producciÓn de bacillus thuringiensis subesp kurstaki

PRODUCCIÓN DE Bacillus thuringiensis subesp kurstaki

POR LA METODOLOGÍA EN FED-BATCH DISCONTINUO CON

MEMBRANA DE FLUJO TANGENCIAL

MARIA ALEJANDRA DELGADO ORTEGA

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE INGENIERIA

DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA

SANTAFE DE BOGOTA, D.C

2003

PRODUCCIÓN DE Bacillus thuringiensis subesp kurstaki

POR LA METODOLOGÍA EN FED-BATCH DISCONTINUO CON

MEMBRANA DE FLUJO TANGENCIAL

MARIA ALEJANDRA DELGADO ORTEGA

Propuesta de Proyecto de Grado para optar el titulo en Ingeniero Químico.

Director

ANDRES FERNANDO GONZALEZ BARRIOS

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE INGENIERIA

DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA

SANTAFE DE BOGOTA, D.C

2003

AGRADECIMIENTOS

A Andrés Fernando González, por su colaboración.

A todo el personal del CITEC, en especial a José Maria Robles.

A Fernando Andrade, Representante de Purificación y Análisis.

A Amparo Forero, Directora de proyecto biopesticidas, VECOL.

A Oscar Álvarez.

A Carolina Rojas.

A Cristina Gómez.

A mis Padres,

Por su apoyo incondicional

TABLA DE CONTENIDO

Pág.

INTRODUCCIÓN

JUSTIFICACIÓN

OBJETIVOS

1. ANTECEDENTES 9

2. BACILLUS thuringiensis 15

2.1 Morfología 15

2.2 Bioquímica de B. thuringiensis 16

2.3 Ciclo Biológico 16

2.3.1 Germinación y fase vegetativa 16

2.3.2 Fase estacionaria: Esporulación 17

2.3.3 Cristal paraesporal 18

2.4 Patogenicidad 19

3. TIPOS DE FERMENTACIÓN 22

3.1 Fermentación tipo Batch 22

3.2 Fermentación Continua 22

3.3 Fermentación tipo Fed-Batch 23

4. MODELO CINÉTICO PARA EL CRECIMIENTO DE

MICROORGANISMOS 24

4.1 Modelo no estructurado 24

4.2 Curva de crecimiento 24

4.3 Ecuaciones de crecimiento celular 27

4.4 Estequiometría 30

5. FILTRACIÓN 32

5.1 Filtración con flujo tangencial (CFF) 32

5.1.1 Ventajas de filtración con flujo transversal 34

5.2 Ultrafiltración 35

6. PRODUCTOS BIOINSECTICIDAS A BASE DE Bacillus thuringiensis 38

6.1 Productos de primera generación 39

6.2 Productos de segunda generación 42

6.3 Productos de tercera generación 43

7. MATERIALES Y MÉTODOS 45

7.1 Primera parte 45

7.1.1 Activación 45

7.1.2 Aislamiento y Cultivo de la Colonia Madre 46

7.1.3 Conservación de Microorganismos 47

7.2 Segunda parte: Fermentación Batch 47

7.2.1 Procedimiento de inoculación y condiciones de la fermentación

Batch 48

7.3.Tercera parte: Fermentación Fed-Batch Discontinuo 49

7.3.1 Procedimiento de inoculación y condiciones de la fermentación

Fed-Batch discontinuo, pulsos 1, 2 y 3 de sustrato 49

8. MÉTODOS DE ANÁLISIS 53

9. RESULTADOS 54

9.1 Primera parte 54

9.1.1 Activación 54

9.1.2 Aislamiento y Cultivo de la Colonia Madre 54

9.1.3 Conservación de Microorganismos 55

9.2 Segunda parte: Fermentación Batch 55

9.2.1 Parámetros de evaluación 56

9.2.2 Variables del crecimiento celular 58

9.3.Tercera parte: Fermentación Fed-Batch Discontinuo 59

9.3.1 Fermentación Fed-Batch: Con 1 Pulso de sustrato 59

9.3.1.1 Parámetros de evaluación 60

9.3.1.2 Variables del crecimiento celular 61

9.3.2 Fermentación Fed-Batch: Con 2 Pulsos de sustrato 62



9.3.3 Fermentación Fed-Batch: Con 3 Pulsos de sustrato 66



9.4 Análisis cualitativo y cuantitativo de proteína tóxica 69

10. ANÁLISIS DE RESULTADOS 72

10.1 Fermentación Batch 72

10.2 Fermentacion Fed-Batch Discontinuo 74

10.3 Proteína Toxica 79

11. CONCLUSIONES 80

BIBLIOGRAFÍA 84

ANEXOS 86

LISTA DE TABLAS

Pág.

Tabla 1. Diferentes estudios para la producción de B. thuringiensis 13

Tabla 2. Clasificación proteínas Cry 21

Tabla 3. Productos comerciales de cepas nativas 40

Tabla 4. Productos recombinantes comerciales 42

Tabla 5. Productos recombinantes en Pseudomonas 44

Tabla 6. Pulsos de sustrato para las fermentaciones Fed-Batch Discontinuo 49

Tabla 7. Parámetros y metodologías de evaluación. 53

Tabla 8. Condiciones proceso Batch 56

Tabla 9. Resultados Esporulación Proceso Batch 57

Tabla 10. Variables de crecimiento celular Fermentaciones Batch 58

Tabla 11. Condiciones de Proceso Fed-Batch pulso 1 59

Tabla 12. Condiciones de Proceso Fed-Batch pulso 1 R 59

Tabla 13. Resultados Esporulación Proceso Fed-Batch pulso 1 61

Tabla 14. Variables de crecimiento celular Fermentaciones Fed-Batch pulso 1 61


Tabla 16. Condiciones de Proceso Fed-Batch pulso 2 R 63

Tabla 17. Resultados Esporulación Proceso Fed-Batch pulso 2 65

Tabla 18. Variables de crecimiento celular Fermentaciones Fed-Batch Pulso 2 65


Tabla 20. Resultados Esporulación Proceso Fed-Batch 3 68

Tabla 21. Variables de crecimiento celular Fermentaciones Fed-Batch Pulso 3 68

Tabla 22. Resultados proteína total. 71

Tabla 23. Resultados análisis electroforesis. 71

Tabla 24. Resultados finales fermentaciones Batch 73

Tabla 25 Datos Globales fermentación Fed-Batch 78

Tabla 26. Medio de cultivo 86

Tabla 27. Porcentaje del Medio de cultivo 86

Tabla 28. Medio de cultivo LB 87

Tabla 29. Datos de la curva de calibración DNS 93

Tabla 30. Patrones estándares de Proteína 97

Tabla 31. Datos primera fermentación Batch 98



Tabla 34. Datos Fed-Batch pulso 1 100

Tabla 35. Datos Fed-Batch pulso 1 R 100


Tabla 37. Datos Fed-Batch pulso 2 R 101


Tabla 39. Consumo de glucosa Batch 1 103



Tabla 42. Consumo de glucosa Fed-Batch Pulso 1 104

Tabla 43. Consumo de glucosa Fed-Batch Pulso 1R 105


Tabla 45. Consumo de glucosa Fed-Batch Pulso 2R 106


Tabla 47. Cuantificación de Biomasa Batch 1 108



Tabla 50. Cuantificación de Biomasa Fed-Batch Pulso 1 111

Tabla 51. Cuantificación de Biomasa Fed-Batch Pulso 1 R 112


Tabla 53. Cuantificación de Biomasa Fed-Batch Pulso 2 R 114


Tabla 55. Datos Esporulación Batch 1 119

Tabla 56. Promedio Esporulación Batch 1 119





Tabla 61. Datos Esporulación Fed- Batch pulso 1 122

Tabla 62. Promedio Esporulación Fed- Batch pulso 1 122

Tabla 63. Datos Esporulación Fed- Batch pulso 1 R 123

Tabla 64. Promedio Esporulación Fed- Batch pulso 1 R 123



Tabla 67. Datos Esporulación Fed- Batch pulso 2 R 125

Tabla 68. Promedio Esporulación Fed- Batch pulso 2 R 125



Tabla 69. Datos filtración Agua 127

Tabla 70. Datos filtración cultivo 128

Tabla 71. Especificaciones del Biorreactor 133

Tabla 72. Partes del Biorreactor 134

Tabla 73. Especificaciones Bomba peristáltica. 140

LISTA DE FIGURAS

Pág.

Figura 1. Esquema General de filtración Tangencial 33

Figura 2. Inoculo 43

Figura 3. Esquema del sistema de filtración 50

Figura 4. Montaje para el sistema Fed-Batch 51

Figura 5. Grafica oxigeno disuelto fermentaciones Batch 56

Figura 6. Grafica consumo de Glucosa Fermentaciones Batch 57

Figura 7. Grafica Cuantificación de Biomasa Fermentaciones Batch 57

Figura 8. Grafica Oxigeno Disuelto Fermentaciones Fed-Batch Pulso 1 60

Figura 9. Grafica Consumo de Glucosa Fermentaciones Fed-Batch Pulso1 60

Figura 10. Grafica Cuantificación de Biomasa Fermentaciones Fed-Batch

Pulso 1 61


Figura 12. Grafica Consumo de Glucosa Fermentaciones Fed-Batch Pulso2 64


Pulso 2 65


Figura 15. Grafica Consumo de Glucosa Fermentaciones Fed-Batch Pulso 3 67


Pulso 3 68

Figura 17. Resultados Electroforesis 1 69

Figura 18. Resultados Electroforesis 2 70

Figura 19. Muestras de peso seco 90

Figura 20. Muestras para pruebas de Azucares 92

Figura 21 Curva de calibración DNS 93

Figura 22. Grafica Cuantificación de Biomasa Fermentaciones Batch 117

Figura 23. Grafica Cuantificación de Biomasa Fermentaciones

Fed-Batch pulso 1 117





Figura 26. Partes del Biorreactor 126

Figura 27. Partes Bomba peristáltica 140

Figura 28. Proceso de limpieza para la membrana 141

Figura 29. Horno 142

Figura 30. Cámara de flujo laminar 142

Figura 31. Centrifuga para epphendors 142

Figura 32. Balanza de Precisión 142

Figura 33. Desecador 143

Figura 34. Equipo de Electroforesis 143

Figura 35. Bomba peristaltica 143

Figura 36. Espectrofotómetro 143

LISTA DE ANEXOS

Pág.

Anexo A. Composición medio de cultivo liquido 86

Anexo B. Metodologías para los parámetros de evaluación 88

Anexo C. Toma de Datos 98

Anexo D. Datos del Consumo de Glucosa 103

Anexo E. Datos de Biomasa 108

Anexo F. Grafica comparativa de Biomasa Total 117

Anexo G. Datos Esporulación 119

Anexo H. Desempeño de la membrana 127

Anexo I. Descripción del Biorreactor 129

Anexo J. Membrana de flujo tangencial 135

Anexo K. Descripción Bomba Peristáltica 139

Anexo L. Procedimiento de limpieza para la Membrana de filtración 141

AnexoM. Equipos 142

INTRODUCCIÓN

La preocupación mundial acerca del problema sobre el control de plagas con productos

químicos se ha ido incrementado día a día y la reducción en la aplicación de estos

productos en la agricultura es cada vez más notable. Los productos agroquímicos no

siempre dan buenos resultados, por lo que se presta mucha atención e importancia a una

agricultura más biológica y menos dañina para el medio ambiente.

En el control integrado de plagas se trabaja de forma directa y preventiva. Una de estas

opciones es el control biológico, donde el empleo de microorganismos o sus productos

sirven para combatir las plagas. Por lo tanto se evita o reduce el uso de plaguicidas

químicos, los cuales dejan residuos tóxicos en los frutos, plantas y medio ambiente en

general.

En Colombia, el sector agrícola ha sido muy importante en el desarrollo económico del

país. No obstante diversos factores como el ataque de insectos considerados como plagas,

afectan las diferentes clases de cultivos, lo implica una reducción en el nivel de la

productividad nacional.

Como una alternativa de solución a este problema, se ha venido desarrollando en los

últimos años la biotecnología agrícola, la cual busca reducir en buena proporción el uso de

productos químicos existentes en el mercado. Esta tecnología busca incrementar la

producción del agro, y con el uso adecuado de agentes microbianos de control biológico

lograr un gran espectro de eficacia.

Bacillus thuringiensis es uno de los microorganismos más utilizados en todo el mundo

como biopesticida. Entre las diferentes subesp, se encuentra Bacillus thuringiensis subesp

kurstaki, la cual es tóxica para insectos del orden lepidóptera. Esta subespecie ya es

ampliamente industrializada y comercializada en el control biológico agrícola; por su alta

especificidad, estabilidad, biodegrabilidad, de actividad rápida y no siendo tóxica para

animales mamíferos. Por lo tanto surge la necesidad a nivel industrial de buscar nuevos

métodos de producción para aumentar el rendimiento dentro del proceso y obtener mayor

cantidad de producto en menos tiempo.

El propósito de este proyecto es desarrollar y evaluar un nuevo proceso para la producción

de Bacillus thuringiensis subesp kurstaki a nivel de planta piloto. Para dicho proceso se

llevo a cabo la implementación de un biorreactor con membrana de flujo tangencial.

JUSTIFICACION

Debido a que Bacillus thuringiensis subesp kurstaki es uno de los biopesticidas más

producidos a nivel industrial, surge la necesidad de implementar nuevos procesos para una

mejor producción en periodos de tiempos más pequeños, sin alterar la calidad del producto

activo, en este caso la toxina.

Se a encontrado en los diferentes estudios para subespecies diferentes a kurstaki, una

mayor productividad de toxina, utilizando retención parcial de células, y cultivos continuos

de dos fases usando un sistema interno de filtración, también se han hecho estudios en

Cultivos Fed-Batch (Discontinuos y Continuos), llegando a la conclusión que sistemas Fed-

Batch discontinuos y la retención total de células, pueden ser los posibles métodos en los

cuales se podría obtener una mayor producción de esporas y biomasa para Bacillus

thuringiensis subesp kurstaki.

Con el uso de la tecnología de una membrana de flujo tangencial, se quiere desarrollar a

nivel de planta piloto, un proceso de ultrafiltración con retención total de células en la

fermentación. Dicho proceso favorecerá el crecimiento del microorganismo al retirar los

metabolitos secundarios, que según otros estudios realizados inhiben el crecimiento; y en

consecuencia se obtenga una alta producción de biomasa, una alta concentración de esporas

y cristales, que finalmente generen un valor de toxicidad del nivel requerido, y con una

disminución del tiempo total durante el proceso.

La relevancia del proyecto radica en su aplicabilidad a futuro del proceso, dejando las bases

para un posible estudio de escalado en la producción a nivel Industrial de Bacillus

thuringiensis subesp kurstaki. Evaluando el rendimiento obtenido en el proceso Fed-Batch

Discontinuo con membrana de flujo tangencial.

