phÂn tÍch chẾ phẨm bacillus thuringiensis 1

CHƯƠNG 1:

LỜI MỞ ĐẦU

GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh

1.1. Đặt vấn đề

Theo xu hướng toàn cầu hội nhập kinh tế, hàng hóa được tăng cường

lưu thông giữa các nơi trên thế giới. Sản phẩm không chỉ được sản xuất ở

một nơi mà có thể chế tạo, lắp đặt qua nhiều công đoạn tại nhiều quốc gia

khác nhau. Tự do hóa thương mại, hàng rào thuế quan bị xóa bỏ, thị

trường mở rộng trong và ngoài nước cộng thêm khoa học công nghệ ngày

càng phát triển giúp các doanh nghiệp tăng năng suất, giảm chi phí,

những điều này gây áp lực cạnh tranh lớn cho hầu hết các công ty. Trong

điều kiện đó, chất lượng sản phẩm trở thành một nhân tố quan trọng, giúp

thu hút khách hàng và là vấn đề được các doanh nghiệp quan tâm cải tiến

nhằm phát triển bền vững.

Hiện nay, sự phát triển của nền nông nghiệp nước ta đang đi vào mức

độ thâm canh cao với việc sử dụng ngày càng nhiều phân bón hóa học,

thuốc bảo vệ thực vật hóa học và hàng loạt các biện pháp như: trồng lúa 3

vụ, phá rừng canh tác cà phê, hồ tiêu, điều… với mục đích khai thác, chạy

theo năng suất và sản lượng. Chính vì vậy, với sự canh tác trên đã làm

cho đất đai ngày càng thoái hóa, dinh dưỡng bị mất cân đối, mất cân bằng

hệ sinh thái trong đất, hệ vi sinh vật trong đất bị phá hủy, tồn dư các chất

độc hại trong đất ngày càng cao, nguồn bệnh tích lũy trong đất càng nhiều

dẫn đến phát sinh một số dịch hại không dự báo trước. Chính vì vậy, xu

hướng quay trở lại nền nông nghiệp hữu cơ với việc tăng cường sử dụng

chế phẩm sinh học, phân bón hữu cơ trong canh tác cây trồng đang là xu

hướng của Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung. Hiện các chế phẩm

đang được sử dụng nhiều tại các vùng trồng rau sạch như ở Đà Lạt, Vĩnh


Phúc, Thanh Trì, Hải Dương, Hà Tây, Đông Anh... của Việt Nam. Nhiều

thập kỉ qua, thuốc hóa học bảo vệ thực vật (BVTV) đã phát huy được tác

dụng tích cực trong việc phòng trừ sâu bệnh, bảo vệ cây trồng, tuy nhiên

nó cũng gây ra những tácdụng không mong muốn như ảnh hưởng xấu đến

môi trường sống, ô nhiễm lương thực, thực phẩm, gây ngộ độc chết

người... Do vậy, việc sử dụng các tác nhân sinh học như virut, vi khuẩn,

vi nấm hay các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học mạnh để phòng trừ

sâu bệnh cho cây trồng là rất hữu ích và cần thiết, trong đó thuốc trừ sâu

vi sinh đã và đang được lựa chọn. Trong đó thuốc trừ sâu sinh học

Bacillus thuringiensis (Bt) thuộc nhóm thuốc trừ sâu vi sinh nó có nhiều

ưu điểm đối với cây trồng và an toàn đối với môi trường được nhiều

người lựa chọn.

Nhận thấy vai trò quan trọng của thuốc trừ sâu sinh học Bt nên việc

đảm bảo chất lượng chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học Bacillus

thuringiensis (Bt) là hết sức quan trọng, tuy nhiên việc kiểm tra chất

lượng hiện nay vẫn còn gặp nhiều khó khăn về phương pháp thực hiện.

Vì vậy chuyên đề “phân tích chế phẩm Bacillus thuringiensis” được

thực hiện nhằm xây dựng được qui trình kiểm tra chất lượng và phương

pháp tiến hành kiểm tra chế phẩm.

1.2. Mục đích

Xây dựng phương pháp xác định chất lượng sản phẩm của thuốc trừ

sâu sinh học Bt có đạt yêu cầu chỉ tiêu chất lượng của nhà nước đưa ra

hay không gồm:


+ Phân tích định lượng tổng số bào tử Bacillus thuringiensis trong chế

phẩm.

+ Xác định hiệu quả tiêu diệt sâu hại của chế phẩm Bt.


CHƯƠNG 2:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Thuốc trừ sâu sinh học Bt

2.1.1. Lịch sử

Lần đầu tiên vào năm 1870, nhà bác học Pasteur người Pháp đã phát

hiện một loài vi khuẩn gây bệnh cho con tằm và đặt tên là Bacillus

bombycis. Sau đó vào năm 1911, nhà côn trùng học người Đức là Berline

đã phát hiện loài vi khuẩn này trên loài sâu xám ở Thuringia vùng Địa

Trung Hải và đặt tên là Bacillus thuringiensis (viết tắt là Bt). Sau đó đến

khoảng giữa thế ky XX, người ta đã phát hiện nhiều chủng Bt ky sinh trên

nhiều loài sâu khác nhau như sâu xanh, sâu keo, sâu róm thông. Từ đó vi

khuẩn Bt đã được chế tạo thành thuốc trừ sâu sử dụng trong nông nghiệp

ở nhiều nước, mở đầu cho công nghệ thuốc trừ sâu sinh học. Bt lần đầu

tiên được phát hiện vào năm 1901 tại Nhật Bản bởi nhà sinh vật học

ShigenteIshiwarti, khi ông tìm ra nguyên nhân gây ra cái chết đột ngột

của một số sâu tơ. ShigenteIshiwarti đầu tiên phân lập vi khuẩn Bacillus


thuringiensis, gọi đó là Bacillus sotto. Năm 1911, Bernard - người Đức,

tìm thấy trong một xưởng bột mì ở Thuringia, một giống vi khuẩn ky sinh

trong cơ thể côn trùng, có sức trừ sâu rất mạnh, gọi là khuẩn Thuring.

