1. CAPITULO I

1.1 RESUMEN

La biotecnologa agrcola es una opcin para crear mtodos de control de plagas. Adems el uso de insecticidas qumicos traen riesgos a quienes aplican; una alternativa es la produccin y uso de bioinsecticidas. En los viveros es comn encontrar la mosca fungosa de la especie Bradysia, pero est, en cantidades grandes se vuelve una plaga la cual ataca las races de los arboles pequeos y que si no se atiende logra causar grandes prdidas econmicas. El bioinsecticida basado en Bacillus thuringiensis, se logra fermentar en materiales completamente econmicos y fciles de encontrar como lo es la harina de soya, jarabe de maz, la melaza, el almidn de maz y agar dextrosa papa. Despus de la fermentacin y una deshidratacin se logra obtener un polvo que se puede humedecer con agua y de esta forma probar a nivel laboratorio su toxicidad en este caso con larvas de la especie Bradysia sp., a las 24 horas de alimentacin muestran una mortalidad del 44% en promedio y que a las 48 horas una del 92%, los casos aumentan debido a que las larvas muertas no se retiran de la prueba y en estas continua reproducindose la bacteria y sus toxinas se liberan mientras las otras larvas continan alimentndose.Logrando ser un bioinsecticida til para el control de las larvas de Bradysia sp.

1.2 SUMMARY

Agricultural biotechnology is an option to create pest control. Furthermore, the use of chemical insecticides risks to bring those who apply, an alternative is the production and use of bio-insecticides. In nurseries is common to find the kind Bradysia fungus fly in large quantities, but this becomes a pest which attacks the roots of small trees and if left untreated does cause large economic losses. The biopesticide based on Bacillus thuringiensis is done completely ferment cheap and easier materials to find such as soybean meal, corn syrup, molasses, corn starch and potato dextrose agar. After fermentation and drying is possible to obtain a powder may be moistened with water and thus at laboratory test toxicity in this case with larvae of the species Bradysia sp., at 24 hours of power show a mortality of 44% on average and 48 hours a 92% increase cases because no dead larvae are removed from the test and continued playing in these bacteria and their toxins are released while the others continue feeding larvae.Obtaining a bioinsecticide be useful for the control of larvae of Bradysia sp.2. CAPITULO II

INTRODUCCION

Los viveros forestales se encargan principalmente del desarrollo de diferentes clases de semillas de los arboles hasta un crecimiento adecuado. Esto se debe a que el ser humano sobreexplota los troncos de miles de rboles para la construccin de bienes. La funcin principal es proteger el desarrollo inicial de estos rboles durante sus primeras etapas para despus trasplantarlas a zonas donde sea posible su adaptacin. Las semillas de los arboles caen en grandes cantidades en forma natural, pero de estas, por cuestiones climticas, logran germinar menos de la mitad y al ser atacados por plagas menos cantidad de semillas logran crecer. En un vivero se controlan varios factores climticos como lo es el agua, el sol, la temperatura y agregando factores como lo es el sustrato en el que se desarrollan y algunos fertilizantes para darle una mayor resistencia. Pero incluso dentro de un vivero existen factores que afectaran los resultados de las plantas tal como lo son las plagas.

La mosca Fungosa (Bradysia sp.) es comn en los viveros pero al comenzar la poca de lluvias su cantidad aumenta logrando causar que la cantidad y la calidad de la planta se vea afectada; La hembra pone sus huevecillos en la superficie de la tierra hmeda. Y las larvas se alimentan de las races y de los tejidos de los tallos de la parte ms baja de las plantas. Esto debilita y matan la planta afectada. Estos mosquitos son considerados una plaga mayor. Los mosquitos, los adultos y las larvas son tambin capaces de expandir varios patgenos a las plantas, lo que puede causar que la raz y la corona se pudran.Para combatir esta plaga la utilizacin de un bioinsecticida producido dentro de las instalaciones de este vivero resulta ser una buena opcin. El Bacillus thuringiensis var. Israelensis ha demostrado ser efectivo contra los insectos de la clase dptera a la cual pertenece la mosca fungosa y la mosca blanca, que en ocasiones logra ser una plaga dentro de los arboles de la familia de los pinos.3. CAPITULO III

MARCO TEORICO3.1 Viveros Forestales

Los viveros forestales son importantes en los programas de reforestacin, al ser sitios donde las plantas reciben los cuidados necesarios durante su germinacin y crecimiento, lo que les permite a estas asegurar su sobrevivencia y desarrollo en campo. (Prieto et al. 2009)Para garantizar lo anterior, las plantas deben poseer caractersticas morfolgicas y fisiolgicas apropiadas al finalizar su ciclo de produccin en vivero, mediante la utilizacin adecuada de insumos y aplicacin de prcticas culturales, relacionadas con medios de crecimiento, nutricin, micorrizas, riego, manejo de plagas y enfermedades, y el control de las condiciones ambientales, principalmente. (Johnson et al. 1991)En Mxico, la produccin de planta en vivero cada vez adquiere ms relevancia, debido a la demanda creciente de planta de calidad destinada a los programas de forestacin y reforestacin, enfocados a restaurar reas degradadas por causas diversas; por ello, es necesario mejorar los procesos de produccin de planta, de manera que se satisfagan las necesidades en cantidad y calidad. (Duryea 1985).Las caractersticas morfolgicas y fisiolgicas relacionadas con la calidad de planta son, entre otras: altura de la planta, dimetro del cuello, presencia de yema terminal, grado de lignificacin, longitud de la raz, cantidad de races secundarias, relacin parte area/parte radical, nivel de micorrizacin, produccin de biomasa y contenido de nutrimentos. Entre las caractersticas cualitativas se consideran: vigor, color, densidad del follaje y sanidad. Las caractersticas mencionadas, con excepcin del contenido de nutrimentos, pueden medirse en forma simple, por lo que no se requiere de equipo y/o procedimientos sofisticados. La planta de mala calidad debe desecharse, pues tendr pocas posibilidades de sobrevivir en campo, y si lo logra, su desarrollo ser incipiente. (Prieto et al., 1999).3.2 Concepto de PlagasEn la naturaleza, como resultado de mltiples presiones selectivas ocurridas en el curso de miles y millones de aos, los organismos han desarrollado mecanismos de supervivencia y reproduccin que explican su existencia actual. Pero, adems de su presencia se advierte que existe cierto equilibrio en las cantidades de plantas, animales y microorganismos. Es decir, la accin combinada de mltiples factores abiticos y biticos, explica que los organismos muestren una abundancia que, aunque variable estacionalmente, se mantiene ms o menos constante en torno a un valor promedio tpico. As, cada especie en cada localidad exhibe cierta abundancia caracterstica o tpica; segn la magnitud de ese valor, una especie ser poca o muy abundante. (Brechelt, 2004.)Puede afirmarse que en la naturaleza, a causa del efecto recproco de unos organismos sobre otros, bajo ciertas condiciones ambientales, estos muy rara vez incrementan sus densidades ms all de sus populaciones promedios y, cuando lo hacen, con tiempo la situacin retorna al estado normal. En otras palabras, en la naturaleza no existen plagas. (De Los Santos, 1996)Se habla de plaga cuando un animal, una planta o un microorganismo, aumenta su densidad hasta niveles anormales y como consecuencia de ello, afecta directa o indirectamente a la especie humana, ya sea porque perjudique su salud, su comodidad, dae las construcciones o los predios agrcolas, forestales o ganaderos, de los que el ser humano obtiene alimentos, forrajes, textiles, madera, etc. Es decir, ningn organismo es plaga per se. Aunque algunos sean en potencia, ms dainos que otros, ninguno es intrnsecamente malo. El concepto de plaga es artificial. Un animal se convierte en plaga cuando aumenta su densidad de tal manera que causa una prdida econmica al ser humano.

3.2.1 Plagas Claves

Son plagas que ocurren en forma permanente en altas poblaciones, son persistentes y muchas veces no pueden ser dominadas por las prcticas de control; si no se aplican medidas de control pueden causar severos daos econmicos. Slo pocas especies adquieren esta categora dentro de los cultivos, generalmente porque no poseen enemigos naturales eficientes.3.2.2 Plagas ocasionalesSon especies cuyas poblaciones se presentan en cantidades perjudiciales slo en ciertas pocas, mientras que en otros perodos carecen de importancia econmica. El incremento poblacional por lo general est relacionado con cambios climticos o desequilibrios causados por el hombre.

