Metanol+0.1% TFA por 5 minutos lo que permitió eluir a

SP-C.

El método desarrollado para purificar SP-B y SP-C consta de una fase móvil inicial compuesta por

una mezcla de Metanol+0.1%TFA + H2O+0.1%TFA (80:20 v/v) durante 3 minutos, seguida por un

gradiente lineal de Metanol+0.1%TFA a 100% (en 5 minutos), que se mantuvo durante 6 minutos.

La columna utilizada fue una C4 Phenomenex de dimensiones 150x2.0mm y 300 A de tamaño de

partícula; la temperatura de cromatografía fue 23ºC, flujo 0.5 ml/min y el setup cromatográfico un

HPLC Agilet 1100 con desgaseador, bomba cuaternaria, autosampler, horno de columna, detector

DAD y fluorímetro. Para analizar los resultados de cromatografía se utilizó el software

Chemstation.

La cromatografía a escala semi-preparativa se llevó a cabo en una columna C4 Vydac cuyas

dimensiones fueron 250x10mm y tamaño de poro 30m. Para los experimentos se inyectaron

500l de extracto orgánico pulmonar, y se utilizó el sistema de gradiente tal como se mostró para

la cromatografía a escala analítica; con la modificación de los tiempos de inicio, gradiente y

mantenimiento a 10 minutos cada uno. El flujo usado fue 2.0 ml/min y la temperatura de columna

23°C, mientras que el sistema cromatográfico utilizado fue el mismo que para la cromatografía

analítica.


4. RESULTADOS

4.1 Purificación de las proteínas hidrofóbicas del Surfactante y del tejido pulmonar:

Se caracterizó la capacidad resolutiva del sistema de cromatografía preparativo en columna LH-

20 para moléculas hidrofóbicas de bajo peso molecular a partir de la utilización de estándares de

fosfolípidos y colesterol (figura 11 a y b). También se observa el perfil obtenido para una muestra

de extracto orgánico (figura 11-c). En la figura 12 se puede ver los espectros de masa de la elusión

de los picos de fosfolípidos (a y b) y colesterol (c). Hemos podido identificar masas respectivas a

760.67, 794.67 Da las cuales coinciden con la masa prevista para el valor de los fosfolípidos (Fosfa-

tidilcolina y Fosfatidilserina respectivamente) y 369.50 Da que coincide con el valor promedio de

masa para el colesterol. Las fragmentaciones de los fosfolípidos permitieron identificar principal-

mente DPPC, DOPC, POPC y POPS. En la figura 13-a se muestra el cromatograma obtenido al in-

yectar el extracto orgánico obtenido. A los 24 minutos es posible identificar el pico correspondien-

te a la elusión de las proteínas hidrofóbicas del SP; mientras que a los 37 y 45 minutos se pueden

identificar dos picos correspondientes para los fosfolípidos y el colesterol, respectivamente. A los

64 minutos se ve un pico que no fue identificado. El primer pico fue colectado y re-purificado en

las mismas condiciones (figura 13 b y c). Finalmente se recolectaron las fracciones IA, IIB1 y IIB2.


Figura 11: Perfiles cromatográficos para la columna Sephadex LH-20. a) Estándares de fosfolípidos. b) Estándar de

colesterol. c) Muestra de extracto orgánico.

a) b)

c)


Figura 12: Espectros de masa de colesterol y de fosfolípidos, y la fragmentación del pico mayoritario en cada caso. a)

Colesterol. b) Fosfatidilcolina. Las fragmentaciones identificaron la presencia de DPPC, DOPC, POPC.c) Fosfatidilserina

con la fragmentación del pico mayoritario (794.67) (POPS).


Colesterol

Fosfolípidos No identificadas

Figura 13: a) Perfil de elusión de SP-B y SP-C mediante cromatografía de exclusión molecular en columna Sephadex

LH-20. Se midió la absorbancia a 240nm. A los 24 minutos se observa la aparición del primer pico que se corresponde

a las proteínas hidrofóbicas del SP; el pico sucesivo se corresponde con fosfolípidos, el tercero con colesterol y el

último se corresponde con especies no identificadas. b) Re-purificación del primer pico eluido, mostrado en la parte

a). c) Re-purificación del primer pico eluido, mostrado en la parte b).

a)

b) c)

Proteínas


Posteriormente, como estrategia para la identificación de las masas moleculares de las proteínas

se procedió al concentrado de la muestra para correr en un gel de poliacrilamida. En la figura 14 se

puede observar el gel en gradiente de poliacrilamida donde se sembraron las elusiones de la cro-

matografía de exclusión molecular en LH-20 (fracciones IA, IIB1 y IIB2). Se pueden ver las bandas

que, por comparación con el MPM, se corresponden con proteínas de bajos pesos moleculares,

aproximadamente de 14.4 kDa. El tratamiento con -ME no produjo diferencias significativas en la

migración de las bandas.

Figura 14: Gel en gradiente de poliacrilamida 4-12%. Carril 1: MPM. Carril 2: Fracción IA (5l). Carril 3: Fracción IA.

Carril 4: Fracción IA+-ME. Carril 5: Fracción IIB1. Carril 6: Fracción IIB1+-ME. Carril 7: Fracción IIB2. Carril 8: Frac-

ción IIB2+-ME. Carril 9: vacío. Carril 10: MPM. Se observa que todas las fracciones sembradas migraron como proteínas de bajo peso molecular.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10


Posteriormente, la banda que se identifica en el gel con la fracción IIB2 (ver figura 14, carril 8) fue

recortada para ser analizada por espectrometría de masa. Luego de la digestión con tripsina “in

gel” y la elusión de los péptidos, se pudo obtener el espectro que se muestra en la figura 15, don-

de se seleccionaron los iones moleculares mayoritarios (962.48, 1184.69, 1362.75 y 1491.80) que

se volvieron a fragmentar y se obtuvieron los espectros mostrados en la figura A.I del Anexo. Para

identificar las proteínas se realizó una búsqueda en la base de datos NCBI con el motor de bús-

queda Mascot cuyos resultados se muestran en el Anexo I. Fue posible identificar con significancia

estadística la presencia de SP-B porcina en la fracción IIB2.

Figura 15: Espectro de masa obtenido mediante MALDI TOF-TOF obtenido para la fracción IIB2 proveniente de

extracto pulmonar. Este espectro permitió identificar la presencia de SP-B en la muestra analizada.

Con el fin de lograr la separación de SP-B y SP-C se procedió a la realización de una cromatografía

de fase reversa previamente descripto por Bünger et al87. En la figura 16, puede verse un croma-

tograma tipo de los obtenidos utilizando el método de Bünger y colaboradores, con una fase móvil

compuesta por una mezcla de Cloroformo: Metanol (1:1, v/v) y 5% de TFA. Dado la incapacidad

resolutiva que este método mostró se procedió a la optimización de un nuevo método con aplica-

bilidad a escala analítica y preparativa.