Năm 1971, chế phẩm Bt đã được nghiên cứu. Với những thành tựu của di

truyền học và công nghệ sinh học, người ta đã phát hiện nhiều chủng Bt

có khả năng ky sinh mạnh, sản xuất ra những chế phẩm có hàm lượng độc

tố và tính ổn định cao để tăng hiệu lực diệt sâu và mở rộng phổ tác dụng

trên nhiều loài sâu hại thuộc nhiều bộ côn trùng ở nhiều vùng khí hậu

khác nhau. Đã xác định có tới trên 150 loài sâu hại bị nhiễm các chủng

Bt, trong đó bao gồm hầu như toàn bộ các loài sâu hại có ở Việt Nam.

Hiện nay thuốc trừ sâu từ vi khuẩn Bt đã chiếm phần lớn thị trường thuốc

trừ sâu sinh học trên thế giới cũng như ở nước ta. Ngoài việc dùng làm

thuốc trừ sâu, hiện nay người ta đã tách một số gen từ vi khuẩn Bt

ghep vào hệ thống gen của cây để tạo ra các giống cây kháng sâu như

giống bông kháng sâu xanh, giống lúa kháng sâu đục thân, sâu cuốn lá,

giống ngô kháng sâu… Ở Việt Nam, chế phẩm Bt ( Bacillus

thuringiensis) đã được nghiên cứu từ năm 1971. Hơn 20 chế phẩm Bt

nhập khẩu và nội địa đã cho kết quả tốt trong phòng thí nghiệm và ngoài

đồng đối với một số sâu hại chính trên đồng ruộng như sâu xanh, bướm

trắng, sâu xám, sâu tơ, sâu hại bông, sâu đo. Các lọai sản phẩm thương

mại có trên thị trường khá nhiều như Vi-Bt 32000WP,16000WP; BT

Xentary 35WDG, Firibiotox P dạng bột, Firibiotox C dạng dịch cô đặc ...


Hình 2.1. Sản phẩm Bt trên thị trường

2.1.2. Phân loại

Thuộc nhóm trừ sâu sinh học, có nguồn gốc vi sinh vật ( Bacillus

thuringiensis), phổ diệt rộng và hữu hiệu với các loại sâu như sâu cuốn lá,

sâu tơ, sâu xanh, sâu khoang, sâu ăn tạp …Có nhiều loại thuốc Bacillus

thuringiensis trên thị trường thế giới như:- Bacilus thuringiensis var

aizawai kiểu serotype, hoạt chất ở dạng bào tử và tinh thể, chế biến thành

dung dịch đặc, dùng trừ ấu trùng mọt hại kho tàng. Bacillus thuringiensis

var. israelensis (tên khác: Teknar) hoạt chất ở dạng tinh thể ô-endotoxin

tạo thành qua lên men Bacillus thuringiensis Berliner var. israelensis,

Serotuper (H-14). Thuốc được gia công ở nhiều dạng như dịch, bột thấm

nước… dùng trừ muỗi, ấu trùng ruồi.

Bacillus thuringiensis var. kurstaki (tên khác Bakthane, Agritol,

Bactospeine plus, Biotrol...), hoạt chất ở dạng bào tử và tinh thể ô-

endotoxin được tạo thành qua lên men Bacillus thuringiensis Berliner ,

var. kurstaki, Serotype H-3a 3b. Thuốc được gia công thành nhiều dạng

như bột thấm nước, sữa huyền phù, dung dịch đặc... dùng trừ ấu trùng bộ

Lepidoptera như sâu khoang, sâu tơ, sâu xanh và nhiều loại sâu khác hại


rau, màu và cây ăn trái. Bacillus thuringiensis var. morrisoni, hoạt chất ở

dạng bào tử và tinh thể ô-endotoxin được tạo thành qua lên men Bacillus

thuringiensis Berliner var morrisoni, serotype 8a 8b.Thuốc được gia công

thành dạng bột khô tan trong nước và bột thấm nước, dùng trừ ấu trùng bộ

Lepidoptera hại rau màu, cây ăn trái, cây cảnh, cây công nghiệp. Bacillus

thuringiensis var. San Diego (tên khác: Myx 1850), dùng để trừ bọ cánh

cứng cho khoai tây, cà chua, cây xanh.

2.1.3. Tính an toàn của thuốc sinh học Bt

Các sản phẩm Bt được sử dụng rộng rãi trên thế giới, chiếm 1 đến 2%

tổng sản lượng thịtrường thuốc trừ sâu trên thị trường thế giới vào những

năm 1990. Protein Cry có tính đặchiệu cao tới các loài côn trùng có chủ

đích. Các protein Cry ít hoặc không ảnh hưởng tới các loài sinh vật khác.

Trong gần 40 năm được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới, chúng ta chưa

tìm thấy ảnh hưởng xấu của chúng tới sức khỏe con người hay môi trường

( EPA, 1998a; Mc Clontock et. A;..1995 ). Kể từ năm 1961 đến năm 1998

tại Hoa Kỳ hiện có ít nhất 180 sản phẩm vi sinh Bt đã được đăng ky kiểm

định. Tại châu Âu có hơn 120 sản phẩm. Theo cuộc khảo sát gần đây của

WHO về tính an toàn của sản phẩm vi sinh Bt và đã khẳng định rằng:

“Không tồn tại mối nguy hiểm nào của sản phẩm Bt tới con người, động

vật có xương sống khác hoặc tới các sinh vật không chủ đích khác”

(IPCS, 2000).