3.2.3 Plagas potenciales

Hay que entender que la gran mayora de especies que ocurren dentro de un cultivo, tienen poblaciones bajas sin afectar la cantidad y calidad de las cosechas. Pero si por alguna circunstancia, desaparecieran los factores de control natural, estas plagas potenciales pueden pasar a las categoras anteriores. Por ejemplo la aplicacin exagerada de insecticidas que tambin mata los benficos y los monocultivos entre otras actividades pueden causar este cambio. (Andrews, 1989)La multitud de problemas fitosanitarios se combaten desde hace mucho tiempo con insecticidas qumicos. Mucho ms todava en la agricultura moderna, son tratados como la nica solucin para dichos problemas, causando efectos inmediatos para reducir espectacularmente las poblaciones de insectos de manera efectiva y en el momento oportuno. Pero como resultado han provocado una situacin ms grave todava. Especialmente en la regin tropical se presentan grandes problemas de intoxicaciones de los mismos agricultores y obreros, efectos residuales en los productos agrcolas, contaminaciones de suelo, agua y aire, plagas resistentes contra prcticamente todos los insecticidas en el mercado y como consecuencia de todo esto la destruccin de los sistemas ecolgicos. (Gomero, 1994)Las plagas y enfermedades que afectan a las plantas cultivadas del Gnero Pinus en vivero, estn documentadas en varias literaturas y muchos otros artculos disponibles en bibliotecas y pginas especializadas de internet. La referencia de plaga est relacionada con las alteraciones fisiolgicas que un organismo vivo (patgeno) ocasiona a otro, normalmente con sntomas visibles o daos econmicos. En el caso de las plantas de pino, estos daos son causados por artrpodos, entre estos estn las Clases Insecto y Acarida y el Phylum Nemtoda, mismos que durante su ciclo de vida consumen parte o toda la planta, y con su hbito alimenticio contribuye en la dispersin de hongos, bacterias y virus.(Prieto et al. 2009)Durante la produccin de planta es crucial detectar en forma oportuna los problemas sanitarios, no hacerlo pone en riesgo la produccin y las prdidas econmicas pueden ser considerables. El control de plagas y enfermedades en vivero requiere de la ejecucin de estrategias de manejo especficas, como: monitoreo, evaluacin y diagnstico, control y prcticas de desinfeccin o de prevencin.(Prieto et al. 2009)Los daos ocasionados a las plantas, estn directamente relacionados con los hbitos alimenticios que tienen los insectos, principalmente por el tipo de aparato bucal que poseen. Debido a esto, los insectos se clasifican de acuerdo con el tipo de dao que ocasiona; de este modo se clasifican como: barrenadores, defoliadores, deformadores de follaje y chupadores de savia. (Prieto et al. 2009)3.3 Principales plagas en viveros forestales

El ataque de plagas y enfermedades afectan la calidad y cantidad de plantas producidas. Ocasionan deformaciones, detienen el crecimiento de las plantas y en algunos casos ocasionan su muerte. De acuerdo con literatura, la mayora de entomlogos reconoce 27 rdenes de insectos a nivel mundial; de stos, en Mxico slo nueve rdenes de insectos y caros (clase Acarida, orden Acari) causan dao en rboles forestales (Cuadro 1.), incluida la planta producida en viveros. Para tener xito en la prevencin y control de artrpodos plaga, es esencial conocer su ciclo biolgico y su hbito alimenticio. (Prieto et al. 2009)Cuadro 1. PRINCIPALES RDENES DE INSECTOS QUE CAUSAN DAO A RBOLES FORESTALES EN MXICOOrdenNombre comnCaracterstica

HempteraChinchesSe alimentan de la savia

HompteraChicharritas, cigarras, mosquitas blancas, escamas, piojos harinosos, y pulgones langerosSe alimentan de la savia

ColepteraEscarabajos y picudosSon descortezadores y barrenadores de madera

OrtpteraSaltamontes, langostas, insectos paloSon defoliadores del follaje

DpteraMoscas, mosquitas y midgesSon minadores de hojas, formadores de agallas y barrenadores de tallo

LepidpteraMariposas y palomillasLas larvas son consumidoras de follaje, barrenadoras en brotes suculentos de madera o semillas

ThysanopteraTripsTiene un aparato bucal raspador chupador

HimenpteraMoscas sierra, avispas, abejas y

hormigasLas larvas se alimentan de follaje, barrenan la madera y semillas

Acari

(clase acrida)carosLos fitfagos son los que atacan especies forestales

IspteraTermitas, comejenes, polillasSe alimentan de madera viva o muerta

3.3.1 Mosquita blanca. Se conoce tambin como mosquita de invernadero (Trialeurodes vaporariorum), produce una secrecin dulce y sobre ella se desarrolla moho negro tiznado.

En invernadero completa una generacin en tres a cuatro semanas. Las ninfas son de color blanco aperlado y viven en el envs de las hojas. Las adultas son pequeas, blancas y vuelan rpidamente en diversas direcciones cuando se mueve el follaje de las plantas. (Prieto et al. 2009)3.3.2 Mosca fungosa. (Figura 1.)Los adultos de mosca fungosa (Bradysia spp) miden de 2 a 4 mm de longitud, tienen antenas largas y moniliformes, el nico par de alas que tienen es oscuro con venas en forma de Y, los adultos son inofensivos pero sus larvas se alimentan de la raz de las plantas o de semillas carnosas cuando las condiciones son favorables. Los sntomas de dao en plantas son: marchitamiento, prdida de vigor en forma abrupta y follaje amarillento. Al examinar con lupa los brinzales afectados, se observa la presencia de larvas en la capa superior del sustrato.

Figura 1. Bradysia sp. mosca macho, larva, mosca hembra.Las larvas son blancas, delgadas, cabeza negra, piel semi-transparente que revela el contenido digestivo y longitud mxima de 5 mm. Normalmente la larva se encuentra en el sustrato y materia orgnica, y para encontrarlas se recomienda buscarlas por la maana.

La hembra oviposita en superficies hmedas, de preferencia en sustratos ricos en materia orgnica. La infestacin es ms severa cuando en los envases se han desarrollado algas o musgos por exceso de humedad. Los huevos se incuban en aproximadamente seis das, emergen las larvas y se alimentan por un par de semanas y pupan en el sustrato. Posteriormente, en cinco o seis das emergen las moscas completando el ciclo de vida. Por su corto ciclo de vida, la poblacin de mosca fungosa se incrementa rpidamente en invernaderos con presencia de materia orgnica, principalmente cuando la temperatura y humedad relativa son superiores al 70%.El control de larvas no es prctico; en vez de esto, los adultos deben ser controlados inmediatamente despus de ser vistos. Los adultos y larvas son transmisores de patgenos del suelo que causan pudricin del tipo Damping-off, como Fusarium, Botrytis, Verticillium y Pythium.

Para el control de la mosquita se usan insecticidas de contacto como Parathin metlico (paratin metlico) y Thionex (endosulfn), y Decis (deltametrina), este ltimo tiene menor eficiencia, tanto para larva como para adulto. Son muchos los insecticidas efectivos contra insectos adultos; sin embargo, es difcil alcanzar los lugares donde habitan, por lo que se recomienda controlar las larvas aplicando los insecticidas en el agua de riego. (Prieto et al. 2009)3.4 Control Orgnico de Plagas

Actualmente se busca fortalecer los factores naturales que regulan las plagas y enfermedades, de modo de crear condiciones de inmunidad y prevencin, donde los factores de resistencia acten evitando el desarrollo exagerado de los organismos potencialmente perjudiciales (Cuadro 2.). En lo fundamental, se busca estimular el establecimiento y desarrollo de los enemigos naturales y generar condiciones favorables de suelo para producir plantas sanas y resistentes a plagas y enfermedades. (Ramn, 2007)El objetivo del manejo no es eliminar los organismos potencialmente perjudiciales, sino regular el crecimiento de sus poblaciones para evitar la necesidad de tratamientos o acciones de represin directas. Consecuentemente, es necesario contar siempre con un remanente de los organismos que son plagas potenciales, para permitir la sobrevivencia y reproduccin de sus biorreguladores. (Suquilandia, 2003)Cuadro 2. Compuestos orgnicos e inorgnicos comercializados para control de insectos en MxicoNombre

del producto CompaaAgente activoControl de:

Azatina

Thermo Trilogy

RCI 1

Mosquita blanca, fidos, trips, gusanos defoliadores, orugas y minadores de hoja

Dimilin 25 PH

Uniroyal Chemical

Mxico, DFRCI

Larvas y ninfas de gusanos diversos, conchuela del frijol, picudo del algodn, mosquitas de los championes, caro de la negrilla de los ctricos, etc.

