proyecto v.4.0 05.09.2012. hfn

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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS

Aplicacin de la metodologa cientfica para evaluar la

eficacia de un quelato frrico de nueva sntesis en su uso

como fertilizante de micronutrientes.

PROYECTO FIN DE CARRERA Elena Formaux Nieto

Madrid, Septiembre 2012

Tutor: Dr. Felipe Yunta Mezquita. Dpto. Geologa y Geoqumica. Universidad Autnoma de Madrid.

Co-tutor: Dra. Paloma Nadal Ruiz. Dpto. Qumica Agrcola.

Universidad Autnoma de Madrid.

Aplicacin de la metodologa cientfica para evaluar la eficacia de un quelato frrico de nueva sntesis en su uso como fertilizante de micronutrientes.

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PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA MEMORIA

Ponencias y comunicaciones en congresos.

Martin, I.; Grate, A.; Lucena, J.J.; Formaux, E. y Yunta, F.; 2012. Evaluacin preliminar de un mtodo de lavado para estudiar la efectividad de la aplicacin foliar de fertilizantes de micronutrientes. XIV Simposio Hispano-Luso de nutricin mineral de las plantas. Universidad Autnoma de Madrid. 23al 26 julio 2012. Poster

Publicaciones en Libros Colectivos

I Martn, A Grate, JJ Lucena, E Formaux, F Yunta 2012. Evaluacin preliminar de un mtodo de lavado para estudiar la efectividad de la aplicacin foliar de fertilizantes de micronutrientes. En. Nutricin Mineral de las Plantas como base de una Agricultura Sostenible. Libro de Comunicaciones del XIV Simposio Hispano-Luso de nutricin mineral de las plantas. ISBN: pendiente. Edi.


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AGRADECIMIENTOS Existen muchas personas a quienes nombrar en el presente trabajo por

todo el apoyo que he recibido en su realizacin y, por ende, resulta

imposible nombrarlas a todas.

Aun as, mi primer agradecimiento he de dedicrselo al Doctor Felipe

Yunta, mi tutor en este proyecto. Gracias por tu paciencia, que ha sido

infinita, por darme la oportunidad de trabajar contigo y, sobre todo, gracias

por ser un gran docente.

En segundo lugar, quiero nombrar a mi hermano Pedro, quien, a pesar

de no haber estado presente en muchos momentos, s que se sentir muy

orgulloso de m, y que me ha enseado que, a pesar de los obstculos que

nos encontremos, debemos luchar para conseguir aquello que queremos.

En tercer lugar, a mi cuada Celia, y a mis sobrinas Carolina y Laura, por

haberme apoyado en los momentos ms difciles, y por haberme dado un

capn bien merecido cuando me he desviado de mi camino.

En cuarto lugar, a mi familia, mi madre, mi padre, mi abuela, mis

hermanos (Sandra, Salomn, Ezequiel, Bacambe), porque s que para ellos

es un orgullo que siga adelante en mi formacin acadmica con xito.

Menciono, especialmente, a mi hermana Sandra y su marido Juan, quienes

siempre me han ayudado en todo lo posible, tanto moralmente como

econmicamente, para poder llevar a cabo esta gran tarea. Y, por supuesto,

a mis sobrinas Kendra y Nerea.

En quinto y ltimo lugar, a todos mis amigos: Rubn, Laura, Elena,

David, Mohamed, Olga, Estefana, Carlos y Juan Carlos, porque gracias a los

momentos de felicidad que me han aportado, y a las largas charlas que he

tenido con todos y cada uno de ellos, he podido seguir adelante a pesar de

las adversidades. Recibe especial mencin mi amiga Elena, quien me ha

acompaado durante este arduo y largo camino, apoyndome

incondicionalmente, y hacindome ver que puedo hacer lo que me

proponga.

Gracias a todos y cada uno de vosotros, hoy soy quien soy, y es por eso

que os dedico este trabajo a todos. Gracias.


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La naturaleza benigna provee de manera que, en cualquier parte, halles algo que aprender.

- Leonardo Da Vinci-


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ndice

PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA MEMORIA .........................1

ndice ........................................................................................5

1. Introduccin ......................................................................7

2. Objetivo del ensayo .........................................................21

3. Materiales y mtodos ......................................................22

3.1. Aplicacin edfica sobre un suelo agronmico. ............22

3.2. Aplicacin foliar del agente quelante en hojas de vid ...31

4. Resultados y discusin ....................................................38

4.1. Ensayo en suelo agronmico. .......................................38

4.2. Ensayo de aplicacin foliar............................................56

5. Conclusiones ....................................................................65

5.1. Ensayo en suelo agronmico ........................................65

5.2. Ensayo en aplicacin foliar............................................66

6. Bibliografa. ......................................................................68


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Abreviaturas

AAS: Espectrometra de Absorcin Atmica.

BPDS: cido Batofenantrolindisulfnico.

CEN-EN: Comit Europeo de Normalizacin. Normativa a nivel europeo.

13C-RMN: Resonancia Magntica Nuclear de Slido.

DOUE: Diario Oficial de la Unin Europea.

DTPA: cido Dietilen-Triamin-Pentaactico.

EDDHSA: cido Etilen-Diamin-bis (2-hidroxi-5-sulfonatoetil) actico.

EDDS: cido Etilen-Diamino-Disuccnico.

EDTA: cido Etilen-Diamino-Tetraactico.

HEDTA: cido 2- hidroxi-etilendiamino-triactico.

ICP-MS: Espectrometra de Masas con fuente de Plasma de Acoplamiento

Inductivo.

IDHA: cido Imino-Disuccnico.

LS: Lignosulfonato.

o,o EDDHA: cido o,o Etilen-Diamino-Dihidroxi-Fenilactico.

o,p EDDHMA: cido etilendiamino-di (o-hidroxi-p-metilfenilactico)

OMS: Organizacin Mundial de la Salud.


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1. Introduccin El hierro (Fe) es un micronutriente esencial en los organismos vivos por ser un

constituyente indispensable de un gran nmero de enzimas que intervienen en su

metabolismo. En el caso concreto de las plantas, este elemento participa en la

sntesis de la clorofila, siendo esencial en el proceso de fotosntesis y en el

mantenimiento de la estructura del cloroplasto (Abada et al., 2004). Interviene,

adems, en procesos como la respiracin, la fijacin de nitrgeno (Clark, 1983) y

en la sntesis de ADN y hormonas (Briat y Lobraux, 1997).

La deficiencia de este micronutriente es, por tanto, una alteracin nutricional

que debe ser solventada debido, precisamente, a las funciones que realiza. A esta

deficiencia se la denomina clorosis frrica, y se manifiesta por un amarilleamiento

en las zonas intervenales de las hojas jvenes, permaneciendo los nervios con

tonalidad verde. La principal consecuencia de esta deficiencia en las plantas es la

disminucin en la produccin agrcola, que se debe, sobre todo, a la reduccin en la

produccin de los fotosintatos necesarios para el crecimiento y desarrollo de la

planta (Miller et al., 1984). En el caso de los rboles frutales, el efecto sobre la

produccin es muy significativo, ya que disminuyen tanto la produccin del fruto

como su calidad (lvarez-Fernndez et al., 2003; lvarez-Fernndez et al., 2006).

Otra consecuencia relevante de esta deficiencia, es que las plantas son la principal

fuente de hierro en la dieta de la poblacin mundial, por lo que bajos niveles de

este alimento acabaran afectando a la salud humana. De hecho, segn la

Organizacin Mundial de la Salud (OMS), 2 billones de personas en el mundo

sufren anemia por la carencia de este nutriente (Santi y Schmidt, 2009).

Esta alteracin afecta a una gran variedad de especies y regiones geogrficas,

como Espaa, Italia, Francia, EE.UU, Turqua, etc., siendo las especies vegetales ms

susceptibles a sufrirla la soja (Glycine max), el cacahuete (Arachpis hypogaea), el

frijol (Phaseolus vulgaris), el sorgo (Sorghum bicolor), el arroz (Oryza sativa), los

ctricos, el melocotonero, la vid (Vitis vinfera) y el tomate (Orera, I., 2010).


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Es importante mencionar, adems, el impacto econmico que supone esta

deficiencia en agricultura, debido no slo a que se produce un descenso en la

produccin y el valor nutricional de las partes de la planta, sino tambin al elevado

precio de algunos fertilizantes frricos (estimado en 200-400 ha-1 para rboles

frutales (Rombol y Tagliavini, 2006)).

Causas de la deficiencia de Fe

La deficiencia de este micronutriente en las plantas se debe, generalmente, a la

combinacin de varios factores:

- Baja disponibilidad de Fe en los suelos. Los suelos contienen, por norma

general, elevadas concentraciones de hierro, pero en muchos de ellos, su

disponibilidad es muy baja. Esto sucede principalmente en suelos alcalinos

y calizos (pH 7,5-8,5), en los que el hierro se encuentra en forma de xidos e

hidrxidos poco solubles (Lindsay y Schwab, 1982). Su elevado contenido

en caliza (CaCO3) produce un efecto tampn que dificulta la solubilizacin

de estos xidos e hidrxidos. As, los factores que determinan la

disponibilidad de Fe en el suelo son el pH, el tipo de mineral del que

procede el Fe (ya que cuanto ms soluble sea el mineral, mayor

concentracin de Fe habr disponible en el suelo), y la superficie especfica

del mineral (ya que, cuanto menor sea sta, ms lenta ser la liberacin del

Fe (Schwermann, 1991)).

La presencia del in bicarbonato en los suelos influye negativamente en la

biodisponibilidad del Fe, ya que consumir los protones que se puedan

producir, evitando as la participacin de stos en la solubilizacin de los

hidrxidos frricos (Lucena, 2003). Puede afectar, adems, al crecimiento y

metabolismo de las races (Yang et al., 1994), al transporte de Fe a la parte

area, y a la disponibilidad fisiolgica del Fe en las hojas (Alhendawi et al.,

1997). Igualmente, la presencia de este in puede producir la alcalinizacin

del apoplasto y el citoplasma de las clulas vegetales, lo que podra causar


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la precipitacin del Fe en dichos compartimentos (Romera et al., 1992) y

una disminucin de la actividad reductasa frrica de la raz (Susn et al.,

1996).