Figura 16: Cromatogramas obtenidos para una mezcla de SP-B y SP-C (a) y para la muestra del extracto orgánico

(fracción IIB2) (b) utilizando como fase móvil Cloroformo:Metanol (50:50) + TFA 0.1%. Se muestra la medición de

absorbancia a 240nm y 280nm para ambas muestras analizadas.

a)

b)


4.2 Purificación analítica y preparativa de SP-B y SP-C:

Como estándares de las proteínas del surfactante pulmonar se utilizaron proteínas SP-B y SP-C

purificadas y marcadas con Alexa Fluor 543 y 660, respectivamente (provistas por el Dr. Jesús Pé-

rez-Gil). En la figura 17 se muestran los espectros de excitación y emisión de las proteínas, con el

objetivo de determinar los máximos de excitación y emisión para cada proteína conjugada con

Alexa Fluor. Se obtuvo un máximo de excitación y emisión para la SP-BSTD a 540nm y 570nm res-

pectivamente; mientras que para SP-CSTD el máximo de excitación se encontró a 670nm y el de

emisión a 700nm. Se corroboró la calidad de las proteínas estándares obtenidas a través de un gel

de poliacrilamida en gradiente revelado por fluorescencia. La figura 18 muestra el resultado obte-

nido, en el que se puede observar la migración de las proteínas marcadas con Alexa-543 y -660

(SP-BSTD/verde; SP-CSTD/rojo, respectivamente), al mismo tiempo que el efecto de la adición de

agente reductor (-ME). La adición de -ME produjo un incremento en la migración de SP-B, mien-

tras que para SP-C no mostró cambios significativos.

Figura 17: Espectros de emisión y excitación realizados para SP-B marcada con Alexa530 (a) y SP-C marcada con Alexa660 (b).

a) b)


Figura 18: Gel de poliacrilamida en gradiente 4-12%. Carril 1 y 6: MPM. Carril 2 y 4: 10 y 100 l de SP-B/Alexa540

con BME. Carril 3 y 5: 10 y 100 l de SP-B/Alexa540 sin BME. Carril 7 y 9: 10 y 100 l de SP-C/Alexa670 con BME.

Carril 8 y 10: 10 y 100 l de SP-C/Alexa670 sin BME.

Con el fin de caracterizar a las proteínas estándares por espectrometría de masa se realizaron

análisis de MALDI TOF-TOF. Para ello se sembró una alícuota de cada proteína sin digerir en una

placa, de modo de obtener espectros correspondientes a cada proteína. En la figura 19 a y b se

presentan los resultados obtenidos, identificándose para SP-B señales correspondientes a m/z

10511 y 21027 Da; y para SP-C señales correspondientes a m/z 4187 y 5012 Da. De esta manera se

obtuvieron señales en el espectro correspondientes a la masa de la proteína entera sumada a la

masa de la sonda fluorescente correspondiente, tal como se muestra en las figuras. La masa espe-

rable para suma de SP-B-Alexa543 es de 9400 y 18800 kDa (aprox.) para su estado de monómero y

dímero; y para SP-C-Alexa660 es de 4.8 kDa (aprox.).


Con el fin de identificar el patrón de migración de las proteínas provenientes del extracto

pulmonar, se comparó la migración de las proteínas nativas con los estándares puros marcados

fluorescentemente. Se realizó un gel en gradiente con las mismas condiciones experimentales que

Figura 19: a) Espectro de masa entera para SP-BSTD. Picos mayoritarios centrados en 10511.3454 y 21027.6901 Da. b)

Espectro de masa entera para SP-CSTD. Se observan dos picos mayoritarios a 4187.0186 y 5012.1479 Da respectiva-

mente.

a)

b)


las utilizadas para la figura 18, obteniéndose el patrón de migración para las proteínas nativas y

marcadas (figura 20 a y b).

Figura 20: Gel en gradiente 4-12% de poliacrilamida revelado por tinción azul de Coomasie (a) y fluorescencia (b).

Carril 1: MPM GE. Carril 2: Fracción IIB2. Carril 3: Fracción IIB2 c/BME. Carril 4: SP-BSTD+ SP-CSTD. Carril 5: vacío. Carril 6:

SP-BSTD+ SP-CSTD c/BME. Carril 7: vacío. Carril 8: SP-BSTD Carril 9: SP-CSTD. Carril 10: MPM GE. b) Gel en gradiente 4-12%

de poliacrilamida revelado por fluorescencia.

El revelado por azul de Coomasie y fluorescencia muestra que SP-BSTD (Carril 8 y 5, sin -ME)

presenta tres bandas, mientras que para SP-B incubada con agente reductor (Carril 6) se identifica

la desaparición de las bandas correspondientes a mayores pesos moleculares. Por otra parte se

observa que SP-CSTD que co-migra con SP-B, evidenciado por la mezcla de los revelados verde y

rojo (Alexa543 y 660) de los carriles 5 y 6. Mediante la tinción de Coomasie se identificaron las

bandas correspondientes a las proteínas nativas de la fracción IIB2 obtenida de la purificación

preparativa (figura 12). Se observó una única banda de bajo peso molecular (Carriles 2 y 3) con

una masa similar a las proteínas marcadas (Carril 6). Para la fracción IIB2 el tratamiento con -ME

no tuvo un efecto significativo.

Para separar a ambas proteínas entre sí se procedió a realizar una cromatografía de fase reversa

con una columna analítica. Para la puesta a punto de las condiciones cromatográficas se utilizaron

las proteínas puras marcadas con las sondas fluorescentes y luego de la optimización del método

se utilizó la muestra proveniente del extracto pulmonar de cerdo purificada previamente.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

a) b)


Para valorar la respuesta de nuestro sistema de cromatografía al incremento en la concentración

de la muestra se procedió a realizar una curva de calibración para SP-BSTD, mostrada en la figura

21-a. En la figura 21-b se muestra la curva de calibración obtenida al procesar el área debajo de

cada pico del cromatograma vs. concentración utilizada.

Figura 21: a) Cromatograma obtenido en columna C4, para la mayor concentración de SP-BSTD(58 g/ml) utilizando

como fase móvil MeOH+TFA/H2O+TFA utilizando la emisión de fluorescencia de la sonda a 570nm. b) Curva de

calibración obtenida para SP-B, área del pico cromatográfico vs. concentración de proteína; para todas las

concentraciones utilizadas (58, 11.6, 5.8 y 2.32 g/ml). El ajuste de la regresión lineal fue de un r2=0.9969, y los

parámetros a=1638.4090 y b=-174.2453 (con Y=ax + b).