2.1.3.1. Sức khỏe con người


Các nghiên cứu về tính an toàn của thuốc trừ sâu vi sinh Bt trong hơn

40 năm đã chứng minh rằng không tìm thấy dấu hiệu ảnh hưởng nào tới

việc tăng cân, khám nghiệm lâm sàng hay trên tử thi. (McClintock et al.,

1995). Cục Bảo vệ Môi trường Hoa kỳ (US Environmental Prôtectin

Agency US-EPA) đã triển khai những đánh giá độc tố và thậm chí các

protein Bt đã được thử ở liều lượng cao hơn. Theo Extension Toxicology

Network (Extoxnet), các dự án về thông tin thuốc trừ sâu ở một số trường

đại học của Hoa kỳ cho thấy “Kết quả cuộc thử nghiệm trên 18 người mỗi

ngày ăn 1 gram Bt thương mại trong vòng 5 ngày, và trong các ngày khác

nhau… không gây ra chứng bệnh gì. Những người ăn 1 gram Bt/ngày

trong 3 ngày liên tục hòan toàn không bị ngộ độc hay nhiễm bệnh”. Hơn

nữa, ở mức phân tử protein nhanh chóng bị phân hủy bởi dịch vị dạ dày

(trong điều kiện phòng thí nghiệm) (Extoxnet, 1996).

2.1.3.2. Ảnh hưởng đến môi trường

Nước ngầm và hệ sinh thái đất: Nước ngầm protein Bt tồn tại

tương đối bền trong đất và được phân loại vào dạng bất động vì nó không

có khả năng di chuyển hoặc thấm qua nước ngầm. Protein này không bền

vững trong điều kiện đất axit, và bị phân hủy nhanh chóng khi phơi dưới

ánh sáng mặt trời, dưới tác động của tia UV. Các chuyên gia đã tiến hành

những nghiên cứu độc lập nhằm điều tra các ảnh hưởng của cây trồng Bt

đối với sinh vật đất và các loài côn trùng khác được xem là có ích trong

nông nghiệp. Kết quả cho thấy, chúng không gây ra ảnh hưởng bất lợi đối

với các sinh vật đất không phải là đích tấn công của chúng, thậm chí ngay

cả khi các sinh vật này được xử ly Bt với liều lượng cao hơn nhiều so với

thực tế có thể xảy ra trong điều kiện trồng trọt tự chothấy không có sự


thay đổi nào trong quần thể vi sinh vật đất giữa các cánh đồng có nguyên

liệu thực vật Bt và cánh đồng có nguyên liệu thực vật truyền thống

(Donegan và cộng sự, 1995), cũng như không quan sát thấy sự khác biệt

giữa các cánh đồng trồng cây Bt và cây không chuyển gen Bt (Donegan

và cộng sự, 1996 ).

2.1.3.3. Động vật và côn trùng

Các thử nghiệm tiến hành trên chó, chuột, chuột lang, thỏ, cá, ếch, kỳ

nhông và chim cho thấy protein Bt không gây ra những ảnh hưởng có hại.

Cũng cần nhấn mạnh rằng, độc tố cũng hoàn toàn không gây ảnh hưởng

đến các loài côn trùng có ích hoặc động vật ăn thịt như một số loài ong và

bọ cánh cứng (Extoxnet, 1996). Năm 1999, có một báo cáo về ảnh hưởng

có hại của hạt phấn từ cây ngô Bt đến ấu trùng của loài bướm Monarch.

Báo cáo này đã gây ra mối quan tâm và lo ngại về những rủi ro mà thực

vật Bt có thể gây ra đối với sinh vật không cần diệt. Tuy nhiên, những

nghiên cứu gần đây cho thấy ngô Bt gây ảnh hưởng không đáng kể đối

với quần thể bướm Monarch trên cánh đồng. Nỗ lực nghiên cứu hợp tác

giữa các nhà khoa học Hoa Kỳ và Canada đã cung cấp những thông tin để

xây dựng quá trình đánh giá rủi ro tiêu chuẩn về ảnh hưởng của ngô Bt

đối với quần thể bướm Monarch. Họ đi đến kết luận rằng, hầu hết các

giống lai thương mại, protein Bt được biểu hiện với nồng độ thấp trong

hạt phấn và nghiên cứu trong phòng thí nghiệm cũng như trên cánh đồng

cho thấy mọi mật độ hạt phấn đều không gây ảnh hưởng có hại trên đồng

ruộng.


2.1.3.4. Tính an toàn của cây trồng được bảo vệ bởi Bt được chứng

minh nhờ các đặc tính sau

+ Cây trồng được bảo vệ bởi Bt không có độc tố tới con người và

không tìm thấy dấu hiệu của sự dị ứng.

+ Dựa trên hai tiêu chí (về lương thực và thực phẩm) thì cây trồng Bt

là an toàn cho tiêu thụ.

+ Các protein Cry gần như không có độc tố tới các sinh vật không chủ

đích, ngoại trừ các loài côn trùng có quan hệ gần gũi với vật chủ đích.

+ Protein Cry, các marker và cây trồng Bt không tìm thấy rủi ro tới

môi trường.