Asimismo, otras caractersticas del suelo, como la elevada proporcin de

arcilla y carbonato (Kashirad y Marschner, 1974; Kolesch et al., 1987a,b),

falta de materia orgnica, alta humedad, poca aireacin, elevada salinidad

(Award et al., 1988) y alta concentracin de fosfatos (Lindsay y Schwab,

1982), afectan negativamente a la disponibilidad del Fe.

- Factores relacionados con la absorcin y metabolismo del Fe. Dentro

de estos factores destacan los que inhiben el crecimiento de las races, tales

como la compactacin y encharcamiento del suelo (Chen y Barak, 1982), las

bajas temperaturas y la adicin de herbicidas (Chaney, 1984), y los que

inhiben la absorcin del Fe, como la presencia de fosfatos y metales pesados

(Lucena, 2003).

- Factores que afectan a la actividad del Fe dentro de la planta. Se ha

observado en frutales crecidos en el campo que el contenido de Fe en las

hojas de las plantas deficientes puede ser similar o incluso algo superior al

de las hojas verdes y, sin embargo, presentar sntomas de deficiencia de Fe

(Orera, I., 2010). Este fenmeno es conocido como la paradoja de la

clorosis frrica (Morales et al., 1998) y sugiere que el Fe podra acumularse

en alguna zona de la hoja (principalmente en los nervios principal y

secundarios (Jimnez et al., 2009)) en una forma no asimilable por la planta.

Adems, se ha propuesto que los fosfatos y un elevado pH del apoplasto

podran provocar la precipitacin del Fe en el exterior de la clula

impidiendo su utilizacin (Mengel y Geurtzen, 1986).


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Adquisicin de hierro por la raz en condiciones de deficiencia de hierro

La toma de hierro por parte de las plantas se realiza directamente de la

solucin del suelo mediante un proceso de absorcin activa a travs de las races

(Uren, 1984), principalmente en su forma de Fe (II) (excepto en el caso de las

gramneas, que lo toman en forma de Fe (III)). Cuando hay elevada concentracin

de Fe disponible, las plantas tienden a utilizar sistemas de transporte de Fe de baja

afinidad y a absorber tan slo la cantidad necesaria para su crecimiento. Cuando

hay escasez de Fe biodisponible, las plantas pueden permanecer indiferentes

(plantas no eficientes) o desarrollar mecanismos de adaptacin para aumentar su

capacidad de adquirir Fe del suelo (plantas eficientes). Dependiendo del

mecanismo de adaptacin desarrollado por la planta para la adquisicin de Fe en

ambientes deficientes en este elemento, las plantas se clasifican en dos grupos

distintos:

- Plantas de Estrategia I. A este grupo pertenecen las plantas dicotiledneas

y monocotiledneas no gramneas. Se caracterizan por desarrollar, en

condiciones de deficiencia de Fe, una serie de respuestas que afectan a la

fisiologa, estructura y morfologa de las races, incluyendo un incremento

en la reduccin de los quelatos de Fe (III) a Fe (II) en la superficie de la raz,

y el transporte del Fe (II) a travs de la membrana celular de la epidermis

de la raz. Los genes que codifican la enzima Fe (III)-quelato reductasa

localizada en la membrana plasmtica de las clulas de la raz (FCR o FRO2

(Robinson et al., 1999)) y el transportador del in ferroso (IRT1) (Conolly et

al., 2003) han sido identificadas en la especie Arabidopsis (Nadal et al.,

2009). El aislamiento de estos genes y su implantacin en estos cultivos,

puede tener implicaciones para la generacin de cultivos con un mecanismo

de adquisicin de Fe mejorado.

- Plantas de Estrategia II. Las plantas gramneas producen y secretan a la

rizosfera compuestos de bajo peso molecular llamados fitosiderforos (PS).

Debido a su alta afinidad por el Fe, los fitosiderforos quelan y solubilizan

de forma muy eficaz el Fe (III) del suelo, formando complejos de


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Fe (III)-fitosiderforo (Fe(III)-PS) que son tomados por la raz a travs de

un sistema de transporte de alta afinidad.

Correccin de la deficiencia de Fe

Existen diferentes metodologas para prevenir y/o tratar la clorosis frrica:

- Mejora gentica y seleccin de cultivares existentes. Estas tcnicas son

de carcter preventivo, por lo que deben adoptarse antes de la implantacin

del cultivo. Solventan la deficiencia de hierro mediante el cultivo de

especies resistentes, obtenidas tanto por tcnicas tradicionales de seleccin

como por modificacin gentica (Charlson et al., 2003).

- Prcticas agrcolas apropiadas. Utilizadas en cultivos ya establecidos,

estas prcticas consisten en eliminar los riesgos de alcalinizacin,

compactacin y encharcamiento del suelo (Romera y de la Guardia, 1992),

favoreciendo un buen drenaje (Chen y Barak, 1982). Otra prctica habitual

en rboles frutales y viedos es su cultivo junto con otras plantas anuales,

reduciendo as la compactacin y aumentando la porosidad, filtracin y

contenido en materia orgnica suelo (Tagliavini y Rombol. 2001). Entre

estas plantas anuales se incluye el cultivo de especies con Estrategia II, que

excretan fitosiderforos capaces de aumentar la solubilidad del Fe en el

suelo (Rombol y Tagliavini, 2006). La adicin de enmiendas como la

materia orgnica (sustancias hmicas) y acidificantes se lleva a cabo para

favorecer la solubilizacin del Fe existente en el suelo pero que no est

disponible para las plantas.

- Fertilizantes. Actualmente, la adicin de productos fertilizantes es la

tcnica ms eficaz y comn para corregir deficiencias de Fe en cultivos ya

establecidos, aunque depende de la forma en que se adiciona el Fe:

o Sales inorgnicas de hierro: El sulfato ferroso se ha aplicado

tradicionalmente al suelo para corregir las carencias de hierro

(Rombol y Tagliavini, 2006), aunque esta prctica resulta

ineficiente, ya que el Fe2+ del sulfato ferroso se oxida rpidamente a


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o Fe3+ y precipita en forma de hidrxido frrico, dejando de estar

disponible para la planta.

o Complejos de hierro: Al igual que los quelatos, que explicaremos a

continuacin, los complejos son molculas formadas por un in

metlico aceptor de electrones y por una sustancia orgnica capaz de

compartir los electrones con el metal. La diferencia entre quelatos y

complejos est basada en la fortaleza del enlace y en su naturaleza

sinttica o natural.

o Quelatos sintticos: Constituyen la tcnica ms eficiente para

corregir la clorosis frrica (Chen y Barak, 1982). Por tratarse de los

productos utilizados en el presente ensayo, se les dedicar una

mayor atencin en las siguientes pginas.

Formacin y propiedades de los quelatos.

La quelatacin es la capacidad de un compuesto qumico para formar una

estructura en anillo con un in metlico, dando como resultado un compuesto

organometlico con propiedades diferentes de las que tena anteriormente,

secuestrando al in metlico en cuestin e impidiendo que ste siga sus

reacciones qumicas normales. La estructura del quelato tiene forma de anillo, en

cuyo interior queda englobado el in metlico (Figura 1.1).

Figura 1.1: Estructura de un quelato de Fe (Fe-o,oEDDHA) usado como fertilizante. (Fuente:

lvarez-Fernndez et al., 2006).


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En condiciones normales, los metales estn presentes en la solucin del suelo

en su forma hidratada, esto es, rodeados de molculas de agua. Ante la presencia

de un agente quelante, estas molculas son reemplazadas por dicho agente

quelante, al que se denomina ligando (que posee dos o ms grupos funcionales

capaces de compartir pares de electrones con un in metlico central (Shenker y

Chen, 2005)), y producindose entonces el fenmeno de formacin del quelato

(Yunta et al. 2003b).

Propiedades de los quelatos

Estequiometra

Muchos quelatos se forman en una proporcin molar 1:1 metal:ligando (M:L).

Dependiendo de las condiciones existentes, pueden formarse complejos estables

con una mayor proporcin de in metlico o una mayor proporcin de ligando.

Constantes de estabilidad

La formacin de un quelato es una reaccin de equilibrio y, por lo tanto,

reversible hacia la formacin/disolucin del quelato:

M+L ML

La determinacin de la constante de estabilidad de un quelato puede obtenerse

a partir de la siguiente expresin:

Esta constante determina la afinidad de la molcula de agente quelante por el

in metlico (lvarez-Fernndez et al., 2006).

En el mbito de los quelatos frricos, los quelatos de EDTA, DTPA y HEDTA no

son estables al pH de los suelos calizos, ya que a pH superiores a 6 el zinc, el

manganeso o el calcio desplazan al hierro de la molcula de quelato (lvarez-

Fernndez et al., 2006). Por otro lado, el Fe-o,o-EDDHA y el Fe-o,p-EDDHMA son

estables en el intervalo de pH de 4 a 9, habiendo demostrado ser muy eficaces en

la correccin y control de la clorosis frrica (lvarez-Fernndez et al., 2006).

Cte. Estabilidad = Log K =


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Orden de quelatacin

Si en el medio se encuentra ms de un metal, el quelato que se forme

inicialmente ser aqul que tenga una constante de estabilidad mayor, es decir, el

metal que posea una mayor constante de estabilidad en la formacin de complejos

desplazar a aquellos metales que tengan una constante de estabilidad menor.

Yunta et al., (2003 a, b, c) realizaron la sntesis y la posterior determinacin de las

constantes de protonacin y estabilidad de agentes quelantes y quelatos de Fe, Ca,

Mg y Cu anlogos al o,o-EDDHA.