El estudio de SP-CSTD se llevó a cabo utilizando el método propuesto por Bünger et al 2000m

aplicando una fase móvil compuesta por una mezcla de Metanol:Cloroformo (1:1) y 5% TFA 0.1M

(ver Materiales y métodos). De igual manera que con SP-B, se procedió a realizar una curva de

calibración para esta proteína, con la diferencia de que el menor volumen usado fue de 5l. Los

cromatogramas adquiridos se muestran en la figura 22 a y b se muestra la curva de calibración

obtenida luego de procesar los datos del cromatograma. Se puede apreciar que el pico

correspondiente a SP-CSTD en cada cromatografía realizada eluyó en un tiempo cercano a 1.5

minutos.

a) b)


Dado que el método de Bünger et al87 no resultó eficiente para la separación de SP-B y SP-C se

planteó un nuevo método capaz de purificar a ambas proteínas con mejor resolución y mayor

separación entre los picos. Se realizaron corridas cromatográficas para inyecciones de SP-BSTD y SP-

CSTD empleando diferentes condiciones de corrida hasta lograr obtener las condiciones óptimas

para la purificación. Las cromatografías se siguieron mediante la emisión de la sonda la 570nm

para SP-BSTD y la absorbancia a 670nm para SP-CSTD; y se obtuvieron los parámetros mostrados en

la Tabla 2. En la figura 23 se muestran los cromatogramas obtenidos para las diferentes

condiciones empleadas para la inyección de la mezcla de SP-BSTD y SP-CSTD. Se puede observar que

la disminución del porcentaje de H2O provocó la elusión de las proteínas junto con el volumen

muerto. El aumento de tiempo de mantención de Metanol 100% disminuyó el tiempo de retención

de ambas proteínas. Se observó también que el gradiente de Cloroformo no era necesario para

lograr la elusión de SP-B ni de SP-C. En la tabla 2 se muestran los parámetros obtenidos en cada

corrida mostrada en la figura 23.

Figura 22: a) Cromatograma obtenido para la mayor concentración de SP-CSTD (67 l/ml) inyectada en una columna C4,

utilizando como fase móvil Metanol:Cloroformo 1:1 y 5% TFA 0.1M y midiendo la absorbancia de la sonda a 670nm para

monitorear las corridas. b) Curva de calibración para SP-CSTD, área del pico cromatográfico vs. concentración de proteína

para todas las concentraciones inyectadas (67, 26.8, 13.4 y 6.7 l/ml). El ajuste de la regresión lineal fue de un

r2=0.9989, y los parámetros a= 430.2012 y b= -16.0380 (con y= ax + b).

a) b)


Hbmnbm,nb,mnbm,nb

Figura 20**: Puesta a punto del método cromatográfico utilizando una columna C4. a) La fase móvil inicial fue de 90:10

Metanol+0.1%TFA + H2O+0.1%TFA (3’), y luego se aplicó un gradiente lineal a 100% de Metanol+0.1%TFA (3’-8’) el cual

se mantuvo en el tiempo (8’-13’). Posteriormente se aplicó un gradiente a 100% de Cloroformo+0.1%TFA (13’18) y se

finalizó con un gradiente de Metanol+0.1%TFA al 100% (18’-20’). b) Se utilizó una fase móvil inicial de 85:15

Metanol+0.1%TFA + H2O+0.1%TFA (3 min) y luego se aplicó un gradiente lineal al 100% de Metanol+0.1%TFA (3’-8’) el

cual fue mantenido en el tiempo (8’-13’). Posteriormente se aplicó un gradiente lineal al 100% de Cloroformo+0.1%TFA

(13’-18’) y se finalizó con un gradiente de Metanol+0.1%TFA al 100% (10’-20’). c) La fase móvil inicial fue de 80:20

Metanol+0.1%TFA + H2O+0.1%TFA (3’), y luego se aplicó un gradiente lineal a 100% de Metanol+0.1%TFA (3’-13’).

Posteriormente se aplicó un gradiente a 30% de Cloroformo+0.1%TFA (13’-18’) y se finalizó con un gradiente de

Metanol+0.1%TFA al 100% (18’-20’). d) La fase móvil inicial empleada fue de 80:20 Metanol+0.1%TFA + H2O+0.1%TFA

(3’), y luego se aplicó un gradiente lineal a 100% de Metanol+0.1%TFA (3’-11’) el cual se mantuvo en el tiempo (11’-

14’). Posteriormente se aplicó un gradiente a 30% de Cloroformo+0.1%TFA (14’-19’) y se finalizó con 100% de

Metanol+0.1%TFA (19’-20’).

a)

a)

b)

c)


Figura 23: Puesta a punto del método cromatográfico utilizando una columna C4. a) La fase móvil inicial fue de 90:10

Metanol+0.1%TFA + H2O+0.1%TFA (3’), y luego se aplicó un gradiente lineal a 100% de Metanol+0.1%TFA (3’-8’) el cual

se mantuvo en el tiempo (8’-13’). Posteriormente se aplicó un gradiente a 100% de Cloroformo+0.1%TFA (13’18) y se

finalizó con un gradiente de Metanol+0.1%TFA al 100% (18’-20’). b) Se utilizó una fase móvil inicial de 85:15

Metanol+0.1%TFA + H2O+0.1%TFA (3 min) y luego se aplicó un gradiente lineal al 100% de Metanol+0.1%TFA (3’-8’) el

cual fue mantenido en el tiempo (8’-13’). Posteriormente se aplicó un gradiente lineal al 100% de Cloroformo+0.1%TFA

(13’-18’) y se finalizó con un gradiente de Metanol+0.1%TFA al 100% (10’-20’). c) La fase móvil inicial fue de 80:20

Metanol+0.1%TFA + H2O+0.1%TFA (3’), y luego se aplicó un gradiente lineal a 100% de Metanol+0.1%TFA (3’-13’).

Posteriormente se aplicó un gradiente a 30% de Cloroformo+0.1%TFA (13’-18’) y se finalizó con un gradiente de

Metanol+0.1%TFA al 100% (18’-20’). d) La fase móvil inicial empleada fue de 80:20 Metanol+0.1%TFA + H2O+0.1%TFA

(3’), y luego se aplicó un gradiente lineal a 100% de Metanol+0.1%TFA (3’-11’) el cual se mantuvo en el tiempo (11’-14’).

Posteriormente se aplicó un gradiente a 30% de Cloroformo+0.1%TFA (14’-19’) y se finalizó con 100% de

Metanol+0.1%TFA (19’-20’).

d)


Tabla 2. Datos cromatográficos de la purificación de las proteínas del surfactante pulmonar para =570nm y

=670nm.

SP-B SP-C

abs tR A S tR abs tR A S tR

570 1.07 1428.5 0.76 6.31 670 1.04 63.30 0.8 9.69

7.38 81.24 0.71 --- 10.73 33.40 0.79 ---

570 1.06 1387.7 0.52 7.75 670 1.01 22.50 0.72 10.33

8.81 142.2 0.59 --- 11.34 30.70 0.72 ---

570 1.08 943.40 0.58 --- 670 1.01 15.18 0.59 16.47

--- --- --- --- 17.48 132.08 3.50 ---

570 1.07 955.60 0.58 10.08 670 1.00 13.25 0.54 12.85

11.13 231.12 0.71 --- 13.85 55.53 0.79 ---

En la primer fila se muestran los parámetros obtenidos de la cromatografía mostrada en la figura A.III-a.

En la segunda fila se muestran los parámetros obtenidos de la cromatografía mostrada en la figura A.III-b.