TriactThermo TrilogyDeshidratanteFungicida-Acaricida 2

Bio CrackBerni Labs

Aguascalientes, Ags.Alomonas (extractos

vegetales)Mosquita blanca, minador de la hoja, picudos, chinches y trips

Bio-agro Controlador

biolgicoBioTecnologa Agropecuaria

Quertaro, Qro.Humus de lombrizGallina ciega, palomilla blanca, palomilla dorso de diamante, etc.

Seed Right GAEB-Agro-Ecologa de

Quertaro 3 Quertaro,

Qro.Dixido de slice, slice

amorfa y gel de slice

anhidroPreviene la proliferacin de hongos y evita el dao causado por insectos del grano (ej., gorgojos, palomillas)

1 Reductor del crecimiento de Insectos

2 An no est registrado para su uso en Mxico

3 Producido por AEB, distribuido por Agro-Ecologa de Quertaro.El enfoque del manejo ecolgico de plagas va ms all de detectar sntomas. Apunta a resolver las causas, buscando las soluciones en la raz de los problemas. Por ello, este enfoque est ms orientado a prevenir que a curar los problemas. (Landez, 2001)Segn Ramn en el 2007, el manejo ecolgico de plagas y enfermedades busca lo siguiente:

3.4.1 Medidas preventivas: Se pretende evitar dificultades posteriores logrando:

- Aumentar la resistencia individual de la planta.

- Situar a la planta en condiciones apropiadas para aumentar la resistencia.- Crear las condiciones desfavorables para los parsitos.

Asociacin de plantas y plantas compaeras:Esta medida se basa en el manejo del principio de la biodiversidad.- Alelopata, es la relacin de atraccin y repulsin debida a que las plantas liberan ciertas molculas derivadas de su metabolismo, las que actan como atrayentes para ciertos microorganismos a tiempo que repelen otros.

- Plantas compaeras actan como repulsivo del individuo (plaga) que estn atacando.

- A veces se asocian al cultivo plantas que son preferidas por el parasito actuando como cebo, siendo as ms fcil su control.

Tratamientos vitalizadores: Consiste en potenciar y nutrir bien a la planta para que resista al ataque de los insectos: ejemplo los preparados de plantas, estircoles, fermentos, caldos microbiales e hidrolizados.

3.4.2 Medidas curativas: Son las que se aplican una vez que la planta ha sido infestada por la plaga o enfermedad.

Control fsico:

Incluye una gama de procedimientos para cambiar el ambiente a fin de que este no sea propio para el desarrollo del patgeno por ejemplo la temperatura alta o muy baja y el uso de desecantes.

Control cultural: Es el manejo adecuado que se le da al cultivo en lo que respecta al suelo, agua, escardas, podas sanitarias, tutorajes, cultivos asociados, plantas repelentes, cultivos trampas, incorporacin de materia orgnica, control de la poca de siembra y cosecha.

Control mecnico:Este mtodo consiste en la destruccin manual de insectos, la recoleccin a base de aspiradoras, el manejo del agua, la implementacin de barreras.

Control natural:Consiste en que los depredadores naturales de los insectos plaga ayudan a mantener el equilibrio en el medio como por ejemplo aves, mamferos, arcnidos, reptiles, batracios e insectos benficos.

Control biolgico:Comprende el uso de enemigos naturales, insectos benficos y agentes microbiolgicos, pero esta vez con la intervencin del hombre.

Control etolgico:Consiste en determinar la atraccin que los insectos sienten por determinados estmulos utilizando dispositivos qumicos o fsicos que afectan el comportamiento de los insectos tales como fermentos, luz, colores y feromonas.

Control fitogentico:Propone el uso de cultivos resistentes o tolerantes a plagas.

Control legal:Son mandatos del estado como:

- Evitar en lo posible la introduccin o el arraigo de plagas o enfermedades procedentes de otros pases.

- Evitar y retardar la dispersin de plagas localizadas en reas restringidas.

- Reforzar y coordinar a nivel regional la implementacin de un manejo ecolgico de las plagas.

- Asegurar la calidad y eficiencia de los insumos a utilizarse.

Control autocida:Consiste en la liberacin de insectos estriles o de poblaciones genticamente degradadas o contaminadas para influir en la reproduccin y sobrevivencia de las poblaciones de plagas o en su contaminacin.

Control qumico:Propone el uso de los principales qumicos que se encuentran presentes en los extractos de plantas y algunas sales permitidas, con principios insecticidas, fungicidas y nemticidas. (Ramn, 2007)3.5 Biofungicidas Muchos han sido los organismos que de manera experimental han sido aislados y se ha probado su actividad fungicida, aunque no todos han desarrollado un producto comercial. En general son productos formulados a base de bacterias u hongos: Bacterias: es posible encontrar en el mercado distintos productos de origen bacteriano para el control de hongos de raz y cuello a base de diferentes aislados de los gneros Bacillus, Pseudomonas y Streptomyces. A Burkholderia cepacia se le atribuye adems un efecto nemticida. (Backman et al. 1997)

Hongos: existe un considerable trabajo realizado con Trichoderma y Gliocladium debido a su fcil aislamiento, cultivo y fermentacin a gran escala. Otros hongos como Ampelomyces quisqualis Cesati ex Schlecht., Fusarium oxysporium Schlecht., Phytium oligandrum Drechler, Coniothyrium minitans Campell y Phlebiopsis gigantea (Fries) Jlich tambin han desarrollado distintos productos comerciales. 3.6 Bioherbicidas Los bioherbicidas son productos basados en microorganismos capaces de matar selectivamente las malas hierbas sin daar los cultivos. Estos ACB pueden ser de origen bacteriano o bien fungco:Bacterias: los condicionantes para su uso son la necesidad de una elevada humedad y presencia de heridas o entradas naturales. Se puede favorecer la entrada del ACB mediante la siega previa a su aplicacin. Ciertos surfactantes como Silwet L-77 (0.02%) facilitan su entrada a travs de los estomas y al mismo tiempo, las bacterias quedan protegidas de los efectos de la radiacin UV y la desecacin. (Boyetchko et al. 1998).Hongos: la temperatura y la humedad son las principales limitaciones para su eficacia. Varios adyuvantes mejoran la germinacin de las esporas, como es el caso del aceite de maz sin refinar, que mejora la actividad de Colletotrichum truncatum (Schwein) Andrus y Morre y reduce los requerimientos de humedad necesarios para su germinacin. Surfactantes como Tween 20 permiten a las plantas a reducir la tensin superficial y mejoran la dispersin de las esporas en las gotas. Hay que tener en cuenta la posible accin inhibitoria / estimuladora del surfactante en la germinacin de las esporas, infeccin y desarrollo.

3.7 Biobactericidas Hasta el momento solamente existen productos basados en bacterias como ACB para el control de enfermedades bacterianas (Wilson & Backman 1998): Bacterias: Agrobacterium radiobacter Conn cepa K86 empez a comercializarse en 1973 para el control del tumor de cuello causado por Agrobacterium Conn. Su control se deba a la presencia de agrocina 84 y 434. La produccin de agrocina 84 es codificada por un plsmido (pAgK84) que tambin contiene genes que codifican para la resistencia a la agrocina 84 y a la transferencia por conjugacin (Tra). Con el fin de prever la conjugacin y transferencia del gen que de la resistencia a agrocina al patgeno, transformndolo en resistente, la empresa australiana Bio-Care Technology desarroll en 1991 una cepa genticamente modificada sin el gen Tra, comercializndose como NOGALL. Pseudomonas fluorescens se aplica en forma de spray para combatir Erwinia amylovora (Burrill) Winslow en frutales y hortcolas, as como los efectos provocados por heladas.

Natural Plant Protection, en Francia, han desarrollado una suspensin bactericida a base de un bacterifago capaz de controlar la pudricin radicular causada por Pseudomonas tolaasii Paine en cultivos de championes (Agaricus spp.) y Pleurotus spp. Esta misma empresa comercializa PSSOL formulado para el control de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi basado en una cepa no-patognica.