Fuerza de la quelatacin

La fuerza de los agentes quelantes se clasifica atendiendo a sus constantes de

disociacin. Esta propiedad debe tenerse muy en cuenta a la hora de aplicar el

quelato, puesto que el hecho de que sea un agente demasiado estable puede

provocar que no se libere el metal y, por lo tanto, deje de ser activo para la planta

(Yunta et al. 2003b).

Tipos de quelatos

Los quelatos pueden ser de origen natural (complejos) o sinttico (quelatos

sintticos).

Aquellos que son de origen natural, y que son permitidos en nuestro pas para

aplicaciones foliares y fertirrigacin, incluyen el cido lignosulfnico, el cido

glucnico, el cido heptaglucnico, las sustancias hmicas, los aminocidos libres y

el cido ctrico (Rodrguez-Lucena, 2010). Para la correccin de la clorosis frrica,

los lignosulfonatos (polmeros naturales que se obtienen como subproducto de la

industria del papel y pueden formar complejos con metales) han demostrado ser

eficaces en peral cuando los complejos eran aplicados por va foliar (Raese y Staiff,

1988).

Los agentes quelantes de origen sinttico son los ms utilizados a pesar de su

elevado coste, ya que son muy eficientes a la hora de suministrar micronutrientes a


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la planta, siendo los ms utilizados los cidos poliaminocarboxlicos. Este grupo

se clasifica en dos grandes subgrupos dependiendo de la presencia o ausencia de

grupos fenlicos en su estructura, siendo el principal agente quelante no fenlico el

EDTA, y el principal fenlico, el o,o-EDDHA.

Para el caso concreto del hierro, los quelatos sintticos ms usados son el

Fe (III)-EDTA, Fe (III)-o,o-EDDHA, Fe (III)-DTPA, Fe (III)-EDDHSA y Fe (III)-o,o-

EDDHMA. Sin embargo, debido a su escasa biodegradabilidad y, por consiguiente,

al problema medioambiental que generan, se estn proponiendo nuevos quelatos

sintticos ms biodegradables, entre los que destacan el cido iminodisuccnico

(IDHA) y el cido etilendiaminodisuccnico (EDDS; Rodrguez-Lucena et al.,2010 y

Villn et al., 2007).

Evaluacin de la eficacia de los quelatos

La eficacia de un quelato para suministrar un determinado nutriente a la planta

depende de la calidad de formacin, de su estabilidad, de la persistencia del metal

quelado en la solucin del suelo y de la capacidad del quelato para aportar el in a

la planta en las condiciones de cultivo. Los tres primeros factores se pueden

estudiar desde un punto de vista qumico, mientras que para estudiar el ltimo se

precisa de una evaluacin agronmica. Yunta et al. (2003c) reportaron una

metodologa cientfica para la determinacin de las constantes de estabilidad y de

protonacin de dichos agentes quelantes, y su posterior evaluacin en condiciones

de suelo/planta mediante el uso de modelos computacionales. Aun as, es

necesario conocer su comportamiento en condiciones agronmicas.


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Evaluacin qumica

Segn el Reglamento de la UE (DOUE, 2003) los agentes quelantes deben ser

identificados y cuantificados con los mtodos descritos en las normas CEN-EN

13368-1 (2001a) para los compuestos a base de EDTA. DTPA y HEDTA, y en la

CEN-EN 13368-2 (2001b), especfico para las molculas de Fe-EDDHA y Fe-

EDDHMA. Para evaluar este ltimo mtodo de anlisis, se hizo un estudio (Garca-

Marco et al., 2003) que consisti en pruebas inter-laboratorios en las que se

comparaba dicho mtodo por el desarrollado por Lucena et al., en 1996 (lvarez-

Fernndez et al., 2006). Ambos mtodos dieron resultados similares cuando se

aplicaron a compuestos de EDDHA-Fe, pero en las formulaciones a base de Fe-

EDDHMA, el contenido del componente activo determinado por el mtodo de

Lucena et al. (1996) era inferior al propuesto por el mtodo de la Unin Europea

(Garca-Marco et al., 2003). El motivo de estos resultados es que el mtodo de

Lucena et al. (1996) era capaz de distinguir los ismeros de estas molculas, por lo

que finalmente la UE adopt el mtodo de Lucena et al. (1996) como mtodo oficial

de anlisis, aunque con unas pequeas modificaciones realizadas con el fin de

aumentar su robustez (lvarez-Fernndez et al., 2006).

Evaluacin agronmica

La evaluacin agronmica de un quelato puede realizarse administrndolo por

diferentes vas:

1. Aplicacin foliar. La efectividad de esta aplicacin depender de la

formulacin y el procedimiento utilizados (Orera, I., 2010). Para que la

absorcin del Fe en hoja mejore, se adiciona conjuntamente con agentes

tensioactivos que mejoran la capacidad de penetracin del Fe en la hoja

(Fernndez et al., 2009). Aun as, la respuesta a esta aplicacin depender

de factores relacionados con la planta (especie, variedad, etc.), el medio

ambiente en que se encuentre (luz, temperatura, etc.) y factores fsico-

qumicos (Fernndez y Ebert, 2005).


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En cuanto a las aplicaciones foliares, algunos autores recomiendan

disoluciones cidas de quelatos para corregir la deficiencia de Fe (Chen y

Barak, 1982; Wallace, 1988). Otros, en cambio, comprobaron que son ms

eficaces aquellos tratamientos que contienen sales inorgnicas de Fe

(FeSO4) que los de quelatos (lvarez-Fernndez et al., 2004; Fernndez et

al., 2006). Se ha comparado, adems, la eficacia de rociados foliares con

diferentes quelatos y complejos naturales, obtenindose mejores

reverdecimientos para los quelatos sintticos y complejos de aminocidos,

mientras que la movilizacin del Fe hacia las races slo ocurri con los

lignosulfonatos de Fe (Rodrguez-Lucena et al., 2010).

2. Inyeccin al tronco. Este tipo de aplicacin slo se puede realizar en

rboles. La inyeccin de quelatos frricos se lleva a cabo en forma lquida,

pero otro tipo de fertilizantes de Fe (FeSO4 y citrato frrico) se pueden

aplicar en forma slida (Orera, I. 2010). Los estudios realizados muestran

que los implantes slidos de sales inorgnicas (FeSO4) en el tronco tuvieron

un efecto de hasta un ao en peral en la correccin de la clorosis frrica

(Abada et al., 2004; Larbi et al., 2002). Otros estudios compararon el efecto

de inyecciones lquidas de quelatos frricos de Fe-EDDHA y Fe-EDDHMA en

olivo y melocotonero, corrigiendo la clorosis en ambas especies, aunque el

efecto ms prolongado se produjo en el caso del Fe-EDDHMA (Fernndez-

Escobar et al., 1993).

3. Aplicacin al suelo o sustrato. Este mtodo de aplicacin, junto con el de

la fertirrigacin, es el ms utilizado y donde la aplicacin de quelatos

frricos resulta ms eficaz que otros productos como las sales de Fe,

acidificantes y humatos (Lucena, 2003).

Los quelatos ms eficaces para suelos calizos son el Fe-EDDHA y

derivados, ya que el Fe-EDTA y el Fe-DTPA son inestables a pH alcalino

(Orera, I., 2010). Los resultados para quelatos frricos con grupos fenlicos

en su estructura son contradictorios, ya que algunos autores obtuvieron un

efecto ms duradero con un producto de Fe-EDDHMA frente a uno de Fe-

EDDHA en plantas de tomate crecidas en sustrato calizo


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(lvarez-Fernndez et al., 1996), y otros consiguieron un efecto ms

duradero en tratamientos con Fe-EDDHA que con Fe-EDDHMA en girasol,

melocotonero y peral (lvarez-Fernndez et al., 2005).

En solucin nutritiva, se ha comparado la eficacia de cinco quelatos

sintticos (Fe-EDDS, Fe-IDHA y tres formulaciones comerciales de Fe-

EDTA) y diez complejos (humatos, lignosulfonatos, aminocidos,

glicoprotenas, polipptidos, citrato y gluconato) aplicados a plantas de soja

clorticas, obtenindose como resultado que los quelatos sintticos

favorecan el crecimiento de las plantas en mayor medida que los

complejos, as como el incremento en la concentracin de Fe y en el ndice

SPAD (Rodrguez-Lucena et al., 2010).

4. Adicin a las aguas de riego: fertirrigacin. Con este tipo de regado, la

clorosis suele agravarse ya que, adems del uso de aguas y sustratos calizos,

las races de la planta se desarrollan poco, lo que conlleva una menor

superficie de contacto con el sustrato; este hecho hace necesaria la

aplicacin regular de Fe en forma soluble en cultivos fertirrigados (Orera,I.

2010). Las sales inorgnicas no pueden usarse en fertirrigacin porque

precipitan como xidos o fosfatos de Fe, lo que obturara los goteros. Es por

esto que los quelatos sintticos son los fertilizantes frricos ms utilizados

(Lucena, 2003).

Mecanismo de accin de los quelatos frricos sintticos

Estos quelatos se aplican principalmente a plantas de Estrategia I, ya que las de

Estrategia II no suelen padecer deficiencia de Fe (Orera, I. 2010).

El mecanismo de accin propuesto para los quelatos frricos sintticos se

compone de las siguientes etapas (Shenker y Chen, 2005):

1. Adsorcin del Fe (III)-quelato en la raz.

2. Reduccin del Fe (III)-quelato a Fe (II)-quelato mediante una enzima

radicular especfica denominada Hierro Quelato Reductasa (FCR).

3. Disociacin del quelato y liberacin del Fe (II).


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4. Transporte del Fe (II) al interior de la clula a travs del transportador de

membrana IRT1.