Lo que se pretende con este proyecto en acuerdo con la Corporación para Investigaciones

Biológicas (CIB) Medellín, Col, es el de implementar un proceso para la producción de

Bacillus thuringiensis subesp kurstaki, por medio de un sistema Fed-Batch discontinuo con

membrana de flujo tangencial

OJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

• Aumentar el rendimiento para la Producción de Bacillus thuringiensis subesp kurstaki

por medio de un sistema de Fed-Batch discontinuo con membrana de flujo tangencial.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Implementar un biorreactor con una membrana de flujo tangencial y evaluar su

desempeño para la producción de Bacillus thuringiensis subesp kurstaki.

• Conocer y analizar los diferentes parámetros de la cinética de crecimiento de Bacillus

thuringiensis subesp kurstaki en un sistema Batch y en un sistema Fed-Batch

Discontinuo.

• Evaluar el comportamiento de diferentes variables importantes en el proceso como

son: concentración de biomasa, concentración de esporas, cantidad y análisis

cualitativo de toxina producida.

IQ-2002-2-06

9

1. Antecedentes1

La producción de Bacillus thuringiensis se realiza tanto en fermentaciones discontinuas o

tipo Batch como fermentaciones continuas y semicontinuas, denominadas Fed-Batch. La

metodología Batch es la más usada para producción industrial, pero a nivel de planta piloto

se han desarrollado otras metodologías como: Fed-Batch, cultivos discontinuos de Fed-

Batch (IFBC), cultivos continuos de Fed-Batch (CFBC), y sistemas de dos fases. Con el

fin de tener un aumento en la biomasa, concentración de esporas y toxicidad, logrando

una disminución en el tiempo total en el proceso de producción.

El proceso para la producción Bacillus thuringiensis tipo Batch, el cual consiste en la

adición inicial de nutrientes para que el microorganismo se reproduzca en forma

exponencial hasta que se agote el sustrato limitante; en esta fase hay mayor demanda de

oxígeno disuelto en el fermentador y al mismo tiempo, debido a la inhibición en el ciclo

del ácido tricarboxílico se produce una acumulación de ácidos y consecuentemente se

obtiene una disminución en el pH.

Finalizando el sustrato limitante, la fermentación llega a la fase estacionaria donde

aumenta la concentración del oxigeno disuelto y pH, iniciándose tanto el proceso de

1 Producción de Bacillus thuringiensis, Pág. 113-122.

IQ-2002-2-06

10

esporulación como el proceso para la formación del cristal. El proceso de producción

finaliza con la separación del cristal y las esporas con ayuda de alguna de las operaciones

de separación sólido-liquido tales como centrifugación o filtración.

El proceso Fed-Batch consiste en la adición de nutrientes durante la fermentación pero sin

la eliminación de medio agotado y material celular. Este procedimiento se puede realizar

en forma continua o discontinua. El Fed-Batch continuo consiste en un flujo constante de

nutrientes al fermentador, tratando de mantener una concentración permanente de sustrato

limitante dentro del cultivo ó para mantener constante la velocidad de crecimiento.

El mantenimiento de la concentración baja de sustrato limitante disminuye la velocidad de

crecimiento y permite un metabolismo mas ordenado, generando un posible aumento en la

densidad celular, y en la toxicidad del producto; también puede disminuir la demanda de

oxigeno disuelto en el fermentador. Kuppuusamy y Balaraman (1991) realizaron estudios

en Fed-Batch continuo con Bacillus thuringiensis subesp israelensis manteniendo la

concentración de glucosa entre 0.3 y 0.5%, obteniendo una de las densidades celulares más

altas señaladas hasta el momento, manteniendo la concentración de esporas y obteniendo

una toxicidad 5 veces mayor que la obtenido en cultivo Batch (tabla 1).

Con el mismo propósito Kang et al. (1992) realizaron estudios en Fed-Batch discontinuo y

continuo con Bacillus thuringiensis subesp kurstaki con un flujo constante de sustrato; sin

embargo para inducir la esporulación en el cultivo fue necesario suspender el suministro de

nutrientes logrando una esporulación completa a las 23 horas de iniciada la fermentación.

IQ-2002-2-06

11

También notaron que el aumento de la concentración de sustrato limitante (glucosa)

aumentaba la concentración de bacteria, pero inhibía la esporulación. Avignon-Rossa y

Mignone (1993) desarrollaron un sistema Fed-Batch continuo con incremento lineal de

flujo de sustrato utilizando Bacillus thuringiensis subesp israelensis. Este incremento

lineal del flujo se adapta mejor al crecimiento del microorganismo, lo que permite tener

mayor concentración de sustrato en donde la concentración celular es baja y viceversa. La

toxicidad del producto fue menor a la obtenida en cultivos Batch, pero se logro mantener en

los ensayos realizados a diferentes concentraciones de sustrato en Fed-Batch.

El sistema Fed-Batch discontinuo consiste en el suministro de nutrientes en forma de

pulsos, durante momentos estratégicos de la fermentación cuando el sustrato limitante esta

próximo a acabarse. Kang et al. (1992) realizaron con éxito un cultivo Fed-Batch

discontinuo con Bacillus thuringiensis subesp kurstaki obteniendo concentraciones de hasta

72.6 g/L de biomasa y 1.25x1010 esporas/mL, estos resultados son superiores a los logrados

en Fed-Batch continuo; en este proceso se pude realizar una disminución controlada de

sustrato limitante y, por lo tanto, una disminución en la velocidad de crecimiento. Se puede

concluir que es necesario una velocidad alta de crecimiento para lograr una buena

esporulación.

Vallejo et al. (1999), estudiaron la producción de Bacillus thuringiensis subesp Medellín

en un sistema Fed-Batch discontinuo, logrando mantener la toxicidad del producto a nivel

IQ-2002-2-06

12

normal en los cultivos con 1, 2 y 3 pulsos de sustrato. Obteniendo valores de 25 g/L de

biomasa y 9x108 esporas/mL. La adición de un cuarto pulso causa una esporulación y una

toxicidad menor.

La producción de Bacillus thuringiensis en sistemas fermentativos alternativos ha sido

estudiadas por Kang et al. (1993) quienes desarrollaron una metodología semejante a un

cultivo continuo pero con retención celular completa, permitiendo de esta manera retirar

medio agotado que posiblemente puede inhibir la esporulación y agregar medio fresco.

Utilizando Bacillus thuringiensis subesp kurstaki se obtuvo una biomasa de 82.2 g/L y

una concentración de 1.6x1010 esporas/mL.

Selinger et al. (1988) investigaron el crecimiento y producción de cristales de Bacillus

thuringiensis subesp kurstaki en un reactor tipo ciclón por medio de un cultivo Batch y

continuo. Pasados los 25 ciclos del cultivo continuo, se encontró que se empezaron a

generar microorganismos asporiferos, disminuyendo los rendimientos en las producción

de la toxina de interés. Los cultivos continuos de Bacillus thuringiensis solo se han

realizado para el estudio de la cinética de crecimiento de la bacteria (Mignone y Avignone-

Rossa, 1996; Sachidananham et al., 1997), ya que en la prolongación del tiempo del

cultivo se registra la aparición de mutantes asporiferos y en consecuencia una disminución

de de la toxicidad. Esto posiblemente sea debido a que los cultivos continuos han utilizado

como fuente de carbono par la esporulación glucosa y se ha descrito que la glucosa inhibe

IQ-2002-2-06

13

la producción de algunos metabolitos generados en el ciclo del ácido tricarboxílico

(Sachidananham et al. 1997).

En la siguiente tabla se muestran los resultados de diferentes estrategias alternativas para

la producción de Bacillus thuringiensis realizados a nivel de planta piloto.

Estrategia Subesp de Bacillusthuringiensis

Biomasa[g/L]

Esporas[esp/mL] Referencias

Fed-Batch Continuo con

el flujo dependiente de la

concentración de glucosa

Israelensis 80 NDKuppusamy y

Balaraman (1991)


flujo constante de sustratokurstaki 36 4.8x109 Kang et al. (1992)

Fed-Batch Discontinuo kurstaki 72.6 1.2x1010 Kang et al. (1992)


aumento lineal de flujoIsraelensis 5.5 5.3x108 Avignone Rossa y

Mignone (1993)

Cultivo Continuo con

retención celular totalkurstaki 82.2 1.6x1010 Kang et al. (1993)

Cultivo continuo de dos

etapas con retención

celular parcial

kurstaki ND 1.8x109 Kang et al. (1993)

IQ-2002-2-06

14

Continuación

Estrategia Subesp de Bacillusthuringiensis

Biomasa[g/L]

Esporas[esp/mL] Referencias


flujo dependiente del pHthuringiensis 5.0 8x109 Jong et al (1994)

Fed-Batch Continuo en

el reactor air-lift

modificado

darmstadiensis 6.5 1x1010 Jong et al (1995)

Cultivo Batch en reactor

airfitdarmstadiensis 2.2 ND

Tzeng y Yong

(1996)

Cultivo Continuo gallerie 8 NDSachidanandham

et al (1997)

Fed-Batch Discontinuo medellin 25 9x108 Vallejo et al (1999)

Tabla 1. Diferentes estudios para la producción a nivel planta piloto de B. thuringiensis

IQ-2002-2-06

15

2. Bacillus thuringiensis2

2.1 Morfología

Bacillus thuringiensis es una bacteria entre 1.0 y 1.2 µm de ancho por 3-5 µm de largo.

Pertenece a la familia Bacillaceae, situado taxonómicamente dentro del grupo de los

bacillos Gran positivos formadores de endoesporas. Durante el proceso de esporulación

hay la formación de uno o mas cuerpos cristalinos de naturaleza proteica adyacente a la

espora.

Estos cristales contienen proteínas (δ-endotoxinas) que son tóxicas para ciertas especies de

insectos, el cristal presenta una diversidad de formas dependiendo de las proteínas que lo

integran, con tamaños desde los 350 nm de diámetro en algunos cristales irregulares hasta

de 2 µm de longitud en muchos cristales bipiramidales.

La morfología de las colonias de Bacillus thuringiensis varían de forma diferente según el

medio en que sean cultivado, en agar nutritivo, forma colonias circulares con borde

irregular, perfil plano y color marfil claro, su textura es seca y cerosa. En medio LB, las

colonias son de borde circular y textura mucosa

2.2 Bioquímica de B. thuringiensis

Bacillus thuringiensis es un organismo anaerobio facultativo, quimioorganotrofo, con

actividad catalaza positiva, poseen una serie de características bioquímicas comunes, con

2 Iriarte, Pág. 16-24

IQ-2002-2-06

16

son capaces de hidrolizar almidón, gelatina, glucógeno, esculina y N-acetil-glucosamina, no

fermentan galactosa, lactosa ni manitol.

2.3 Ciclo Biológico

2.3.1 Germinación y fase vegetativa

El comienzo del ciclo de Bacillus thuringiensis se puede establecer en la germinación de la

espora de resistencia, proceso que en condiciones adecuadas durara unos minutos. El factor

fundamental que provoca la germinación de la espora dentro de los intestino es el pH

alcalino donde se lisa. Entonces aparece la fase vegetativa, que se multiplica activamente

en condiciones aeróbicas. Crece adecuadamente en la hemolinfa de los insectos y en gran

variedad de medios no selectivos.

La temperatura optima de crecimiento se sitúa entre 26 y 30ºC, con un pH optimo entre

valores de 6.5 y 7.5.

2.3.2 Fase estacionaria: Esporulación

La esporulación normalmente esta inducida por el empobrecimiento del cultivo y coincide

con el cambio de fase de crecimiento exponencial a fase estacionaria. En la fase

estacionaria tiene lugar simultáneamente la formación de la endoespora de resistencia y el

IQ-2002-2-06

17

cristal paraesporal. En condiciones de baja tensión de oxigeno o altos niveles de nitrógeno

orgánico en el medio de cultivo, la esporulación puede llegarse a inhibirse completamente.

El proceso de formación de la espora puede dividirse en siete etapas. Inicialmente, el ADN,

duplicado inmediatamente antes, se dispone formando un eje longitudinal de la bacteria . A

continuación se forma un septo transversal que divide a la célula en dos partes asimétricas,

encerrando una copia de ADN en cada una de ellas. La membrana de la célula mayor crece

rodeando a la mas pequeña. De manera que esta queda englobada finalmente por el

citoplasma de la anterior, lo que constituye la preespora, que se define como una porción

de citoplasma rodeada por dos membranas celulares. El cortex, espacio comprendido entre

estas dos membranas, se rellena de un único péptido glucano y es la primera estructura que

se forma. Después vendrá la acumulación de proteínas altamente resistentes a disolventes

alrededor de la membrana mas externa, lo que constituye la denomina cubierta de la espora.

La cubierta representa el 30 al 60% del peso seco total de la espora y contiene cerca del

80% de la proteína contenida en ella. La espora se rodea después de una capa mas fina y

laxa, el exosporio y, por ultimo, madura acumulando iones Ca2+ y ácido dipicolínico, que le

confiere resistencia al calor.

La espora de Bacillus thuringiensis es de contorno elipsoidal y ocupa una posición

subterminal dentro de la célula vegetativa, es resiste a temperatura extremas entre (70 y

80ºC), puede resistir a la desecación y a muchos desinfectantes (etanol 95%) por largos

periodos de tiempo. Son sensibles a la radiación ultravioleta.

IQ-2002-2-06

18

2.3.3 Cristal paraesporal

Simultáneamente a la formación de la espora, tiene lugar la síntesis de uno o varios

cristales paraesporales, que pueden presentar entre un 20 y un 30% del peso seco del

esporangio.

El cristal paraendosporal se ubica en el interior del esporangio y, generalmente fuera del

exosporio. Sin embargo, se han descrito cristales paraendosporarales dentro del exosporio

en algunos aislamientos, con lo que el cristal y la espora continúan juntos tras la lisis

celular. Al igual que la espora existen pruebas de que los cristales son inactivados por la

acción de la luz ultravioleta, siendo además fácilmente degradados por la acción de

microorganismos del suelo.

Cada cristal esta constituido por proteínas de una o varias clases, también denominadas δ-

endotoxinas, que se agrupan entre si mediante puentes de disulfuro. La estabilidad de estas

uniones condiciona el pH de solubilización del cristal, al estabilizarse los puentes de

disulfuro previene la disolución de la proteína, impidiendo su activación por parte de las

proteasas.

IQ-2002-2-06

19

Una ves completada la esporulación, se produce la lisis de la pared del esporangio,

liberándose el cristal y la espora en el medio, comenzándose el ciclo si las condiciones son

favorables.

2.4 Patogenicidad

El mecanismo de actuación de las proteínas Cry, las cuales producen el efecto toxico hacia

los insectos, se establece en los siguientes pasos: los cristales paraesporales de Bacillus

thuringiensis son ingeridos y a continuación se solubilizan en el intestino medio del insecto

liberando las proteínas cristalinas en su forma de protoxína. Una vez las protoxinas han

sido activadas en el intestino del insecto, las toxinas se unen específicamente a receptores

de membrana de naturaleza glicoproteica con pesos entre 120 y 180 kDa, situados en la

células columnares del intestino medio de los insectos, cuya permeabilidad al ión K+

aumenta inmediatamente. La teoría mas aceptada es que la inserción de las varias hélices α

de la toxina en torno a un punto concreto da lugar a la atrición de una estructura que actúa

como un poro de un radio de unos 0.6 nm en la membrana celular. La apertura del poro

hace que las células culumnares se hinchen rápidamente perdiendo funcionalidad con lo

que se inicia un cambio de fluidos entre la luz intestinal y la cavidad hemocelica, con el

consiguiente choque osmótico. Los receptores son claves en la acción toxica de las

proteínas Cry, cuya actividad esta en relación con la afinidad hacia los mismos y su

densidad en el epitelio. Después las células se lisan, desorganizándose el tejido epitelial del

mesenteron.