En la tercer fila se muestran los parámetros obtenidos de la cromatografía mostrada en la figura A.III-c.

En la cuarta fila se muestran los parámetros obtenidos de la cromatografía mostrada en la figura A.III-d.

abs: longitud de onda de absorbancia en nanómetros

tR: tiempo de retención (segundos)

A: área (unidades relativas de Absorbancia)

S: parámetro de simetría

tR1 = t2 - ti

tR2 = t2 - t1

Finalmente con las condiciones de corrida óptimas para el sistema en estudio, se realizaron

cromatografías inyectando las proteínas estándares de forma independiente y una mezcla de

ambas, y posteriormente la fracción IIB2 (ver más adelante, figura 25). El cromatograma obtenido

para la elusión de cada proteína (figura 24-a) muestra que para SP-B hay un primer pico a 1

minuto aprox. (570nm y 280nm) de comenzada la cromatografía, y posteriormente uno de menor

intensidad a los 8 minutos aprox. Para SP-C (figura 24-b) se observa un pico minoritario que eluye

junto con el volumen muerto de la columna, un pico central posterior a los 10 minutos (670nm y

240nm) y uno minoritario cercano a los 9 minutos. En la Tabla 3 se muestran los parámetros

obtenidos para el cromatograma mostrado.


Figura 24: Cromatogramas obtenidos para para SP-B (a) y SP-C (b) midiendo la absorbancia de la sonda a 570nm y

670nm respectivamente y comparándola con la absorbancia a 280 y 240nm respectivamente; utilizando como fase

móvil inicial MeOH+TFA 0.1% : H2O+TFA0.1% (80:20). Se aplicó un gradiente a 100% de MeOH+TFA0.1% el cual se

mantuvo en el tiempo. La elusión mayoritaria de SP-B ocurrió a los 8 minutos y de SP-C a los 11 minutos aprox.

Tabla 3: Parámetros obtenidos del cromatograma mostrado en la figura 21, al inyectar una

mezcla de SP-BSTD y SP-CSTD en una columna de fase reversa C4.

(nm) Tiempo de retención

Área Simetría

240

0.978 - - - - - -

8.526 60.88 1.66

10.416 101.62 2.93

670

0.962 20.12 1.24

9.661 13.20 0.59

10.416 301.84 2.94

280 0.965 - - - - - -

8.527 12.29 1.07

570 0.991 955.49 0.74

8.574 519.91 1.06

a) b)


Al aplicar el nuevo método propuesto para una mezcla de SP-BSTD y SP-CSTD en iguales cantidades

de obtuvieron los cromatogramas que se muestran en la figura 25. Se comparan los

cromatogramas obtenidos para SP-BSTD(a), SP-CSTD (b) y la fracción IIB2 (c) midiendo la absorbancia

a 240 (1) y 280nm (2). En la figura 25-a 1 y 2 se ve uno pronunciado pico a 1 minuto, como se

observó en la figura 24-a que se corresponde con la elusión de SP-B y posteriormente cercano a

los 8 minutos tanto a 240 como a 280nm. La elusión de SP-C se muestra en la figura 25-b 1 y 2;

donde se ve un pico inicial a 1 minuto de comenzada la corrida y un de menor intensidad a los 10

minutos; que se observa a 240nm y es casi imperceptible a 280nm. Para la fracción IIB2 (figura 25-c

1 y 2) se obtuvo un pico mayoritario a un minuto de comenzada la corrida, tal como ocurrió en a) y

b) para ambas proteínas. Para la absorbancia a 240nm también se ve un pico a los 9 minutos

aproximadamente, mientras que para 280nm se ve señal a los 9 y 10 minutos respectivamente.


Figura 25: Cromatograma obtenido al inyectar 20l de SP-BSTD, SP-CSTD y de fracción IIB2 en una columna C4, utilizando como

fase móvil MeOH+TFA 0.1%:H2O+TFA 0.1% (80:20) y posteriormente un gradiente a 100% de MeOH+TFA 0.1% a un flujo de

0.5 ml/min y una presión de 210barr aprox. En 22-1 se muestran los cromatogramas obtenidos para 240nm y en 22-2 se

muestran los obtenidos para 280nm. a) SP-BSTD. b) SP-CSTD. c) Fracción IIB2 proveniente del extracto pulmonar.


Posteriormente se realizó la separación de SP-B y SP-C a escala preparativa (figura 26) partiendo

de una muestra de extracto orgánico pulmonar (sin previa purificación por LH-20). En

concordancia con el perfil cromatográfico obtenido para la separación a escala analítica, se

observa la aparición de un pico en el volumen muerto de la columna (7 minutos), tanto a 240nm

como a 280nm. Avanzada la cromatografía se observó un pequeño pico a 280nm y 240 a los 22

minutos, y posteriormente un pico más pronunciado únicamente a 240nm a los 27 minutos.

Figura 26: Perfil cromatográfico obtenido para la separación de SP-B y SP-C a partir de extracto orgánico pulmonar en

una columna C4 a escala semi-preparativa, utilizando como fase móvil inicial Metanol+ TFA 0.1%: H2O + TFA 0.1% y

finalizando con Metanol+ TFA0.1% al 100%, a un flujo de 2 ml/min. El proceso se siguió mediante medición de

absorbancia a 240 y 280nm respectivamente.


Las fracciones eluidas de las cromatografías realizadas a escala analítica y preparativa se

sembraron en un gel en gradiente, cuyo resultado se muestra en la figura 27. Se sembraron los

picos marcados en la figura 25-c1 (*, **) y en la figura 26 (minutos 7 , 21 , 27 ).

Figura 27: Electroforesis en gel de poliacrilamida en gradiente 4-12%. Carril 1:MPM. Carril 2: elusión de t= 1min

aprox. de la cromatografía mostrada en la figura 22-c. Carril3: elusión de t= 9min aprox. de la cromatografía

mostrada en la figura 22-c.Carril 4: Vacío. Carril 5: SP-BSTD+SP-CSTD. Carril 6:Vacío. Carril 7: elusión de t= 7min aprox.

de la cromatografía mostrada en la figura Carril 8: elusión de t= 21min aprox. de la cromatografía mostrada en la

figura 23. Carril 9: elusión de t= 27min aprox. de la cromatografía mostrada en la figura 23. Carril 10: MPM

El resultado obtenido muestra para las muestras provenientes de la cromatografía preparativa la

presencia de una banda intensa (carril 8) que co-migra con la banda de SP-BSTD (carril 5); y dos

bandas (carril 9) que co-migran con la banda correspondiente SP-C (carril 5). Las siembras corres-

pondientes a la cromatografía realizada a escala analítica generaron una única banda (carril 3) casi

imperceptible.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10


5. DISCUSIÓN

Para la obtención de las proteínas hidrofóbicas del surfactante pulmonar fue necesario purificar

a las mismas presentes en el tejido pulmonar y el LBA, lo cual se realiza clásicamente por

extracciones orgánicas. Dichas extracciones fueron exitosas ya que se logró generar un sistema de

dos fases y extraer únicamente la fase clorofórmica. Para excluir a los componentes lipídicos de la

fracción proteica, la muestra fue separada a través de una columna de exclusión molecular

Sephadex LH-20, permitiendo obtener las proteínas en el volumen muerto de la cromatografía.

