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Purificación de proteínas Métodos cromatográficos
M. en C. Esdras Israel Carrizosa Carbajal
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Secuencia experimental típica para purificar una proteína:
Obtención de extractos libres de células
Seleccionar una fuente biológica. Tejido celular, proteína recombinante
Solubilización. Liberar la proteína de su fuente(lisis osmótica o enzimática,
ruptura mecánica) y solubilizarla en un amortiguador acuoso
Estabilización. Temperatura, pH, fuerza iónica, reducción residuos Cys
Separación. Fraccionar el extracto crudo por centrifugación
Precipitar selectivamente la proteína(Solventes, PEG, Sulfato de amonio)
Detección. Desarrollar un ensayo para identificar y cuantificar la proteína
deseada.
Aislamiento
Efectuar cromatografía de intercambio iónico (CARGA)
Efectuar cromatografía de filtración en gel(TAMAÑO)
Efectuar cromatografía de afinidad(AFINIDAD)
Determinar pureza y tamaño molecular por electroforesis en gel.
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TÉCNICAS DE SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS
Aunque la tecnología de proteínas recombinantes puede aumentar la
concentración de una proteína específica dentro de la célula, el
problema de la separación la proteína deseada de todos los otros
componentes celulares permanece
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• Biomoléculas son purificadas usando técnicas de cromatografía que separan de acuerdo a las diferencias en sus propiedades especificas.
Propiedad Técnica
TAMAÑO Cromatografía filtración en gel (GF)
CARGA Cromatografía de intercambio iónico (IEX)
BIORECONOCIMIENTO(ESPECIFICIDAD POR LIGANNDO)
Cromatografía de afinidad (AC)
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Fraccionamiento por cromatografía en columna
• Fase estacionaria: material sólido y poroso colocado en una columna
• Fase móvil: solución tamponada que se hace fluir a través de la columna
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a)El volumen total (Vt), que es el volumen que ocupa el cilindro de gel
hidratado.
b) El volumen de vacío (Vo), o el volumen existente entre las esferas del gel.
c)El volumen ocupado por las esferas del gel, que se expresa como la
diferencia entre los dos volúmenes anteriores: Vt-Vo.
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Cromatografía de filtración en gel o exclusión
por tamaño Size Exclusion Chromatography (SEC)
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• Fase estacionaria es un polímero poroso con poros de un rango de tamaño definido.
• Salen primero las mas grandes, luego las mas pequeñas. El tamaño de una proteína se define como su Masa molecular (en Daltones).
FUNDAMENTO TEÓRICO
Principio de exclusión molecular
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Materiales para la filtración en gel
• Un gel es una red tridimensional cuya estructura estáentrecruzada al azar. Los geles utilizados como tamizmolecular son polímeros hidrofílicos e insolubles cuyascadenas poliméricas se entrecruzan hasta formar una redtridimensional.
• Los geles normalmente utilizados son : dextrano, agarosa ypoliacrilamida. El gel de dextrano (polímero ramificado deglucosa, entrecruzado y formado en pequeñas bolitas) secomercializa con el nombre de SEPHADEX. Existen distintostipos, según el tamaño de poro, proporcionando límites deexclusión comprendidos entre 1 y 200 000 daltons. Estos gelesse identifican por una denominación de G-10 hasta G- 200, loque se refiere a la capacidad de retención de agua del gelmultiplicada por 10.
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Resinas superdex consisten de una base de matriz
compuesta de dextrano y agarosa. Esta
matriz combina las excelentes propiedades SEC de dextrano
con la física y química
estabilidad de la agarosa reticulada, lo que resulta en una
resina con excelente selectividad y alta
resolución.
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Proceso de separación de SEC
Típico cromatograma de SEC
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Akta pure Superdex 200 HR 10/30
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Se puede calcular el tamaño de una proteína desconocida
Vol de elución
Existe una relación lineal entre el volumen de elución y el
logaritmo del peso molecular de las proteínas
Medir el volumen de elución de una proteína desconocida para
llevarlo a una recta de calibración permite determinar el peso
molecular
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Diálisis y ultra centrifugación
Amicon® Ultra Centrifugal Filters
Permiten eliminar sales y concentrar proteínas
Tienen membrana de corte que va de los 10-100KDa
15 mL 4mL
500 µL
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Cromatografía de intercambio iónico
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Fundamento teórico• Se basa en la carga eléctrica de las proteínas.
• Se aplica en una matriz de carga opuesta a la de la proteína que se quiere purificar.
• Se debe tener un pH determinado.
• Las proteínas se eluyen de menor a mayor fuerza de unión.
• La fase estacionaria consiste de un polímero que tiene unido grupos cargados: carga
negativa intercambiador catiónico; carga positiva intercambiador aniónico.• Intercambiadores catiónicos: CM celulosa (con grupos COO-)
• Intercambiadores aniónicos: DEAE celulosa (con grupos NH+)
Suma de las cargas de las cadenas laterales de los aminoácidos, Dependen de: pH y pKa; ambiente que los rodea
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• Se utiliza principalmente para separar una proteína de otroscontaminantes siempre que las diferencias entre las cargas seansuficientemente grandes.