IQ-2002-2-06

20

Tras la lisis de las células epiteliales, cuyos efectos pueden bastar para matar al insecto, las

esporas contenidas en el intestino pueden acceder a la cavidad hemocélica del insecto

aprovechando las lesiones como puerta de entrada, provocando en ocasiones septicemia al

germinar y multiplicarse activamente en la hemolinfa, lo que supone un efecto sinérgico

con el de la toxina.

En larvas de lepidópteros, los síntomas iniciales del proceso toxico vienen marcados por la

parálisis muscular de todo el intestino, por lo que el insecto deja de alimentarse. El tiempo

entre la ingestión y el cese de la alimentación es de 80 minutos para B. mori. A

continuación el pH y el contenido de K+ de la hemolinfa aumentan rápidamente, y la larva

disminuye sus movimientos. Comienza entonces un proceso de vómitos, diarrea y,

seguidamente, la parálisis se vuelve general. Desaparecen los reflejos de los movimientos y

la larva muere tras cesar los latidos cardiacos, Si la cantidad de protoxina ingerida no es

letal, la larva supera el síndrome de parálisis intestinal inicial y se recupera, pero si la

exposición subletal es continua dará lugar a adultos con menor fertilidad y fecundidad.

IQ-2002-2-06

21

Las proteínas Cry se clasificaron según la homología de la secuencias de aminoácido.

CLASE PATOTIPOPESO

MOLECULAR[kDa]

TIPO DE CRISTAL

CryI Lepidoptera 130-140 Bipiramidal

CryII Lepidoptera/Diptera 65 Cúbico

CryIII Coleoptera 73 Plano

CryIV Diptera 135,128,65 Semiesférica / esférica

CryV Lepidoptera/Coleoptera 81 Críptico

Cyt Inespecífico 27 Redondo-Poliedrico

Tabla 2. Clasificación Proteínas Cry

3 Tipos de Fermentación

3.1 Fermentación tipo Batch3

La fermentación tipo batch o discontinua se puede considerar como un sistema cerrado,

donde se agrega una cantidad inicial de medio de cultivo y de microorganismos en

condiciones optimas de fermentación. A lo largo de toda la fermentación no hay adición o

remoción de nutrientes, excepto oxigeno (aire), antiespumante y ácidos o bases para el

control de pH.

3 Shuler, Pág. 149

IQ-2002-2-06

22

Una típica curva de crecimiento para una fermentación posee cinco fases de crecimiento4:

(1) la fase lag o de latencia, (2) la fase de crecimiento logarítmica o exponencial, (3) la fase

de desaceleración, (4) la fase estacionaria, (5) la fase de muerte.

3.2 Fermentación Continua

En la fermentación continua se estable un sistema abierto. Existen dos formas básicas de

cultivo de flujo tapón y el quimiostato. En el Cultivo flujo tapón, el cultivo viaja sin

mezclarse a través de un reactor tubular. Un quimiostato consiste en un tanque agitado con

una suspensión de biomasa perfectamente mezclada y homogénea, a la que se alimenta con

medio fresco a una tasa constante, el caldo de fermentación es extraído a la misma

velocidad de alimentación de modo que el volumen permanece constante5. La composición

de nutrientes, la biomasa, la transferencia de masa y la productividad varían en distintas

posiciones dentro del sistema6.

3.3 Fermentación tipo Fed-Batch7

La fermentación tipo Fed-Batch los nutrientes son alimentados continuamente o

discontinuamente, mientras que el efluente es removido discontinuamente. Un sistema Fed-

Batch es usualmente utilizado para superar la inhibición por sustrato o la represión

4 Shuler, Pág. 1555 Quintero, Pág. 576 Crueger, Pág. 777 Shuler, Pág. 243

IQ-2002-2-06

23

catabólica en la alimentación intermitente de sustrato. Si el sustrato es inhibitorio, la

adición intermitente de este aumenta la productividad de la fermentación, manteniendo la

concentración baja de sustrato.

4. Modelo cinético para el crecimiento de microorganismos

4.1 Modelo no estructurado8

Donde la biomasa es descrita por una sola variable (concentración de biomasa total) y no

se considera segregación en la población celular (todas las células son iguales).

4.2 Curva de crecimiento9

1. Fase lag o de latencia

Ocurre inmediatamente después de la inoculación, es un periodo de adaptación para las

células debido a un nuevo ambiente. Los microorganismos reconocen sus constituyentes

moleculares cuando se transfieren a un nuevo medio. Fase de crecimiento logarítmica o

exponencial. Durante esta fase la masa celular puede aumentar un poco, sin aumentar la

densidad celular. Es conveniente reducir la fase de latencia como sea posible, no solo para

8 Brown, Pág. 1319 Shuler, Pág. 154-159

IQ-2002-2-06

24

evitar la perdida de tiempo, sino también por que se consumen nutrientes para mantener el

cultivo viable en dicho periodo previo al crecimiento.

El tiempo de la fase de latencia puede reducirse usando un inoculo relativamente grande

(3-10%) de un cultivo en fase exponencial que haya sido preparado del mismo medio

utilizado para la fermentación10.

2. Fase de crecimiento exponencial

También conocida como fase logarítmica, en esta fase las células ya se han ajustado a su

nuevo ambiente. Después del periodo de adaptación , las células se pueden multiplicar

rápidamente. Este es un periodo de crecimiento balanceado en donde todos los

componentes de crecimiento de la célula están a la misma taza. La velocidad especifica de

crecimiento esta determinada por el numero de células o por la masa de células, ya que son

la misma. Debido a una concentración grande de nutrientes en el medio, la velocidad de

crecimiento es independiente de la concentración de nutrientes.

3. Fase de desaceleración

Continua después de la fase de crecimiento exponencial, en esta fase el crecimiento se

desacelera debido a la disminución de los nutrientes esenciales, o debido a la acumulación

10 Boffey, Pág. 77

IQ-2002-2-06

25

de subproductos tóxicos del crecimiento. En cultivo de bacterias este cambio ocurre en un

periodo de tiempo muy pequeño.

4. Fase estacionaria

Empieza al final de la fase de desaceleración, cuando la taza de crecimiento es igual a cero

o cuando la taza de crecimiento es igual a la taza de muerte. A pesar que la taza neta de

crecimiento es cero, las células siguen metabolicamente activas y hay producción de

metabolitos secundarios.

- Metabolitos primarios: Productos relacionadas al crecimiento.

- Metabolitos secundarios: Productos no relacionadas al crecimiento.

Durante la fase de desaceleración los siguientes fenómenos ocurren:

- La concentración de masa total se mantiene constante; pero el numero de células

viables puede disminuir.

- Puede ocurrir lisis celular y la masa de las células viables puede disminuir; puede

ocurrir una segunda fase de crecimiento.

- Al estar activo el metabolismo de las células, la regulación celular puede cambiar

cuando hay una concentración baja de ciertos metabolitos. Metabolitos secundarios

son producidos como resultado de la no regulación de metabolitos.

IQ-2002-2-06

26

5. Fase de muerte.

Debido al agotamiento total de nutrientes o acumulación de subproductos tóxicos comienza

la fase de muerte, durante esta fase la célula se puede o no lisar.

4.3 Ecuaciones de crecimiento celular

En una fermentación los microorganismos extraen nutrientes del medio para convertirlos en

componentes biológicos. Parte de esos nutrientes son usados para producción de energía y

otra parte son usados para biosíntesis y formación de productos. Como resultado de esa

utilización de nutrientes, la biomasa aumenta en el tiempo:

nXPXS +∑→+∑

La taza de crecimiento de microorganismos se caracteriza por la taza de Crecimiento

Especifico:

dtdX

X1

=µ

Donde: µ = Crecimiento especifico (h-1)

X = Es la concentración de biomasa (g/l)

t = Tiempo (h)

Substrato Células Productosextracelulares

Mas células+ +

IQ-2002-2-06

27

El aumento de la biomasa o numero de células en el tiempo esta determinado por la taza de

crecimiento exponencial (reorganizando):

XdtdX .µ= XoX = a tot =

Para el relacionar el número inicial de células con el número final de células tenemos de la

ecuación anterior:

Separando variables

∫∫ =t

to

X

Xo

dtX

dXµ

∫∫ =t

to

X

Xo

dtdXX

µ1

Integrando:

tXoX µ=− lnln

( ) tXotX µ+= lnln

Aplicando exp:

( ) teXotX µ*=

IQ-2002-2-06

28

Para poder calcular µ, se realiza una regresión lineal de logaritmo natural de la biomasa Vs

tiempo en la curva de crecimiento, donde µ es la pendiente de la recta, según las ecuaciones

tenemos:

tXoX µ=− lnln

XoXt ln=µ

El tiempo de duplicación, es el tiempo donde la masa microbiana se duplica:

XdtdX .µ=

tXoX

µ=lnln

Si XoX =2 :

tXoXo

µ=2ln

µτ

2ln=d

IQ-2002-2-06

29

Cuando el crecimiento celular esta limitado por un solo un nutriente del medio (sustrato

limitante). La ecuación de Monod describe la relación entre la velocidad especifica de

crecimiento, µ, y la concentración del sustrato limitante, S, en un cultivo microbiano11:

De la fase exponencial tenemos: maxµµ =

SKsS

+= maxµ

µ

Donde: µmax= Velocidad de Crecimiento especifico maxima(h-1)

Ks= Constante de saturación.

4.4 Estequiometría

La estequiometría para el crecimiento celular varia con el microorganismo, con el sustrato y

con las condiciones ambientales como el pH, temperatura, y potencial de reducción.

Coeficiente de Rendimiento

ConsumidoSustratoFormadaBiomasaY

SX _

_=

11 Quintero, Pág. 31

IQ-2002-2-06

30

SSoXoXY

SX −

−=

XSS

X YY 1

=

Coeficiente de Rendimiento relacionado al producto

ConsumidoSustratoFormadooductoY

SP _

_Pr=

SSoPoPY

SP −

−=

El coeficiente de mantenimiento, se describe como la taza de consumo para el

mantenimiento celular:

`´*___

tiempoBiomasantomantenimieparaConsumidoSustratom =

[ ]Xdt

dSm

m.=

IQ-2002-2-06

31

5. Filtración12

La filtración es muy utilizada en los procesos de separación sólidos-liquido, por lo general

la diferencia de presión se mantiene del impulsor constante, la velocidad de filtración

disminuye con el tiempo. Esta reducción de velocidad se puede atribuir directamente al

incremento de la resistencia al flujo a través de la creciente torta del filtro (acumulación).

5.1 Filtración con flujo tangencial (CFF)

La limitación del crecimiento de la torta en el filtro puede reducir la disminución de la

velocidad de filtración, para evitar lo anterior se diseño una modalidad de operación

llamada Filtración con flujo tangencial (CFF). En este tipo de filtración se utiliza una alta

velocidad de circulación del fluido, tangencial con el medio filtrante, con el objeto de

minimizar la acumulación de partículas sobre la superficie del filtro.

Concentrado

Salida delFluido

Pi

Pf

Po

Entrada delFluido

Filtrado

IQ-2002-2-06

32

Figura 1. Esquema General de filtración Tangencial13

Según el anterior esquema, la caída de presión dada por el flujo del fluido es:

PoPiP −=∆

Donde la caída de la presión transmembranal es:

PfPoPiPM −+

=∆2

Pf es la presión del filtrado, usualmente la presión atmosférica. Si se asume que Pf es igual

a la presión atmosférica o que Pf es igual a cero, si es presión manométrica, se puede

relacionar ∆P con ∆PM de la siguiente manera:

PPiPM ∆−=∆ 21

por lo tanto para obtener alto ∆PM es necesario tener una alta presión de entrada con una

velocidad de fluido pequeña. El flux de filtración. Como una función de la caída de presión

transmembranal esta dada por la siguiente ecuación:

MG

M

RRPJ+

∆=

Donde RG y RM son las resistencias de la torta y de la membrana respectivamente, RM es

constante y RG varia según la concentración del soluto y la velocidad tangencial a través de

la membrana, la cual se puede eliminar la formación de la torta.

12 Perry, sec. 17, Pág. 5613 Shuler, Pág. 343

IQ-2002-2-06

33

5.1.1 Ventajas de filtración con flujo transversal

- la velocidad de filtración no se ve afectada en forma significativa por la diferencia de

densidad en el medio de suspensión de las partículas.

- La acumulación de las partículas en la superficie del filtro se minimizan; debido a las

altas velocidades de filtración que evitan la acumulación.

- No se requiere la alimentación de aditivos, como agentes floculantes.

- No se requiere adición de ayuda de filtro. Esto es especialmente importante cuando se

desea minimizar la contaminación del producto sólido.

5.2 Ultrafiltración14

La ultrafiltración es un proceso de membrana, impulsado por la presión, para la separación

de dos componentes de una solución, con base en el tamaño y forma de la molécula.

Bajo una diferencia de presiones aplicadas a una membrana de ultrafiltración, el disolvente

y las especies pequeñas de soluto pasan a través de una membrana y se recogen en el

filtrado, en tanto que las especies mas grandes de soluto se recirculan por la membrana y se

recuperan como un concentrado ó retenido.

14 Perry, Cáp. 17 Pág. 57

IQ-2002-2-06

34

La acumulación de las partículas sobre la superficie del medio filtrante produce una

resistencia importante a la filtración. El desplazamiento tangencial del fluido minimiza la

acumulación de partículas, pero no la elimina completamente.

La polarización del filtro ocurre por que las partículas son transportadas a la superficie por

el liquido y se retiene ahí, mientras que el liquido pasa a través del medio. En dirección

perpendicular al medio filtrante se establece un gradiente de concentración de sólidos

retenidos, que regresan a la corriente masiva por un mecanismo de difusión (movimiento

browniano). Esta polarización de las partículas se puede controlar al variar la velocidad de

flujo tangencial en el medio filtrante, por que este flujo promueve la difusión de regreso a

la corriente masiva.

Por lo tanto, en estado estacionario la taza convectiva de transferencia del soluto a través de

la membrana es igual a la taza de difusión del soluto en dirección opuesta debido a la

concentración de la polarización:

CDdXdCJC =

Donde DC es la difusividad del soluto en el liquido [cm2/s], J es el Flux volumétrico de

filtración del liquido [cm3/cm2s] y C es la concentración del soluto [mol/cm3liquido].

Integrando la ecuación en las siguientes condiciones limite:

BCC = a 0=X y CCW = a δ=X

IQ-2002-2-06

35

Tenemos:

B

We

CCD

J lnδ

= ó B

W

CC

kJ ln=

Donde δ

CDk = , el cual es el coeficiente de transferencia de película y δ es el ancho de la

capa de la torta.