Este sistema de cromatografía está basado en una hidroxipropilación de una resina convencional

Sephadex G-25, lo cual permite la utilización de solventes orgánicos.

Previamente Hall et al.94 han demostrado que esta cromatografía permite la separación y

purificación de proteínas, fosfolípidos y colesterol en tiempos crecientes de retención. Para validar

esto y ajustar los tiempos de retención en nuestro sistema recurrimos a el uso de estándares de

cromatografía para los lípidos y análisis por espectrometría de masas de las fracciones eluidas de

las muestras de extracto de surfactante pulmonar (figura 11). De los resultados de espectrometría

de masas es posible identificar a alguno de los fosfolípidos mayoritarios del SP (tal como DPPC,

DOPC, POCP y POPS), así como del colesterol (figura 12).

En la figura 11 se pueden identificar los tiempos de retención para los estándares y en la figura

13 puede verse los cromatogramas obtenidos a partir de la cromatografía de exclusión molecular

LH-20 donde se observa que se logró separar satisfactoriamente a SP-B y SP-C del resto de los

componentes lipídicos. La aparición de un pico agudo permitió inferir que se correspondía con la

elusión de las proteínas de interés, ya que coincidió con los resultados publicados previamente.94

Las re-purificaciones fueron realizadas con el fin de eliminar toda contaminación de lípidos de la

fracción obtenida (IA). La aparición de dos picos luego de la segunda purificación testifica que la re-

purificación resultó exitosa y necesaria. El hecho de haber re-purificado permitió que la fracción

con la que se trabajó posteriormente (IIB2) estuviera libre de lípidos, facilitando en cierto grado los

análisis ulteriores y logrando que la purificación proteica fuera eficiente.

Si bien la estrategia de re-purificación de las proteínas en la columna LH-20 eliminó la

interferencia de los lípidos, la hidrofobicidad de las proteínas en estudio dificultó el procesamiento

de la muestra en cada experimento realizado, debido a que las metodologías desarrolladas están


concebidas para sistemas hidrofílicos. Por dicho motivo hubo que poner a punto las condiciones

experimentarles para cada técnica utilizada; especialmente en las corridas electroforéticas donde

la hidrofobicidad de las proteínas dificultó su migración en el gel. Con el fin de solucionar dicho

inconveniente se realizaron varios geles con diferente porcentaje de poliacrilamida y diferentes

buffer de carga. Se observó que al variar únicamente el porcentaje de poliacrilamida (y

manteniendo el mismo buffer de carga) no mejoraba la entrada de las proteínas al gel ni tampoco

su migración; por lo cual se propuso variar el buffer de carga especial para nuestras proteínas. Se

incrementaron los niveles de SDS a 20% y se adiciono además un detergente no iónico como

CHAPS (10%). Esto mejoró las condiciones ingreso al gel y migración de la muestra para una

resolución satisfactoria en un gel en gradiente.

El resultado obtenido en la electroforesis en gel en gradiente 4-12% mostrada en la figura 14

muestra únicamente bandas de bajo peso molecular, tal como se esperaba (3.7 y 8.7 kDa para SP-

C y SP-B monomérica respectivamente). La presencia de una única banda en cada carril demuestra

la co-migración de las proteínas presentes en las fracciones sembradas, lo que puede deberse a

las interacciones que presentan SP-B y SP-C entre sí cuando se encuentran en la misma solución.

La co-migración evidencia que el porcentaje de poliacrilamida utilizado no es suficiente para lograr

separar ambas proteínas entre sí, por lo cual debería ser necesario aplicar otras técnicas que

permitan su purificación. Para la SP-B no se identificó una segunda banda de mayor peso

molecular, debido a que el buffer de carga utilizado poseía DTT. Dicho motivó llevó a eliminar la

presencia de DTT del buffer de carga para los geles realizados posteriormente de forma de lograr

evidenciar la presencia de SP-B dimérica. La presencia de “smear” observada en el gel muestra en

menor grado la dificultad que implica realizar la electroforesis para estas proteínas.

A partir de la digestión con tripsina y posterior análisis de los fragmentos peptídicos de la banda

recortada del carril 8 (figura 14, fracción IIB2) mediante la técnica MALDI TOF/TOF, se pudo

identificar a la SP-B. El espectro obtenido (figura 15) muestra las señales correspondientes a la

masa de los péptidos y fragmentos, para la SP-B porcina de forma significativa (ver Anexo). No se

logró evidenciar la presencia SP-C, lo cual sea probablemente debido a su baja concentración en la

fracción obtenida del extracto orgánico.

Para la purificación preparativa de la SP-B y SP-C, Crustedt et al 85 ha propuesto un método

utilizando una columna de exclusión molecular Sephadex LH-60 la cual requiere la previa

purificación utilizando la columna LH-20. En 1988, Arjomaa et al 86 propusieron un método


analítico de separación de SP-C mediante HPLC en fase reversa, utilizando para equilibrar la

columna acetato de amonio (pH 6.5) y aplicando un gradiente lineal de 1-propanol 0-80%, el cual

no resultó efectivamente exitoso. Posteriormente, Gustafsson et al 45 propuso otro método para

lograr la purificación de SP-B y SP-C a escala analítica utilizando como fase móvil inicial

Isopropanol+TFA 0.1%. Este método pese a mostrar resultados alentadores no fue utilizado debido

a las elevadas presiones que genera dicho solvente en el sistema cromatográfico y además por el

tiempo de corrida. No existiendo referencias sobre su aplicabilidad a sistemas preparativos.

Bünger et al 87 desarrolló un método diferente a los anteriores, utilizando una cromatografía de

fase reversa y una fase móvil compuesta fundamentalmente por Metanol: Cloroformo en

proporciones 50:50% v/v y acidificados con TFA. El método permitía la elusión en un corto período

de tiempo (5 minutos) a escala analítica y semi-preparativa; por lo cual inicialmente se pretendió

usar dicho método o variaciones del mismo. Lamentablemente no se obtuvo una separación con

buena resolución entre las proteínas hidrofóbicas (figura 16); por lo que se procedió al desarrollo

de un nuevo método capaz de purificar a SP-B y SP-C a escala analítica y preparativa.

Para lograr desarrollar un nuevo método cromatográfico eficiente para la purificación de SP-B y

SP-C se utilizaron a modo de estándares las proteínas puras marcadas con sonda fluorescente (SP-

B/Alexa543 y SP-C/Alexa660). Se realizó una corrida electroforética para SP-BSTD y SP-CSTD (figura 18),

la cual muestra claramente como la presencia o ausencia del agente reductor hace variar el estado

oligomérico de SP-B, pasando de estar en su forma dimérica a la monomérica. Este resultado

infiere que en el stock de SP-BSTD esta proteína se encuentra en su forma mono y dimérica, aunque

la segunda estaría en mayor proporción (evidenciado por la presencia de una banda mayoritaria

en el Carril 5; figura 18). La presencia de agente reductor para SP-CSTD no modificó su patrón de

migración, lo cual era previsible ya que esta proteína existe únicamente en forma de monómero y

no es esperable una reducción de los enlaces tioéster de sus palmitoilos.