2.1.4. Ứng dụng của chế phẩm Bt

2.1.4.1. Diệt sâu bệnh

Ngày nay các chế phẩm sinh học an toàn cho phòng trừ sâu hại cây trồng

và nông sản bảo quản đã được khuyến khích, ứng dụng để thay thế dần các thuốc

trừ sâu hoá học, trong đó thuốc trừ sâu vi sinh Bacillus thuringiensis (gọi tắt là

Bt) được dùng rộng rãi nhất. Trong những năm gần đây các nhà khoa học đã có

rất nhiều cố gắng để phân lập vi khuẩn này từ môi trường của nhiều nước trên

thế giới với hy vọng tìm ra những chủng Bt có phổ gây bệnh mới và khoảng vật

chủ rộng hoặc nâng cao hoạt tính các chủng Bt đối với các nhóm côn trùng mới,

hay tìm kiếm nguồn gen từ những chủng phân lập cho các kỹ thuật di truyền tiếp

theo. Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học hiện đại, đặc biệt là

công nghệ gen đã mở ra những tiềm năng hết sức to lớn cho việc phát triển thuốc

trừ sâu sinh học Bt. Việc làm giàu thêm bộ sưu tập các chủng B. thuringiensis

phân lập ở Việt Nam và nguồn gen quy từ những chủng này nhằm tạo ra các

chủng tái tổ hợp mới có phổ diệt sâu rộng hơn đối với một số loài côn trùng quan


trọng là rất cần thiết.Đã thử nghiệm hoạt tính diệt sâu của 10 chủng B.

thuringiensis var. kurstaki phân lập có tinh thể hình quả trám, trong đó 9/10

chủng có hoạt tính diệt 90 - 100% đối với sâu tơ P. xylostella và sâu keo S.

exiqua; 7/10 chủng có hiệu quả diệt 80-90% đối với sâu khoang S. litura; 6/10

chủng có hoạt tính diệt 50-60% đối với sâu bông H. armigera. 10/10 chủng có

hiệu quả diệt 100% đối với sâu ngài gạo C. cephalonica.

2.1.4.2. Cây trồng Bt

Cây trồng Bt là công cụ diệt sâu bệnh thực vật mới. Vấn đề khai thác

mọi khả năng giảm thiệt hại mùa màng và tăng sản lượng lương thực trở

nên cấp bách khi dân số toàn cầu tăng lên nhanh chóng và diện tích đất

canh tác lại giảm đáng kể. Cùng với kỹ thuật canh tác nông nghiệp thích

hợp, công nghệ kháng côn trùng Bt có thể đem lại rất nhiều lợi ích cho

loài người.

Những lợi ích của cây trồng Bt:

Tăng cường quản ly sâu bệnh.

Giảm sử dụng thuốc trừ sâu.

Thu được lợi nhuận nhiều hơn.

Cải thiện điều kiện cho các sinh vật có ích.

Ngô chứa ít độc tố mycotoxin – độc tố có thể gây chết gia súc và ung

thư cho người

Quản ly tính kháng côn trùng (IRM) Cây Ngô Bt kháng côn trùng biến

đổi gen

2.1.4.3. Ngoài ra vi khuẩn Bt còn được dùng để diệt lăng quăng


Một nhóm các nhà khoa học tại Viện Pasteur TPHCM vừa nghiên cứu

thành công chế phẩm vi sinh từ chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis

subsp. israelensis serotype diệt lăng quăng.

TS. Hồ Thị Hồng Nhung - Viện Pasteur TP.HCM cùng các cộng sự

vừa nghiên cứu thành công một loại chế phẩm vi sinh học từ chủng vi

khuẩn có tác dụng diệt trừ được lăng quăng trong nhiều điều kiện sống

khác nhau. Chỉ cần 200g chế phẩm này, với giá thành khoảng 300.000

đồng có thể bảo vệ được một khu vực có diện tích 1 ha khỏi nạn lăng

quăng.

Loại chế phẩm sinh học chứa vi khuẩn này có tác dụng diệt lăng quăng

trong nhiều điều kiện sống khác nhau, từ ao tù nước đọng cho đến nước

kênh rạch.

Khi Bt theo nước và thức ăn vào trong ruột của lăng quăng, độc chất

của vi khuẩn sẽ gây thủng ruột và diệt lăng quăng.

Trên thế giới, các nước phát triển như Bắc Mỹ, Châu Âu đã kiểm soát

được dịch sốt xuất huyết do hạn chế được lăng quăng. Một trong các biện

pháp là sử dụng chế phẩm vi sinh có thành phần Bti rải xuống các khu

vực tự nhiên có muỗi sinh sống.

Bt có thể giết được mọi loại lăng quăng muỗi thường cũng như muỗi

truyền bệnh sốt xuất huyết, viêm não Nhật Bản, sốt ret, hay loại bệnh mới

như viêm não Nipar (Philipine), bệnh viêm não Chikungunya.


2.2. Vi khuẩn bacillus thuringiensis

2.2.1 Đặc điểm vi khuẩn Bacillus thuringensis (Bt)

Bacillus thuringiensis là loài vi khuẩn đất điển hình được phân lập ở

vùng Thuringia, Đức. Ở Việt Nam trong số 185 mẫu đất, bùn thu thập ở

Hà Nội, Hà Nam, Nam Định, Thái Bình, Hải Dương, Hưng Yên, Ninh

Bình đã phân lập được 920 chủng Bacillus với đặc điểm Gram +, hình

que, bào tử không phình. Chỉ có 295 chủng trong số đó có tinh thể hình

tròn, tháp đôi, hình kim. Các chủng Bacillus có tinh thể được phân loại

thành loài Bacillus thuringiensis (Bt).