El coeficiente de transferencia de masa es función del fluido, de las propiedades del soluto,

de las condiciones de flujo y se puede correlacionar con el número de Reynolds (Re) y el

número de Schmidt (Sc):

bb

e

ScaCdkSh Re==

Donde µυρ /Re d= , eDSc ρµ /= , siendo Sh, el numero de Sherwood, el valor de a es

1/3, b es aproximadamente 0.5 para flujo laminar y 1.0 para flujo turbulento.

6.

7. Productos bioinsecticidas a base de Bacillus thuringiensis15

El primer producto comercial de Bt usado como insecticida microbiano, llamado

Sporeine® estuvo disponible en Francia en 1938 para el control del gusano barrenador de la

15 Cerón, Pág. 154-155

IQ-2002-2-06

36

harina. A partir de este momento se produjo un desarrollo de productos comerciales mas

extenso durante la década de los años 50s en varios países como URSS, Checoslovaquia,

Francia y Alemania. En Estados Unidos también se inicio el interés del uso de Bt, lo cual

llevo al desarrollo y comercialización de Thuricide® por parte de Bioferm Co.

Entre los años 1960 y 1970 se determino el alto grado de especificidad entre las cepas;

cepas diferentes exhibían diferentes espectros de actividad insecticidas. Las cepas Bt

difieren en su patogenecidad contra especies de insectos particulares. En los últimos 20

años el mercado de lo los bioinsecticidas ha sido dominado por productos que contienen

como ingrediente activo una mezcla de cristal y esporas de la cepa HD1 subesp kurstaki

para el control de plagas agrícolas y forestales, dando lugar a la sustitución de algunos

insecticidas convencionales.

La mayoría de los bioinsecticidas a base de Bt son producidos por cepas de Bt nativas y

utilizan una pequeña fracción de las proteínas Cry conocidas. En los Estados Unidos y

Canadá se han utilizados productos con la cepa Bt HD1 subesp kurstaki para el control de

lepidópteros de interés agrícola y forestal.

6.1 Productos de primera generación

Son aquellos cuya formulación incluyen como ingrediente activo una mezcla de cristales

(δ-endotoxinas) y esporas de una cepa nativa de Bt. Constituyen la mayor proporción de los

IQ-2002-2-06

37

productos comerciales y corresponden al 84% de un total de 75 productos registrados. Estos

productos están disponibles en diferentes formulaciones tanto sólidas como liquidas y son

empleadas en una amplia gama de sectores que van desde la agricultura hasta la salud

publica y las zonas urbanas.

En el sector agrícola han sido utilizados productos a basa de Bt en cultivos de trigos, maíz,

algodón, frutales, sorgo y soja, entre otros, casi exclusivamente para el control de plagas de

lepidópteros filófago.

En la siguiente tabla se enumeran algunos productos comerciales de cepas nativas de Bt.

Compañía Nombre Comercial Variedad Blanco

Dipel, Biobit XL,

Foraykurstaki Lepidópteros

Gnatrol, Bactimos,

VectoBacisraelensis Dípteros

Florbac aizawi Lepidópteros

Xentari aizawi Lepidópteros

Abotts Labs

Futura kurstaki Lepidópteros

Bactec Bernan Bt kurstaki Lepidópteros

Biochem Bactmos israelensis Dípteros

IQ-2002-2-06

38

Products

Farbwerbe-

HoechstBiospor kurstaki Lepidópteros

Fermenta

ASC Co.Cutlass kurstaki Lepidópteros

Chamapol-

BiokaBathurin thuringiensis Lepidópteros

Bactis kurstaki LepidópterosCompagnia di

Recerca chim.

CRC Bactucide israelensis Dípteros

Farmos Muscabac thuringiensis Lepidópteros

Dendrobacilin dendrolimus LepidópterosGlavmikro-

bioprom Endobacterin Galleriae Lepidópteros

Huazhong

Aggricultural

University

Shuangdu preparat Chinesensis Ct-43

Lepidópteros

Dípteros

Coleópteros

Libec Sporine kurstaki Lepidópteros

IQ-2002-2-06

39

Continuación


Knol Bioproducts Larvo-Bt kurstaki Lepidópteros

M-One tenebrrionis ColeópterosMycogen

M-Peril kurstaki Lepidópteros

Biobit kurstaki Lepidópteros

Foray kurstaki LepidópterosNovo Nordisk

Skeetal israelensis Dípteros

Suturad kurstaki LepidópterosRandoja

Nubilacid kurstaki Lepidópteros

Steward kurstaki Lepidópteros

Trident tenebrrionis ColeópterosTermo Triogy

Corporation

Vault kurstaki Lepidópteros

Shionogi Bacillex thuringiensis Lepidópteros

Thomson

Hayward Co.Bactur kurstaki Lepidópteros

Towagosei Chem Toaro, Toaro-Ct kurstaki Lepidópteros

Tuticorin Alcali

Chemicals and

Fertilisers Limited

Spicturin gallerie Lepidópteros

Tabla 3. Productos comerciales de cepas nativas

IQ-2002-2-06

40

6.2 Productos de segunda generación

Son aquellos constituidos por una mezcla de esporas y cristales (δ-endotoxinas)

provenientes de una cepa de Bt a la cual se le introdujo, por conjugación o transformación,

los genes que codifican para las δ-endotoxinas de genes presentes en varias cepas nativas,

ampliando su espectro de actividad hacia otro s insectos plagas.

La manipulación de genes Cry en Bt ofrece un gran potencial en la mejora de la efectividad

y la relación costo-beneficio de los productos a base de Bt,. Se ha descrito que ciertas

combinaciones de proteínas exhiben una actividad sinérgica hacia plagas de insectos

lepidópteros y dípteros.

El desarrollo de vectores de clonación para Bt ha hecho posible la construcción de cepas

mejoradas de Bt. El uso de cepas de Bt como huésped ofrece varias ventajas. Las cepas

nativas pueden mantener, de forma estable y expresar eficientemente, varios genes

homólogos de toxinas de Bt.

IQ-2002-2-06

41

En la siguiente tabla se enumeran algunos productos comerciales recombinantes de Bt


Abbott Labs NovodorTenebrrionis

NB176Coleópteros

Ecogen Lepinox ® Kurstaki ED7826 Lepidópteros

Crymax Kurstaki ED7841 Lepidópteros

Raven Kurstaki EG7673 Coleópteros

Condor kurstaki Lepidópteros

Cultas (T) Kurstaki Lepidópteros

Foil OF

Ecogen

Foil BFCkurstaki EG2424

Lepidópteros

Coleópteros

Agree aizawi-CG91 LepidópterosTermo Trilogy

Corporation Desing aizawi Lepidópteros

Tabla 4. Productos recombinantes comerciales

7.3 Productos de tercera generación

Han sido desarrolladas con el objeto de resolver las limitaciones de una inadecuada

aplicación y de su corta toxicidad residual.

Son aquellos cuya formulación bacterias recombinantes muertas, consistentes en

Pseudomonas flourescens que han sido transformadas con genes que codifican δ-

IQ-2002-2-06

42

endotoxinas de Bt. Este tipo de producto se conocen con el nombre de CellCap (tabla 5).

Solamente se conocen 3 productos de este tipo, los cuales representan el 4% del total de

productos de Bt y son elaborados por a empresa Mycogen.

Estos productos se obtienen insertando los genes que codifican para las toxinas de Bt en

otros microorganismos, los cuales son capaces de colonizar el habitad del insecto objeto en

tratamiento, con la idea de que los organismos transformados puedan sintetizar en forma

continua cantidades suficiente de toxinas para prevenir el daño causado por el insecto.

El inconveniente de esta técnica se encuentra en que involucra la liberación de

microorganismos recombinantes, lo cual representa numerosas restricciones de regulación

en su empleo.

En la siguiente tabla se enumeran los productos comerciales recombinantes en

Pseudomonas


Match (R) Pseudomonas(EC) Lepidópteros

MTrak (R) Pseudomonas(EC) ColeópterosMycogen

MVP (R) Pseudomonas(EC) Lepidópteros

Tabla 5.Productos recombinantes en Pseudomonas

IQ-2002-2-06

43

7. Materiales y Métodos

7.1 Primera parte

7.1.1 Activación

Para la realización de este estudio se utilizó la cepa Bacillus thuringiensis subesp kurstaki

proporcionada por la Corporación para Investigaciones Biológicas (CIB), Medellín,

Colombia.

Para desarrollar las diferentes fermentaciones, fue necesario activar esta cepa, la cual se

encontraba liofilizada. Este procedimiento se utiliza para el mantenimiento de células,

donde el agua es removida por sublimación16 (secado al vació partiendo del estado de

congelación).

Se realizó el siguiente procedimiento para activación de la bacteria: primero se preparó

medio de cultivo líquido estéril con un volumen total de 50 ml, en un erlenmeyer de 500 ml

(Anexo A), se tomó una pequeña muestra de las esporas liofilizadas con una asa redonda, y

se realizó la siembra directamente en el medio, colocándose el erlenmeyer en el shaker por

un período de 36 horas a una temperatura de 30ºC; después fue necesario tomar una

muestra para observar el crecimiento del microorganismo en el microscopio, realizándose

proceso de coloración.

IQ-2002-2-06

44

7.1.2 Aislamiento y Cultivo de la Colonia Madre

Para evitar tener diferentes características genéticas entre la cepa a utilizar, se decidió aislar

y cultivar una sola colonia para partir del principio de igualdad con el siguiente

procedimiento: se preparó 10 cajas de petri con medio sólido de LB estéril (Anexo A).

Partiendo del cultivo anterior, se realizó siembras por asilamiento en cada caja de petri.

Colocándose luego en la incubadora por un período de 24 horas a una temperatura de 30ºC.

Después de haberse observado crecimiento se escogió la caja de petri en la cual se pudiera

visualizar colonias individuales separadas de Bacillus thuringiensis subesp kurstaki.

Para el cultivo de la colonia madre se preparó medio de cultivo líquido estéril con un

volumen total de 100 ml, en un erlenmeyer de 1000 ml (Anexo A). Posteriormente de la

caja de petri escogida se seleccionó una sola colonia, la cual se sembró en este medio

líquido; se colocó el erlenmeyer en el shaker por un período de 72 horas, a una temperatura

de 30ºC. Luego de transcurrido el tiempo, se tomó una muestra para observar el

crecimiento y esporulación del microorganismo en el microscopio, realizándose el proceso

de coloración correspondiente.

7.1.3 Conservación de Microorganismos

16 Shuler, Pág. 356

IQ-2002-2-06

45

Para poder mantener varias réplicas de la colonia viables para utilizarlas en los procesos de

fermentación, fué necesario realizar el siguiente procedimiento para la conservación de la

solución de esporas de Bacillus thuringiensis subesp kurstaki: se llevó a centrifugación el

cultivo anterior durante 10 minutos a 4000 rpm. Se obtuvo el botton (biomasa),

descartándose el sobrenadante. Después, se preparó un solución estéril glicerol-agua 20/100

v/v, resuspendiéndose el botton con esta solución. Posteriormente se prepararon 30

eppendors estériles con 1 ml de la solución anterior y se llevaron al congelador a una

temperatura de –20ºC

7.2 Segunda parte: Fermentación Batch

Para poder conocer el comportamiento y la cinética de crecimiento de Bacillus

thuringiensis subesp kurstaki, se realizaron 3 fermentaciones Batch. Utilizando el

fermentador Bioflo 3000 (New Brunswick), el cual tiene una capacidad total de 5 L, y

utilizando un volumen de control de 3.3 L.

IQ-2002-2-06

46

7.2.1 Procedimiento de inoculación y condiciones de la fermentación Batch

Para poder realizar el procedimiento de inoculación al fermentador, se preparó medio de

cultivo con un volumen total de 300 ml y con 1 mL de la solución de esporas; este ultimo

equivale al 9% del volumen de control, en un erlenmeyer de 500 ml, a una temperatura de

30ºC por un período de 14 horas en el shaker (figura2), esto con el fin de disminuir la fase

estacionaria de Bacillus thuringiensis subesp kurstaki.

Figura 2. Inoculo

Pasadas las 14 horas del cultivo del inóculo, se pasó el inóculo al fermentador de manera

aséptica con un volumen de medio de cultivo de 3L, en las siguientes condiciones de

fermentación: una temperatura de 30ºC, la cual se controló automáticamente mediante un

controlador PID, el pH se mantuvo entre 6.5 y 8, monitoreado por un electrodo pH (Mettler

Toledo). La velocidad de agitación fué de 300 rpm mediante un controlador PID,

modificándose el flujo de aire según la demanda de oxígeno disuelto en el fermentador no

IQ-2002-2-06

47

menor a un valor del 20% de DO y monitoreado por un electrodo polarográfico de oxígeno

(Mettler Toledo).

7.3 Tercera parte: Fermentación Fed-Batch Discontinuo

Para realizar el proceso de fermentación Fed-Batch discontínuo, se tuvo en cuenta los

estudios realizados anteriormente en este campo y se determinaron los momentos

estratégicos para adicionar los pulsos tanto de glucosa como de extracto de levadura al

medio de cultivo según el análisis de la cinética de crecimiento desarrollada en el

laboratorio por Bacillus thuringiensis subesp kurstaki.

Al realizar los diferentes pulsos de sustrato, se tuvo en cuenta la taza de consumo de

glucosa, desarrollándose estos en un aumento lineal y por repetición de la siguiente manera:

Fermentaciones Glucosa[gr/L]

Extr. Levadura[gr/L]

Batch 8 8

Fed-Batch Pulso 1 16 16



Tabla 6. Pulsos de sustrato para las fermentaciones Fed-Batch Discontinuo

IQ-2002-2-06

48

Se implemento un sistema de filtración mediante una membrana de filtración tangencial

con el fin de realizar una recirculación de células al fermentador mientras se llevaba a cabo

una remoción por filtración de metabolitos secundarios generados en la fase de crecimiento

del microorganismo, evitando la inhibición del crecimiento celular y así poder realizar los

pulsos de sustrato en iguales proporciones al volumen retirado en la filtración (figura 3).

Figura 3. Esquema del sistema de filtración

Se utilizo como membrana de filtración tangencial el Filtro Ultraflux AV400 (Fresenius,

Hamburgo, Alemania). La membrana esta hecha de polisolfona, la longitud de los capilares

es de 27 cm con un área efectiva de filtración de 0.75 m2, La carcaza esta hecha de

policarbonato y el material de relleno es de poliuretano. Esta membrana deja pasar

sustancias con un peso molecular de 30.000 Daltons. La adaptación de la membrana al

fermentador se hizo mediante conexiones hechas con manguera siliconada de diámetros de

1/8 in y 1/2 in. El volumen de remoción del fermentador de 3.3 L fue de 1 L con excepción

Membrana FT

GlucosaExt. de Levadura

MedioAgotado

IQ-2002-2-06

49

del primer pulso donde el volumen retirado fue de 0.5L, para la succión del medio agotado

se utilizo una bomba peristáltica (Manostat, IL USA) y para llevar a cabo el filtrado se

utilizo una bomba de vació con una presión manométrica de 9 in de Hg.

