PROTEINI

Dušica PavlovićBiohemija, 2006St 1083-1094St 1110-1122

Centralno mesto biohemije u odnosu na sve ostale “nauke o životu”

Sadržaj predavanjaStruktura u uloga proteinaŽivotni ciklus proteina ćelijeSinteza proteina i posttranslaciona modifikacijaNivoi strukture proteinaŠaperon sistemiGreške u sklapanju proteinaRazgradnja proteina u organizmuIntracelularna degradacija proteinaProteini plazmeFunkcije proteina plazmePromene koncentracije proteina u plazmiSpecifični proteini plazmeProteini u ostalim telesnim tečnostima

Grč. Proteos – prvi, primarni, najvažniji Naziv protein uveo je Berzelius, a često se koristi tetrmin

belančevine Oligopeptidi do 10AK; Polipeptidi sadrže 10 do 100

aminokiselinskih ostataka(Proteini preko 100 AK) Bakterija E. Coli sadrži oko 3000 različitih proteina a čovek

>1 000 000 Najaktivniji su biomolekuli – svi životni procesi odvijaju se u

strukturama proteina ili uz njihovo učešće Dnevna potreba čoveka iznosi 100-110g proteina

Proteini su pored vode najzastupljeniji biomolekuli u ćeliji

Proteine grade alfa amino kiseline L-konfiguracije za sintezu prteina kriste se 20 AK

Nivo proteina u ćeliji

Količinu proteina u ćeliji određuju:• Nivo transkripcije

•Nivo translacije

•Degradacija proteina

Transkripcija se odvija u jedruTranslacija u ribozomimaPostranslaciona modifikacija u citozolu

Proteini – opšte karakteristike

50-70% suve težine ćelije anabolizam ↔ katabolizam su u ravnoteži (120 g/dan) Poluživot (meri se satima, danima)–ćelijski i plazma proteini;(meri se godinama)–strukturni proteini Sinteza: jetra, gastrointestinalni trakt, retikuloendotelni sistem Razgradnja: jetra, bubreg, digestivni trakt. Uglavnom su makromolekuli –MM od 6 000 do nekoliko miliona Prosti i složeni proteini Monomeri i polimeri (homo i heteropolimeri)

Složeni (konjugovani) proteini

Hromoproteini (hem) Metaloproteini (metalni ioni) Fosfoproteini (fosfat) Lipoproteini (lipidi) Glikoproteini, proteoglikani (ugljenihidrati) Nukleoproteini (nukleinske kiseline)

Replikacija DNK

Informacija za aminokiselinsku sekvencu proteina se nalazi u sekvenci nukleotida u određenom

segmentuDNK (gen)

GENOMIKA / PROTEOMIKA

PROTEOMPROTEOM

Ukupna nasledna Ukupna nasledna informacijainformacija

GENOMGENOM

Aktivnost i struktura proteina determinišu fenotip

Životni ciklus proteinaNa račun informacije koju nosi DNA vrši se sinteza proteina

mRNA Protein

Proteolytic CleaveageAcylationMethylationPhosphorylationSulfationSelenoproteins UbiquinationGlycolisation

Transport

Oštećenje -free radicals

Razgradnja

Uticaj faktora sredine-chemicals-radioactiivty

Posttranslaciona modifikacija

U ćelijske organele ili u ekstrćelijski prostor

Pakovanje

Post-translational modification

Autophosphorylation, phosphorylation, ubiquitination, multiubiquitination, N-acetylation, O-glycosylation, N-glycosylation,nitrozilacion methylation, carboxymethylation, palmitoylation, unknown

Kombinacijom blokova od 20 aminokiselina + alternativni splajsing + alternativni promotor + postranslaciona

modifikacija > 1 000 000 različitih proteina

 Alternativni promotor objašnjava varijabilnost strukture eukariotskih promotora odredjenih gena koji kodiraju različitu regulatornu poruku u datoj DNK kodirajućoj sekvenci

A B C

D EF

BC

BC

1

2

12

 

ULOGE (dinamičke i strukturne) Strukturna i potporna uloga: u izgradnji citoskeleta

(aktin, tubulin, spektrin); u izgradnji unutarćelijskog matriksa (proteoglikani, kolagen, elastin, integrini.