Bt có trong các mẫu đất ruộng, đất vườn, bùn nước, ao hồ… Hình dạng

tinh thể (một trong những đặc điểm quan trọng để phân loại Bt thành loài

phụ) rất đa dạng. Phần lớn các chủng Bt phân lập có dạng tinh thể hình

tháp đôi, một số hình cầu và một số chủng có tinh thể với các hình dạng

khác nhau. Bt là trực khuẩn sinh bào tử hiếu khí không bắt buộc, gram

dương (không mất màu nhuộm khi tẩy bằng iôt và cồn, kích thước 3(-)6

µm, có phủ tiêm mao không dày, tế bào đứng riêng rẽ và xếp thành từng

chuỗi, chứa tinh thể độc có khả năng diệt sâu. Bt phát triển trong điều

kiện nhiệt độ 15(-)45oC nhưng thích hợp nhất 29(-)30oC. Bào tử dạng

hình oval, hình trứng dài 1,2 – 1,6 µm.


Hình 2.2. Vi khuẩn Bacillus thuringensis

Hình 2.3. Khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus thuringensis

Trưởng thành mỗi tế bào vi khuẩn có một bào tử hình trứng và một

tinh thể độc hình quả trám.


Hình 2.4. Tế bào vi khuẩn Bt với tinh thể (crystal) và bào tử (spore)

2.2.2. Đặc điểm tinh thể độc và cơ chế tác động của vi khuẩn Bacillus

thuringiensis.

2.2.2.1. Đặc điểm tinh thể độc

Dựa vào cơ chế tác động diệt côn trùng người ta xác định có 4 loại độc

tố:- Nội độc tố endotoxin, còn gọi là tinh thể độc crystal: cry I, cry II, cry

III, cry IV. Hầu hết là các chủng Bt có một hoặc nhiều gen tiền độc tố. Cơ

sở gây bệnh cho côn trùng chính là các gen Cry khác nhau. Gen Cry được

chia thành 4 lớp chính: Cry I, II, III, IV.

+ Gen Cry I: Thường tổng hợp các protein hình thoi gây bệnh cho côn

trùng bộ cánh vẩy.

+ Gen Cry II: Tạo tinh thể dạng hình tháp gây bệnh cho côn trùng bộ

cánh vẩy và côn trùng bộ 2 cánh. Ví dụ như gen Cry IIA gây bệnh cho

loài Lymantria dispa, Cry IIB Helicoverpaarmigera.

+ Gen Cry III: Tổng hợp tinh thể dạng hình thoi, gây bệnh cho côn

trùng bộ cánh cứng Coleoptera .

+ Gen Cry IV: Tổng hợp cả tinh thể dạng hình thoi và hình tháp, chỉ

gây bệnh cho côn trùng bộ 2 cánh Diptera.


Hình 2.5. Pansy peacock

Hình 2.6. Diaethria


Hình 2.7. Helicoverpa armigera

Hình 2.8. Lymantria dispa


Hình 2.9. Bộ cánh cứng coleoptera

Hình 2.10. Bộ 2 cánh Diptera

Năm 1955, C.L. Hannay và P.C Fitz James xác định được bản chất

protein có liên quan đến độc tính của vi khuẩn. Tinh thể độc của Bt có

dạng hình thoi, hình quả trám, hình tháp mang bản chất protein và có độc

tính cao với rất nhiều loại côn trùng, chiếm 30% trọng lượng khô của tế

bào. Khi nhuộm xanh metylen hoặc fusin đỏ thì độc tố bắt màu dưới kính

hiển vi đối pha tinh thể độc. Tinh thể độc rất bền vững ở nhiệt độ cao, có

trọng lượng phântử là 5000 đơn vị và không phải bào tử nào cũng có tinh

thể độc. Trong quá trình bảo quản nếu để lâu Bt sẽ mất hoạt tính do tinh

thể độc bị biến dạng hoặc phân huy. Chất formandehyde 20% và tia tử

ngoại có thể làm mất hoạt tính của tinh thể độc.


Hình 2.11. Bào tử Bt và tinh thể độc

Bản chất hóa học của tinh thể: trong tinh thể độc có nhiều loại acid

amin, trong đó có hai loại có tỉ lệ cao nhất là acid glutamic và acid

asparaginic. Trong tinh thể có chứa lượng khá lớn 5 nguyên tố C, N, H,

O, S. Ngoài ra còn chứa 19 nguyên tố khác nhưng không có P.Các phân tử

có khối lượng lớn thì có độc tính còn loại có phân tử lượng nhỏ thì không

có độc tính.Tinh thể bền vững với nhiệt độ cao so với độc tố ở dạng hòa

tan, chẳng hạn tinh thể B.thuringensis sotto ở 65oC sau 1 giờ vẫn còn

hoạt tính trong khi các dạng khác sẽ mất hoàn toàn độc tính. - Ngoại độc

tố (anpha) exotoxin, còn được gọi là phospholipaza. Thực chất đây là một

loại men liên quan đến sự phân hủy phospholipit dẫn đến côn trùng

chết. Ngoại độc tố (beta) exotoxin, còn gọi là ngoại độc tố bền nhiệt,

chúng có khối lượng phân tử thấp 707()850. Sau 15 phút ở 120oC vẫn

còn hoạt tính. Chúng tác động lên côn trùng làm cản trở việc tổng hợp

ARN thông tin. Chúng còn có tác động cộng hưởng với nội độc tố, sau

khi nội độc tố phá vỡ biểu bì ruột giữa, chúng nhanh chóng xâm nhiễm


vào huyết tương và máu đi đến các cơ quan làm thay đổi quá trình trao

đổi chất và làm cho côn trùng mau chết. - Ngoại độc tố

(gamma) exotoxin, còn gọi là độc tố tan trong nước. Chúng có khối

lượng phân tử thấp 200(-)2000, có một số acid amin tự do, tan

trong nước, mẫn cảm với ánh sángvà đặc biệt mất hoạt lực trong 15 phút

ở 600oC trở lên.