La descripción del montaje completo para el sistema Fed-Batch discontinuo se puede ver en

la figura 4. Desarrollado en el laboratorio de Ing. Química de la universidad de los Andes

(CITEC).

Figura 4. Montaje para el sistema Fed-Batch

IQ-2002-2-06

50

7.3.1 Procedimiento de inoculación y condiciones de la fermentación Fed-Batch

discontinuo para los pulsos 1, 2 y 3

Para el procedimiento de inoculación y las condiciones para el proceso de fermentación

Fed-Batch discontínuo para los pulsos 1, 2 y 3, fueron las mismas que para el proceso

Batch explicadas anteriormente.

IQ-2002-2-06

51

8 Métodos de análisis

Los parámetros a analizar tanto en el proceso Batch como en el proceso Fed-Batch fueron

los siguientes:

PARÁMETROS METODOLOGÍAS

Determinación de Biomasa Peso Seco

Concentración de Esporas Unidades Formadoras de Colonia

Concentración de Glucosa DNS

Cantidad de d-endotoxína SDS PAGE

Tabla 7. Parámetros y metodologías de Evaluación.

Para conocer la confiabilidad de los datos, la determinación de biomasa se realizó por

duplicado, mientras que la concentración de esporas se realizó por triplicado. Para

procedimientos ver anexo B

IQ-2002-2-06

52

9. Resultados

9.1 Primera parte

9.1.1 Activación

La activación de la cepa de a Bacillus thuringiensis subesp kurstaki se dio de manera

positiva con el cambio de color del medio, signo de crecimiento de la bacteria. Para poder

corroborar esto se realizó el procedimiento de coloración y llevándose la muestra al

microscopio, pidiéndose apreciar el color rozado característico de Bacillus thuringiensis.

9.1.2 Aislamiento y Cultivo de la Colonia Madre

Al finalizar el período de tiempo del procedimiento de aislamiento se observó el

crecimiento de colonias separadas en las diferentes cajas de petri. Con las siguientes

características:

- Morfología Macroscópica bacteriana:

• Forma de crecimiento: Circular

• Elevación de colonia: Plana

• Característica de los bordes: Ondulado.

• Consistencia de la colonia: Cremosa

IQ-2002-2-06

53

- Pigmentación: Color abano claro.

Para corroborar la esporulación de la colonia madre se realizó la coloración habitual y se

llevó la muestra al microscopio, donde se podía apreciar Bacillus thuringiensis de color

rozado, y esporas de color verde lo cual indicaba la esporulación positiva del cultivo.

9.1.3 Conservación de Microorganismos

Para mantener viable la solución de esporas, se la colocó en glicerol-agua al 20% y se

llevaron a congelación los 30 eppendors a -20°C.

9.2 Segunda parte: Fermentación Batch

Las 3 fermentaciones Batch, se llevaron a cabo sin contaminación y en iguales condiciones

de operación.

Tiempo total Fermentación = 33 h

IQ-2002-2-06

54

CONDICIONES

Tiempo O2 Vol de Aire Temperatura AgitaciónOPERACIÓN

[h]pH

[%] [L/min] [ºC] rpm

Inoculación Batch 1 0 6,38 84 0 30 300

Inoculación Batch 2 0 6,33 83,5 0 30 300

Inoculación Batch 3 0 6,21 78,3 1,1 30 300

Tabla 8. Condiciones proceso Batch

9.2.1 Parámetros de Evaluación

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Tiempo [h]

OD

[%

] Batch 1

Batch 2

Batch 3

Figura 5. Grafica oxigeno disuelto fermentaciones Batch

IQ-2002-2-06

55

0

2

4

6

8

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Tiempo [h]

Glu

cosa

[g

r/L

]

Batch 1

Batch 2

Batch 3

Figura 6. Grafica consumo de glucosa fermentaciones Batch

0

0,3

0,6

0,9

1,2

1,5

1,8

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Tiempo [h]

Bio

mas

a [g

r/L

]

B atch 1

B atch 2

Batch 3

Figura 7. Grafica cuantificación de biomasa fermentaciones Batch

FermentacionesEsporas

[UCF/mL]

Batch 1 6x107

Batch 2 8,2x108

Batch 3 7x107

Tabla 9. Resultados esporulación proceso Batch

IQ-2002-2-06

56

9.2.2 Variables de crecimiento Celular:

Según los datos analizados en la fase de crecimiento exponencial de Bacillus thuringiensis

subesp kurstaki se obtuvieron los siguientes resultados:

Biomasa final µµ Y X/S ττdFermentaciones

[gr/L] [h-1] [%] [h]

Batch 1 4,15 0,20 51,87 3,47

Batch 2 3,45 0,12 43,12 5,78

Batch 3 3 0,20 37,50 3,47

Tabla 10. Variables de crecimiento celular fermentaciones Batch

µ : Velocidad especifica de Crecimiento

Y X/S: Rendimiento Global del proceso

τd: Tiempo de duplicación.

9.3 Tercera parte: Fermentaciones Fed-Batch Discontinuo

Se realizaron 5 fermentaciones Fed-Batch, con suministro de sustrato tanto de glucosa

como de extracto de levadura en iguales cantidades, realizando 1, 2 y 3 pulsos.

IQ-2002-2-06

57

9.3.1 Fermentación Fed-Batch: Con 1 Pulso de sustrato

Fermentación Fed-Batch pulso 1

Tiempo Inóculo = 13 h

Volumen Total removido Filtración 1 = 500 mL


Condiciones

Tiempo O2 Vol de Aire Temperatura AgitaciónOperación

[h]pH

[%] [L/min] [ºC] [rpm]

Inoculación Batch 0 6,5 30 6,7-7,2 30 300

Filtración 1 12 6,5 45,2 6,9-6,5 30 300

Inoculación Pulso 1 13,2 6,5 43 6,8-7,5 29,7 300

Tabla 11. Condiciones de proceso Fed-Batch pulso 1

Fermentación Fed-Batch pulso 1 Repetición




Condiciones


[h]pH


Inoculación Batch 0 6,32 85 8,2-7,5 30 300

Filtración 1 R 12 6,5 29,9 7,2-7,6 30 300

Inoculación Pulso 1R 14 6,5 26,2 7,7-8,3 30 300

Tabla 12. Condiciones de proceso Fed-Batch pulso 1 R

IQ-2002-2-06

58

9.3.1.1 Parámetros de Evaluación

0

20

40

60

80

100

120

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52

Tiempo [h]

OD

[%

]

1 Pulso

1Pulso R

Figura 8. Grafica oxigeno disuelto fermentaciones Fed-Batch Pulso 1

0

2

4

6

8

10

12

14

0 2 4 6 8 10

Tiempo [h]

Glu

cosa

g/L

Pulso 1

Pulso 1 R

Figura 9. Grafica consumo de glucosa fermentaciones Fed-Batch Pulso1

IQ-2002-2-06

59

0

2

4

6

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tiempo [h]

Bio

mas

a [g

r/L

] Pulso 1

Pulso 1 R

Figura 10. Grafica cuantificación de biomasa fermentaciones Fed-Batch Pulso1


[UCF/mL]

Pulso 1 3x108

Pulso 1 R 1x109

Tabla 13 . Resultados Esporulación Proceso Fed-Batch Pulso 1

9.3.1.2 Variables de crecimiento Celular:

Biomasa final µµ Y X/S Pulso Y X/S Global ττdFermentaciones

[gr/L] [h-1] [%] [%] [h]

Pulso 1 6.2 0.37 38.75 25.83 1.83

Pulso 1 R 8.35 0.15 52.18 34.79 4.44

Tabla 14. Variables de crecimiento celular Fermentaciones Fed-Batch Pulso 1

IQ-2002-2-06

60


Y X/S Pulso: Rendimiento por pulso del proceso

Y X/S Gobal: Rendimiento Global del proceso


9.3.2 Fermentación Fed-Batch: con 2 Pulsos de Sustrato


Tiempo Inóculo = 13 h (congelación)




Condiciones


[h]pH


Inoculación Batch 0 6,79 100 5,6-5,9 30,2 300

Filtración 1 10 6,5 15 7,3-7,5 30 300

Inoculación Pulso 1 10.5 6,2 19 7,9-6,5 30 300

Filtración 2 24 4,93 0,1 5,1-5,6 30,2 300

Inoculación Pulso 2 24.5 6,5 14,5 5,6-5,4 30 300

Tabla 15. Condiciones de Proceso Fed-Batch pulso 2

IQ-2002-2-06

61

Fermentación Fed-Batch pulso 2 Repetición





Entrada de oxígeno al fermentador para mantener 1% de OD = 30 h

Condiciones

Tiempo O2 Vol de Aire Temperatura Agitación Operación

[h]pH


Inoculación Batch 0 7,23 90,1 7,6-8,4 29,7 300

Filtración 1 11,5 6,9 69 6,4-6,2 30 300

Inoculación Pulso 1 12 7,33 53,7 6,1-6,0 29,7 300

Filtración 2 26 6,76 9,4 6,1 30 300

Inoculación Pulso 2 R 26,5 6,83 55,4 5,5 30 300

Tabla 16. Condiciones de Proceso Fed-Batch pulso 2 R

IQ-2002-2-06

62

9.3.2.1 Parámetros de Evaluación

0

10

20

30

40

50

60

0 10 20 30 40 50

Tiempo [h]

OD

[%

]

Pulso 2

Pulso 2 R

Figura 11. Grafica oxigeno disuelto fermentaciones Fed-Batch Pulso 2

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

0 2 4 6 8 10

Tiempo [h]

Glu

cosa

[g

r/L

]

Pulso 2

Pulso 2 R

Figura 12. Grafica consumo de glucosa fermentaciones Fed-Batch Pulso 2

IQ-2002-2-06

63

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Tiempo [h]

Bio

mas

a [g

r/L

]Pulso 2

Pulso 2 R

Figura 13. Grafica cuantificación de biomasa fermentaciones Fed-Batch Pulso 2


[UCF/mL]

Pulso 2 No Esporulo

Pulso 2 R 2.5x109

Tabla 17 . Resultados esporulación proceso Fed-Batch Pulso 2

9.3.1.2 Variables de crecimiento Celular:


[gr/L] [h-1] [%] [%] [h]

Pulso 2 4.76 0.13 19.83 9.91 5.23

Pulso 2 R 15.71 0.14 65.45 32.72 4.80

Tabla 18. Variables de crecimiento celular Fermentaciones Fed-Batch Pulso 2

IQ-2002-2-06

64





9.3.3 Fermentación Fed-Batch: con 3 Pulsos de Sustrato







Entrada de oxígeno al fermentador para mantener 1% de OD = 43 h

Pequeña contaminación.

Condiciones


[h]pH


Inoculación Batch 0 7,8 67-7 8,9-8,2 30 300

Filtración 1 13,5 6,5 40 7,8-8,3 30 300

Inoculación Pulso 1 14 5,61 22,6 7,9-7,4 30,4 300

Filtración 2 23 6,59 75,5 6,9-6,6 30,1 300

Inoculación Pulso 2 23,5 7,05 32,5 7,5-7,1 31,7 300

Filtración 3 37,5 6,5 21,3 6,6-6,7 30 300

Inoculación Pulso 3 39 5,62 19 6,4-6,7 29,2 300

Tabla 19. Condiciones de Proceso Fed-Batch pulso 3

IQ-2002-2-06

65

9.3.1 Parámetros de Evaluación

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 10 20 30 40 50

Timepo [h]

OD

[%

]

Figura 14. Grafica oxigeno disuelto fermentación Fed-Batch Pulso 3

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

0 2 4 6 8

Tiempo [h]

Glu

cosa

[g

r/L

]

Figura 15. Grafica consumo de glucosa fermentación Fed-Batch Pulso 3

IQ-2002-2-06

66

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

16,00

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Tiempo [h]

Bio

mas

a [g

r/L

]

Figura 16. Grafica cuantificación de biomasa fermentaciones Fed-Batch Pulso 3


[UCF/mL]

Pulso 3 1x108

Tabla 20 . Resultados Esporulación Proceso Fed-Batch Pulso 3

9.3.2 Variables de crecimiento Celular:


[gr/L] [h-1] [%] [%] [h]

Pulso 3 17.23 1.04 54.06 21.62 0.66

Tabla 21. Variables de crecimiento celular fermentación Fed-Batch Pulso 3





IQ-2002-2-06

67

9.4 Análisis cualitativo y cuantitativo de Proteína Tóxica

Para el análisis cualitativo de la toxina se llevo a cabo dos electroforesis en gel de

poliacrilamida con las muestras obtenidas tanto el proceso Batch como en el proceso Fed-

Batch para la producción de Bacillus thuringiensis y se obtuvieron los siguientes

resultados:

Primer Gel

Figura 17. Resultados Electroforesis 1

kDa207

121

81

5133.6

28.6

21.1

P B2 B1 B2 B3 FB1 FB1R FB1 FB1R P

IQ-2002-2-06

68

Segundo Gel

Figura 18. Resultados Electroforesis 2

Para la cuantificación de proteína se realizaron dos métodos: Proteína total (Bradford) y

concentración de proteína de 60 y 130 kDa según las bandas obtenidas en el proceso de

electroforesis (desitometro).

kDa207

121

81

51

33.6

28.621.1

P FB1 FB1R FB2R FB2R FB3 FB3 FB1 P FB2R

IQ-2002-2-06

69

FermentacionesBradford

[µg/mL]

Batch 1 110

Batch 2 65

Batch 3 60

Fed-Batch Pulso 1 1912

Fed-Batch Pulso 1 R 2001

Fed-Batch Pulso 2 R 2231

Tabla 22. Resultados análisis de proteína total

Electroforesis

[µg/mL]Fermentaciones

60 kDa 130 kDa

Batch 1 37 0

Batch 2 140 648

Batch 3* - -


Fed-Batch Pulso 1 R 236 703

Fed-Batch Pulso 2 R 930 178

Tabla 20. Resultados análisis de Electroforesis

*A la fermentación Batch 3 no se realizo análisis de electroforesis.

IQ-2002-2-06

70

10. Análisis de Resultados

10.1 Fermentación Batch

Se llevaron a cabo 3 fermentaciones de tipo Batch, para conocer la cinética de crecimiento

y el comportamiento del microorganismo durante todo el proceso de fermentación. Se

demostró una buena reproducibilidad en los datos obtenidos en oxigeno disuelto, biomasa,

consumo de glucosa, velocidad de crecimiento y cantidad de esporas. En la variación de la

biomasa en el tiempo se puede apreciar que la fase de latencia es de 2 horas, seguido por

una fase de crecimiento lineal, característico de Bacillus thuringiensis subesp kurstaki

según las publicaciones (Liu and Bajpai., 1995), (Kang et al., 1993), (Vallejo et al., 1999)

desarrollándose una cinética de crecimiento de orden cero y una velocidad específica de

crecimiento promedio de 0.17 h-1 (δ=4.61x10-2) (Ver figura 7).