3.8 Bionematicidas

Pocos son los productos bionematicidas que se comercializan. La mayora de organismos estudiados son de tipo fngico aunque tambin existen algunas bacterias (Strirling 1991): Bacterias: ensayos realizados desde hace dcadas con Pasteuria penetrans Sayre y Starr demuestran su capacidad en controlar nematodos, pero la complejidad del cultivo, la dificultad de producir esporas en cantidades elevadas (1013 esporas/l), y la especificidad husped-bacteria, son las principales limitaciones para su uso a nivel comercial. En Israel se comercializa BioSafe y BioNem, dos productos basados en la bacteria Bacillus firmus Bredemann y Werner para el control del nematodo agallador Meloidogyne sp. (Kerry, 1993)Hongos: Ciertas especies de hongos como Nematophtora gynophila Kerry y Crump, Arthrobotrys oligospora Fresenius, Paecylomyces lilacinus (Thom), y Verticillum chlamydosporium Goddard son parsitos de nematodo. Pero no existe su produccin a nivel comercial debido a su lento crecimiento en condiciones in vitro, el poco tiempo de supervivencia del cultivo, sus requerimientos nutricionales y algunas inconsistencias entre los distintos ensayos de campo. (Cabanillas, 1989)DiTera es un nemticida de amplio espectro de origen microbiano producido por la fermentacin sumergida de Myrothecium verrucaria Ditmar, sin estar constituido el producto por propgulos viables. (Fernndez 2001) 3.9 Bioinsecticidas Cada vez es ms cuestionada el uso de insecticidas qumicos para el control de plagas y enfermedades de los cultivos debido a su efecto negativo sobre los seres humanos y el medio ambiente.

Existen diferentes alternativas a los mtodos qumicos, como por ejemplo el uso de biopesticidas, plantas resistentes a determinados patgenos, plantas micorrizadas, rotacin de cultivos, entre otras. Dichas alternativas no son excluyentes, por el contrario, una combinacin de ellas de manera correcta podra llevar a un control econmicamente aceptable para la mayora de los cultivos. (Glass, 1995)Los biopesticidas son productos que contienen un microorganismo como ingrediente activo o bien se extraen de un ser vivo mediante procedimientos que no alteran su composicin qumica. Pueden estar constituidos por toda o una parte de la sustancia extrada, concentrada o no, adicionada o no a sustancias coadyuvantes.

Entre las ventajas que podemos encontrar podemos mencionar algunas como: la especificidad en su actuacin, respeto al medio ambiente, los patgenos tienden a desarrollar menor resistencia a productos microbianos que a productos qumicos; aunque como todo podemos encontrar algunas desventajas tales como: Una efectividad de control en general menor que los productos qumicos, generalmente su accin no es inmediata, dificultades de produccin a nivel comercial, necesidad de resolver problemas tcnicos como la sensibilidad a factores ambientales (temperatura, radiacin UV, humedad) que presentan la mayora de estos productos.(Realpe et al. 1995)Los bioinsecticidas pueden estar formulados a base de bacterias, virus, u hongos:

Bacterias: la mayora de productos estn basados en diferentes cepas de la bacteria gram-positiva Bacillus thuringiensis, la cual produce toxinas especficas (-endotoxinas) txicas para diferentes rdenes de insectos. Otro tipo de productos se basan en la extraccin de la -endotoxina que es incorporada a un plsmido que se inserta a un aislado de Pseudomonas fluorescens. A las clulas bacterianas recombinantes se les permite crecer en un medio de cultivo adecuado para que expresen la -endotoxina y posteriormente se les aplica un tratamiento de alta temperatura. Las clulas bacterianas muertas sirven de microcpsulas que protegen a la frgil toxina de Bacillus thuringiensis. (Gaertner 1993)A nivel comercial, las bacterias se multiplican generalmente en un tanque de fermentacin lquida. Los agentes para el control biolgico pueden ser formulados en estado de dormancia o ser metablicamente activo. Las formulaciones que contienen clulas activas son menos tolerantes a fluctuaciones ambientales, menos compatibles con productos qumicos, de vida ms corta, y requieren un empaquetamiento que permita el intercambio de gases y humedad. Sus ventajas son que al estar activas, empiezan actuar en el momento de su aplicacin.

Virus: otra estrategia consiste en utilizar diferentes virus que poseen una elevada especificidad en sus huspedes. Estos productos no han tenido el xito que cabra esperar, debido a su bajo nivel de virulencia, poca estabilidad a la luz UV, dificultades en la produccin y una pobre persistencia.Hongos: de entre ellos destacan Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin y Paecilomyces fumosoreus para el control de la mosca blanca, Verticillium lecanii para fidos, y Metarrhizium anisopilae para cucarachas. Estos productos se aplican directamente sobre el insecto en forma de polvo, emulsin o polvo mojable. En condiciones de campo, pueden aplicarse mezclados con aceites a volmenes ultrabajos a fin de incrementar su eficacia y proteger el agente de control biolgico. (Geartner, 1990)Los organismos entomopatgenos son aquellos que infectan al insecto y se reproducen en l hasta causarle la muerte. Esto ltimo no es necesariamente cierto, ya que en muchas ocasiones el nmero de organismos que infectan no es suficiente como para ocasionar la muerte del insecto. Esto, que podra considerarse como una desventaja, en realidad no lo es, ya que el insecto vivo contina dispersando al agente infectivo y provocando la infeccin de otros insectos en el rea. Este fenmeno es conocido como autodiseminacin y sus ventajas se han observado principalmente con ciertos baculovirus y protozoarios.3.9.1 Empleo de bioinsecticidas en Mxico

En el mercado nacional el incremento de bioinsecticidas es lento pero continuo. Entre los entomopatgenos, Bt es el bioinsecticida de mayor aceptacin y empleo, con una aplicacin estimada de 100,000 ha. de maz, 174,000 en algodn, y otras 200,000 ha. en hortalizas y otros cultivos. Para dar un ejemplo especfico podemos considerar el cultivo de maz. Se estima que en Mxico se siembran alrededor de 10 millones de hectreas al ao, de las cuales, unos dos millones corresponden a cultivos de riego. Para cubrir un 5% de la superficie del maz de riego, que se siembra en Mxico, se requieren 100 toneladas del producto comercial. (Tamez et al. 2001)Cuadro 3. Organismos entomfagos comercializados en Mxico

Organismo entomfagoCompaa productoraSugerido para el control de

Trichogramma

AlternaAgro

P.I.F.S.V.C.L1

Gusano bellotero, gusano tabacalero, barrenador de

la nuez, barrenador de la caa de azcar, palomilla

del manzano, etc.

Chrysoperla

AlternaAgro

P.I.F.S.V.C.L.

Pulgones, trips, mosquita blanca, pslido del tomate,

gusano falso medidor, gusano descarnador, gusano

barrenador de la nuez, gusano bellotero y gusano

tabacalero

Spalangia

Diaschaminorpha longicaudata

Coccinella 7-punctataAlternaAgro

CESAVEG

CNRCB

Moscas (en establo)

Mosca de la fruta

Pulgones (al menos 35 especies diferentes)

Slo en la regin del Bajo Guanajuatense se estima que se tendr una aplicacin de 37 toneladas de Bt para el ao 2001. En base a esta informacin, muy probablemente el empleo de bioinsecticidas a base de Bt en Mxico oscile entre un 4-10% del total de insecticidas.

Las principales compaas productoras de Bt que comercializan en Mxico son transnacionales. El precio del producto es de US $ 19/ha, por lo cual puede competir con los productos qumicos del mercado. (Tamez et al. 2001)Con respecto a hongos entomopatgenos, la produccin de Beauveria bassiana, Metarhizium anisoplae, Paecilomyces fumosoroseous y Verticillium lecanii se viene realizando en los estados de Colima, Guanajuato, Oaxaca y Sinaloa, para el control de plagas en cultivos de hortalizas, gramneas y leguminosas. La nica empresa mexicana independiente que produce y comercializa bioinsecticidas es Agrobionsa (Culiacn, Sin.). Adems de Bt, dicha empresa comercializa los hongos B. bassiana, M. anisoplae y P. fumosoroseous para su aplicacin en diferentes cultivos, control de plagas caseras y en invernaderos. Existe tambin la produccin de hongos a nivel estatal en ciertas regiones agrcolas.6 Un ejemplo lo constituye el producto BioFung (BbChc-LBIH-28), elaborado por el Centro de Reproduccin de Organismos Benficos del Comit Estatal de Sanidad Vegetal de Guanajuato, A.C., y cuyo agente activo son esporas de B. bassiana. Ellos tambin estn produciendo M. anisoplae. As tambin, el Centro Nacional de Referencia de Control Biolgico. CNRCB-DGSV (Tecomn, Col.) se encarga de producir diferentes tipos de hongos para investigacin sobre el control de plagas de insectos en el pas, adems de entomfagos. (Fuentes, 1994)El empleo de baculovirus para control biolgico es casi nulo en Mxico, pero existen diferentes proyectos donde se estudia la factibilidad econmica y las ventajas del empleo de dichos agentes para plagas que son difciles de controlar con hongos o bacterias.