2.1.2.2. Cơ chế tác động

Hình 2.12. Cơ chế tác động của tinh thể độc đối với sâu

Khi được phun lên lá cây, protein độc tố dưới dạng tinh thể sẽ diệt

những loại sâu hại nhất định. Tác động của tinh thể lên côn trùng là rất

phức tạp. Tác động điển hình là làm liệt đường ruột và xoang miệng. Cụ

thể là sau khi sâu hại ăn phải các tinh thể tiền độc tố, dưới tác dụng của

một loại men tiêu hoá trong dịch ruột của sâu, tiền độc tố bị hoà tan thành

những phân tử nhỏ có hoạt tính độc.


Các độc tố này bám vào màng vi mao trong ruột, tạo ra các lỗ rò để

cho nước chảy vào, làm sâu mọng nước, ngừng ăn và chết. Sau khi ăn tinh

thể 1()7 giờ tằm dâu bị liệt toàn thân các tế bào thượng bì. Sau khi ăn

1 phút, tinh thể đã xuất hiện tại thượng bì ruột giữa sâu xanh bướm cải.

Một số tế bào bị tách rời, biến đổi, các chất bên trong chảy ra ngoài màng

(như trên sâu độc thân) làm tăng tínhthấm thẩu Kali và đã chứng minh

tăng K+ trong máu và bạch huyết là nguyên nhân gây tê liệt đường ruột

và toàn thân tằm dâu. Sự thay đổi tác động của tinh thể phụ thuộc vào

nhiều yếu tố. Chẳng hạn bình thường, khivào ruột trước và ruột giữa, nếu

pH cao (>7,0) và cơ thể không có cơ chế giải độc, tinh thể sẽ vỡ ra làm

nhiễm độc máu. Hiện tượng thấy phổ biến trên tằm, sâu róm, bướm cải…

Tuy vậy trong nhiều trường hợp khi tinh thể độc vỡ ra, một số loài sâu có

cơ chế tự giải độc, ngừng ăn, pH đường ruột giảm xuống, sau một thời

gian nhất định đường tiêu hóa được phục hồi. Các động vật có vú không

bị ngộ độc khi ăn phải tinh thể là do chất pepsin trong ruột động vật (hoạt

động thích hợp khi pH =2) đã làm mất tính độc của tinh thể vi khuẩn.


Hình 2.13. Sâu chết do trúng độc từ thuốc trừ sâu Bt


CHƯƠNG 3:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

PHÂN TÍCH CHẾ PHẨM Bt


3.1. Phân tích định lượng tổng số bào tử Bacillus thuringiensis trong

chế phẩm

3.1.1. Nguyên tắc

Trên môi trường đặc, mỗi vi sinh vật hoặc mỗi bào tử đứng riêng sẽ

phát triển thành một khuẩn lạc. Đếm số khuẩn lạc có thể tính ra số lượng

vi sinh vật trong mỗi đơn vị thể tích của dịch nghiên cứu. Ưu điểm của

phương pháp này là không phát hiện nhầm các vi sinh vật chết hoặc các

mảnh xác hữu cơ.

Sử dụng phương pháp đếm thạch đĩa, đếm số khuẩn lạc trên môi

trường thạch sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 37oC ± 1oC trong 24h. Tổng số

bào tử Bacillus trong 1g hoặc 1ml mẫu chế phẩm kiểm nghiệm được tính

từ số khuẩn lạc đếm được từ các đĩa nuôi cấy ở các nồng độ pha loãng.

3.1.2. Môi trường và hóa chất

Môi trường nuôi cấy, pH 7,0 ± 0,2 có thành phần như sau:

Bảng 3.1. Thành phần môi trường nuôi cấy

Thành phần Khối lượng

Cao nấm men 5g

Peptone 10g

NaCl 5g

Agar 15()20g

Nước cất 1000ml

- Cao nấm men

- Agar

- NaCl

- Peptone


- Nước cất

- NaOH

- HCl

3.1.3. Thiết bị, dụng cụ

3.1.3.1. Thiết bị

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông

thường và cụ thể như sau:

- Tủ cấy vi sinh vật.

- Nồi hấp áp lực.

- Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 37oC.

- Tủ lạnh.

- Máy lắc.

- Máy đếm khuẩn lạc.

- Máy đo pH.

- Cân phân tích, có khả năng cân chính xác đến 0,1mg.

- Kính hiển vi quang học.

- Lò vi sóng.

- Bể điều nhiệt, có thể duy trì nhiệt độ ở 45oC ± 1oC và 80oC.


Hình 3.1. Các thiết bị dùng trong phân tích

A. Autoclave D. Máy đếm khuẩn lạc

B. Máy đo pH E. Máy lắc

C. Cân phân tích F. Tủ ấm

3.1.3.2. Dụng cụ


- Bình định mức, dung tích 1000 ml (loại A).

- Bình nón.

- Ống nghiệm

- Pipet, dung tích 1 ml và 10 ml.

- Ống đong, dung tích 100 ml và 250 ml.

- Micropipet, dung tích 1000 µl.

- Bông không thấm nước.

3.1.4. Lấy mẫu và bảo quản mẫu

3.1.4.1. Yêu cầu chung

- Lấy mẫu theo nguyên tắc ngẫu nhiên.

Lượng thuốc trong mẫu phân tích cũng như trong mẫu lưu ít nhất phải

đủ cho ba lần phân tích hoặc phải đủ để thực hiện các phep thử đảm bảo

thu được kết quả chính xác và tin cậy. Lượng thuốc này được tính toán

trên cơ sở tiêu chuẩn phương pháp thử của sản phẩm. Thông thường mỗi

lô sản xuất được lấy hai mẫu (một mẫu phân tích và một mẫu lưu).