Según la curva de oxígeno disuelto (figura 5) en el fermentador se pudo apreciar que este

empezó a disminuir desde la primera hora de inicio de la fermentación, signo de que se

están llevando a cabo las reacciones metabólicas típicas de microorganismo. En

consecuencia se puede ver igualmente una disminución considerable en el pH. Cuando el

valor de oxígeno disuelto aumentó, simultáneamente aumentó el valor del pH,

IQ-2002-2-06

71

demostrándose que el microorganismo entró en fase de desaceleración y posteriormente a

fase estacionaria, que es donde se lleva a cabo la formación el complejo espora-cristal.

El parámetro de diseño para los pulsos de sustrato en las fermentaciones Fed-Batch, se baso

en el análisis de la curva de glucosa. La taza promedio de consumo de glucosa según el

cálculo de la pendiente fue de 0.43 gr/Lh en la fase de crecimiento. Analizando los datos

obtenidos, el consumo de glucosa total se dió entre las 12 y 14 horas después de haber

iniciado el proceso. Lo anterior indica que el consumo es lento debido a que la densidad

celular es pequeña.

Al analizar los parámetros de evaluación del proceso (tabla 24), se obtuvo una biomasa

final promedio de 3.45 g/L (δ=0.57), un rendimiento global promedio de 44.16% (δ=7.24)

y una concentración de esporas promedio de 3.16x108 UFC/mL (δ=4.35x108), esta ultima,

es una concentración baja comparada con resultados reportados por: (6.5x109 UFC/mL)

Pearson y Ward, 1988, (4.0x109 UFC/mL) Golberg et al., 1980, y (2.1x109 UFC/mL) Arcas

et al., 1984, para el proceso de fermentación Batch. Esto posiblemente debido a que se

estaba utilizando en diferentes cantidades en algunos componentes del medio de cultivo que

se utilizo, como son glucosa 10 g/L y extracto de levadura 28 g/L.

IQ-2002-2-06

72

Biomasa Final µ YX/SFermentaciones

[gr/L] [h-1] [%]

Batch 1 4,15 0,2 51,87

Batch 2 3,45 0,12 43,12

Batch 3 3 0,2 37,5

Promedio 3,53 0,17 44,16

Desv Estandar 0,57 4,61x10-2 7,24

Tabla 24. Resultados finales fermentaciones Batch

10.2 Fermentación Fed-Batch Discontinuo

Según los datos analizados en el proceso de fermentación Batch y teniendo en cuenta las

condiciones en el laboratorio, se realizaron fermentaciones Fed-Batch discontinuo con uno,

dos y tres pulso de sustrato por repetición. Mejorando las condiciones de cada uno, con

miras obtener mejores resultados.

Los componentes para el diseño de los pulsos de sustrato fueron glucosa y extracto de

levadura en un radio de 1:1, debido a que la cinética de crecimiento del microorganismo fue

de orden cero, se decidió llevar a cabo un aumento lineal según la concentración inicial de

estos componentes en el proceso de fermentación Batch. En consecuencia la concentración

fue de 16 gr/L para el primer pulso, 24 gr/L para el segundo y finalmente 32 gr/L para el

tercer pulso para la glucosa y para el extracto de levadura..

IQ-2002-2-06

73

A medida que se realizaron los diferentes pulsos de sustrato, el oxígeno disuelto disminuyo

desde la primera hora de haber iniciado el proceso de fermentación; signo de que se

activaron nuevamente y empezaron a llevarse a cabo las reacciones metabólicas (figuras

8,11,14) del microorganismo. Se observó que el consumo de oxígeno era mayor con

respecto a la transferencia de este en el fermentador, obteniéndose un valor de 0% en el

sensor oxígeno disuelto desde la hora 4 de haber iniciado el pulso 1 de sustrato.

Simultáneamente se pudo apreciar una disminución considerable en el pH durante la fase

de crecimiento debido a la inhibición que se presenta en el proceso del ciclo del ácido

tricarboxílico. Llegando hasta el punto que en el proceso Fed-Batch pulso 2, el pH llego a

tener un valor de 4, lo que constituye un choque osmótico grande para Bacillus

thuringiensis; por lo tanto esta deficiencia de oxígeno disuelto sumado a la baja tan drástica

en el pH, influyeron de manera importante para que no se llevara a cabo el proceso de

esporulación por parte de la bacteria, y por ende la producción de las δ-endotoxínas. Para

aumentar la transferencia de oxígeno en el fermentador, para los procesos Fed-Batch pulso

2 (repetición) y Fed-Batch pulso 3, se suministro oxigeno puro y se mantuvo el porcentaje

de oxígeno disuelto por encima del 1%; para que este no fuera un factor limitante en la

esporulación.

Durante el desarrollo de todo el proceso de fermentación, el valor del oxígeno disuelto no

aumentó y se mantuvo en valores muy bajos. Por el contrario se pudo observar un aumento

en el valor del pH, signo de que el microorganismo entró en fase de desaceleración para

IQ-2002-2-06

74

pasar a fase estacionaria, siendo en esta última donde se lleva a cabo simultáneamente el

proceso de esporulación y formación del cristal.

En los procesos de fermentación Fed-Batch, según el análisis para el consumo de glucosa,

en la primera parte se llevo a cabo un proceso Batch con un periodo de 12 horas, y se pudo

determinar que a medida que se llevaron a cabo los pulsos 1 y 2 de sustrato, el consumo

total de glucosa se daba entre las 6 y 4 horas respectivamente (Figuras 9,12) de haberse

realizado los pulsos para los procesos Fed-Batch. Según el cálculo de la pendiente la taza

promedio de consumo de glucosa aumentó en 4 y 8 veces respectivamente, en comparación

a las fermentaciones Batch anteriores. Esto se debe a que hay mayor densidad celular, el

consumo de glucosa se realizó en menor tiempo y a mayor velocidad.

Durante el proceso de filtración, se decidió remover 1000 mL, con excepción en el pulso 1

de 500 mL, para disminuir la concentración de metabolitos secundarios en la fermentación

y realizar el pulso con en el mismo volumen removido para mantener el volumen promedio

de la fermentación en 3.3 L. A medida que se llevaron a cabo todos los procesos de

filtración se puede apreciar un decaimiento drástico en el flux entre los volúmenes filtrados

(ver anexo H), esto debido al taponamiento que se va generando en la superficie de la

membrana a través del tiempo mientras se lleva a cabo la filtración tangencial; por ende al

aumentar la concentración celular, la membrana es ineficiente hasta el punto de triplicar el

tiempo de filtración para el tercer pulso.

IQ-2002-2-06

75

A los filtrados se realizó tanto análisis de glucosa como cuantificación de biomasa; como

resultados no se obtuvo ninguna concentración de glucosa ni de biomasa, de acuerdo a lo

esperado para los proceso de primer pulso, lo cual indicó que si se llevo a cabo una

retención celular total por parte de la membrana en la fermentación.

Debido a que se presentaron unos problemas de contaminación, se tuvo que recurrir a un

proceso de limpieza para la membrana (Ver anexo L) para poder llevar a cabo las

fermentaciones Fed-Batch con dos y tres pulsos de sustrato; el cual al parecer dilato en un

porcentaje pequeño el diámetro de los poros de filtración de la membrana, disminuyendo

así la retención celular por parte de esta en el proceso de filtrado. Por lo tanto a medida que

se realizaron las diferentes filtraciones, la cantidad de biomasa en el filtrado aumentó (Ver

anexo E), obteniéndose un máximo valor de 2.55 g/L en la filtración del tercer pulso,

donde se puede ver que la influencia en la dilatación de los poros ya es un factor critico en

el desarrollo del proceso de filtración; determinante para la escogencia de la membrana y

posible escalamiento del proceso.

Al analizar los parámetros de evaluación para el proceso Fed-Batch discontinuo, se puede

ver que al aumentar linealmente la concentración de sustrato por medio de los pulsos se

puede llegar a aumentar la densidad celular y en consecuencia obtener una esporulación

alta. Según los resultados obtenidos en los procesos que se llevaron a cabo en mejores

condiciones la evaluación del rendimiento por pulso se aumento en comparación al proceso

Batch, con el primer pulso 1.2 veces y con el segundo pulso 1.5 veces, (tabla 25). Estos

IQ-2002-2-06

76

resultados obtenidos tienen igual tendencia según datos publicados por Vallejo et al. (1999)

(duplicando valores obtenidos en la fermentación Batch).

Biomasa Final µ Y X/S Pulso Y X/S GlobalFermentaciones

[gr/L] [h-1] [%] [%]

Pulso 1 6.2 0.37 38.75 25.83

Pulso 1 R 8.35 0.15 52.18 34.79

Pulso 2 4.76 0.13 19.83 9.91

Pulso 2 R 15.71 0.14 65.45 32.72

Pulso 3 17.23 1.04 54.06 21.62

Tabla 25 Datos Globales fermentación Fed-Batch

Los mejores resultados obtenidos se dieron en los procesos Fed-Batch 1 (repetición) y Fed-

Batch pulso 2 (repetición) (tabla 25), con una concentración celular final de 8.35 y 15.71

gr/L respectivamente y una concentración de esporas de 1x109 UFC/m y 2.5x109 UFC/mL

respectivamente. Lográndose un aumento en este ultimo parámetro de ocho veces los

resultados obtenidos analizados en la fermentaciones Batch. Según datos publicados por

Vallejo et al., (1999), donde se utilizo un proceso Fed-Batch discontinuo con Bacillus

thuringiensis subesp medellín; a pesar que se llego a un valor mas alto en la biomasa (25

gr/L), se obtuvo una concentración menor de esporas (9x108 UFC/mL), generándose una

diferencia al implementar el proceso de fermentación con la membrana de flujo tangencial

y así disminuir la concentración de metabolitos secundarios en el proceso, los cuales

podrían influir tanto en el aumento de biomasa como en la concentración de esporas.

IQ-2002-2-06

77

Por lo tanto al realizar una comparación con el proceso Batch, se puede ver que se mejoró

en todos los parámetros de evaluación propuestos para el proceso Fed-Batch discontinuo

con 1, 2 y 3 pulsos de sustrato, y que variables de operación como por ejemplo el volumen

de filtración, el control de pH y el oxigeno disuelto, son fundamentales para que el proceso

sea efectivo.

Cabe anotar que el redimiendo global para los diferentes pulsos (YX/S) fue menor debido a

que en este se tuvo en cuenta la entrada total de glucosa al sistema, en acuerdo con

resultados obtenidos por Vallejo et al., (1999). pero si se logró mejorar el rendimiento a

nivel de pulso, el cual es muy importante para ver la eficiencia del proceso.

10.3 Proteína Tóxica

Para el análisis cualitativo de la expresión de la proteína toxica en los procesos de

fermentación tanto Batch como Fed-Batch, se realizo dos electroforesis en gel denaturante

de poliacrilamida (SDS PAGE) (figuras 17, 18), donde claramente se pueden diferenciar las

bandas para las toxinas de interés, las cuales tienen pesos moleculares de 60 y 130 kDa

respectivamente, y se puede determinar que el aumento en la concentración de sustrato

llevadas a cabo en los pulsos 1, 2 y 3, y el desarrollo del proceso de filtración no tienen una

influencia en la expresión de las proteínas toxicas por parte del microorganismo.

IQ-2002-2-06

78

Según el análisis cuantitativo para la proteína toxica (tabla 22), se pudo ver que en los

procesos de fermentación Batch la cantidad de proteína total, se encuentra por valores muy

bajos con un promedio de 78.33 µg/mL (δ=27.53) comparados a los resultados obtenidos

en las fermentaciones Fed-Batch discontinuo, donde se obtuvo valores de 1912 µg/mL para

el primer pulso, 2001 µg/mL para la repetición del primer pulso y para el segundo pulso

repetición con el valor más alto de proteína total de 2231 µg/mL; por lo tanto a medida que

se va aumentando la concentración de sustrato en los diferentes pulsos, hay un aumento en

la cantidad de toxina total.

Para la cuantificación de toxina expresada según las bandas obtenidas para las proteínas de

60 y 130 kDa, siendo esta última la de mayor efecto tóxico, se puede apreciar que a medida

que se fue incrementando la concentración sustrato mediante los pulsos, la concentración

de la proteína de 60 kDa, va en aumento; mientras que para la proteína de 130 kDa, no se

puede establecer un parámetro de comportamiento, es necesario que se realicen más

investigaciones y que además se completen con Bioensayos, para poder determinar la

toxicidad de la proteína, y si este aumento en la concentración de sustrato tiene algún efecto

en la síntesis del cristal.

IQ-2002-2-06

79

11. Conclusiones

Debido a la creciente demanda en los sistemas de control biológico para plagas en los

diferentes cultivos, la mayoría de los procesos para la producción a nivel industrial de

Bacillus thuringiensis se realizan por medio de una fermentación tipo Batch, las otras

metodologías existentes solo se han llevado acabo a nivel de planta piloto. Es por eso que

surgió la necesidad de desarrollar una metodología diferente en relación a los parámetros de

evaluación como son: la concentración de biomasa, concentración de esporas, análisis

cualitativo y cualitativo de toxina obtenidos, para ver la factibilidad de realizar a futuro el

escalamiento del proceso. En este estudio se implemento un sistema Fed-Batch discontinuo

en un biorreactor con membrana de flujo tangencial y se evaluaron los resultados obtenidos

comparando con los de un proceso Batch en iguales condiciones de operación.

De los resultados obtenidos, uno de los parámetros más importantes para la evaluación del

proceso para la producción de Bacillus thuringiensis subesp kurstaki fue la biomasa. Se

puede concluir que a medida que se llevo a cabo el aumento en la concentración sustrato

por medio de los pulsos, se logro aumentar la densidad celular del cultivo; al realizar una

comparación de los procesos de fermentación Batch donde se obtuvo un valor promedio de

biomasa final de 3.53 gr/L, con la realización del proceso Fed-Batch discontinuo con 1

pulso de sustrato donde se obtuvo un valor de biomasa final de 8.35 gr/L; se puede ver la

densidad celular aumento en 2.36 veces que el proceso Batch. Con el proceso Fed-Batch

IQ-2002-2-06

80

discontinuo con 2 pulsos de sustrato, donde se obtuvo un valor de biomasa de 15.71 gr/L,

el aumento ya es de 4.45 veces comparado con el proceso Batch y finalmente si hacemos

una comparación con el proceso Fed-Batch con 3 pulsos de sustrato con un valor en la

densidad celular es de 17.23 gr/L, el aumento de esta última alcanza un valor de 4.88 veces;

cabe anotar que en esta fermentación se presento un pequeña contaminación afectando

todos los parámetros de evaluación.