La reduccin de los Fe (III)-quelatos fue descrita por primera vez en plantas de

soja, utilizando la formacin del complejo de Fe (II) con cido

batofenantrolindisulfnico (BPDS; Chaney et al., 1972). El agente reductor que se

ha propuesto como donor de electrones a la enzima FCR es el NAD(P)H, siendo el

Fe (III)-quelato el aceptor de electrones (Harrington y Crumbliss, 2009; Shenker y

Chen, 2005).

Tras la disociacin del quelato, el agente quelante queda libre en la solucin del

suelo, pudiendo disolver el Fe nativo del suelo y transportarlo hacia la rizosfera.

Este proceso es conocido como efecto shuttle (Lucena, 2006). Segn este

mecanismo, el agente quelante queda fuera de la planta, y slo el Fe (II) es

incorporado al interior. Adems, el Fe (II) producido por la FCR y no absorbido por

la planta tiene que ser re-oxidado. Se ha propuesto que los propios agentes

quelantes puedan actuar como catalizadores de la reaccin de re-oxidacin,

favoreciendo la formacin, de nuevo, del quelato frrico (Lucena, 2006).

Las caractersticas que idealmente debe tener un quelato para que su uso con

fines agrcolas sea viable son las siguientes (Brown, 1969; Shenker y Chen, 2005):

- El metal quelado no debe ser sustituido fcilmente por otro metal.

- Debe ser estable frente a la hidrlisis.

- No debe descomponerse por la accin de los microorganismos del suelo.

- Debe ser soluble en agua.

- No debe fijarse fcilmente a la superficie de las partculas del suelo.

- Debe estar en forma accesible para la planta.

- No debe ser txico en dosis adecuadas.

- Debe estar en forma fcilmente aplicable al suelo y a la planta.

- Debe ser barato.


2012

20

Marco legal de los fertilizantes La regulacin del uso de estas sustancias se realiz por primera vez en la Unin

Europea en el ao 1976, pero debido a la aparicin de nuevos quelatos sintticos,

en el ao 2003 se elabor el Reglamento 2003/2003 de la Comunidad Europea,

traspuesta al derecho espaol en el Real Decreto 824/2005, en el que se

incluyeron estos nuevos quelatos. En la Tabla 1.1 se muestran los diferentes

agentes quelantes permitidos por dicha normativa, estando sealados en color

negro aqullos que eran ya aceptados en la norma anterior a la vigente.

Tabla 1.1: Lista de agentes orgnicos autorizados y complejantes para micronutrientes.

Fuente DOUE 2003.

cido etilendiaminotetraactico EDTA cido etilentriaminopentaactico DTPA [o,o]: cido etilendiamino-di(o-hidroxifenilactico) EDDHA [o,p] cido etilendiamino-N-(o-hidroxifenilactico)-N-(p- hidroxifenilactico)

EDDHA

cido 2-hidroxietilendiaminotriactico HEEDTA [o,o]: cido etilendiamino-di (o-hidroxi o-metilfenilactico) EDDHMA [o,p] cido etilendiamino-di (o-hidroxi-p-metilfenilactico) EDDHMA [p,o] cido etilendiamino-di (p-hidroxi-o-metilfenilactico) EDDHMA [2,4]: cido etilendiamino-di (2-hidroxi-4carboxifenilactico) EDDCHA [2,5]: cido etilendiamino-di(2-carboxi-5 hidroxifenilactico) EDDCHA [5,2]: cido etilendiamino-di (5-carboxi-2-hidroxifenilactico) EDDCHA cido etilendiamin bis (2-hidroxi-5-sulfonatoetil) actico EDDHSA cido N,N-di(2-hidroxibenzil)etilendiamino-N,N-diactico (*) HBED (*)

(*) Este agente quelante queda regulado en la Orden PRE/630/2011, y podr ser utilizado siempre y cuando cumpla los requisitos del Reglamento CE no 1907/2006, del Parlamento Europeo y del Consejo, relativo al registro, evaluacin, autorizacin y restriccin de las sustancias y preparados qumicos (REACH).

En el Reglamento 2003/2003 CE, se indica que un fertilizante a base de quelato

de hierro debe contener un mnimo del 5% de hierro soluble en agua, del cual la

fraccin de hierro quelado debe ser de, al menos, un 80% (Diario Oficial de la

Unin Europea, DOUE 2003). Adems, en la etiqueta debe detallarse el contenido

de hierro quelado por cualquiera de los agentes quelantes presentes en la

formulacin en una concentracin superior al 2%, as como el intervalo de pH que

garantiza una buena estabilidad de la fraccin de hierro quelada (DOUE 2003).


2012

21

Desde el ao 1995 hasta la actualidad, se han realizado diversos estudios sobre

la calidad de las formulaciones comerciales de los quelatos de hierro. As, en 1996

se desarroll un mtodo que permita determinar la cantidad de hierro unido a la

molcula de agente quelante (Lucena et al., 1996). Este mtodo de anlisis se

aplic a un gran nmero de formulaciones comerciales en Espaa entre los aos

1998 y 1999 que declaraban contener EDDHA como agente quelante en la etiqueta,

dando como resultado que todos los productos presentaban contenidos de Fe-

EDDHA inferiores al contenido requerido por la directiva europea en vigor

(Hernndez-Apaolaza et al., 1997; lvarez-Fernndez, 2000). Esta falta de calidad

de los productos se atribuy a la presencia de otros compuestos en la formulacin

comercial que se producan durante el proceso de sntesis de la parte orgnica de

la molcula, siendo identificadas aos despus las estructuras de algunos de estos

compuestos, resultando ser, en muchos casos, molculas muy parecidas a los

componentes activos de las formulaciones (Cremonini et al., 2001; lvarez-

Fernndez et al., 2002; Garca-Marco et al., 2006).

2. Objetivo del ensayo

En este ensayo, se ha aplicado la metodologa cientfica para evaluar la eficacia

de un nuevo agente quelante sinttico para corregir la clorosis frrica. Para ello, se

han realizado varios ensayos agronmicos aplicando el quelato de nueva sntesis,

elaborado con dos compuestos de Fe diferentes, siguiendo las normas de

utilizacin habituales con este tipo de compuestos, aplicacin directa en el suelo

(como el caso del o,o-EDDHA/Fe) y rociado va foliar (como el caso del EDTA). Se

ha realizado una aplicacin edfica sobre un suelo agronmico, donde se

cultivaron plantas de soja (Glycine max L. Klaxon), y una aplicacin foliar en vid

(Vitis Vinifera L. cv. Tempranillo sobre el portainjerto R-110). Adems, para el

ensayo en aplicacin foliar, se realizaron lavados de la materia vegetal con dos

disolventes orgnicos diferentes, Tween 80 (lvarez Fernndez et al., 2001) y

Triclorometano (CHCl3) (Jetter et al., 2000) con el fin de evaluar el efecto del

mtodo de lavado sobre la valoracin del contenido total de micronutriente en la


2012

22

hoja, mediante la comparacin de la concentracin potencialmente absorbida de

un micronutriente, que en este caso fue el Fe (Martin et al., 2012).

3. Materiales y mtodos

3.1. Aplicacin edfica sobre un suelo agronmico.

Se realiz un cultivo con plantas de soja (Glycine max L. Klaxon), por ser una

variedad ineficiente en la captacin de hierro, y susceptible a desarrollar clorosis

frrica (Lucena et al., 2009). El ensayo vegetal se realiz en cmara de cultivo

durante 56 das a partir de la germinacin de las semillas y sobre un suelo calizo.

Se realizaron 3 muestreos vegetales a partir de la aplicacin de los

correspondientes tratamientos (10/05/2011). La cmara de cultivo de

investigacin dispone de funcin fotoperiodo modelo CCKF 0/16985. Durante la

realizacin del ensayo, el ciclo de cultivo utilizado fue: 16 horas de da a 28 C y

40% de humedad, y 8 horas de noche, a 20 C y 60 % de humedad. La intensidad

de luz fue 10872 lum m-2.

Preparacin y anlisis del suelo y la arena

Para el presente ensayo se utiliz un suelo agronmico con alto contenido en

caliza activa sobre el que se cultivan frutales para produccin, y sobre el que se

aplican, de forma anual, correctores frricos, debido a la presencia sistemtica de

clorosis frrica. Se eligi un suelo calizo procedente de Valencia (vase Tabla

3.1.2). Se prepar inicialmente el suelo secndolo, destruyendo los agregados y

tamizndolo a travs de un tamiz de 2 mm de luz de malla.

Dicho suelo agronmico se mezcl con arena caliza para mejorar la estructura

del suelo con el fin de poder muestrear las races al final del ensayo biolgico, y

para acentuar las condiciones alcalinas de dicho ensayo y as evaluar la eficacia de

los productos ensayados (vanse Tablas 3.1.1 y 3.1.2).


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Tabla 3.1.1: Composicin qumicas de la arena utilizada.

Tabla 3.1.2: Propiedades fsico-qumicas del suelo agronmico.

Macronutrientes (NH4Ac)

cmolc /Kg

Ca 5,13 Mg 2,92 K 0,51 Na 0,14 Micronutrientes (Soltanpour) cmolc/Kg

Fe 5,26 Mn 4,52 Cu 1,07

Zn 3,00

Propiedad Contenido

CaCO3 (g/Kg) 975 SiO2 (g/Kg) 11,0 Al2O3 (g/Kg) 1,8 MgCO3 (g/Kg) 11,5 Fe2O3 (g/Kg) 0,55 Densidad (Kg/L) 2,60 CaO (g/Kg) 548

Propiedad Contenido

Arena (g/Kg) 435 Limo (g/Kg) 80 Arcilla (g/Kg) 485 Textura Arena arcillosa pH(H2O) 7,92

pH (KCl) 7,66 C.E. (extracto 1:5) (dS/m) 0,270 M.O (oxidada) (g/Kg) 9,2

N Kjeldahl (g/Kg) 0,3 C/N 30,7

CaCO3 Total (g/Kg) 380 Caliza activa (g/Kg) 89


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Cultivo de las plantas de soja Se pusieron a germinar 400 semillas de soja (Glycine max L. cv Klaxon).