Los estándares de cada proteína presenta el color característico a la luz visible de las sondas

(rosado para SP-B y lila para SP-C), lo que permitió identificar que estas proteínas luego de

tratadas con tripsina en los geles no eluian con el tratamiento convencional de ACN: Agua 60/40

(v/v). Por dicho motivo fue necesaria la utilización de nuevos protocolos de extracción: ACN 100%,

ACN: Isopropanol (50:50), Isopropanol: Ácido fórmico (90:10) e incluso Cloroformo: Isopropanol

(50:50); pero en ninguno de estos procedimientos se tuvo éxito. Finalmente se utilizó una mezcla


de Ácido fórmico: ACN: Isopropanol: H2O (50:25:15:10) propuesta por Feick et al 93 para péptidos

hidrofóbicos en gel, la cual logró la liberación de los mismos para su posterior análisis de

espectrometría de masas.

En la figura 19 a y b se muestran los espectros de masa entera obtenidos para la siembra directa

de las proteínas puras marcadas fluorescentemente. En la figura19-a se aprecian dos señales

mayoritarias para SP-BSTD (10511 y 21027 Da aproximadamente), que junto con el resultado

mostrado en la figura 18 permite afirmar que SP-BSTD está bajo su forma de monómero y dímero.

En la figura 19-b, se pueden ver dos señales mayoritarias de SP-C (4187 y 5012 Da

aproximadamente). Esta proteína se presenta únicamente en su forma de monómero (en

concordancia con el resultado obtenido para la figura 18), por lo que las señales se corresponden

a la proteína marcada con la sonda y sin marcar, ya que la diferencia entre ambas es el peso de la

sonda Alexa660 (1100 Da aproximadamente).

La co-migración de ambas proteínas es evidente en el gel en gradiente como puede verse en la

figura 20, lo que se aprecia de manera inequívoca por el revelado por de la fluorescencia. Además

es posible identificar otras bandas de menor intensidad entre la forma mono y dimérica, así como

por encima de la masa molecular de la forma dimérica. Esto puede deberse a la combinación de

proteínas no marcadas y multi-marcadas con la sonda fluorescente que genera una modificación

de masa de aproximadamente 1 kDa por cada adición. La figura 19-a no es totalmente

concluyente en esta hipótesis, pero es posible ver unos picos menores en masa a los mayoritarios

para la forma mono y dimérica, que podrían explicarse por la alternancia en el marcado de la

proteína.

Los resultados de la migración de la fracción IIB2 indican la presencia de la proteína SP-B en su

estado monomérico mayoritariamente; y es esperable que sea la responsable de la mayor

intensidad de la banda, dado que se encuentra habitualmente en una relación 10:1 con respecto a

la SP-C. Dado los resultados que se obtuvieron para las proteínas marcadas fluorescentemente, es

esperable la presencia de una única banda para SP-B y SP–C debido a la escasa capacidad

resolutiva que presenta el gel en gradiente para estas proteínas.

Para el desarrollo de un nuevo método cromatográfico que permita obtener una separación

eficaz de SP-B y SP-C, se hizo un estudio previo de las características de elusión de cada proteína.

Las cromatografías realizadas para SP-B (figura 21) mostraron que es necesaria la presencia de

un porcentaje de agua (20%) en Metanol (80%) para que esta proteína logre adherirse a la


columna. Esta relación debe mantenerse, ya que experimentalmente se vio que un menor

porcentaje de agua favorece su elusión junto con el volumen muerto, y un porcentaje superior

favorece su precipitación. La presencia de un pico anterior al pico principal de elusión de SP-B

puede corresponderse con la especie monomérica de esta proteína, lo cual se explica por la menor

hidrofobicidad y fuerzas de adhesión a la columna que presenta frente a la forma dimérica (figura

21 a y b). Los picos que se identifican después del pico mayoritario asociado a la forma dimérica

(aprox. 18 minutos) podrían deberse, tal como se mencionó anteriormente, a formas mono y

multi-marcadas de la proteína, así como combinaciones de subunidades con diferente número de

marcas.

Para la purificación de la SP-C fue necesario superar algunos aspectos técnicos en el sistema de

detección del equipo utilizado. Particularmente, la lámpara halógena y el fotomultiplicador (PMT)

que posee el detector del HPLC Agilent 1100, tiene una caída en sus respuestas de iluminación y

detección para longitudes de onda mayores a 650nm (ver catálogo de fabricante). Por dicho

motivo la proteína marcada con Alexa-660 no lograba ser efectivamente excitada a 670nm y la

respuesta del PMT resultaba ser extremadamente pobre a 700nm. Esto llevó a decidir utilizar la

absorbancia de la sonda a 670nm para monitorear la cromatografía.

Para la purificación de la SP-CSTD luego de intentos fallidos con diferentes mezclas de Cloroformo:

Metanol, así como diferentes gradientes; se logró su purificación en una columna C4 mediante la

utilización del método de Bünger et al 87. La identificación del estándar de SP-C no resuelve lo que

previamente hemos demostrado a la co-elusión de ambas proteínas en el método propuesto por

Bünger y sus colaboradores, por lo cual se propuso un nuevo método que mejora la resolución y

separación de ambas proteínas mediante cromatografía en fase reversa.

En la puesta a punto del método cromatográfico se modificaron las proporciones de Agua:

Metanol: Cloroformo, así como los tiempos de gradiente y espacios estacionarios.

Particularmente, fue necesario el incremento el porcentaje de agua inicial para retener

suficientemente a ambas proteínas y al mismo tiempo separarlas entre sí. Luego de un gradiente

lineal de metanol 80 a 100% en 10 minutos, es necesario un período de cromatografía en modo

isocrático a 100% de Metanol para eluir a SP-C y sin la necesidad de incluir cloroformo en el

sistema. Los cambios cromatográficos y las variaciones en los parámetros pueden ser observados

en la figura 23 y tabla 2.


Para la optimización de las condiciones cromatrográficas las proteínas marcadas permitieron

trabajar de manera independiente con cada una de ellas buscando un sistema óptimo que

permitiese separar a ambas proteínas sin la necesidad de una cromatografía de exclusión

molecular previa. Para esto se intentó primeramente eluir SP-B cerca del volumen muerto y

retener a SP-C con un porcentaje de agua que no indujera la precipitación de las proteínas. Los

porcentajes menores al 20% de H2O+0.1%TFA no fueron eficientes para separar a ambas

proteínas; y además era necesario incluir una breve gradiente de Cloroformo+0.1%TFA con el fin

de eluir a SP-C (figura 23). Sin embargo, luego de varias pruebas de gradientes y mantenimiento

de metanol isocrátrico tras un gradiente lineal, fue posible identificar que SP-C eluia

independientemente de la presencia de cloroformo, por lo cual se varió finalmente la

cromatografía que se observa en la figura 23-d al patrón que se propone en la figura 24, donde SP-

B y SP-C eluyen a tiempos de retención razonable y sin solapamiento.