Otro parámetro para la evaluación del proceso para la producción de de Bacillus

thuringiensis subesp kurstaki, es la concentración de esporas; en cuanto al proceso Batch se

obtuvo una concentración promedio baja con un valor de 3.16x108 UFC/mL (δ=4.61x10-2),

pero al llevar a cabo el proceso Fed-Batch discontinuo, a medida que se realizaban los

pulsos de sustrato la concentración de esporas también aumento, con 1 pulso de sustrato

(repetición) se obtuvo una concentración de esporas de 1 x109 UFC/mL; llegándose a

obtener el valor mas alto en concentración de esporas de 2.5x109 UFC/mL con 2 pulsos de

sustrato (repetición). En este parámetro de evaluación, hay una influencia directa de la

transferencia de oxígeno disuelto en el fermentador, la cual se debe tener en cuenta para el

desarrollo del proceso.

La implementación de la membrana de filtración tangencial al fermentador fue satisfactoria

desde todo punto de vista en cuanto al proceso de producción de Bacillus thuringiensis

subesp kurstaki, ya que se logró aumentar tanto la biomasa como la esporulación,

IQ-2002-2-06

81

obteniéndose buenos resultados en la cuantificación de la toxina expresada por el

microorganismo; ya que al retirar medio agotado; se disminuyo la probabilidad de una

inhibición por una concentración alta de metabolitos secundarios en el fermentador

generados en la fase de crecimiento.

Al llevar a cabo el análisis para la concentración de azúcares durante el proceso de

fermentación, se pudo observar un aumento en el consumo de este parámetro en el tiempo,

ya que al llevar a cabo una remoción de los metabolitos secundarios en la fermentación, se

mejoro las condiciones para el desarrollo del metabolismo del microorganismo,

aumentándose la taza para el consumo de glucosa, y consecuentemente obteniéndose una

densidad celular mayor. Sin embargo es indispensable que se sigan efectuando

investigaciones en este campo para determinar si el microorganismo continua su

crecimiento y posteriormente desarrolla el complejo espora-cristal o si la concentración de

sustrato es excesiva hasta punto de llegar a inhibir la esporulación; según datos reportados

por Kang et al., (1992) a una concentración de glucosa de 200 gr/L, se obtuvo un aumento

en la biomasa de 49 gr/L, pero no se desarrollo proceso de esporulación.

Durante el proceso de fermentación Fed-Batch discontinuo con membrana de flujo

tangencial, se encontraron dos problemas de operación para la producción de Bacillus

thuringiensis subesp kurstaki; el primero esta relacionado con la baja transferencia de

oxígeno en el fermentador, esta limitación genero un aumento en el tiempo para el

IQ-2002-2-06

82

crecimiento del microorganismo, el cual se encuentra entre 12-14 horas, posiblemente

debido a que el experimento se llevo a cabo en Bogotá, donde la altura es de 2.600 msnm,

siendo este un facto critico ya que la cantidad de oxigeno disuelto es menor; en

comparación a procesos llevados a cabo en Medellín donde la altura es de 1474 msnm,

donde la cantidad de oxígeno disuelto es mayor y en consecuencia la duración de la fase de

crecimiento es de 4 h (Vallejo et al., 1999).

El segundo problema operacional es el desempeño de la membrana de filtración, ya que

según los resultados obtenidos, el flux decae a medida que se llevan a cabo las diferentes

filtraciones, debido a un taponamiento progresivo. Además es de suma importancia que el

proceso de fermentación se lleve a cabo en condiciones asépticas, siendo fundamental que

el proceso de limpieza de la membrana sea efectivo, para que no se generen problemas de

contaminación.

Por lo tanto la deficiencia en la transferencia de oxigeno y el taponamiento de la membrana

son factores limitantes para el posible escalamiento del proceso para la producción de

Bacillus thuringiensis subesp kurstaki.

IQ-2002-2-06

83

BIBLIOGRAFÍA

1. Brown C., Campbell I., Priest F., “Introducción a la Biotecnología”, Primera Edición,

Editorial Acribia S. A. España 1989.

2. Crueger W. Crueger A. "Biotecnología: Manual de Microbiología Industrial" Editorial

Acribia S.A. España, 1993.

3. Escobar J M, Kishore D. Rane, Cheryan M “Ethanol Production in a Membrane

bioreactor ”(1993) Humana press inc, 0283: 283-296.

4. González A., Restrepo A., y S. Orduz. (2001). “Desarrollo y Aplicaciones de Bacillus

como Bioinsecticida”, Capítulo V, Producción de Bacillus Thuringiensis editorial M.

V. Phytoma, Universidad Pública de Navarra España.

5. Kang BC, Lee SY, Chang HN (1993) “Production of Bacillus Thuringiensis Spores in

total cell retention culture and two-stage continuous culture using an internal ceramic

filter system” Biotechnol. Lett 42: 1107-1112.

6. Kang BC, Lee SY, Chang HN (1992) “Enhanced Spores production Bacillus

Thuringiensis by Fed-Batch culture” Biotechnol. Lett 14: 712-726.

7. Quintero Rodolfo, “Ingeniería Bioquímica, teoría y aplicaciones”, Primera edición

Editorial Alambra S.A, México 1981.

8. Ratledge C., Kristiansen B., “Basic Biotechnology”, Second edition, Cambridge

University Press, UK 2001.

IQ-2002-2-06

84

9. Shuler, Michael. “Bioprocess Engineering”. Editorial Prentice Hall. 1992.

10. Tamez P, Galan L, Medrano H, Garcia C, Rodriguez C, Gomez R, Tamez R,

(2001)”Bioincecticidas: su empleo, producción y comercializacion en Mexico” Ciencia

UANL/ Vol IV, No 2.

11. Vallejo F, González A, Posada A Restrepo A, Orduz S, (1999)“Production of Bacillus

Thuringiensis subsp Kurstaki by batch and fed-batch culture” Biotechnol. Lett 13: 279-

281.

12. Universidad de los Andes, Departamento de Ingeniería Química.”Manual de

Laboratorio de Biopolímeros” Santa fe de Bogota, 2001

13. Universidad de los Andes, Facultad de Ciencias.” Departamento de Ciencias

Biológicas” Manual de Laboratorio Microbiología para Biólogos”, Santa fe de Bogota,

1997.

14.

IQ-2002-2-06

86

Anexo A

Composición medio de cultivo liquido:

ComponentesCantidad

[g/l]

Glucosa Anihidra 8

Extracto de Levadura 8

Fosfato monobásico de Potasio 3

Fosfato bibásico de Potasio 3

Sulfato de Amonio 1

Cloruro de Calcio 0.41

Sulfato de Magnesio 4

Tabla 26. Medio de cultivo

Para poder llevar a cabo el proceso de esterilización por autoclave fue necesario separar los

componentes del medio en glucosa, sulfato, y el resto en las siguientes proporciones:

Componente del Medio LiquidoVolumen Total

[%]

Glucosa Anihidra 10

Sulfato de Magnesio 10

Resto 80

Tabla 25. Porcentaje del Medio de cultivo

IQ-2002-2-06

87

1. Composición del medio cultivo sólido LB:

ComponentesCantidad

[g/l]

B Bacto-Tryptone 10

Extracto de Levadura 5

Cloruro de Sodio 15

Agar 15

Tabla 28. Medio de cultivo LB

IQ-2002-2-06

88

Anexo B1

Metodologías para los parámetros de evaluación

1. Coloración de Esporas

Se realizó el siguiente procedimiento para la coloración de esporas en la cámara de flujo

Laminar (Figura 30):

1. Se toma la muestra en la lámina.

2. Se realiza una fijación de la muestra con evaporación.

3. Se agrega verde malaquita

4. Se realiza una fijación de colorante verde malaquita con evaporación hasta formar un

anillo alrededor de la lamina.

5. Se lava con cuidado la muestra con agua.

6. Se agrega fushina

7. Se espera por un periodo de tiempo de 3 minutos.

8. Se lava con cuidado la muestra con agua.

9. Se seca fija la coloración con evaporación.

IQ-2002-2-06

89

2. Determinación de biomasa

La biomasa es una medida o una estimación económica de conocer la concentración de

microorganismos que hay en una muestra. Una de las metodologías para determinarla es

por peso seco.

Procedimiento

1. Los recipientes que se utilizan son eppendors de 1.5 ml, los cuales se llevaran al horno

(figura 29) a 121ºC durante 4 horas, posteriormente se llevan al desecador durante 2

horas para que éstos alcancen la temperatura ambiente. Finalmente se pesan en la

balanza (con guantes de látex) (figura 32) y se anota el peso de cada uno de ellos.

2. Se toma 1 ml de cada una de las muestras y se centrífuga (figura 31) por un periodo

de tiempo de 10 minutos a 10000 rpm.

3. Se Revisa que este separado el sobrenadante de la biomasa, en caso contrario repetir el

procedimiento del ítem 2 a las muestras que no están completamente separadas.

4. Se descarta el sobrenadante del botton.

5. Se resuspende el botón con 1 ml de agua destilada y se centrifugar en las mismas

condiciones.

6. Repetir el ítem 5

7. Se descarta el sobrenadante.

8. Se llevan al horno a 121 0C durante 2 horas

1 Manual laboratorio polímeros y biopolímeros

IQ-2002-2-06

90

9. Se pesa nuevamente (Con guantes de látex) y se resta el peso tomado inicialmente.

Figura 19. Muestras de peso seco

3. Determinación de la concentración de esporas

Debido a que B. thuringiensis es una bacteria esporulada, y que la esporulación está

acoplada a la formación del cristal, una de las variables más importantes a cuantificar es la

concentración de esporas. El método que será utilizado para cuantificar la concentración de

esporas es el conteo de unidades formadoras de colonia (UFC) en caja de petri.

Procedimiento

1. Se prepararan 24 tubos de ensayo cada uno con 4.5 ml de agua estéril.

2. Se toman 0.5 ml de la última muestra del primer día y las muestras de las 3 últimas

muestras y se llevan a tubos de ensayo previamente estériles con 4.5 ml de una

solución de agua previamente esterilizada.

3. Se preparan 36 cajas de petri con medio sólido LB.

4. Se realizan diluciones sucesivas dependiendo de la muestra de la siguiente manera:

- Ultima muestra primer día, dilución 1/10

IQ-2002-2-06

91

- 3 últimas muestras: 10-5, 10-6 , 10-7

5. Se Lleva a choque térmico los anteriores tubos. El choque térmico consiste en colocar

en baño Maria a 80oC durante 10 minutos.

6. Una vez los tubos de ensayo alcancen la temperatura ambiente, se siembra por

Triplicado en cajas de petri.

7. Se Llevan a incubación durante 20 horas a 30oC

8. Se escoge la dilución que presente l cifra más cercana a 100 y se realiza el conteo de

colonias.

5. Determinación de Azucares

La determinación de azucares reductores, como es el caso de glucosa se utilizara el método

DNS, el cual se basa en la colorimetría dado por el ácido Di-nitro-salicílico, el cual la

glucosa reduce transformándolo en 3-amino5-nitro-salicílico de color naranja-rojo. La

densidad óptica del color producido por es directamente proporcional a la cantidad del

cuerpo reducido y a la cantidad de glucosa en la solución.

Preparación de la solución estándar de DNS

1. Se mezclan y disuelven los siguientes componentes:

• Agua destilada:1416 mL

• Ac. Di-nitro-salicílico: 3,510.6 gr

• NaOH :19.8 gr

IQ-2002-2-06

92

2. Se agrega:

• Tartato de sodio y potasio (sal de Rochelle): 306 gr

• Fenol: 7.6 mL

• Metabisulfito de sodio:8.3 gr

Se almacena la anterior solución a temperatura ambiente por una semana antes de su uso.

Para usar la solución DNS, adicionar 210 µL de una solución de glucosa0.1 M, para 100

mL de DNS el día que se va a usar.

Procedimiento

1. Se toma 0.25 ml de cada una de las muestras en un tubo de ensayo y se lleva a 10 ml

con agua desionizada.

2. De la anterior solución se toman 2 ml y se agregan 5 ml de la solución de DNS.

3. Se debe realizar la muestra Blanco con 2 ml de agua y 5 ml de DNS.

4. Se lleva a ebullición por un periodo de 15 minutos y se deja enfriar.

5. Se lee en espectrofotómetro a 600nm (figura 35).

IQ-2002-2-06

93

Figura 20.. Muestras para pruebas de Azucares

Curva de Calibración

Muestra Absorvancia Glucosa Agua DNS

[mmol/tubo] [nm] [gr/L] [µL] [mL]

0 0 0 2000 5

0,5 0,0875 0,315 1910 5

1 0,1753 0,63108 1820 5

1,5 0,2608 0,93888 1730 5

2 0,3358 1,20888 16,4 5

2,5 0,4256 1,53216 1550 5

3 0,5204 1,87344 1460 5

5 0,8588 3,09168 1100 5

7 1,2607 4,53852 740 5

10 1,7243 6,20748 200 5

Tabla 29 Datos de la curva de calibración DNS

Curva de Calibracón DAS

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

2

0 2 4 6 8 10

Muestra [��mol/tubo]

Ab

so

rva

nc

ia [

nm

]

Figura 21 Curva de calibración DNS

99901.0

00317.017470.02 =

−=

Rxy

IQ-2002-2-06

94

6. Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

Una de las principales características de las proteínas expresadas por B. thuringiensis que

permite diferenciar cualitativamente es el peso molecular. Uno de los procedimientos más

adecuados para esto es realizar una electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS PAGE).

Procedimiento:

1. Preparación del gel 10% para mls del gel:

• Agua bidestilada: 2 mL

• Tris-HCl 1.5 M pH 8.8: 1.25 mL

• SDS 10% (w/v): 50 µL

2. Solución Acrilamida/Bisacrilamida al 30%:

• Persulfato de Amonio al 10%: 1.6666 mLs

• Temed: 10 µL

Se coloca en las laminas de vidrio

3. Stakin Gel al 4% para un volumen de 2.5 mL:

• Agua bidestilada: 1.6 mLs

IQ-2002-2-06

95

• Tris –HCl 0.5 M, pH 6.8: 625 µL

• SDS 10% (w/v) : 25 µL

• Acrilamida (30 gr) + Bisacrilamida (1.6 gr) :375 µL

• Persulfato de amonio 10% : 21µL

• Temed : 28 µL

Se coloca encima del anterior gel, colocándose la peineta y esperar 30 minutos hasta que

endurezca.

4. Buffer de la muestra:

• Agua deshionizada: 3.8 mL

• Tris de HCl 0.5 M, pH 6.5: 10 mL

• Glycérol :0.8 mL

• SDS 10% (w/v) : 1.6 mL

• 2 mercaptoetanol : 0.4 mL

• Azul de bromo fenol 1% (w/v):0.4 mLs

Diluir la muestra 1:4 con el buffer de la muestra y calentar a 95ºC por 4 minutos

6. Buffer de corrida

• Glicina: 14.4 gr

• Trizma base: 3.03 gr

• SDS al 20%: 5mls

• Se completa con agua deshionizada: hasta 1000 mL

IQ-2002-2-06

96

Una vez estén las muestra y el patrón aplicadas en el gel tapar la cámara (figura 34).,

verificar el color de los electrodos y colocar en 18 mA constantes hasta que llegue al final

del gel las muestras

7. Fijación de las proteínas

Una vez terminada la electroforesis, se sumerge los vidrios con el gel durante 5 minutos

en la solución de fijado.