Transportna: proteini krvne plazme, ali i svi drugih proteina koji učestvuju u transportu molekula kroz ćelijsku membranu (transportuju: kiseonik, lipide, proizvode metabolizma, jone, vitamine, hormone, lekove, otrove)

Katalitička: svi enzimi su proteinske strukture Regulatorna: Veliki broj hormona je proteinske prirode,

svi do sada izolovani faktori rasta su proteinske prirode, receptori za hormone i faktore rasta su proteini, transkripcioni faktori;

Održavanje koloidno-osmotskog pritiska (albumini)

Zaštitna: antitela su po strukturi proteini; skoro svi faktori koagulacije su proteini; Rezervni proteini : ovoalbumin, gluten,

kazein, feritin Održavanje acido-bazne ravnoteže

(hemoglobin) Omogućavaju kretanje i kontraktilnost:

flagelini, aktin, miozin i sl. Veliki broj otrova su proteini: toksin

difterije, zmijski otrov

Struktura proteina

primarna struktura (polipeptidni lanac) sekundarna struktura (α-i β-zavojnica) tercijarna struktura kvarterna struktura (vise subjedinica) superkvaternerna struktura

Primarna struktura proteina

Primarna struktura predstavlja broj, vrstu, redosled i raspored amino kiselina u polipeptidnom lancu.

Čini je peptidna veza, koja se uspostavlja između karboksilnog kraja jedne i amino kraja sledeće amino kiseline.

Ova veza je stabilna i može se raskinuti reakcijama kisele hidrolize ili delovanjem specifičnih proteolitičkih enzima-proteaza. Prva primarna struktura ustanovljena je za insulin 1958god.

Peptidna veza

Polipeptidni lanac ima N-i C-kraj

U okviru primarne strukture može postojati razlika, što znači da proteini istih funkcija (najčešće enzimi) mogu pokazivati minimalne razlike unutar vrste (intra species) ili između različitih vrsta (inter species) proteini.

Mogu imati potpuno različite funkcije, a pokazivati veliku sličnost u sekvencama, što je označeno kao invarijante (proteazomi i histoni).

Familije proteina pokazuju strukturnu i funkcionalnu homologiju – plimorfizam (familije proteaza: tripsin, himotripsin, elastaza; nespecifična holin esteraza).

Mutacije u primarnoj strukturi mogu značajno funkcionalno umanjiti vrednost jednog proteina, kakav je primer srpasta anemija.

Male promene u primarnoj strukturi proteina jakose odražavaju na njihovu funkciju

Funkcinalne grupe u molekulu proteina

Hidrofilne grupe Hidrofobne grupeKarboksilna (-COOH) Metil (-CH3)

Karbonilna (>C=O) Metilenska (-CH2)

Hidroksilna (OH) Etil (-C2H5)

Aldehidna (-CHO) Propil (-C3H8)

Amino (-NH2) Fenil (-C6H5)

Imino (>NH)Amidna (-CONH2)

Sulfhidrilna (-SH)

Hemijske osobine proteina zavise od amino, karbksilne i drugih funkcionalnih grupa, koje nisu angažovane u stvaranju peptidnih veza

Osobine proteina zasnovane na primarnoj strukturi Rastvoreni proteini su polivalentni joni.Njihova negativna

naelektrisanja potiču od karboksilnih anjona u bočnim lancima glutaminske I asparaginske kiseline.