Trường hợp đặc biệt, số mẫu phân tích và mẫu lưu có thể nhiều hơn

hai để đủ gửi kiểm nghiệm và lưu ở nhiều nơi nếu xet thấy cần thiết.

- Lấy mẫu thành phẩm

Mẫu được lấy tại những vị trí khác nhau của lô sản xuất, không được

phá lẻ các đơn vị đóng gói sản phẩm để lấy mẫu. Từ các đơn vị lấy mẫu

được tập hợp lại thành mẫu chung và mẫu cuối cùng.

Số lượng mẫu thành phẩm cần lấy theo quy định tại Bảng 1.

Bảng 3.2. Số lượng mẫu cần lấy theo quy cách đóng gói

Quy cách đóng gói (g hoặc ml) Số lượng mẫu lấy (đơn vị bao


gói)

Đến 2 70

Từ 2 đến 5 30

Từ 5 đến 50 7

Từ 50 đến 100 4

Từ 100 trở lên 3

Trong trường hợp đặc biệt thì tùy theo quy cách đóng gói và tính chất

của thuốc chỉ lấy mẫu đủ để phân tích và lưu.

3.1.4.2. Bảo quản mẫu

Xem tiêu chuẩn cụ thể đối với sản phẩm liên quan hoặc theo hướng

dẫn của nhà sản xuất.

3.1.5. Cách tiến hành

3.1.5.1. Chuẩn bị dung dịch pha loãng

Cân 9g natri clorua, hòa tan trong nước cất đựng trong bình định mức

1000ml, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 bằng dung dịch

HCl 0,1N và NaOH 0,1N. Dùng ống đong cho vào bình nón mỗi bình

90ml và dùng pipet lấy cho vào ống nghiệm mỗi ống 9ml dung dịch trên.

Đậy bằng nút bông không thấm nước, có giấy bạc, hấp tiệt trùng ở nhiệt

độ 121oC trong 15 phút. Bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2 đến 8oC, sử

dụng trong 15 ngày.

3.1.5.2. Chuẩn bị môi trường

Cân các thành phần môi trường PCA theo bảng 1 hoặc lấy 22,5g môi

trường tổng hợp, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 bằng


dung dịch HCl 0,1N và NaOH 0,1N. Lắc đều và đun cách thủy hoặc trong

lò vi sóng đến khi sôi (môi trường trong). Rót vào bình 250ml lượng môi

trường 100ml. Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút.

Nếu môi trường sử dụng ngay, để nguội đến 45oC ± 1oC ở bể điều

nhiệt, nếu chưa sử dụng ngay thì cần bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ

2 đến 8oC không quá 30 ngày.

3.1.5.3. Chuẩn bị mẫu thử

Cân vô trùng khoảng 10g (10ml), chính xác đến 0,1mg, mẫu thử cho

vào bình nón đựng 90ml dung dịch pha loãng đã tiệt trùng được độ pha

loãng 10-1. Cho lên máy lắc đồng hoá mẫu khoảng 30 min. Đặt trong bể

điều nhiệt 800C trong 10 phút.

3.1.5.4. Các bước tiến hành

- Pha loãng mẫu

Dùng micropipet lấy 1ml dịch pha loãng 10-1 từ bình nón mẫu đã đồng

hóa cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng đã tiệt trùng được

độ pha loãng 10-2. Tiếp tục pha loãng tương tự đến độ pha loãng cần thiết

để đếm được từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc trên đĩa theo dự kiến.

- Cấy giống

Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 nồng độ pha

loãng liên tiếp, mỗi nồng độ dùng 2 đĩa petri vô trùng.

Lấy 1ml mẫu hoặc dung dịch pha loãng ở các nồng độ khác nhau cho

vào giữa từng đĩa petri.


Môi trường PCA đã đun nóng chảy, để nguội đến 45oC ± 1oC. Rót vào

từng đĩa 12ml đến 15ml môi trường thạch, đảo đều dung dịch mẫu với

môi trường bằng cách lắc 3 lần sang phải và 3 lần sang trái.

Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng mát, nằm ngang.

Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không

được quá 30 phút.

3.1.5.5. Ủ ấm

Khi thạch đã đông, lật úp đĩa và cho vào tủ ấm 37 0C trong thời gian

từ 18h đến 24h.

3.1.5.6. Đọc kết quả

Sau 24h, đếm kết quả, đếm tổng số các khuẩn lạc mọc trên các đĩa.

Vi khuẩn Bacillus trên môi trường thạch tạo thành khuẩn lạc màu

trắng, hình dạng thay đổi.

3.1.6. Tính và biểu thị kết quả

3.1.6.1. Tính kết quả

Chọn những đĩa có từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc của 2 nồng độ

pha loãng liên tiếp để tính kết quả. Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 nồng độ

nhỏ hơn hoặc bằng 2 lần, thì tính số N bào tử cho 1 g hoặc 1 ml sản phẩm

bằng cách tính trung bình cộng của tống số khuẩn lạc đếm được trên các

đĩa theo công thức sau:

Trong đó:


C: là tổng các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại từ 2

nồng độ pha loãng liên tiếp.

V: là thể tích mẫu cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit (ml).

n1: là số đĩa có nồng độ pha loãng thứ nhất được giữ lại.

n2: là số đĩa có nồng độ pha loãng thứ hai được giữ lại.

d: là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất. Làm tròn

số kết quả có được, chỉ giữ lại 2 số có nghĩa.

3.1.6.2. Biểu thị kết quả

Biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa số 1,0 và 9,9 nhân với 10n

(n là số mũ thích hợp của 10).

Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 nồng độ lớn hơn 2 lần, thì lấy giá trị của

nồng độ pha loãng thấp hơn để tính kết quả.

Nếu 2 đĩa của sản phẩm lỏng nguyên chất hoặc nồng độ pha loãng ban

đầu có ít hơn 15 khuẩn lạc tính kết quả là trung bình cộng của các khuẩn

lạc đếm được ở cả 2 đĩa tính ra cho 1g hoặc 1ml sản phẩm.

Nếu tất cả các đĩa không có khuẩn lạc nào mọc, đánh giá kết quả như

sau:

- Ít hơn 1 khuẩn lạc Bacillus trong 1 ml sản phẩm.

- Ít hơn 1/d khuẩn lạc Bacillus trong 1g sản phẩm.

trong đó d là hệ số pha loãng của nồng độ pha loãng ban đầu (10-1).


3.2 Xác định hiệu quả tiêu diệt sâu hại của chế phẩm Bt

3.2.1. Vật liệu thí nghiệm

- Sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học Bt được lấy từ nhà sản xuất.

- Sâu xanh được bắt ngoài đồng về.

- Cây đậu.

3.2.2. Thiết bị và dụng cụ

- Bình phun.

- Hộp nhựa.

- Bảng biểu.

3.2.3. Bố trí thí nghiệm

Chuẩn bị 4 hộp nhựa 10x20cm. Cây đậu được cắt nhỏ 2x3cm cho vào

4 hợp nhựa làm giá thể cho sâu sống. Cho vào mổi hộp nhựa 30 con sâu

xanh.

Tiếp theo ta tiến hành pha chế và phun thuốc vào 3 hộp nhựa và một

hộp không phun làm mẫu đối chứng. thuốc được pha chế theo đúng hướng

dẫn được in trên bao bì về nồng độ và đúng liều lượng. Sau khi phun

xong ta dùng vải mùng che mẫu lại. Sau 2 ngày đêm kể từ khi phun chúng

tôi tiến hành điều tra và ghi chep số sâu chết, theo dõi cho đến tận ngày

cuối cùng.

3.2.4. Tính toán kết quả

Tỉ lệ sâu chết trong phòng thí nghiệm được tính theo công thức:


T ỉ l ệ s âu ch ế t=S ố s â u ch ế t t hí ng h iệ mT ổ ng s â ut h í ng h i ệm

x100

Tính hiệu quả tiêu diệt sâu của thuốc

Hiệu quả tiêu diệt sâu trong thí nghiệm được tính theo công thức sau:

H %= B – K100 – K

x100

Trong đó:

- H%: Hiệu quả tiêu diệt sâu của thuốc ở các công thức.

- K: Là tỉ số phần trăm số sâu chết ở công thức đối chứng.

- B: Là tỉ số phần trăm số sâu chết ở công thí nghiệm.


CHƯƠNG 4:

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ


4.1. Kết luận

Hoàn thành qui trình phân tích tổng số bào tử có trong sản phẩm.

Hương pháp đánh giá hiệu quả diệt sâu của chế phẩm Bt

Đã xây dựng được quy trình phân tích chế phẩm Bacillus

thuringiensis. Qui trình này đơn giản hóa qui trình kiểm tra chất lượng

của chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis. Giúp việc

quản lí chất lượng chế phẩm dễ dàng hơn.

4.2. Kiến nghị

Cần phải chú trọng đầu tư hơn nữa về mặt kĩ thuật phân tích đánh giá

chất lượng sản phẩm.

Tiếp tục nghiên cứu xây dựng hoàn thiện kĩ thuật phân tích đánh giá

chất lượng chế phẫm Bt.

Thường xuyên kiểm tra đánh gia chất lượng các sản phẩm Bt thường

xuyên hơn.


TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Tài liệu Tiếng Việt

[1]. Nguyễn Thị Me, Nguyễn Thị Nhung, Nguyễn Thị Hồng Vân, Trần

Ngọc Hân (2001), Kết quả xác định tính kháng thuốc của rầy nâu

hại lúa của một số Tỉnh đồng bằng Sông Hồng. tuyển tập công

trình nghiên cứu BVTV 2000-2002, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội

2002.

[2]. Lương Minh Châu( 2007), State of insecticide resistance of brown

planthopper in Mekong delta, Viet Nam.

[3]. Nguyễn Thế Nhã, Trần Văn Mão, Trần Công Loanh (2001 ), Điều

tra dự tính - dự báo sâu bệnh hại trong lâm nghiệp . Nxb Nông

nghiệp - Hà Nội.

[4]. Kết quả khảo nghiệm một số chế phẩm sinh học phòng trừ sâu hại

chính bộ cách vảy ăn lá muồn đen tại Bắc Cạn.

2. Tài liệu Tiếng Anh

[5]. Bacillus thuringiensis an environment biopesticides.(1986), Theory &

Practice.

[6]. Cannon, R.J.C. (1993) Bacillus thuringiensis use in agriculture: a

molecular perspec-tive.


[7]. Becker, N., Zgomba, M., Ludwig, M., Petric, D. and Rettich, F. (1992b)

Factors influencing the activity of Bacillus thuringiensis var. israelensis

treatments.

3. Tài liệu Internet

[8]. http://www.sinhhocvietnam.com/forum/index.php

[9]. http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_thuringiensis

[10]. http://tailieu.vn

[11]. http://violet.vn

[12]. http://dienkhanh.vn


http://dienkhanh.vn/

http://tailieu.vn/

http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_thuringiensis

http://www.sinhhocvietnam.com/forum/index.php

phÂn tÍch chẾ phẨm bacillus thuringiensis 1

Documents