Previamente se lavaron con agua destilada durante 30 minutos (para hidratarlas y

eliminar posibles residuos), cambiando esta agua cada 10 minutos. La germinacin

se realiz poniendo las semillas en bandejas de plstico, cubrindolas con papel de

celulosa saturado con agua destilada. Se dejaron germinar durante 72 horas en

oscuridad y en estufa a 30 oC y 60 % de humedad relativa.

Pasado este tiempo, se seleccionaron 120 semillas con un estado de

germinacin homogneo. Se colocaron en bandejas de hidropona pura durante 7

das para favorecer el desarrollo de la plntula con una disolucin nutritiva

estndar 5 veces diluida (Tabla 3.1.3).

Tabla 3.1.3: Composicin de la disolucin nutritiva utilizada en el cultivo hidropnico.

Sal

Inorgnica Concentracin

Ca(NO3)2 0,2 mM KNO3 0,18 mM K2SO4 0,04 mM MgSO4 0,02 mM KH2PO4 0,02 mM NaCl 7 M H3BO3 2 M Na2MoO4 0,01 M EDTA/Na2 23,1 M CuSO4 0,2 M MnSO4 0,5 M CoSO4 0,2 M ZnSO4 2 M NiCl2 0,2 M HEPES 0,02 mM KOH 0,01 mM EDTA/Fe 5 M Zn 0,04 mM


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Se trata de una disolucin nutritiva tamponada en micronutrientes en

donde se aade una concentracin de agente quelante (EDTA) mayor que la

suma de todos los micronutrientes para, de esta forma, asegurar que todos

ellos se encuentran formando el quelato correspondiente y, as, se evita la

precipitacin de alguno de ellos en la disolucin nutritiva, evitando la

interferencia sobre el contenido en raz. Esta disolucin se prepar, por

dilucin, a partir de disoluciones concentradas de las sales inorgnicas

correspondientes enrasando su volumen a 10 L. La concentracin final de

hierro fue 5 M, y el pH final de la disolucin se ajust a 7.5.

Transcurridos 4 das en hidropona, se indujo la clorosis frrica. Para ello se

elimin cualquier fuente de Fe de la disolucin nutritiva, dejando el resto de

nutrientes en la misma concentracin.

Despus de 10 das de la germinacin, se trasplantaron 70 semillas a tiestos.

Cada tiesto se dise para contener 600 g de una mezcla compuesta por 70%

del suelo anteriormente descrito y un 30% de arena caliza (p/p). Se saturaron

con agua destilada tras su preparacin, y se mantuvieron al 80 % de la

capacidad de campo antes del trasplante, restituyendo la cantidad de agua

perdida cada da, por pesada. Se cubrieron con papel de aluminio para evitar el

paso de la luz al suelo y que as no se desarrollaran algas ni se produjera una

fotodegradacin de los quelatos de hierro (Hill-Cottingham, 1955; Gmez-

Gallego et. al., 2005).

A partir de ese da, y hasta el da en que se realiz el tercer y ltimo

muestreo, las plantas se regaron con una disolucin nutritiva de

macronutrientes, cuya composicin figura en la Tabla 3.1.4.

Tabla 3.1.4.: Composicin de la disolucin nutritiva de riego.

Ca(NO3)2 0,2 mM KNO3 0,18 mM K2SO4 0,04 mM MgSO4 0,02 mM KH2PO4 0,02 mM


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Adems, se prepar otra disolucin nutritiva de igual composicin en

macronutrientes que la anterior, aunque contena Zn-EDTA en una concentracin

de 0,04 mM con el fin de cubrir las necesidades de la planta respecto a este

micronutriente. sta se aada 2 veces por semana, y el resto de das de la semana

se regaba diariamente con la disolucin de macronutrientes, manteniendo la

capacidad de campo de los tiestos al 80%. A ambas disoluciones se les aada 0.1

g/L de CaCO3 y de NaHCO3, y se ajustaba el pH a 7.5.

Inicialmente se colocaron 70 tiestos y, antes de la aplicacin de los

tratamientos se retiraron los 10 tiestos cuyas plantas presentaban un desarrollo

fenolgico no homogneo.

Durante todo el ensayo biolgico, se estim la concentracin de clorofila en

hoja mediante el ndice SPAD con un equipo Minolta SPAD 502 tres veces por

semana. Esta medida se registr separando entre los diferentes desarrollos foliares

de las plantas, segn los pisos de hojas emergentes.

Aplicacin de los tratamientos Tras 4 das del trasplante a tiestos (14 das desde la germinacin) de cada una

de las 70 plntulas, se aplicaron los diferentes tratamientos (10/05/2011),

considerndose este da como el inicio del experimento. Los tratamientos fueron:

Control sin Fe, Quelato Sinttico 1 con hierro (QS1/Fe), Quelato Sinttico 2 con

hierro (QS2/Fe) y cido Etilendiamino-N,N-di[(orto-hidroxifenil)actico] con

hierro (o,o-EDDHA/Fe). Se prepararon para que todos ellos tuvieran una

concentracin de 840 M. Se dise un experimento con cinco repeticiones

(tiestos) por tratamiento, y tres muestreos. En cada muestreo, se coga una planta

entera de tal forma que en cada muestreo se quitaban 20 plantas (vase Esquema

1).


2012

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Las nuevas formulaciones a ensayar tienen una relacin ligando:metal de 2:1,

siendo determinado el porcentaje de hierro quelado mediante resonancia

magntica nuclear de slido (13C-RMN).

La formacin de los correspondientes quelatos de Fe a partir de los agentes

quelantes o,o-EDDHA/Fe, QS1/Fe y QS2/Fe se realiz siguiendo el procedimiento

descrito por lvarez-Fernndez et al. (2002), en el que sobre una disolucin del

agente quelante se aadi el volumen necesario de una disolucin concentrada de

Fe (III) manteniendo el pH durante dicho proceso entre 5 y 7 para evitar la

precipitacin del Fe aadido y/o la ruptura del quelato durante dicho proceso. El

pH del quelato de Fe (III) resultante se ajust a 7,0 0,2 con HCl o NaOH.

Esquema 1. Diseo del experimento biolgico para estudiar la eficacia de un nuevo quelato frrico.

Se aplicaron 5 mL de disolucin 840 M de Fe quelado en cada tiesto (QS1/Fe,

QS2/Fe y o,o -EDDHA/Fe (vase figura 3.1.1.).

Figura 3.1.1: Disposicin de los tiestos en la cmara de cultivo

4 Tratamientos

(15 plantas por tratamiento)

Total: 60 plantas

3 Muestreos eliminatorios. 5 plantas por tratamiento en cada muestreo.


2012

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Muestreos de material vegetal y sustrato de cultivo 1. Material vegetal

Se realizaron tres muestreos a los 7, 21 y 42 das tras la aplicacin de

tratamientos, respectivamente.

Antes de retirar las plantas de soja de los tiestos, se fotografiaron, para

poder evaluar posibles sntomas visuales.

En la realizacin del muestreo, se separaron las diferentes partes de las

plantas (hojas sin pecolo, tallos con pecolo y races), y se procedi a su

pesado, con el fin de obtener el peso fresco de los mismos. Una vez pesados,

se lavaron con Tween 80 al 0.1% en solucin 0.1 M HCl (lvarez-

Fernndez et. al., 2003), para eliminar las impurezas inorgnicas que

pudieran existir en los tejidos vegetales, y despus en agua y agua destilada,

respectivamente. Seguidamente, se llevaron a la estufa, separadamente, y se

mantuvieron durante 3 das a 65oC, tras los cuales se volvieron a pesar,

obteniendo as el peso seco, y, por diferencia, el contenido en humedad.

Una vez secas, todas las muestras correspondientes a las diferentes

partes de la planta, se molieron. Una vez molidas, se procedi a su

mineralizacin, esto es, la destruccin de la materia orgnica por

incineracin en horno de mufla a 480 oC para el anlisis de Fe total de la

planta (MAPA, 1994).

Atendiendo a la cantidad de muestra vegetal obtenida, se pesaron 0,10,

0,25 0,50 g en balanza analtica, en crisoles de porcelana. En cada tanda se

incluyeron dos crisoles como blanco de muestra.


2012

29

Se introdujeron los crisoles con las muestras vegetales en la mufla fra,

procediendo a la incineracin, siguiendo la siguiente rampa de

temperaturas:

- Subida a 180 oC, 45 minutos.



- Subida a 480 oC, 2 horas.

Una vez finalizada la incineracin, se dejaron enfriar las muestras en el

horno durante 24 horas.

A continuacin, se redisolvieron las cenizas, se humedecieron las

muestras contenidas en los crisoles con agua MilliQ y, seguidamente, se les

aadi 6 gotas de agua MilliQ, y HCl suprapur (volumen aadido en funcin

del peso de la muestra). Se taparon los crisoles con vidrio de reloj y se

calentaron sobre placa a 80 oC durante 30 minutos. Al terminar este proceso,

y una vez enfriadas las muestras, se filtraron las mismas con un filtro exento

de cenizas y se enrasaron con agua milliQ (el enrase depender del peso de

muestra vegetal que se tenga, enrasndose a 10 mL las muestras que

pesaban 0,10 g, a 25 mL las muestras que pesaban 0,25 g y a 50 mL aqullas

que pesaban 0,50 g, respectivamente). La determinacin del Fe total se

realiz mediante AAS.


2012

30

A modo de resumen, en la Figura 3.1.2., se adjunta un cronograma del ensayo vegetal, realizado en el ao 2011.

Figura 3.1.2: Cronograma del ensayo vegetal.


2012

31

3.2. Aplicacin foliar del agente quelante en hojas de vid

Para la realizacin de este estudio, se utilizaron 30 vides (Vitis vinfera L. cv.