Pozitivne naboje daju bočni lanci baznih aminokiselina: arginin,lizin I histidin

Promenom PH vrednosti može se uticati na naelektrisanje proteina Izoelektrična tačka (IT) je ona vrednost PH pri kojj je broj + jednak

broju – naboja (jonozacija proteina je najmanja, kretanje u električnom polju najsporije)

Ako u proteinu preovlađuju bazne AK ITće biti u baznoj sredini i obrnuto

Proteini se najlakše talože na IT. Taloženje može biti reverzibilno (isoljavanje) i ireverzibilno (denaturacija proteina)

SEKUNDARNA STRUKTURA

Obrazuje se uglavnom na bazi stvaranjavodoničnih veza između atoma koji se nalaze usastavu peptidne veze koji se nalaze relativnoblizu u polipeptidnom lancu. Vodonične veze se grade između karbonilnogkiseonikovog atoma svakog prvog ostatakaaminokiseline u nizu i atoma vodonika iz NHgrupesvake četvrte amino kiseline. Glavni vidovi sekundarne strukture su -spirala(α -heliks) i β- nabrana struktura.

Linus Pauling i Robert Corey su(1951)predvideli(prvo)α-heliksa (potom) i ß-niz (pločicu)!

Sekundarna struktura Sekunadrna struktura se može formirati u okviru istog

lanca ili između različitih lanaca, stvaranjem vodoničnih ali i drugih sekundarnih veza

Ukoliko se formira u istom lancu onda dolazi do obrazovanja vodonične veze između svake prve i četvrte amino kiseline formirajući spiralnu strukturu, tzv. heliks. On može biti zavijen ulevo ili udesno

Ukoliko dolazi do stvaranja vodonične veze između različitih polipeptidnih lanaca to je presavijena struktura -ploča tj -nabrana struktura (cik-cak)

Sekundarna struktura proteina

•α–heliks

Slika Alfa helikoidna struktura. Vodonične veze su paralelne sa osnovnim lancem

Alfa heliks ima 3.6 ostatka AK po okretu

β-nabrana struktura

Postojanje strukture pretpostavili i opisali Pauling i Corey, 1951

Nastaje formiranjem vodoničnih veza između paralelnih i antiparalelnih lanaca

Segmenti sa konformacijom nabrane strukture mogu biti dužine od 2 do 12 aminokiselinskih ostataka

tip sekundarne strukture tip sekundarne strukture

Kraći tip prikazivanja ovih struktura

Slika Tipovi sekundarnih struktura proteina

•β-nabrana struktura

Sekundarna struktura proteina

• Polipeptidni lanac, koji u sebi već sadrži delove sa sekundarnom strukturom, jesposoban da se u celini izuvija u prostoru izauzme položaj koji odgovara najstabilnijoj konformaciji, pri datim uslovima, koji se naziva tercijerna struktura.

• U interakciju stupaju bočni nizovi ostataka aminokiselina koji su u polipeptidnom lancu dosta udaljeni jedan od drugoga

TERCIJERNA STRUKTURA

Tercijarna struktura

Tercijarna struktura predstavlja viši oblik organizacije proteinskog lanca u prostoru i čini osnovu podele proteina na fibrilarne i globularne.

Fibrilarni proteini su veoma dugi (miozin, kolagen, keratin), nerastvorljivi su u vodi i lako se talože solima lakih metala

Globularni proteini su loptastog ili elipsoidnog izgleda (mioglobin,albumini, globulini,enzimi). Rastvorljivi su u vodi.

Disulfidne veze

Vodonične veze između

peptidnih grupa

Vodonične veze između dva lanca

Hidrofobnainterakcija

Jonska vezaVodonične veze

između bočnih lanacai peptidnih grupa

Slika Tipovi nekovalentnih interakcija u formiranju tercijalne strukture proteina

Elektrostatičke interakcije

Hidrofobne interakcije

Kovalentne veze (disulfidne veze)

U stabilizaciji tercijerne strukture proteina poredvodonične veze veliku ulogu i drugi vidoviinterakcije bočnih nizova

oksidovani Lys koji povezujelance obezbeđuje krutostkolagena

Globularni proteiniSrukturne karakteristike• Većina ostaka polarnih kiselina okrenuto je prema spoljaa polarne grupe su maksimalno izložene rastvaraču.• Većina hidrofobnih ostataka su unutar proteinskogmolekula i interaguju međusobom.• Proteinski molekul se na taj način zgušnjava.• Haotična struktura nazvana struktura slučajnog klupka“random coil” nije slučajna.• Strukture globularnih proteina nisu statične.• Različiti elementi strukture i strukturni domeni proteina,kreću se u različitim pravcima.