Es muy probable que en el futuro se incremente paulatinamente el consumo de productos a base de estos microorganismos en pases en desarrollo. Los nemtodos que se emplean como bioinsecticidas son Heterorhabditis y Sterinernema. Es importante aclarar que son bacterias simbiticas que coexisten con estos microorganismos las que infectan al insecto, no el nematodo en s. Adems de stos, el nematodo Romanomermis spp se est produciendo a nivel de laboratorio en el CIIDIR Unidad Oaxaca, de manera similar a las mencionadas para el caso de hongos. La produccin est dirigida al control de mosquitos de importancia en salud pblica (Anopheles sp y Culex sp). (Miller ,1983)Los datos de produccin y comercializacin de bioinsecticidas en Mxico son comparables al de pases desarrollados. Esto refleja la comunicacin entre los investigadores y agricultores en nuestro pas. Es tambin importante hacer mencin de la conciencia que existe en el dao potencial del uso irracional de insecticidas qumicos y ha ayudado al progreso de la biotecnologa agrcola, misma que ha permitido el incremento en la produccin de entomopatgenos y entomfagos en Mxico. (Cuadro 4.) (Tamez et al. 2001)La produccin de organismos entomfagos se realiza en toda la repblica, y los organismos que ms se distribuyen son Chrysoperla carnea y Trichogramma pretiosum. (Cuadro 3.) Extractos vegetales de las plantas Chrysanthemus sp y Tagetes sp tambin se emplean en control biolgico. Las ventas anuales de estos productos en Mxico se han estimado

en $ 30,000.00 anuales, con un precio del producto a $ 80.00/litro o Kg. Sin embargo, estos productos no han tenido el impacto y la aceptacin en la agricultura tradicional que han tenido los organismos entomfagos. (Rodrguez, 1999)Cuadro 4. Organismos entomopatgenos que ms se comercializan en

Mxico en la actualidad.AGENTE DE BIOCONTROL:TIPO:NOMBRE DEL PRODUCTO:SUGERIDO PARA EL CONTROL DE:COMPAA PRODUCTORA:

Bacillus thuringiensis aizawaiBXenTariPalomilla dorso de diamante, gusano falso medidor, gusanos soldados, gusanos defoliadoresAbbott-dupont

Bacillus thuringiensis israelensisBSkeetal, VectobalDpterosAbbott-dupont

Bacillus thuringiensis kurstakiBBactospeine DFPalomilla dorso diamante, gusano falso medidor, mariposilla blancaAbbott-dupont

Bacillus thuringiensis kurstakiBBiobit HPGusano de la llemas del tabaco, gusano falso medidor, gusanos soldados, gusanos defoliadoresAbbott-dupont

Bacillus thuringiensis kurstakiBDipelLepidpterosAbbott-dupont

Bacillus thuringiensis kurstakiBJavelin, ThuricideLepidpterosEcogen

Bacillus thuringiensis tenebrionis morrisoniBNovodorColepterosThermo Trilogy, Columbia MD., USA

Bacillus thuringiensis tenebrionisBTridentColeopterosEcogen

Bacillus thuringiensis thuringiensisBTeknar DipterousEcogen

Beauveria bassianaHBea-SinPlagas de cultivoAgrobionsa, Culiacn, Sin.

Beauveria bassianaHBotaniGardPlagas de InvernaderoMycotech Mxico, DF

Beauveria bassianaHMycotrolPlagas de cultivoMycotech

Beauveria bassianaHBeauveria bassianaBroca del caf, Mosquita blanca, chapulinesCNRCB Tecoman, Col.

Beauveria bassianaHBio-FungChapuln en frijol y mazCESAVEG Irapuato, GTO

HzNPVVGemstarHelicoverpa zeaThermo Trilogy

Metarhizium anisopliaeHBio-BlastTermitas y cucarachasEco Science

Metarhizium anisopliaeHMeta-SinPlagas caserasAgrobionsa, Culiacn, Sin.

Metarhizium anisopliaeHFitosan-MGallina ciega, chapulinesCESAVEG

Myrothecium verrucariaHDitera ESNematodos de las cucurbitaceasAbbott-Dupont

P. fumosoroseusHPea-SinPlagas de invernaderoAgrobionsa

P. fumosoroseusHPFR-97Plagas de invernaderoThermo Trilogy

P. fumosoroseusHP. fumosoroseusMosquita blanca, chicharrita.CESAVEG

Sterinemema sp. Heterorhabditis spNACB Nematodosplagas del suelo y barrenadoresAlternaAgro, Texcoco, Mex

SeNPVVSpodexSpodoptera exiguaThermo Trilogy

B= bacteria, H= hongo V= virus Nematodo

Organismos benficos comercializados en Mxico3.9.2 Bacillus thuringiensis (Bt)

Bacillus thuringiensis es un bacilo gram-positivo, aerobio, que se encuentra de forma natural en suelo y plantas. El Bt fue descubierto en Japn en 1901 por Ishiwata, pocos anos despus fue aislado en Thuringia (Alemania), siendo este el primer ingrediente activo utilizado para formular y generar el primer producto comercializado a base de Bt en Francia, en el ano de1938. Desde entonces hasta nuestros das, aunque durante la dcada de los 40 y 50 su uso fue desplazado debido al descubrimiento de los insecticidas de sntesis orgnica, es el biopreparado ms utilizado en la prctica y representa ms del 90% del mercado de insecticidas biolgicos. (Feitelson et al. 1992).El cristal o cuerpo paraesporal es formado por el bacilo al mismo tiempo que forma la espora. Generalmente tiene forma de diamante, pero en algunas especies tiene forma de romboide o cuboide. Por lo general cada esporangio contiene un cristal. Este est separado de la pared celular con la espora, y parece persistir indefinidamente. En la naturaleza proteica, tiene ms de un 97 % de nitrgeno y cuando menos 17 aminocidos, pero no tiene fsforo. Se tie fcilmente con colorantes biolgicos y con facilidad se observa con tinciones negativas o por medio de microscopio de fase. (Charles, 1992)Este insecticida microbiano fue colocado originalmente en 1961 como pesticida de uso general. Los nombres comerciales incluyen Acrobe, Bactospeine, Berliner (de la variedad kurstaki), Certan (de la variedad aizawai), Dipel, Javelin, Leptox, Novabac, Teknar (de la variedad israeliensis). (Hofte, 1989).En Mxico, el uso de Bt no haba sido muy utilizado, en parte debido al alto costo de los bioinsecticidas comerciales importados basados en Bt. Las formulaciones que contienen como ingrediente activo Bt han sido estudiadas detalladamente durante los ltimos anos para aumentar su eficacia y para prolongar la actividad residual de la misma. (Galan-Wong y

Rodrguez-Padilla, 1991).Algunos bioinsecticidas son capaces de eliminar plagas altamente nocivas para los cultivos agrcolas, al inmovilizar su aparato digestivo, el insecto muere pues no puede ingerir alimento. Empero, su uso tiene ventajas y desventajas. Bacillus thuringiensis es una bacteria que cuando est en condiciones desfavorables para su crecimiento, y como mecanismo de supervivencia, produce una espora con gran cantidad de protena y se forma un cristal. (Maldonado-Blanco, 2003).Bacillus thuringiensis es una bacteria natural comn en suelos en todo el mundo, esta bacteria insecticida es muy usada para el control de numerosas plagas importantes de las plantas, principalmente insectos del orden Lepidptera. Esta bacteria ha sido, desde su descubrimiento, tema de investigacin cientfica y una de las mejores promesas como agente efectivo para el control de insectos plaga. (Oatman and Platner, 1972). En la industria agroqumica existen numerosos productos que contienen Bt representando cerca del 1% del mercado agroqumico total (fungicidas, herbicidas e insecticidas). Los productos comerciales elaborados a base de Bt contienen una mezcla de esporas y de cristales. Se aplican a las hojas o a otros ambientes donde las larvas del insecto se alimentan.