Tempranillo sobre el portainjerto R-110) en sombrculo durante diez das (6-

15 junio de 2011). El diseo experimental fue de 5 tratamientos con 5

repeticiones por tratamiento, siendo la unidad experimental una cepa en su

segundo ao en un tiesto de 25 dm3 (Martin et al., 2012). Cada tiesto se rellen

con una mezcla de un sustrato comercial (Universal de PONS) y grava caliza,

en relacin sustrato:grava 2:1, para alcanzar un pH final de la mezcla de 7,20

(tabla 3.2.1.) (Martin et al., 2012).

Tabla 3.2.1: Propiedades fisicoqumicas del sustrato, de la grava caliza y de la mezcla.

Propiedad Suelo

Densidad (Kg/L) 0,35 pH (H2O, pasta saturada) 5,60 C.E. (extracto 1:5) (dS m-1) 0,362

Grava caliza (NH4Ac, cmolc Kg-1)

Densidad (kg/L) 1,38 CaCO3 total (g Kg-1) 975 Calibre (mm) 2-4

Mezcla sustrato:grava caliza (2:1 v:v)

pH (H2O, extracto 1:5) 7,20 C.E. (extracto 1:5) (dS m-1) 0,186

Las cepas se regaron con agua y, ocasionalmente, con una disolucin

nutritiva Hoagland de micronutrientes, a excepcin del in Fe, diluida y con

una disolucin de 0,1g CaCO3/ L y 0,1 g NaHCO3/L, con el fin de mantener

condiciones alcalinas para inducir la clorosis frrica (pH del agua del riego

alrededor de 8,4). (Martin et al., 2012).


2012

32

De estas 30 vides, se seleccionaron aquellas 25 que presentaban

homogeneidad en el crecimiento, y en las que se viera claramente el

crecimiento apical.

El esquema del diseo experimental y la disposicin de las cepas lo

observamos en las figuras 3.2.1. y 3.2.2., respectivamente.

Figura 3.2.1: Esquema del diseo experimental. Disposicin de los tiestos en el sombrculo y

los tratamientos aplicados en cada uno de ellos.


2012

33

Figura 3.2.2: Disposicin de los tiestos en el sombrculo. Aplicacin de los tratamientos Se aplicaron los 5 tratamientos con 5 repeticiones/tratamiento. Se prepararon

500 mL de todos los tratamientos, aadindoles un surfactante en concentracin

0,1 % (v/v), concretamente Tween 80. Este surfactante, como habitualmente se

encuentra en los fertilizantes que se aplican va foliar, se aadi para que el

tratamiento se adhiriese a la superficie de las hojas. Todos ellos, excepto el Control,

se prepararon con una concentracin de 5 mM de Fe. El pH de todos estos

tratamientos se ajust a un valor de 5.0.

Control-Fe: Este tratamiento no contiene Fe, es decir, no administramos

ninguna fuente de Fe exgena.

EDTA/Fe: Este tratamiento se elabor a partir de EDTA-Na2 (Titriplex

III) y Fe (NO3)3, con una concentracin de 0.1371 M.

FeSO4/Fe: Se prepar directamente a partir de la sal de Fe (II) en

condiciones atmosfricas inertes para evitar la oxidacin del Fe (II).

LS/Fe: Se prepar a partir del agente complejante LS (Lignorit AM),

con una capacidad de complejacin de Fe (III) de 8.6 % de Fe

complejado. En este caso, se le aadi un exceso de Fe del 5% de agente

complejante para evitar la floculacin con el exceso de Fe.


2012

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QS/Fe: Se prepar a partir del agente quelante QS con riqueza del

18.07%, determinada por mtodo espectrofotomtrico.

Una vez preparados los tratamientos y realizado el diseo del ensayo mediante

la asignacin de los tiestos segn los tratamientos, se procedi a la eleccin de las

hojas utilizadas para el ensayo de la siguiente manera:

- Hoja Tratada. Se eligi de cada uno de los tiestos la hoja sobre la que se

aplic posteriormente el rociado foliar. Para ello, se eligi la tercera hoja

a partir del extremo superior de la parte area. Se verific que dicha

hoja no presentase deformaciones, alteraciones nutricionales o

enfermedad. Si as hubiera ocurrido, o bien se descartara el tiesto y se

seleccionara otro en su lugar, o se elegira, en su caso, la cuarta hoja.

Antes de tratar la hoja, se limpi con agua destilada con ayuda de un

algodn para retirar cualquier depsito que pudiera interferir en la

medida final. Esta hoja se marc con una cinta azul. (Figura 3.2.3.).

- Hoja no Tratada. Se eligi la hoja inmediatamente superior a la hoja

tratada, es decir, la segunda hoja desde la parte superior del pice. Esta

hoja se marc con una cinta roja. (Figura 3.2.3.).

Figura 3.2.3: Disposicin de hojas tratadas y no tratadas.


2012

35

Una vez elegidas las hojas a utilizar para la realizacin del ensayo, y antes de la

aplicacin de los tratamientos, se midi el ndice SPAD en las 25 plantas, tanto en

las hojas tratadas como en las no tratadas, para poder llevar un control de la

evolucin de la clorosis frrica y su correccin mediante la aplicacin de los

tratamientos.

Hecho todo esto, se realiz la aplicacin de los tratamientos de la siguiente

manera:

o La hoja tratada se sumergi completamente en la disolucin de cada

uno de los tratamientos, permaneciendo sumergida durante 30

segundos.

o Se realiz una nica aplicacin de los tratamientos a lo largo del ensayo.

Seguimiento del ensayo Durante el perodo de duracin del ensayo (10 das) se realizaron las siguientes

determinaciones:

- Sntomas visuales. Se hizo un seguimiento visual cada dos das para

identificar posibles alteraciones visuales y, sobre todo, para controlar el

riego de las plantas. Se reg antes de la aplicacin de los tratamientos y

no volvi a regarse. El riego inicial se llev a cabo aadiendo 2 L de agua

destilada por tiesto, y se midi el pH en el lixiviado de cada tiesto.

- Medida de SPAD. Se estim la concentracin de clorofila en hoja

mediante la medida del ndice SPAD con un equipo Minolta SPAD 502 en

das intermitentes durante los 10 das de duracin del tratamiento,

haciendo la medida tanto en hojas tratadas como en las no tratadas. El

nmero total de das en que se midi el ndice SPAD fue de 5 das.


2012

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Muestreo final Pasados los 10 das desde la aplicacin de los tratamientos, se finaliz el ensayo

vegetal. Para ello, se realizaron las siguientes determinaciones:

- Medida del SPAD tal y como se realiz durante el ensayo vegetal.

- Se recogieron las hojas tratadas y no tratadas de cada uno de los tiestos

y se metieron en bolsas de plstico separadas.

- En el laboratorio, se procedi de la siguiente manera:

Se pesaron las hojas tratadas y no tratadas enteras para obtener el

dato de peso fresco.

La hoja no tratada se lav con 90 mL de la disolucin que contena

Tween 80 con HCl 0.01 M durante 10 segundos, otros 10 segundos

en agua de grifo y otros 10 en agua destilada, segn el mtodo de

lvarez-Fernndez et al. (2003). Se pesaron y se metieron en la

estufa durante 72 horas. La hoja tratada se dividi por la mitad y

cada una de las mitades volvi a pesarse, y se denominaron:

Mitad Tween 80: esta mitad se lav igual que la hoja no

tratada, y se sigui el mismo procedimiento para medir el

Fe en AAS que el seguido para la hoja no tratada. Esta

parte de la hoja se meti en la estufa.

Mitad Triclorometano. La hoja se sumergi en Tween

80 con HCl 0,01 M, al igual que la otra mitad. A

continuacin, se sumergi la hoja en 90 mL de

Triclorometano durante 30 segundos, y posteriores

aclarados de 10 segundos con agua corriente y agua

destilada, respectivamente.

Despus, se meti la hoja igualmente en la estufa.

Se pesaron las hojas despus de tres das en la estufa, para obtener el

dato del peso seco.


2012

37

Se procedi a la digestin de cada una de las hojas de cada uno de los

tratamientos mediante digestin cida microondas con H2O2, y HNO3.

En la solucin resultante, se midi Fe y Mn total en AAS.

Los resultados fueron analizados estadsticamente mediante pruebas t-Student

para muestras relacionadas (p0,05) con el paquete informtico SPSS 18.0. Se

aplic la regla-4D de descarte de rplicas (Harris, D.C., 2004).


2012

38

4. Resultados y discusin

4.1. Ensayo en suelo agronmico.

Observaciones visuales

En las figuras 4.1.1 a 4.1.6 se muestran los sntomas visuales de las diferentes

plantas a lo largo de los diferentes muestreos.

Figura 4.1.1: Vista de las plantas correspondientes al primer muestreo (tras 7 das de

aplicacin de tratamientos) antes del muestreo destructivo.


2012

39

Figura 4.1.2: Vista de las plantas correspondientes al segundo muestreo (tras 21 das de

aplicacin de tratamientos) antes de la realizacin del muestreo destructivo.


2012

40

Figura 4.1.3: Vista de las plantas correspondientes al tercer muestreo (tras 42 das de

aplicacin de tratamientos) antes de la realizacin del muestreo destructivo.


2012

41

Figura 4.1.4.: Vista de las plantas correspondientes al primer muestreo (tras 7 das de

aplicacin de tratamientos) tras la realizacin del muestreo destructivo.

Figura 4.1.5: Vista de las plantas correspondientes al segundo muestreo (tras 21 das de



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42

Figura 4.1.6: Vista de las plantas correspondientes al tercer muestreo (tras 42 das de


Atendiendo a las observaciones visuales (Figuras 4.1.1 a 4.1.6.) el

comportamiento de los diferentes tratamientos por muestreo es el que sigue:

- Control: se puede observar cmo la clorosis se acenta con el transcurso

del tiempo. Si se comparan las plantas Control de los diferentes

muestreos, se aprecia ese aumento paulatino de la clorosis.