Pravilna tercijarna struktura proteina je od egzistencijalnog značaja za ćeliju.

Ona je kod enzima odlučujuća za stvaranje enzim-supstrat kompleksa, kod hormona i receptora za proces prepoznavanja, u transportnim proteinima za obavljanje normalne funkcije vezivanja i transporta materija.

Izmenjena tercijarna struktura može neki protein učiniti neprepoznatljivim, stranim za organizam i time dovesti do pojave bolesti.

KVATERNERNA STRUKTURA Nekoliko polipeptidnih lanaca se mogu međusobnopovezati gradeći pri tome kvatenernu strukturu,

tako dobijene strukture se nazivaju kompleksi ili agregati

U okviru tog kompleksa, svaki polipeptidni lanacpredstavlja jednu podjedinicu

podjedinica ima očuvanu primarnu, sekundarnu i tercijernu strukturu

stabilizovana je uglavnom vodoničnim vezama i hidrofobnim intrakcijama između polipeptinih lanaca koje predstavljaju podjedinice

moguće su sve vrste interakcija koje stabilizuju tercijernu strukturu

Kvaternerna struktura

Interakcija između više proteinskih lanaca uslovljava stvaranje kvaternerne strukture proteina.

Tipovi kvaternerne strukture su: dimeri, tetrameri, filamenti od više zajednički uvijenih heliksa (kolagen), filamenti od paralelnih heliksa (keratin). Svaka polipeptidna jedinica se naziva subjedinica ili protomer, a nastali protein je oligomer

Subjedinice se vezuju nekovaletnom interakcijom (vodonične veze, jonske, hidrofobne interakcije)

Šaperoni• In vivo, šaperoni pomažu da se proteini, označeni kao proteini saspecijalizovanom funkcijom, vežu međusobom na adekvatan i korektan način.

šaperon sistemi (heat shock) U formiranju tercijarne a posebno kvaternerne strukture

proteina u ćeliji od pomoći su specifični sistemi koji se nazivaju molekularni vodiči ili šaperon sistemi.

Oni imaju zadatak da pomognu u formiranju tercijarne strukture novostvorenog proteina i da spreče druge neželjene transformacije proteina, kao što je agregacija sa drugim proteinima putem hidrofobnih grupa.

Šaperoni imaju izgled šuplje cevi koju izgrađuju dva prstena sačinjena od po sedam proteina Hsp 70s i Hsp 60s (zajednički poznati kao GroEL).

Jedan manji protein (GroES) (40s) predstavlja «kapu», tj. poklopac koji se otvara da bi protein ušao. U šupljini se nalazi malo sklonište u kome se smešta novopristigli protein

Ribozomi

Novosintetisaniprotein

Šaperon

Protein sa definisanom tercijarnom strukturom

Delovanje šaperona za vreme prenosa proteina

Molekularni šaperonprotein koji pomaže strukturiranju inekovalentnom združivanju drugihproteinskih struktura in vivo, a nepredstavlja dеo nastale strukture(uredbeni protein, engl. chaperon)šaperonin (uređivački protein, engl.chaperonin): protein unutar kojega seodvija strukturiranje drugih proteina

Smatra se da poremećaj normalnih puteva šaperon proteinakoji omogućavaju promet nesolubilnih proteina dovodido taloženja AMILOID beta u ćelijama i njihovo oštećenje Doovakvih poremećaja mogli bi da dovedu kako smanjeno vezivanješaperona za A beta, tako i smanjena raspoloživostšaperon proteina