El modo de accin de Bt es solo por ingestin. La accin insecticida es debida a la presencia del cristal proteico producido durante la esporulacin de la bacteria, llamada delta endotoxina. (Caballero y Ferre, 2001).Los insectos ingieren los cristales diseminados sobre las hojas o sustrato de alimentacin durante su fase larvaria, estos llegan a su intestino medio, se disuelven por la accin de los jugos intestinales que presentan pH alcalino. (Schnepf et al, 1998). Los sntomas que se observan a partir de que las larvas de insectos susceptibles ingieren los cristales y esporas de Bt son: cese de la ingesta, parlisis del intestino, vomito, diarrea, parlisis total y finalmente la muerte. (Soberon y Bravo, 2006).La muerte de las larvas ocurre durante los primeros cinco das; si sobreviven los primeros das, no causan mas dao al cultivo pues no pueden alimentarse. Cuando ingieren dosis sub letales algunas veces logran pupar pero los adultos que emergen son estriles, controlando as poblaciones futuras. Los efectos de control de larvas que se pueden observar en el campo son: la disminucin del dao fresco, deposiciones secas, deformacin, cambio de color y prdida de movilidad. (Caballero y Ferre, 2001).Cuando las esporas y cristales son ingeridos por insectos susceptibles, las partes bucales y el intestino quedan paralizados y se destruye el epitelio intestinal. El insecto muere en un lapso que vara desde algunas horas desde algunas horas hasta 3 semanas, dependiendo de las dosis ingeridas y del tipo de accin patgena inducida. El cristal es el componente ms importante contra los insectos ms susceptibles pero la muerte puede ocurrir tambin por septicemia bacteriana, especialmente en orugas. La bacteria rara vez puede difundirse entre las poblaciones de plagas pero persiste en el follaje por periodos que varan entre 3 das y seis semanas, segn las condiciones. Los cristales son insolubles en agua y a las esporas y cristales constituyen un insecticida en forma de partculas, usualmente formulados como polco humectable o emulsionable. Este bioinsecticida microbiano es comparable a un veneno estomacal. Solo es efectivo cuando es ingerido por el insecto y no tiene accin por contacto. (De Barjac, 1974)Los productos que contienen Bacillus thuringiensis son notablemente seguros. Hasta ahora, segn clculos muy conservadores, han sido usadas ms de 5 mil toneladas sin producir daos. No se han registrado efectos dainos en ensayos de seguridad con abejas, vertebrados, mamferos y humanos. La mayor parte de los insectos benficos no son daados aun con dosis enormes. (De Barjac 1974)La endotoxina-delta del Bacillus thuringiensis puede resistir 80C durante 24 horas sin perder actividad, pero una exposicin a 120C durante 15 minutos causa inactivacin. No se observo prdida significativa alguna en la actividad larvicida despus de una onda calorificante durante 20 minutos a 60C, liofilizacin o exposicin a radiaciones ultravioleta 253.6nm. (De Barjac, 1974)Aun cuando parece que la endotoxina-delta es inactiva enseguida de su ingestin por las larvas de mosquito, estudios de laboratorio han demostrado que la actividad se limita a unos cuantos das, pero puede aumentarse cuando se dejan las larvas muertas en el medio. Se ha observado tanto la estabilidad de la endotoxina cristalina como la supervivencia de la bacteria en las larvas muertas despus de secar y volver a inundar las suspensiones de cristales-esporas. (De Barjac, 1974)Los estudios de laboratorio indican que la clase de agua, sedimentos de estanque, radiaciones ultravioleta de la luz solar y la sedimentacin en el agua, podran reducir la disponibilidad de Bacillus thuringiensis para las larvas objetivo. Por otro lado, aunque la bacteria no se reprodujo despus de la aplicacin del agua, puede anticiparse con un control adicional por medio de las larvas de mosquito que se alimentan de las larvas muertas por el medio Bacillus thuringiensis que contienen clulas vegetativas con cristales y esporas de la bacteria. De esta manera una investigacin adicional sobre los factores que afectan la efectividad, persistencia y estabilidad de la formulacin de la bacteria en el campo, puede resultar en una eficacia incrementada. (De Barjac, 1974)Existen dos tipos de delta-endotoxinas: las protenas Cry y las protenas Cyt. A la fecha se han clonado y secuenciado ms de 200 diferentes genes Cry y 16 diferentes genes Cyt. Esto es sin duda un arsenal muy valioso para el control de diferentes insectos plaga y de insectos transmisores de enfermedades. La nomenclatura de las d-endotoxinas est basada exclusivamente en la similitud de la secuencia primaria. La definicin de protenas Cry es cualquier protena paraesporal de Bt que muestre un efecto txico hacia algn organismo, verificable por medio de bioensayos o cualquier protena que muestre similitud con las protenas Cry. Actualmente se han encontrado toxinas Cry en otras especies de bacterias como Clostridium bifermentans (clasificadas como Cry16A y Cry17A) con actividad hacia mosquitos. Las protenas Cyt denotan a las protenas paraesporales de Bt que muestren actividad hemoltica o tengan similitud a la secuencia de las toxinas Cyt. (Chickmore et al. 1998)Los sntomas que se observan a partir de que las larvas de insectos susceptibles ingieren los cristales y esporas de Bt son: cese de la ingesta, parlisis del intestino, diarrea, parlisis total y finalmente la muerte. De manera general se acepta que las toxinas Cry son toxinas formadoras de poro que ejercen su actividad txica al provocar un desequilibrio osmtico en las clulas epiteliales donde se insertan en la membrana. (Yu-CaoGuo et al. 1997)Las protenas Cry son producidas como protoxinas que requieren ser procesadas proteolticamente por proteasas presentes en el intestino de insectos susceptibles. Este procesamiento proteoltico libera fragmentos txicos de 55 a 65 kDa que interaccionan con protenas receptoras presentes en la microvellosidad de las clulas intestinales de los insectos blanco. Posteriormente, las toxinas se insertan en la membrana formando un poro ltico. (Fernndez y Vega, 2002)Un caso excepcional es el control de mosquitos por una cepa de Bt conocida como Bacillus thuringiensis subespecie israeliensis (Bt). Esta bacteria produce tres toxinas Cry (Cry4A, Cry4B y Cry11A) y dos toxinas Cyt (Cyt1A y Cyt2A) con alta actividad insecticida contra larvas de diferentes especies de mosquitos y otros dpteros. Bti se ha ocupado por ms de 30 aos en el control de mosquitos y moscas transmisores de enfermedades como el dengue, la malaria y la oncocercosis sin que a la fecha se haya reportado la aparicin de resistencia. Distintos estudios en diferentes laboratorios demostraron que la no aparicin de insectos resistentes a Bt se debe a la presencia de la toxina Cyt1Aa. (Galn et al. 1996)La habilidad de los insectos para sobreponerse y adaptarse al estrs ambiental hace que los mtodos de control se vuelvan ineficientes, como sucede con el uso excesivo de algunos plaguicidas. Hasta el momento aparecen pocos informes de resistencia a Bacillus thuringiensis. Dos ejemplos son Plutella xylostella en repollo en Asia y Plodia interpunctella, plaga de productos almacenados. En el laboratorio se ha demostrado la posibilidad de que el insecto desarrolle resistencia al uso continuado de B. thuringiensis, sobre todo a las delta endotoxinas, porque para la beta exotoxinas el efecto es mucho menor. Es importante sealar que los resultados de laboratorio no pueden extrapolarse a las condiciones de campo, porque las condiciones ambientales y la presin de seleccin natural juegan un papel importante. (Feitelson, 1992)La resistencia por parte del insecto a Bacillus thuringiensis se explica por va bioqumica, fisiolgica y de conducta. En el primer caso, el insecto llega a metabolizar las toxinas, en el segundo parece existir una disminucin de sensibilidad en los receptores y en el tercero disminuye la habilidad del insecto para aceptar el insecticida. (Fernndez y Vega, 2002)Se han desarrollado diferentes estrategias para disminuir la posible resistencia a esta bacteria. Una de las ms utilizadas es su uso en programas de manejo integrado. Otra estrategia es el uso de productos a partir de diferentes cepas de B. thuringiensis, con diferentes tipos de delta endotoxinas.Se han podido aislar poblaciones de moscos resistentes a las toxinas Cry4A, Cry4B y Cry11A, o a las tres toxinas, sin embargo no se han podido aislar poblaciones resistentes a la toxina Cyt1Aa. Es ms, las poblaciones de mosquitos resistentes a las toxinas Cry recuperan la sensibilidad a estas toxinas en presencia de cantidades subletales de Cyt1Aa. Por otra parte, se ha demostrado que la toxina Cyt1A sinergiza la actividad insecticida de las otras toxinas Cry, es decir, la actividad txica de la mezcla de toxinas Cry con Cyt es mucho mayor que la suma de sus actividades individuales. (Fernndez y Vega, 2002)Las toxinas Cry y Cyt son toxinas formadoras de poro. Esto significa que para matar a su insecto blanco, las toxinas Cry y Cyt se insertan en la membrana de las clulas apicales del intestino formando un poro que permite el paso de iones y agua, provocando un desbalance osmtico y finalmente la lisis celular. Sin embargo, las toxinas Cry y Cyt tienen mecanismos diferentes para interactuar con la membrana. Es importante mencionar que el mecanismo ms comn de la resistencia a las toxinas Cry son mutaciones que afectan a los receptores protenicos, lo que evita as la unin de la toxina a su membrana blanca. En cambio, las toxinas Cyt, formadas por un solo dominio estructural, no interaccionan con protenas de membrana, si no que interaccionan directamente con lpidos especficos de la membrana de mosquitos formando el poro. (Fernandez y Vega 2002)4. CAPITULO IV