- QS1/Fe y QS2/Fe: Con respecto a estos tratamientos, se advierte que

existe una ligera mejora en la correccin de la clorosis, aunque no llega a

ser tan eficaz como el o,o-EDDHA/Fe, como se confirmar con los

resultados analticos.


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- o,o- EDDHA/Fe: Se observa el intenso verdor de las hojas en el primer

muestreo al aplicarse este tratamiento. A medida que transcurre el

tiempo, sigue habiendo una mejora de la clorosis, aunque sta

disminuye con el paso del tiempo. Se advierte que las hojas jvenes

permanecen verdes, siendo las ms viejas las que presentan un

amarilleamiento no debido a la clorosis frrica, sino a senescencia. Esta

observacin es importante a la hora de interpretar los resultados

analticos para ser capaces de diferenciar entre sntomas directamente

imputables a la deficiencia de hierro (y, por lo tanto, objetivo del

presente experimento), de sntomas fisiolgicos no imputables a dicha

deficiencia (y, por lo tanto, fuera del objetivo del presente proyecto).

Por otra parte, el alargamiento de los entrenudos y el reducido nmero de

hojas que presentaban las plantas, hace pensar que stas hayan podido sufrir un

efecto avoidance por falta de luz (Asencio et al., 2009).

Seguimiento de la evolucin de la clorosis mediante el ndice SPAD Desde el da de aplicacin de los diferentes tratamientos, y con una frecuencia

de 3 veces por semana, se midi el ndice SPAD sobre cada uno de los pisos de cada

planta de cada tratamiento, lo que suponen quince medidas de SPAD por

tratamiento.

Durante la medida del ndice SPAD a lo largo del experimento y para cada uno

de los pisos, se fue observando que, en los primeros pisos de hojas (pisos 2 y 3), se

podan identificar dos procesos totalmente diferenciados (vase figura 4.1.7.). En

los primeros das, puede identificarse el efecto de la aplicacin de tratamientos de

Fe sobre la clorosis frrica; en cambio, en la segunda mitad del experimento, se

observa un amarilleamiento general en dichas hojas, no imputable a una

deficiencia de hierro, sino a un desorden nutricional o un problema fisiolgico de

la planta. Este efecto es muy importante, ya que nos centraremos en comentar

aquellos datos de SPAD que se puedan relacionar directamente con la clorosis

frrica y no con otros desrdenes adicionales. As, los pisos 4 y 5 sern aquellos

que proporcionen una mayor informacin de la evolucin del ndice SPAD a lo


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largo de todo el experimento ya que, a medida que se va subiendo en los pisos, al

tratarse de hojas nuevas, los datos que se obtienen corresponden ms a la segunda

parte del ensayo y, por lo tanto, no se evala el efecto de los tratamientos de Fe al

inicio del experimento.

En la figura 4.1.7 puede observarse la evolucin de este ndice durante el

transcurso del ensayo en los pisos de hojas 2 a 7 de cada planta. Debido a la

disparidad entre las medias, se ha aplicado la regla estadstica 4D como criterio de

descarte de rplicas (Harris, D.C., 2004).

El o,o-EDDHA/Fe presenta unos valores de SPAD significativamente superiores

a las hojas no tratadas para todos los pisos en estudio. As, para el piso 2, se

observa que dicha diferencia es superior y significativa durante, aproximadamente,

los primeros 12 das desde la aplicacin de tratamientos. Para los pisos 4, 5, 6 y 7,

el tratamiento o,o-EDDHA/Fe presenta valores de SPAD superiores al Control en

los primeros 19, 26, 33 y 35 das, respectivamente. El comportamiento del quelato

de nueva sntesis, independientemente de la formulacin utilizada, indica que, si

bien no existen diferencias con los valores del SPAD del tratamiento Control,

parece que la formulacin QS2/Fe tiende a presentar valores similares al o,o-

EDDHA/Fe para todos los pisos que se evalan. As, los valores de SPAD de las

hojas tratadas con QS2/Fe presentan valores similares al o,o-EDDHA/Fe durante

los primeros 19 das para el piso 4, durante 26 das para el piso 5 y durante 33 das

para el piso 6, mientras que la formulacin QS1/Fe muestra valores de SPAD

significativamente menores a los del o,o-EDDHA/Fe. Estos resultados estn en

lnea con los ya publicados por Lucena, 2009, donde qued demostrada la eficacia

del o,o-EDDHA/Fe para corregir la clorosis frrica.


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Figura 4.1.7: Evolucin del ndice SPAD en los pisos 2, 3, 4, 5, 6 y 7 desde la aplicacin de tratamientos, y durante todo el ensayo.


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Otro dato importante que se ha obtenido de los resultados es que todos los

tratamientos donde se ha aplicado Fe (o,o-EDDHA/Fe, QS1/Fe y QS2/Fe)

poseen el piso 11 de hojas, pudiendo haberse realizado la medida de SPAD en

todos ellos hasta el piso 12. En el tratamiento o,o-EDDHA/Fe, concretamente,

pudo medirse este ndice hasta el piso 14, y QS1/Fe y QS2/Fe hasta el piso 13,

mostrando as un mayor desarrollo vegetativo con respecto a las plantas no

tratadas (Control), donde el desarrollo vegetativo se alcanz hasta el piso 10.

Dicha observacin debera reflejarse en el peso seco de las hojas aunque,

debido al pequeo tamao de las mismas puede, dicha diferencia, no

observarse por la variabilidad intratratamientos.

Parmetros biomtricos de las plantas por muestreo En cada muestro se tom el dato de peso fresco y peso seco de hojas, tallos y

races de cada planta por tratamiento (vanse figuras 4.1.8, 4.1.9 y 4.1.10. para

muestreo 1, muestreo 2 y muestreo 3, respectivamente)

Figura 4.1.8.: Histograma del peso seco de cada uno de los diferentes tejidos vegetales en el primer

muestreo segn el tratamiento aplicado. Diferentes letras indican diferencias significativas cuando se

aplica el test de Duncan con un nivel de significacin de = 0.10.


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Figura 4.1.9: Histograma del peso seco de cada uno de los diferentes tejidos vegetales en el

segundo muestreo segn el tratamiento aplicado. . Diferentes letras indican diferencias significativas

cuando se aplica el test de Duncan con un nivel de significacin de = 0.10.

Figura 4.1.10: Histograma del peso seco de cada uno de los diferentes tejidos vegetales en el

tercer muestreo segn el tratamiento aplicado Diferentes letras indican diferencias significativas

cuando se aplica el test de Duncan con un nivel de significacin de = 0.10.

En el primer muestreo, puede observarse que existen diferencias

estadsticamente significativas en el valor de peso seco de las hojas

dependiendo del tratamiento, siendo el tratamiento Control el que presenta un

mayor valor de peso seco, principalmente en races. Esto podra explicarse


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debido a que transcurri poco tiempo entre la aplicacin de tratamientos y el

primer muestreo (7 das tras la aplicacin de los mismos), y los agentes

quelantes no han actuado an en este punto del ensayo. En este primer

muestreo, adems, la planta todava utiliza las reservas de nutrientes de las

semillas, y no puede analizarse el efecto de los tratamientos.

Observando el valor de peso en raz en el primer muestreo, se observan

diferencias estadsticamente significativas entre el Control y el resto de

tratamientos, presentando aqul un mayor valor de peso seco en raz. Esto

podra explicarse debido a que se hubiera producido un engrosamiento de las

zonas subapicales y la aparicin de pelos radicales para aumentar la superficie

de adsorcin (Welkie y Miller, 1993), aumentando as el peso del tejido. Aun

as, el error en el muestreo de races cultivadas sobre suelo agronmico puede

alterar el valor del peso seco de las mismas.

En el segundo muestreo, el tratamiento Control posee valores medios

menores que los del resto de los tratamientos en todos los tejidos, no siendo

significativas en las races. Puede observarse que, entre muestreos, es claro que

el peso seco de las races para el tratamiento Control se ha mantenido, mientras

que para el resto de tratamientos ha aumentado. Posiblemente, si se

compararan los datos poniendo el muestreo como factor en estudio, se

observaran diferencias significativas.

En el caso concreto de las hojas, observamos que los tratamientos QS1/Fe,

QS2/Fe y o,o-EDDHA/Fe presentan diferencias estadsticamente significativas con

respecto al tratamiento Control, lo que indica que, en este segundo muestreo, los

tratamientos estn haciendo efecto, proporcionando un mayor crecimiento

vegetativo de las hojas. Este dato est en lnea con el mayor crecimiento observado

en el apartado de parmetros biomtricos.

En el tercer muestreo, se observa que no existen diferencias estadsticamente

significativas en los valores de peso seco de las hojas y los tallos. Con respecto a las

races, existen diferencias estadsticamente significativas en el tratamiento o,o-

EDDHA/Fe, obtenindose para este tratamiento un valor ms elevado de peso

seco.


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Toma de hierro por las plantas

Tras la mineralizacin de los tejidos vegetales, se obtuvieron datos de

concentracin de hierro total en planta (Figuras 4.1.11 a 4.1.16). Se han obtenido,

adems, datos de la relacin Fe/Mn (Figura 4.1.17.) como ndice nutricional

(Lucena et al., 1990).

Hierro en hoja

Figura 4.1.11: Concentracin de Fe (mg/Kg de materia seca) media total por tratamientos y por

muestreo en hoja. Diferentes letras indican diferencias significativas cuando se aplica el test de

Duncan con un nivel de significacin de = 0.10.

Atendiendo a estos datos, puede observarse que la concentracin media de Fe

en hoja habiendo aplicado el tratamiento o,o-EDDHA/Fe es significativamente

superior en el muestreo 1 a la del resto de tratamientos. En los siguientes

muestreos, esta concentracin de Fe en hoja disminuye debido, posiblemente a

que, al aumentar la biomasa, el contenido total de Fe aumente (Lucena, 2005).