Šaperon

Protein sa definisanomtercijarnom strukturom

Nativni protein, bez tercijarne strukture

Pravilna tercijalna struktura proteina je egzistencijalna za ćeliju

Enzyme catalytic site Prosthetic group

attachment Metal ion binding site Cysteines for

disulphide bonds Protein or molecular

binding

Protein misfolding (greške u sklapanju proteina) Sklapanje (presavijanje proteina) je proces koji može rezultirati greškom, jer

sistem koji obezbeđuje kvalitet protena nije perfektan, Greške u sklapanju proteina mogu nastati spontano ali mogu biti

uzrokovane i mutacijom gena koji produkuju protein sa greškom. U nekim slučajevima atipična proteoliza prekursornog proteina dovodi do nastajanja kraćeg segmenta fibrilarnog proteina koji podleže atipičnom sklapanju.

Dolazi do intracelularne agregacije i degradacije proteina sa greškom u sklapanju. Ova pojava predstavlja molekularnu osnovu za nastanak nekih bolesti – Alzheimer (β amiloid peptid od 40-43 AK, koji agregira u konformaciju β ploče, dobijajući svojstva neurotoksina)

β amiloid peptid nastaje proteolizom iz amiloid prekusornog proteina APP koji je transmembranski protein prisutan u ćelijama CNS i drugih tkiva

Amiloid prekursor proteina Amiloid prekursor proteina je transmembranski glikoprotein sa

funkcijama u preživljavanju neurona i procesima učenja i pamćenja Kod AB umesto alfa, aktivira se beta sekretaza („amiloidogeni put“)

što dovodi do stvaranja A beta koji se sastoji iz dela transmembranskog domena i kratkog ekstracelularnog fragmenta. I alfa i beta sekretaza deluju na ektodomen

Enzymes cut the APP into fragments, the most important of which for AD is called -amyloid (beta-amyloid) orA.

Beta-amyloid is “sticky” so the fragments cling together along with other material outside of the cell, forming theplaques seen in the AD brain.

Glavne patohistološke promene kod AB su ekstracelularnidepoziti amiloida-beta (A beta) – amiloidni ili senilni plakovi (SP)

i

intracelularne nakupine tau proteina – neurofibrilarna klubad (NFK),

2

3

Prevents tubulin

Amiloid beta deluje patološki podstičući oksidativnistres, ekscitotoksičnost sa nakupljanjem kalcijuma u ćelijama,smanjenjem fluidnosti membrana, smanjenjem energetskihzaliha, izmenama citoskeleta, podsticanjem zapaljenskihprocesa i promenama homeostaze metala

Navedeni procesidovode do disfunkcije sinapsi, nekroze ili apoptoze i gubitkaneurona.

Uklanjanje A beta odvija se posredstvommikroglije, putem receptora za krajnje produkte uznapredovaleglikozilacije (advanced glycation end products –AGEs; receptor za AGEs – RAGE; stvaranje AGEs je pojačanokod DM). DM se smatra faktorom rizika za pojavu AB

Prote(in)opathy cascade

protein misfolded protein

mutation

aggregation

deposition

Neurodegeneration

beta-sheet

Denaturacija proteina

Denaturacija je proces gubitka tercijarne strukture proteina, kada on postaje funkcionalno neaktivan, a fizički nerastvorljiv u prvobitnom rastvaraču i gubi svoje prvobitne osobine. To se postiže promenom spoljašnjih uslova, kao što je povišenje temperature, postizanje ekstremnih pH vrednosti, odnosno dodatak organskih rastvarača ili uree

RAZGRADNJA PROTEINA U ORGANIZMU

U organizmu se proteini nalaze u stalnom dinamičkom stanju, neprekidno se sintetišu i razgra|uju, što odredjuje dužinu života specifičnih proteina (poluživot proteina)

Oštećeni kao i nepotrebni proteini se uklanjaju iz organizma degradacijom, a oslobođene amino-kiseline mogu poslužiti za ponovnu sintezu proteina

Razgradnja endogenih proteina vrši se proteolitičkim fermentima- proteazama

Odigrava se u:

1.   ekstracelularnom prostoru - ekstracelularna proteoliza

2. unutar ćelija, intracelularna proteoliza

Ekstracelularna proteoliza Ekstracelularna proteoliza se ostvaruje delovanjem proteaza koje se oslobadjaju iz

rezidualnih tkivnih ćelija i inflamatornih ćelija. Proteaze vrše razgradnju i remodeliranje ekstracelularnih proteina uprkos postojanju visoko-efektivnih inhibitora u ekstracelularnom prostoru, čija se inhibitorna moć smanjuje oksidativnom inaktivacijom.

Proteaze su endopeptidaze, razlažu peptidne veze u unutrašnjosti proteinske molekule. Mogu se klasifikovati u 4 grupe u odnosu na hemijske grupe njihovog aktivnog centra, to su:

1. serin-proteaze 2. metalo-proteinaze 3. cistein-proteinaze 4. aspartat-proteinaze

Serin i metalo-proteinaze su aktivnije pri neutralnom pH, one katalizuju mnoge reakcije proteolize u ekstracelularnim prostorima. Serin-proteaze često aktiviraju druge serin-proteaze koje su u inaktivnoj formi (zimogeni), što se dešava u procesu koagulacije i fibrinolize, aktivaciji komplementa, hormonskoj produkciji, fertilizaciji.

Intracelularna degradacija proteina

Lizozomalna proteoliza Ubikvitin – Proteozomalna proteoliza(visoko konzervisan polopeptid – 76 AK

(8,5kDa – ubikvitin)

Lizozomalna proteoliza

Proteini koji ulaze u ćeliju endocitozom, pinocitozom i fagocitozom

Lizozomi sadrže oko 50 hidrolitičkih enzima (proteaze, nukleaze, lipaze, karbohidraze)

Lizozomalne proteaze označene su kao katepsini aktivni su u kiseloj sredini

Lizozomalna proteoliza

UBIKVITINSKI SISTEM-UBIKVITINACIJA- Ubikvitin prepoznaje proteine za degradaciju i selektivno ih obeležava -

Karboksilni kraj ubikvitina se vezuje za є-amino grupu lizinskih ostataka proteina koji će se degradirati. Ubikvitin je target za proteazom

Degradacija se odvija kompleksom 26S proteazoma

Aminokiselinski ostaci na N terminalnom kraju proteina koji se razlaže određuju dužinu poluživota (proteini sa metioninom imaju poluživot 20 dana a sa argininom oko 2 min)

E3 enzimi koji učestvuju u ovom putu su čitači N-terminalne rezidue

DISFUNKCIJA POJEDINIH KOMPONENTI OVOG SISTEMA UKLJUČENE SU U PATOGENEZU UROĐENIH I STEČENIH BOLESTI

Put ubikvitin proteozom

Hromatografija proteina

hromatografija–komponente smese se razdvajaju na koloni

Zavisi od vrednosti pIrazličitih aminokiselina kojese razdvajaju.Pozitivno naelektrisaniproteini se vezuju zanegativno naelektrisanupodlogu.Negativno naelektrisaniproteini prolaze.Jonoizmenjivačka hromatografija Najkiselije aminokiseline putuju najbrže a najbaznije seeluiraju poslednje.Površina svakog signala je mera relativne količine svakepojedinačne aminokiseline u smesi.

HPLC-mobilna faza se kroz kolonu propušta pod pritiskom-skraćenovreme analize.HPLC Površina svakog signala je mera relativne količine svakepojedinačne aminokiseline u smesi.

Hromatografija na koloni

Sekvencionisanje proteina tehnikomrekombinovane DNK

• Redosled četiri baze u DNK: adenina, guanina, timina i citozina (zapisan u genima) direktno određuje sekvencuaminokiselina u proteinu.

• Moguća automatizovana analiza DNK ili RNK

• Sekvenca stotine proteina, sa velikim brojem aminokiselinskih ostataka određen na ovaj način