Del análisis de los resultados en la puesta punto de la purificación de SP-B y –C se desprende que

los estándares de las proteínas no fueron un sistema completamente puros, lo que dificultó

enormemente la puesta punto del método. Esto pude haberse debido a la presencia de

monómero y dímeros para SP-B (tal como se revela en el gel de la figura 21), así como las

modificaciones en peso e hidrofobicidad por el mono/multi-marcado de las proteínas. Pese al

esfuerzo realizado por el grupo del Prof. Pérez-Gil en el marcado y purificación de las proteínas, es

evidente que la columna LH-60 no es capaz de separar diferencias de masas tan sutiles como las

mono/multi-marcadas de la sonda, ni tampoco la forma monomérica y dimérica de SP-B.

Luego de trabajar con la mezcla de proteínas puras de SP-B y SP-C se procedió a purificar la

muestra proveniente del extracto pulmonar. La figura 25 muestra la comparación a 240 y 280nm

para la elusión de SP-BSTD, SP-CSTD y la fracción IIB2. Como se observó en la figura 24 para la mezcla

de ambas proteínas, la elusión de SP-B (25-a) ocurrió a los 8 minutos aproximadamente (a ambas

longitudes de onda), mientras que la elusión de SP-C (25-b) tuvo lugar aproximadamente a los 11

minutos, evidenciado únicamente a 240nm. Esto era esperable dado que la SP-C no posee

triptófanos para que pueda ser detectada a 280nm. Para la mezcla de proteínas presentes en la

fracción IIB2 se observó un pico a los 8 minutos aproximadamente a 280nm y otro aproximado a

los 9 minutos de iniciada la corrida a 240nm. En todos los casos se obtuvo señal a 240 y 280nm en

el volumen muerto, el cual fue sembrado posteriormente en un gel junto con la elusión a los

9minutos (figura 27).


A escala preparativa se realizó una cromatografía en fase reversa aplicando el nuevo método

desarrollado con variaciones en los tiempos de gradiente y períodos isocrátricos. Se inyectó una

muestra de extracto orgánico sin purificar previamente en la columna LH-20, y se obtuvo el

resultado que se muestra en la figura 26. Se puede observar que de forma similar al resultado

mostrado en la figura 25, hay un pico a 240 y 280nm que se corresponde con el volumen muerto

de la columna (aproximadamente a los 7 minutos para la columna utilizada). Posteriormente se

obtuvieron picos a los 22 (240 y 280nm, correspondientes a SP-B) y 27 minutos aproximadamente

(240nm, correspondiente a SP-C) los cuales fueron recolectados. El cromatograma obtenido fue

similar al adquirido a escala analítica, lo que demuestra que el método desarrollado es aplicable a

ambas escalas; permitiendo obtener mayor cantidad de proteínas que los métodos propuestos

anteriormente para la purificación de SP-B y SP-C. Al mismo tiempo, el resultado obtenido muestra

que no es imprescindible realizar una purificación previa del extracto orgánico mediante LH-20

para obtener la purificación satisfactoria de SP-B y SP-C, ya que se tuvo una separación entre los

picos de cada proteína similar a la obtenida a escala analítica para la fracción IIB2 (previamente

purificada por LH-20).

Todos los picos obtenidos en la cromatografía realizada a escala preparativa fueron sembrados

en el gel de poliacrilamida mostrado en la figura 27 junto con los picos eluidos para la

cromatografía a escala analítica de la fracción IIB2 (figura 25-c, previamente mencionado). Las

siembras de los picos correspondientes a los volúmenes muertos de cada columna (carriles 2 y 7)

no muestra la presencia de bandas, por lo que los picos observados en la cromatografía no se

corresponden con elusión proteica. Este hecho evidencia que la fase móvil inicial del nuevo

método desarrollado logra la interacción entre las proteínas y la fase estacionaria de forma

óptima. La siembra del pico eluido a los 9 minutos de la cromatografía a escala analítica (carril 3)

generó una banda muy tenue de bajo peso molecular, que migró a la misma altura que SP-CSTD.

Dado que dicho pico se evidenció únicamente a 240nm, y migra como una única banda a la misma

altura que el estándar de SP-C utilizado, se puede inferir que dicha elusión posee a SP-C

proveniente del procesado de pulmón porcino. Para las elusiones relativas a la purificación a

escala preparativa se observan bandas de gran intensidad debido a que se tiene mayor

concentración proteica. En el carril 8 (pico eluido a los 22 minutos) se observa la presencia de una

única banda que migra a la misma altura que SP-BSTD; por lo que se infiere que se trata de SP-B

presente en el extracto orgánico. De manera similar, en el carril 9 (pico eluido a los 27 minutos

aproximadamente) se observa la presencia de dos bandas que migraron a la misma altura que las


bandas correspondientes al estándar SP-C, por lo que nuevamente se infiere que se corresponde

con SP-C presente en el extracto orgánico.

El método que se logró desarrollar resultó capaz de separar SP-B y SP-C entre sí con mejor reso-

lución que los métodos ya propuestos, siendo útil para lograr la purificación tanto a escala analíti-

ca como preparativa.


6. CONCLUSIONES

A partir de la cromatografía de exclusión molecular se concluye que se logró poner a punto el

método para separación de proteínas hidrofóbicas, lípidos y colesterol del surfactante pulmonar.

Con el fin de separar a SP-B y SP-C se aplicó el método desarrollado por Bünger et al 87. Al aplicar-

lo, los resultados obtenidos mostraron que éste no resulta efectivo para la separación entre SP-B y

SP-C, lo que nos planteo el desafío de desarrollar un nuevo método que permitiera la purificación

de las mismas a escala analítica y preparativa.

Con el fin de desarrollar un nuevo método de purificación de SP-B y SP-C se utilizaron ambas pro-

teínas puras marcadas con sondas fluorescentes (SP-BSTD y SP-CSTD) que permitieron tener los pa-

trones de migración electroforética y elusión cromatográfica de dichas proteínas. Los geles en

gradiente de poliacrilamida evidenciaron que SP-BSTD se encontraba en forma de monómero y

dímero; lo que se vio respaldado por el resultado obtenido al realizar espectrometría de masa

entera (sin digerir con tripsina) de esta proteína. Para SP-CSTD, los geles en gradiente mostraron

que la misma se encontraba en su forma monomérica, y el resultado de masa entera mostró que

en dicho stock había SP-C marcada con sonda y sin marcar. Mediante fluorescencia se pudo detec-

tar la presencia de Alexa530 en los carriles en que se había sembrado únicamente SP-CSTD y se vio

Alexa660 en los carriles en que solamente se había sembrado SP-B. Dichos resultados permiten

concluir que la purificación y el marcado de SP-B y SP-C realizado por el grupo de Pérez-Gil no re-

sulto satisfactorio, habiendo contaminación de una proteína con otra, así como posiblemente

sonda libre. Respecto a la siembra de la fracción purificada IIB2 se vio que migra a la misma altura

que la mezcla de SP-BSTD y SP-CSTD, por lo cual el gradiente de poliacrilamida no permitió obtener la

resolución necesaria para separar a ambas proteínas presentes en una misma mezcla. La intensi-

dad de la banda correspondiente a la fracción IIB2 muestra que se obtuvo una buena concentra-

ción de proteínas luego de la purificación y re-purificación mediante LH-20.