Respecto a los quelatos QS1/Fe y QS2/Fe se observa que, aunque el contenido

en Fe en el muestreo 2 es significativamente menor para el QS1/Fe respecto al


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resto de tratamientos, no hay diferencias con respecto al tratamiento Control,

existiendo diferencias con ste, no obstante, al comparar el tratamiento QS2/Fe.

Como se mencion anteriormente, debe tenerse en cuenta el desarrollo

vegetativo de las plantas, y es por eso que resulta interesante observar la cantidad

de hierro por planta en cada tejido vegetal. En la figura 4.1.12, se observa la

cantidad de hierro (mg Fe/planta) en hoja en los diferentes muestreos.

Figura 4.1.12.: Histograma representando los mg de Fe en hoja/ planta.

Se ha visto anteriormente, que utilizando nicamente los datos de mg Fe/kg en

hoja, haba una tendencia generalizada a una disminucin de este micronutriente

en este tejido vegetal. Examinando los datos representados en la figura anterior se

aprecia que, realmente, la concentracin de Fe en este tejido aumenta con el paso

del tiempo (exceptuando el tratamiento Control, que sufre una disminucin en el

tercer muestreo). Esto ocurre as porque que debe tenerse en cuenta que no slo

es importante la concentracin en la hoja, sino que el nmero de hojas (en este

caso representadas mediante el peso seco de las mismas) es tambin importante,

ya que el hierro se reparte por todos los tejidos de la planta y, aunque en principio

pueda pensarse que la concentracin de este micronutriente desciende, lo que


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realmente ocurre es que est repartido entre todas las hojas que tiene la planta. Se

observa que los valores ms altos corresponden al tratamiento o,o-EDDHA/Fe,

como era de esperar segn otros estudios realizados con este agente quelante

(Lucena, 2009), sobre todo en el muestreo 1.

Hierro en tallo

Figura 4.1.13: Concentracin de Fe (mg/Kg de materia seca) media total por tratamientos y

por muestreo en tallo. Diferentes letras indican diferencias significativas cuando se aplica el test de


Cuando se compara la concentracin de Fe en tallo de los diferentes

tratamientos, se observa que, nuevamente, la mayor concentracin de Fe en este

tejido procede del tratamiento de o,o-EDDHA/Fe durante el primer muestreo,

disminuyendo paulatinamente con el paso del tiempo, al igual que ocurre con el

tratamiento Control. Es posible que la menor presencia de Fe en tallo para el

tratamiento o,o-EDDHA/Fe en el muestreo 2 sea debida a un mayor transporte

hacia las hojas, ya que as lo muestran los datos de SPAD con valores mayores para

dicho tratamiento.


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Los quelatos evaluados, QS1/Fe y QS2/Fe, no presentan diferencias

estadsticamente significativas con respecto al tratamiento Control en la

concentracin de Fe en tallo.

Figura 4.1.14: Histograma representando los mg de Fe tallo/ planta.

Al igual que ha ocurrido con las hojas, al evaluar los datos de mg de Fe/planta

en el tallo se observa que, realmente, la concentracin de Fe va en aumento

debido al desarrollo vegetativo de la planta, destacando el dato del QS2/Fe, que

en el tercer muestreo la tendencia es a mostrar un valor superior al resto de

tratamientos, incluso mayor que el dato del tratamiento o,o-EDDHA/Fe, aunque

no se ha realizado tratamiento estadstico de estos datos.


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Hierro en raz

Figura 4.1.15: Concentracin de Fe (mg/Kg de materia seca) media total por tratamientos y por

muestreo en raz. Diferentes letras indican diferencias significativas cuando se aplica el test de


Figura 4.1.16: Histograma representando los mg de Fe raz/ planta.


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En la raz, la mayor concentracin de Fe se observa en el tratamiento Control,

producindose un descenso en el segundo muestreo y un nuevo ascenso en el

tercero.

En lo que al resto de tratamientos se refiere, hay un aumento de concentracin

de este nutriente en el tercer muestreo en este tejido, exceptuando el QS1/Fe, que

se estabiliza con respecto al segundo muestreo. Pueden haberse producido

problemas de precipitacin de Fe en la raz, alterndose el anlisis de resultados.

Existen diferencias estadsticamente significativas entre todos los tratamientos

con Fe y el Control en el primer muestreo, y entre QS2/Fe y Control en el segundo.

En cuanto al tercer muestreo, se observan diferencias estadsticamente

significativas entre el tratamiento de nueva sntesis QS1/Fe y el tratamiento

Control.

Atendiendo a los datos de mg de Fe en raz/ planta, se aprecia que hay un

aumento generalizado en todos los tratamientos de este nutriente en la raz a lo

largo del experimento, exceptuando el tratamiento QS1/Fe, que sufre una

estabilizacin en el segundo muestreo.

Relacin Fe/Mn

La relacin Fe/Mn constituye un ndice de la adecuada nutricin frrica de

diversos cultivos (Lucena et al., 1990). En este ensayo, se observa que el

tratamiento o,o-EDDHA/Fe presenta una mayor relacin Fe/Mn que el resto de los

tratamientos (ver Figura 4.1.17), excepto en el tercer muestreo, donde los valores

son similares. Esto implica que el tratamiento o,o-EDDHA/Fe es ms efectivo a la

hora de nutrir a la planta con este microelemento, y que acta principalmente

durante la primera etapa del ensayo.


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Los tratamientos de nueva sntesis evaluados, QS1/Fe y QS2/Fe, presentan

valores similares a los del tratamiento Control. Este resultado muestra que, como

se ha visto en el ndice SPAD, estas nuevas formulaciones de Fe a base de un nuevo

agente quelante sinttico muestran una nutricin frrica inferior a la mostrada al

aplicar el Fe utilizando el tratamiento o,o-EDDHA/Fe. Deben realizarse ms

ensayos vegetales para confirmar dicha tendencia, y ver su eficacia como

correctores de la clorosis frrica.

Figura 4.1.17: Relacin Fe/Mn en hoja (mg/Kg materia seca) por tratamiento y muestreo.

Diferentes letras indican diferencias significativas cuando se aplica el test de Duncan con un

nivel de significacin de = 0.10.


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4.2. Ensayo de aplicacin foliar.

Seguimiento del ndice SPAD La evolucin del SPAD (en promedio) en la hoja tratada podemos observarla en

la Figura 4.2.1, y la de la hoja no tratada en la figura 4.2.2:

Figura 4.2.1: Evolucin del ndice SPAD en Hoja Tratada durante los 10 das de duracin del

ensayo desde la aplicacin de tratamientos.

Figura 4.2.2: Evolucin del ndice SPAD en Hoja no Tratada durante los 10 das de duracin del

ensayo desde la aplicacin de tratamientos.


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En vista de los resultados de SPAD obtenidos, no se observan diferencias

significativas cuando se comparan los valores para cada tratamiento entre

hojas tratadas y no tratadas. De la misma forma, tampoco se han observado

diferencias entre los tratamientos en hoja tratada y no tratada. Debido al

diseo del experimento (con una duracin de 10 das), y teniendo en cuenta

que las cepas no presentaban sntomas visuales de estar afectadas por una

clorosis frrica grave, el hecho de que no existan diferencias resulta esperado.

Parmetros biomtricos de las hojas por tratamiento Se tomaron, adems, datos de peso fresco y peso seco de las hojas por

tratamiento. Los resultados se presentan en las figuras 4.2.3. y 4.2.4.

Figura 4.2.3: Pesos fresco y seco (g) en la hoja tratada, distinguiendo entre el tratamiento

aplicado y el mtodo de lavado utilizado. Diferentes letras indican diferencias significativas cuando

se aplica el test de Duncan con un nivel de significacin de = 0.10.


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Figura 4.2.4: Pesos fresco y seco (g) de la hoja no tratada. Diferentes letras indican diferencias

significativas cuando se aplica el test de Duncan con un nivel de significacin de = 0.10.

Atendiendo a los datos estadsticos y a las grficas anteriormente expuestas, se

aprecia que no hay diferencias estadsticamente significativas entre el peso de las

hojas, tanto tratadas como no tratadas. Igualmente, tampoco existen diferencias en

el contenido de humedad de ambas hojas (datos no mostrados).

Concentracin de Fe en hoja Se han comparado las medias relacionadas para cada uno de los

tratamientos entre la hoja lavada con Tween 80 y la hoja lavada con CHCl3.

Igualmente, se han comparado las medias relacionadas entre la hoja no tratada

(HNT) y la hoja lavada solamente con Tween80, ya que ambas se lavaron con

el mismo procedimiento.

Se puede concluir que, tal y como se observa en la figura adjunta (Figura 4.2.5.),

cuando se comparan los valores de Fe obtenidos para cada una de las mitades de la

hoja siguiendo un protocolo diferente de lavado:


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- La concentracin de Fe en las hojas en el tratamiento Control no ha

experimentado diferencias significativas, independientemente del mtodo

de lavado aplicado.

- La concentracin de Fe en la media hoja lavada con Tween 80 tiene una

mayor concentracin de Fe que la media hoja lavada con CHCl3 para los

tratamientos EDTA/Fe, Sulfato/Fe y QS/Fe.

- La concentracin de Fe en la media hoja lavada con Tween 80 tiene una

menor concentracin de Fe que la media hoja lavada con CHCl3 para el

tratamiento LS/Fe.

Cuando se compara la concentracin de Fe entre la hoja no tratada y la media

hoja lavada con Tween se observa que:

- Existe una menor concentracin de Fe en la hoja no tratada que en la media

hoja tratada y lavada con Tween 80 para los tratamientos Control,

EDTA/Fe, Sulfato/Fe y QS/Fe.

proyecto v.4.0 05.09.2012. hfn

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