• Separa aminoácidos, péptidos, nucleótidos y generalmente compuestosiónicos.
En laboratorios clínicos se utiliza para separación de hemoglobina,
isoenzimas y esteroides.
Usos
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Cromatograma de intercambio iónico
Gradiente de elución linear Gradiente de elución escalonado
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Matrices de cromatografía de intercambio iónico
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Macro-prep High S de Bio rad
pH solución> pI= proteína carga(-) por desprotonación.
pH solución< pI= proteína carga(+) por protonación
pH solución =pI =proteína carga(0) precipitado insoluble
Es una resina de intercambio catiónico fuerte que contiene grupos funcionales sulfonato que es ideal para purificar proteínas y péptidos básicos y neutros
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Pasos de preparación y purificación
• Equilibración.
• Aplicación de muestra y lavado.
• Elución. Estrategias de elución. Para
romper las interacciones electrostáticas entre la proteína y la matriz, se eleva la concentración del contra-ion (sal). Contra iones (sodio o cloruro, bajo PM), -En concentraciones bajas : son desplazados por la proteína, -En concentraciones altas : compiten con la proteína.
• Otras estrategias de elución. Al cambiar
el pH del buffer, cambia la afinidad de unión
de la proteína.
• Regeneración.
pH solución> pI= proteína carga(-) por desprotonación.
pH solución< pI= proteína carga(+) por protonación
pH solución =pI =proteína carga(0) precipitado insoluble
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Cromatografía de afinidad
• Un ligando específico es capaz de unirse a una proteína (No covalente)
• El ligando se une covalentemente a una matriz cromatográfica porosa e inerte.
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Fundamento teórico
• Se basa en la afinidad biológica específica de cadaproteína hacia un ligando en
particular.
• Esta puede ser:
Proteína– Ligando
Enzima – SustratoReceptor – HormonaAnticuerpo-Antígeno
• La cromatografía de afinidad (AC) separa las biomoléculas sobre la base de una interacción reversible
• entre una biomolécula (o un grupo de biomoléculas) y un ligando específico acoplado a un
• matriz de cromatografía
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Matriz cromatográfica• Químicamente inerte con un ligando que puede estar directa o
indirectamente acoplado
• Tiene alta porosidad y una extremadamente baja adsorción no
especifica
• Gran número de grupos funcionales capaces de formarenlaces covalentes con los ligandos
Buenas propiedades de flujo para rápida separación.
• El más usado: Agarosa, también se usan polímeros deacrilamida y sílices CPG.
• Estabilidad bajo un rango de condiciones experimentales
tales como pH alto y bajo, detergentes y agentes disociantes
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Pasos preparación de columna
1. El ligando se une covalentemente
a una matriz.
2. La mezcla de proteínas se hace
pasar por la matriz.
3. Se une sólo la que reconoce al
ligando (unión no covalente)
4. Las demás proteínas y el resto se
eluye.
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Brazos espaciadoresA) Se observa una baja capacidad de unión debido a la interferencia estérica, es decir, el ligando no puede acceder a la unión sitio de la molécula objetivoB)En estas circunstancias, un "brazo espaciador" esinterpuesto entre la matriz y el ligando para facilitar la unión efectiva
El efecto de los brazos espaciadores
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Estrategias de elución
Se desprende la proteína por adición de sal, pH, temperatura o exceso
de ligando libre.
Método 1:El caso más simple. Un cambio en la composición del buffer eluye la proteína unidasin dañarlo ni al ligando.
Método 2: pH extremos o altas concentraciones de agentes caotrópicos (daño )
Método 3 y 4:Elución específica mediante la adición de una sustancia que compite por el enlace
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Resina Cibacron blue 3G-A DEAE affi-gel blue gel
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Ventajas• Capacidad de explotar sus propiedades bioquímicas (únicas).
• Se evitan varios pasos de purificación que con otras técnicas clásicas.
• Normalmente se obtienen altos rendimientos y altaactividad especifica.
• Se pueden separar proteínas, enzimas, anticuerpos, membranas, receptores, vitaminas, antígenos incluso células enteras.
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Conclusiones
• Técnica muy específica
• Altos rendimientos y eficiencia
• Purificación eficiente con menos pasos posibles
• Ampliamente usada en bioquímica para
medicina y farmacia
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Paso de
purificación
Vol de fracción
(mL)
Proteína total
(mg)
Actividad (U) Actividad específica
(U/mg)
Extracto crudo
F1
1,400 10,000 100,000 10
Precipitación con
(NH4)2SO4 F2
280 3000 96000 32
Cromatografía
exclusión de
tamaño F4
Desalado
90 400 80,000 200
Cromatografía
intercambio
iónico
FIA,FIB,FIC
80 100 60,000 600
Cromatografía
de afinidad
FPA,FPB,FPC
6 3 45,000 15,000
Purificación de un enzima hipotético x
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Manuales para diferentes columnas
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