ANTECEDENTES

En 2010 Torres-Ortega diseo una formulacin de un insecticida biodegradable a base de Bacillus thuringiensis para el control de Spodoptera exigua el cual es un insecto que daa cultivos agrcolas el cual es una alternativa para el control de esta plaga sin daar el medio ambiente; elaboro un formulado granular a base de polmeros biodegradables como Capsul, la pectina, gelatina y otros componentes naturales de plantas como el grano de maz, olote, como principio activo se utilizaron las esporascristales de Bacillus thuringiensis; dando como resultados que un formulado a base de la mezcla Capsul-gelatina-olote dio una preferencia alimenticia por parte del insecto y que la 3 concentraciones usadas (3%, 7%, 10%) registraron una mortalidad mayor comparado con un producto comercial.

Escobar en Colombia en el 2004 optimizo un medio de cultivo para la produccin de Bacillus thuringiensis donde se tomo en cuenta no solo el ingrediente activo sino tambin los costos necesarios para la materia prima dando como resultados una produccin de el ingrediente activo entre 15 y 16 g/L con un costo aproximado de US$ 0.30/kg de producto; el medio ms efectivo es el mencionado por Galn (1993) que incluye harina de soya, melaza, jarabe de maz y carbonato de calcio.

En 1992 Abarca optimizo el proceso de fermentacin para la produccin de Bacillus thuringiensis var. Aizawai en un fermentador de 14L resultando como condiciones optimas una agitacin de 800RPM y un pH igual o mayor a 7.0; su concentracin de esporas despus de 24 horas de fermentacin fue de5.5X esp/ml. 10%; el medio de cultivo utilizado incluye componentes como la glucosa, harina de soya, pur de tomate, KH2O4, CaCO3, entre otros; el uso de pur de tomate es debido a su fcil adquisicin y su bajo costo, y la harina de soya se encontr en reportes anteriores producciones elevadas de bioinsecticida.

5. CAPITULO V

OBJETIVOS

5.1 Objetivo general:

-Producir un bioinsecticida granulado de Bacillus thuringiensis var. Israeliensis con utilidad dentro de un vivero de produccin forestal.

5.2 Objetivos especficos:

-Cultivar Bacillus thuringiensis en un medio solido (Agar nutritivo).

-Preparar un medio adecuado para la esporulacin de la bacteria.

-Elaborar un formulado granular con el ingrediente activo deseado.

-Atrapar moscas fungosas fecundadas para oviposicin in vitro.- Mantener condiciones adecuadas para el ciclo vital de las moscas dentro del laboratorio.

-Realizar pruebas de toxicidad del formulado granular con el Bacillus thuringiensis. en larvas de moscas fungosas- Dar una capacitacin al encargado del laboratorio sobre la produccin del formulado.

6. CAPITULO VIJUSTIFICACION:

El 15% de las prdidas mundiales en invernaderos se debe al ataque de insectos, por esta razn, el productor se ve obligado a invertir en el control de plagas, aumentando los costos de produccin. Los insecticidas qumicos pueden generar resistencia en los insectos, obligando a aumentar las dosis e incrementando los costos. Adicionalmente, generan desequilibrio en el ambiente. El uso de biopesticidas es una alternativa econmica al tratamiento con insecticidas qumicos, cada vez ms difundida en el sector agrcola en razn de la necesidad de producir bajo criterios de sostenibilidad ambiental.

Las moscas del gnero Bradysia spp. atacan comnmente en los invernaderos, El adulto de la mosca fungosa no es perjudicial, sin embargo; la larva se alimenta de las races suculentas de brinzales jvenes; La mosca fungosa ocupa el quinto lugar de las plagas que atacan en viveros que producen brinzales en envases rgidos. Se considera a la mosca fungosa como una plaga secundaria que usualmente ataca brinzales debilitados por otros patgenos.7. CAPITULO VII

METODOLOGIA7.1 Obtencin de la cepa:La cepa se obtuvo de un tubo de eppendorff cuyo contenido eran esporas de Bacillus thuringiensis var. Israeliensis, el cual estuvo en refrigeracin a 4C durante aproximadamente un ao; por lo cual se tuvo que poner en crecimiento en agar nutritivo para observar crecimiento y morfologa celular, despus se procedi con el cultivo en un medio nutritivo. Despus de ver un crecimiento de 36-48hrs en el caldo nutritivo se prosigue con el proceso de fermentacin.7.2 Fermentacin:El medio de cultivo empleado para la fermentacin de Bacillus thuringiensis debe contener: una fuente de carbono que suministra la energa para los procesos anablicos, una fuente de nitrgeno de origen inorgnico y otra de origen orgnico para el crecimiento y la esporulacin de la bacteria y para la sntesis de las endotoxinas. Una fuente de carbono comnmente utilizada es la melaza. Tambin es importante la adicin de micronutrientes como calcio, potasio, manganeso, hierro y magnesio.

Se seleccion el medio propuesto por Galn (1993) debido a que se ha demostrado que produce las ms altas concentraciones finales de ingrediente activo. El cual se prepara agregando 20g de Harina de soya, 20g de melaza, 10g de jarabe de maz y 1 g de CaCO3en un litro de agua destilada, las fermentaciones se realizaron durante 96 horas (tiempo en el cual se ha demostrado que la esporulacin ya es mayor al 80%), a 30C y en una agitacin a 200rpm aproximadamente, con una relacin de volmenes de 1:10 (volumen medio/volumen de matraz) para evitar una inhibicin del crecimiento del bacilo por limitacin del oxigeno. Estos matraces se deben inocular directamente con una asada desde los caldos nutritivos.7.3 Preparacin del granuladoPara la elaboracin de los formulados granulares se utilizo almidn de maz como agente

Encapsulante, se utilizara tambin gelatina porcina, como polmeros adherentes. Estos polmeros se mezclaron en proporcin 1:1. El fago estimulante se agrega al 4% de la mezcla.Las cantidades a utilizar se describen a continuacin:

Se agregan 30g de gelatina, 40g de almidn de maz y 10 gr de PDA, 15 ml de agua destilada y se adicionan 15ml del agente activo que sera el fermento de Bacillus thuringiensis en el caldo nutritivo de Galn en un recipiente y la mezcla se incorpora con una esptula hasta formar una pasta hmeda. La pasta se extiende sobre varias cajas de petri formando una capa delgada y se deseca en un horno a una temperatura de 50C por 24 h. Una vez desecadas las mezclas, se muelen en morteros. Los grnulos obtenidos se almacenaron en bolsas de plstico a temperatura ambiente para su uso posterior.