La utilización de las proteínas marcadas con sonda fluorescente permitió evidenciar que las mis-

mas no logran ser extraídas del gel mediante métodos convencionales. Por dicho motivo se aplicó

el método descripto por Feick et al 93, el cual logró remover a las proteínas del gel de manera efi-

ciente. Los resultados obtenidos a partir de espectrometría de masa evidencian la presencia de SP-

B en la fracción de extracto orgánico purificada, aunque no muestran señales correspondientes a


SP-C. Dado que la relación entre ambas proteínas es de 10:1 creemos que la ausencia de señales

de esta última se debe a su concentración extremadamente baja en el extracto pulmonar.

La puesta a punto del nuevo método a desarrollar para purificar a SP-B de SP-C evidenció que es

necesaria la presencia de una pequeña cantidad de agua (20%) para lograr que ambas proteínas

interaccionen con la fase estacionaria; ya que un porcentaje menor favorece la elusión de ambas

junto con el volumen muerto de la columna, y un porcentaje mayor favorece la precipitación de

las mismas. A su vez, la puesta a punto del método permitió llegar a la conclusión de que es estric-

tamente necesaria la mantención en el tiempo de la fase 100% Metanol+0.1%TFA para lograr la

separación satisfactoria entre SP-B y SP-C.

Los cromatogramas obtenidos al utilizar las proteínas marcadas con sonda fluorescente mostra-

ron también que SP-B estaba en su forma de dímero y monómero, y que probablemente la misma

estuviera conjugada con una única molécula de Alexa530 o más de una. Para SP-C se obtuvieron

múltiples picos lo que probablemente se deba a degradación del stock al mismo tiempo que SP-C

mono o multi-marcadas.

Mediante cromatografía en fase reversa se logró separar efectivamente SP-B de SP-C, obtenien-

do gran separación temporal entre la elusión de ambas proteínas, tanto a escala analítica como

preparativa. A su vez, a escala preparativa se logró la separación de SP-B y SP-C provenientes del

extracto orgánico sin purificar previamente mediante cromatografía de exclusión molecular en LH-

20.

El conjunto de resultados obtenidos permite afirmar que se pudo desarrollar un método croma-

tográfico que permite obtener la separación de ambas proteínas con buena resolución, tanto a

escala analítica como preparativa, en cortos períodos de tiempo utilizando HPLC en fase reversa.


7. PERSPECTIVAS A FUTURO:

El estudio del SP y su funcionalidad resulta indispensable para el desarrollo de nuevas tecnolo-

gías que permitan avanzar en el combate de la mortalidad de los prematuros así como mejorar su

calidad de vida más allá de los primeros meses de vida. Por ello el estudio de las proteínas hidro-

fóbicas del SP resulta indispensable, ya que sus funciones son elementales en la dinámica del

mismo. El desarrollo de un nuevo método cromatográfico rápido y eficiente que permite separar

SP-B y SP-C, y la puesta a punto de las metodologías empleadas, deja sobre la mesa las condicio-

nes necesarias para continuar con el estudio de este sistema de forma más exhaustiva y así avan-

zar en una problemática de gran relevancia a nivel local y mundial.

En un futuro resultará fundamental un análisis de las propiedades tensoactivas de ambas proteí-

nas, dado que se ha evidenciado anteriormente que el método de purificación condiciona esta

capacidad39, pero resulta claro que dicho trabajo excede los objetivos de esta tesina.

Pensamos que el estudio de las propiedades funcionales así como estructurales en la organiza-

ción supramolecular del surfactante pulmonar, permitirá comprender de mejor manera los meca-

nismos involucrados en disfunciones del surfactante pulmonar durante la patología pulmonar y

proponer nuevas terapéuticas con diseño específico para cada patología.


8. AGRADECIMIENTOS:

Quisiera agradecer en primera instancia al Dpto de Fisiopatología, que bajo la tutoría del Dr. Arturo Briva y

co-tutoría del Dr. Leonel Malacrida me permitió finalizar con la pasantía de grado e involucrarme en su pro-

yecto. Gracias al Dr. Arturo Briva por la tutoría de este proyecto y brindarme esta posibilidad.

En particular quisiera agradecerle al Dr. Leonel Malacrida quién estuvo en cada paso de este proyecto, y

quién me enseñó no solo las metodologías a emplear sino a investigar a fondo y plantear nuevos horizontes.

Muchas gracias.

También quiero agradecer a la Unidad de Bioquímica y Proteómica Analítica (UByPA) del Institut Pasteur de

Montevideo bajo la dirección de los Dres. Carlos Batthyány y Rosario Durán, quienes abrieron las puertas a

este proyecto poniendo a nuestro alcance materiales y personal humano para poder desarrollar las metodo-

logías empleadas. Gracias por su disposición en todo momento, especialmente cuando se hizo cuesta arriba.

Un agradecimiento particular a todos los integrantes de la Unidad que colaboraron desde el cominezo con el

desarrollo de las técnicas empleadas.

Debo agradecerle al equipo de trabajo del Dr. Jesús Pérez-Gil, de la Universidad Complutense de Madrid, en

particular a él y a la Dra. Mercedes Echaide quienes proporcionaron a las proteínas SP-B y SP-C purificadas y

marcadas con sonda fluorescente. Sin su colaboración no habría sido posible el desarrollo de este método

por lo que les agradezco enormemente su disposición.

Finalmente, quiero agradecerle a las personas que Dios ha puesto en mi camino y cuyo apoyo y amor fueron

indispensables para mi, no solo durante el desarrollo de esta tesis sino durante toda mi carrera. Un gracias

especial a Griselda, Denisse, Nilda, Wilda, Jorge, Jorgen, amigas y amigos que fueron y son fundamentales

para mí. Gracias por su preocupación, apoyo y aliento en cada momento.


9. ANEXO

Resultados de espectrometría de masa obtenidos para la fracción IIB2 analizada:

Se identificó la siguiente secuencia de SP-B proveniente de la especie Sus scrofa de manera signi-

ficativa:

FPIPLPFCWLCRTLIKRIQAVVPKGVLGKAVAQVCHVVPLVVGGICQCLAERYIVILLNMLLDRTLPQLVCGLVLRCS

a)


Figura A.I: Fragmentaciones obtenidas a partir del espectro mostrado en la Fig 15, a partir de los precursores 962.48,

1184.69, 1362.75 ,1491.80 (a, b, c y d respectivamente)

b)

c)

d)


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