7.4 Determinacin de la actividad toxica del formulado contra la larva de la mosca fungosa (Bradysia sp.) a nivel laboratorio:Para hacer la pruebas de toxicidad del producto se realiz la recoleccin de larvas y moscas de la especie Bradysia spp de los viveros de la Comisin Forestal del Estado de Michoacn. Para recolectar las larvas se utilizo medio PDA, el cual se vaci en cajas petri posteriormente fue cortado en cubos e incrustado a lado de los pinos en las charolas, se dejo por aproximadamente 24horas y se recolectaron; los cubos de PDA fueron observados en una lupa y las larvas encontradas se tomaban con mucho cuidado con una aguja sin lastimarlas y luego depositadas en cajas de petri con un fondo de papel filtro y humedecido, para mantenerlas con vida se les introdujo un pedazo de PDA el cual estaba inoculado con el hongo Fusarium para la alimentacin de las larvas.La recoleccin de las moscas se deben de buscar en los invernaderos y atrapar con un tubo con tapn de plstico del cual salen 2 mangueras, una para aspirar con la boca y otro para dirigir el aspiro hacia la mosca, despus de haber atrapado una cantidad se introdujo el tubo al congelador por aproximadamente 1 minuto 30 segundos, esto es para disminuir su actividad y hacerlas ms lentas, despus se dejan caer en una caja de petri el cual tiene un fondo de papel filtro hmedo, se dejan a temperatura ambiente y despus de un da se observa la cantidad de moscas que ovipositen dentro de la cajas petri. Los huevos, si son viables despus de 4-6 das eclosionaran y seguirn con su ciclo biolgico.Estas larvas sern colocadas en cajas petri con fondo de papel filtro hmedo, se utilizaron un total de 130 larvas por tratamiento. La formulacin ser preparada diluyendo en proporcin 1:2 en peso, volumen de formulado de Bt y agua se dar dado de comer a las larvas que se encuentran en las cajas petri. Como blanco utilizaremos una preparacin del formulado pero sin agregarle el Bacillus thuringiensis esto es para observar que no sea ningn componente (almidn de maz, PDA) el causante de los daos a las larvas. Se les permiti alimentarse a las larvas y se observara el ndice de la mortalidad de base a las larvas muertas. Se observara cada 24 horas el avance del bacilo en base a las larvas muertas por aproximadamente 3 das.8. CAPITULO VIII

RESULTADOS Y DISCUSION

A) Obtencin de la cepa: debido a que el producto a base de Bacillus thuringiensis haba sido almacenado por ms de 6 meses en una presentacin en polvo dentro de un refrigerador a 4C se opto por sembrarse en agar nutritivo para observar si tena esporas viables todava. Este mostro un crecimiento despus de 24 horas al cual se le realizo una tincin gram logrndose observar que efectivamente eran bacilos gram positivos y que mostraban estar unidos por varias unidades. B) Fermentacin: despus de las 96 horas de fermentacin en el medio se hace otra tincin gram para confirmar que haya una buena reproduccin de la bacteria. En los matraces se observa a simple vista una disminucin del volumen y de color. En la tincin gram se nota un gran crecimiento del bacilo. C) Preparacin del formulado: al momento de hacer la mezcla, se nota que para embarrar la mezcla en la caja petri es conveniente estar mojando la esptula logrando ser ms fcil. Un producto con solo 24 horas de horneado mostro a los 7 das signos de pudricin. (figura 3.) Por lo que se opto dejarla por 36 horas para quitar completamente humedad y obtener ms tiempo de anaquel. Tambin se cambio el molido en morteros por molido en licuadora que provoca que se forme un polvo ms fino.

Figura 5. Preparacin del formulado: mezclado y horneado.D) Determinacin de la actividad toxica del formulado contra la larva de la mosca fungosa (Bradysia sp.) a nivel laboratorio: Despus de atrapar varias moscas cerca de las charolas de los pinos se observo que gran cantidad de estas son machos, las cuales no eran adecuadas para el experimento (Figura 6.). Dentro del laboratorio se acercaban moscas hembras buscando un lugar donde ovipositar, las cuales fueron capturadas dentro de cajas petri y se logro la oviposicin de ms de 80 huevos por mosca (Figura 4.), los cuales se colocaban bajo humedad controlada, ya que una cantidad excesiva causaba la pudricin de los huevos. La literatura menciona que los huevos tardan en eclosionar aproximadamente de 4 a 6 das, mientras que los huevos obtenidos en laboratorio tardaban aproximadamente 3 das.

Figura 6. Huevos y larvas recin eclosionadas.

Se obtuvieron 3 cajas donde se observo que las mayora de los huevo eclosionaron y fueron seleccionadas para las pruebas mostrando claramente en las 3 una muerte de aproximadamente el 44% de las larvas a las 24 horas de que se les agrego la comida con Bacillus thuringiensis, (Figura 5.) mientras que las larvas a las cuales se les dio una mezcla de almidn de maz y PDA mostraron una baja de casi 5%(Figura 9.), demostrando en este lapso de tiempo que la mezcla realizada con Bacillus thuringiensis era la causante de la muerte de las larvas(figura 8.). Figura 7. Caja de petri con comida Figura 8. Mosca hembra de la especie

Bradysia sp. capturada en laboratorioDespus de 48 horas esta mortalidad subi hasta un 92% (Cuadro 5.)(Figura 7.). Mientras que en las cajas petri donde se agrego la mezcla sin Bacillus thuringiensis en 2 cajas segua la mortalidad casi del 5% inicial; (Cuadro 6.) (Figura 9.)en una tercera caja se observa que la mortalidad aumento al 30% esto puede ser debido a mltiples causas como el secado del papel filtro, que se hayan escogido larvas con mucho tiempo sin comer al momento de la prueba o que al momento de ser observadas a la lupa se haya calentado dems la caja de petri y causado la muerte de varias.Cuadro 5. Contenido de larvas en las cajas de petri a las que se les agrego comida con Bacillus thuringiensis

0 horas24 horas48 horas72 horas

351853

352063

6035105

Figura 9. Contenido de larvas en las cajas de petri a las que se les agrego comida con Bacillus thuringiensis

Figura 10. Larvas muertas despus de haber comido el preparado con Bacillus thuringiensisCuadro 6. Contenido de larvas en las cajas de petri a las que se les agrego comida sin Bacillus thuringiensis

O horas24 horas48 horas72 horas

48484646

2017146

50484642

Figura 11. Contenido de larvas en las cajas de petri a las que se les agrego comida sin Bacillus thuringiensis

Figura 12 Larvas vivas alimentndose de la mezcla sin Bacillus thuringiensisPruebas ensayo antes de la realizada durante la metodologa, en el cual se diluyo 50gr del formulado en 1L de agar-agar (Cuadro 7.) y estos dados de comer a larvas que fueron capturadas directo de las charolas mostraron un comportamiento diferente al comerse el producto. Mostro las primeras muertes de las larvas hasta aproximadamente hasta las 72 horas y empezando por las larvas pequeas y las grandes fueron muriendo en los das posteriores.Cuadro 7. Larvas que se les dio de comer formulado de Bacillus thuringiensis diluido en agar-agar

0 horas72 horas96 horas120 horas144 horas

108431

Otra prueba ensayo en la cual se pusieron larvas de diferentes edades pero esta vez con la comida tal cual dice la metodologa mostro caractersticas semejantes a la prueba donde se utiliz la comida diluida en agar-agar; las larvas pequeas murieron primero mientras que las ms grandes en das posteriores, la diferencia es que se mostro una mortalidad desde las 24 horas a la aplicacin de la comida. (Cuadro 8.)Cuadro 8. Larvas que se les dio de comer el formulado en base a la metodologa

O horas24 horas48 horas72 horas96 horas

106543

9. CAPITULO IX

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

La bacteria demostr viabilidad a pesar de haber estado tanto tiempo en refrigeracin, mostro que todava tiene toxicidad en contra de los insectos. El medio en el cual se realizo la fermentacin mostro ser efectivo y econmico y con ingredientes fciles de encontrar en cualquier mercado. El horneado se cambio de 24 a 36 horas quedando a 50C debido a que el primero mostro al menos de 10 das de haber sido embolsado, un pudrimiento mohoso mientras que el segundo al ser deshidratado por un mayor tiempo no mostro pudricin. La molida se cambio del mortero a una licuadora ya que forma un polvo fino. Este se mezclo con agua para formar una pasta y fue dada de comer a lar larvas mostrando una efectividad del 40% a las 24 horas. El dejar las larvas en el lugar donde muere permite que las larvas vivas se alimenten de ella y se siga diseminando la bacteria por todo la caja petri. Para posteriores estudios se recomendara pruebas con larvas de mas das de nacidos para ver el efecto cunto tarda en diferencia de con las larvas de un da de nacidos. Respecto a la preparacin del formulado en lugar de utilizar mitad de agua destilada y mitad del fermento habr que probar la diferencia si se usara solamente el fermento para observar toxicidad y sera bueno utilizar una menor cantidad de PDA y remplazarla con Agar-Agar pero sin dejar de ponerle el PDA ya que al contener la papa sirve como fagoestimulante. Otra prueba necesaria seria la determinacin de humedad a las 24 horas, a las 36 horas y a las 48 horas; despus de esto determinar la vida en anaquel siendo el producto guardado en bolsas de plstico de preferencia hermticas y a temperatura ambiente. Habra que calcular el precio aproximado por gramo o kilogramo de producto finalizado para comparar y ver si es una opcin viable a la empresa.10. CAPITULO XBIBLIOGRAFAAgrios, G. N. 1996. Fitopatologa. 838 p.

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