• Metano: 25 mL

• Agua: 75 mL

• Ácido acético: 7 mL

Luego con la ayuda de una micro espátula se despega el gel. Y se deja el gel por mas de

una hora.

8. Tinción de las proteínas con Azul de comassie al 0.2%

Después de la fijación, se sumerge el gel en la solución de azul de comassie de 0.2%

durante ½.

• Azul de comassie: 0.2 gr.

• Metanol: 50 mL

• Ácido acético glacial 5 mL

• Se completa con agua hasta 1000 mL.

IQ-2002-2-06

97

9. Decoloración del Gel.

Se sumerge el gel en solución de ácido acético al 10% y 30% de metanol. Cambiar la

solución 3 o 4 veces hasta obtener una buena coloración.

10. Patrones estándares utilizados en la electroforesis:

Bio-rad. Broad Range, Catalog 161-0.318, control 81623

Proteína Peso Molecular[Da]

Myosin 207.000

B-galactosidase 121.000

Bovine Serum Albumin 81.000

Ovalbumin 51.000

Carbonic Anhydrase 33.600

Soybean Trypsin inhibitor 28.600

Lysozyme 21.100

Aprotinin 7.500

Tabla 30. Patrones estándares de Proteína

IQ-2002-2-06

98

Anexo C

Toma de Datos

1. Primera Fermentación Batch

Muestra Tiempo Temperatura Vol de Aire O2 Agitación

# [h]pH

[ºC] [L/min] [%] [rpm]

0 0 6,38 30 0 84 300

1 1 6,46 30 1,4 100 300

2 2 6,5 30 1,2 100 300

3 3 6,49 30 1,3 55,6 300

4 4 6,1 30 3,2 35,9 300

5 5 6,17 30 7,1 44 300

6 6 6,5 30 7,7 22,6 300

7 7 6,5 30 7 28,9 300

8 24 7,5 30 9,1 100 300

9 33 6,5 30 9,2 100 300

Tabla 31. Datos primera fermentación Batch

2. Segunda Fermentación Batch


# [h]pH


0 0 6,33 30 0 83,5 300

1 1 6,5 30 0,9 97,8 300

2 2 6,5 30 0,9 89,9 300

3 3 6,5 30 0,9 68,2 300

4 4 6,5 30 1 40,8 300

5 5 6,5 30 7,2 67,6 300

IQ-2002-2-06

99

6 6 6,5 30 7,9 41,8 300

7 7 6,5 30 8.2 32 300

8 24 6,5 30 8,75 99 300

9 33 6,5 30 8,2 100 300

Tabla 32. Datos segunda fermentación Batch

3. Tercera Fermentación Batch


# [h]pH


0 0 6,21 30 1,1 78,3 300

1 1 6,5 30 1,3 90,3 300

2 2 6,5 30 1,2 88,5 300

3 3 6,5 30 1,2 79,9 300

4 4 6,5 30 0,1 53,8 300

5 5 6,5 30 7 68 300

6 6 6,5 30 6,7 55 300

7 7 6,5 30 7,4 42,6 300

8 24 6,5 30 6,05 99,2 300

9 33 6,5 30 6,1 2,6 300

Tabla 33. Datos primera fermentación Batch

4. Fed-Batch con 1 Pulso de sustrato

Tiempo total Muestra Hora Temperatura Vol de Aire O2 Agitación

Fermentación [#] [h]pH


13 0 0 6,5 29,7 6,8-7,5 43 300

14 1 1 6,5 30 7,9-8,2 92,1 300

15 2 2 6,5 30 8,6 100 300

16 3 3 6,38 30 9,6-8,8 79,3 300

17 4 4 6,5 30 9,5 0,6 300

18 5 5 6,5 30 9,3 0,4 300

IQ-2002-2-06

100

19 6 6 6,5 30 8,1 7,3 300

20 7 7 6,5 30 9,6 28,1 300

21 8 8 6,5 30 9,1 3,2 300

22 9 9 6,5 30 8,1 7,2 300

38 10 24 6,5 30 7,7-8,4 9,5 300

42 11 28 6,5 30 7,7-7,2 0,2 300

46 12 33 6,5 30 7,0-6,5 0,1 300

62 13 49 6,5 30 7,0-6,5 0 300

Tabla 34.Datos Fed-Batch pulso 1

5. Fed-Batch con 1 Pulso de sustrato (repetición)


Fermentación [] [h]pH


14 0 0 6,5 30 7,7-8,3 26,2 300

15 1 1 6,5 30 8,1-8,7 10,5 300

16 2 2 6,5 30 8,5-7,5 1 300

17 3 3 6,38 30 8,8-8,1 3,3 300

18 4 4 6,5 30 7,9-8,4 27,9 300

19 5 5 6,5 30 8,8-8,2 24,1 300

20 6 6 6,5 30 7,8-8,5 29,6 300

21 7 7 6,5 30 7,8-8,6 9,4 300

22 8 8 6,5 30 7,6-8,2 10,3 300

38 9 24 7,74 30 6,2-6,3 0 300

42 10 28 6,5 30 6,3-7,0 0 300

46 11 33 6,5 30 3,6-2,9 0 300

61 12 48 6,5 30 7,5-8,1 0,1 300

Tabla. 35 Datos Fed-Batch pulso 1 R

IQ-2002-2-06

101

6. Fed-Batch con 2 Pulsos de sustrato


Fermentación [h] [h]pH


26 0 0 6,5 30 5,6-5,4 14,5 300

27 1 1 6,14 30 5,3-5,4 11,6 300

28 2 2 6,5 30 4,9-5,0 5,1 300

29 3 3 6,5 30 5,6-5,3 2,8 300

30 4 4 6,4 30 5,3-5,5 0,5 300

31 5 5 6,5 30 6,3-6,0 0,2 300

32 6 6 6,5 30 6,4-6,9 0 300

33 7 7 6,5 30 6,4-6,8 0 300

50 8 24 6,51 30 6,1-6,7 0 300

54 9 28 6,73 30 6,0-6,5 0 300

58 10 32 6,91 30 2,3-2,5 0 300

74 11 48 6,78 30 0,9-0,3 5,2 300

Tabla 36 Datos Fed-Batch pulso 2

7. Fed-Batch 2 Pulsos de sustrato (repetición)




26 0 0 6,2 30,1 6,8-6,6 55,4 300

27 1 1 6,12 30 6,2-6,3 37,3 300

28 2 2 6,18 30,1 7,8 1,3 300

29 3 3 6,22 30,3 0 0 300

30 4 4 6,7 29,9 9,5-9,2 1 300

31 5 5 6,12 30 5,3-5,7 0,6 300

32 6 6 6,78 30 9,1-8,4 7,5 300

33 7 7 6,76 30 7,9-7,6 6,4 300

34 8 8 6,74 30 7,5-8,0 1,3 300

IQ-2002-2-06

102

50 9 24 7,16 30 9,1-9,0 0 300

55 10 29 7,53 30 9,5-9,0 3,6 300

59 11 33 7,77 30 9,0-9,3 2,5 300

74 12 48 8,35 30 10,1-9,5 4 300

Tabla 37 Datos Fed-Batch pulso 2R

8. Fed-Batch con 3 Pulsos de sustrato




37 0 0 6,47 31,4 6,7-7,1 25,2 300

38 1 1 6,57 30,7 6,7-6,5 23,4 300

39 2 2 5,93 28,9 7 16 300

40 4 4 6,27 30 9,2-9,7 24 300

41 5 5 6,38 30,1 9,1-9,5 62,8 300

42 6 6 6,23 30,1 9,9-10,5 70 300

43 7 7 6,13 30,1 9,8-10,7 62,9 300

44 8 8 6,39 29,8 11,6-10,6 74,3 300

60 9 24 6,88 29,6 2,9-2,6 5,3 300

64 10 28 6,84 30 1,9-2,2 4,2 300

68 11 32 6,82 30 1,2-1,5 3,4 300

84 12 48 6,96 30 0,7-0,8 0,8 300

Tabla 38. Datos Fed-Batch pulso 3

IQ-2002-2-06

103

Anexo D

Datos del Consumo de Glucosa


Muestra Lectura Absorbancia Glucosa

[h] [µmol/tubo] [nm] gr/L

1 1,5 0,2594 5,4

2 2 0,3467 7,2

3 1,5 0,2594 5,4

4 1,3 0,22448 4,68

5 1,2 0,20702 4,32

6 1 0,1721 3,6

7 0,8 0,13718 2,88

24 0,6 0,10226 1,08

33 0,6 0,10226 1,08

Tabla 39. Consumo de glucosa Batch 1



[h] [µmol/tubo] [nm] [gr/L]

0 1,7 0,29432 6,12

1 1,8 0,31178 6,48

2 1,8 0,31178 6,48

3 1,7 0,29432 6,12

4 1,7 0,29432 6,12

5 1,5 0,2594 5,4

6 1,3 0,22448 4,68

IQ-2002-2-06

104

7 0,9 0,15464 3,24

24 0,5 0,0848 0,9

33 0,5 0,0848 0,9




[h] [µmol/tubo] [nm] [gr/L]

0 1,5 0,2594 5,4

1 1,8 0,31178 6,48

2 1,7 0,29432 6,12

3 1,7 0,29432 6,12

4 1,6 0,27686 5,76

5 1,5 0,2594 5,4

6 1,4 0,24194 5,04

7 1,4 0,24194 5,04

24 0,8 0,13718 1,44

33 0,4 0,06734 0,72


4. Fermentación Fed-Batch con 1 Pulso de sustrato

Tiempo total Muestra Lectura Absorbancia Glucosa

Fermentación [h] [µmol/tubo] [nm] [gr/L]

13 0 3 0,5182 10,8

14 1 2,5 0,4389 9

15 2 2,6 0,4093 9,36

16 3 2,4 0,4074 8,64

17 4 1,2 0,2089 4,32

18 5 0,9 0,1626 3,24

19 6 0,1 0,0199 0,36

IQ-2002-2-06

105

20 7 0,1 0,0152 0,36

21 8 0 0,0325 0

22 9 0 0,030 0

38 24 0 0,0236 0

42 28 0 0,0286 0

46 33 0 0,0388 0

62 49 0 0,0390 0

F 12 0 0,0011 0

Tabla 42. Consumo de glucosa Fed-Batch Pulso 1

5. Fermentación Fed-Batch con 1 Pulso de sustrato (repetición)

Tiempo total Muestra Lectura Absorbancia Glucosa

Fermentación [h] [µmol/tubo] [nm] [gr/L]

13 0 3,7 0,6366 13,32

14 1 3,5 0,6019 12,6

15 2 3,2 0,56487 11,52

16 3 2,5 0,4325 9

17 4 1,2 0,2082 4,32

18 5 0,3 0,0483 1,08

19 6 0 0,0008 0

20 7 0 0,0023 0

21 8 0 0,005 0

38 24 0 0,0013 0

42 28 0 0,0005 0

46 33 0 0,0011 0

62 48 0 0,039 0

F 13 0 0,0005 0

Tabla 43. Consumo de glucosa Fed-Batch Pulso 1R

IQ-2002-2-06

106

6. Fermentación Fed-Batch con 2 Pulsos de sustrato

Tiempo total Muestra Lectura Absorbancia Glucosa Corrección Vol = 4.3 L

Fermentación [h] [µmol/tubo] [nm] [gr/L] [gr/L]

26 0 5,2 0,9032 18,72 24,39

27 1 5,1 0,8873 18,36 23,92

28 2 3,7 0,6372 13,32 17,36

29 3 2,1 0,3630 7,56 9,85

30 4 0,2 0,0266 0,72 0,94

31 5 0,1 0,0173 0,36 0,47

32 6 0,1 0,0079 0,36 0,47

33 7 0,1 0,0093 0,36 0,47

50 24 0,1 0,0210 0,36 0,47

54 28 0,0 0,0022 0 0,00

58 32 0,0 0,0110 0 0,00

74 48 0,0 0,0098 0 0,00

10 F1 0,3 0,0491 1,08 0,00

24 F2 0,1 0,0095 0,36 0,00


7. Fermentación Fed-Batch con 2 Pulsos de sustrato (repetición)



26 0 4,4 0,7629 15,84 23,04

27 1 3,5 0,6117 12,6 18,33

28 2 2,5 0,4263 9,0 13,09

29 3 0,8 0,1452 2,88 4,19

30 4 0,1 0,1451 0,36 0,52

31 5 0,1 0,0062 0,36 0,52

IQ-2002-2-06

107

32 6 0,1 0,0078 0,36 0,52

33 7 0 0,0055 0 0,00

34 8 0 0,0054 0 0,00

50 24 0 0,0024 0 0,00

55 29 0 0,0048 0 0,00

59 33 0 0,0001 0 0,00

74 48 0 0,0001 0 0,00

11 F1 0 0,0005 0 0,00

26 F2 0 0,001 0 0,00

Tabla 45. Consumo de glucosa Fed-Batch Pulso 2R




37 0 4,6 0,7985 16,56 24,09

38 1 4 0,7008 14,4 20,95

39 2 3,7 0,6513 13,32 19,37

40 4 2,8 0,4835 10,08 14,66

41 5 2,1 0,3609 7,56 11,00

42 6 0,9 0,1475 3,24 4,71

43 7 0,1 0,01 0,36 0,52

44 8 0,1 0,0111 0,36 0,52

60 24 0 0,003 0 0,00

64 28 0 0,001 0 0,00

68 32 0 0,02 0 0,00

84 48 0 0,0019 0 0,00

10 F1 0 0,0014 0 0,00

24 F2 0 0,0013 0 0,00

39 F3 0 0,005 0 0,00


IQ-2002-2-06

108

Anexo E

Datos de Biomasa


MuestraPeso inicial Peso final

Peso

Biomasa Promedio PromedioCodificación

[h] [gr] [gr] [gr] 1mL L

1 1 0,8959 0,8965 0,0006 0,00055 0,55

2 1 0,9402 0,9407 0,0005

3 2 0,9003 0,9007 0,0004 0,0004 0,4

4 2 0,9033 0,9037 0,0004

5 3 0,8998 0,9002 0,0004 0,0006 0,6

11 3 0,9274 0,9282 0,0008

12 4 0,9302 0,9310 0,0008 0,0009 0,9

13 4 0,9036 0,9046 0,0010

14 5 0,8941 0,8955 0,0014 0,00125 1,25

15 5 0,9035 0,9046 0,0011

21 6 0,9057 0,9073 0,0016 0,0014 1,4

22 6 0,9013 0,9025 0,0012

23 7 0,9316 0,9336 0,0020 0,0016 1,6

24 7 0,8975 0,8987 0,0012

25 24 0,9285 0,9325 0,0040 0,0042 4,2

31 24 0,9302 0,9346 0,0044

32 33 0,9026 0,9069 0,0043 0,00415 4,15

33 33 0,9246 0,9286 0,0040

Tabla 47. Cuantificación de Biomasa Batch 1

IQ-2002-2-06

109



Peso


[h] [gr] [gr] [gr] 1 mL L

0 0 0,9033 0,904 0,0007 0,00055 0,55

0 0 0,9006 0,901 0,0004

1 1 0,9022 0,9028 0,0006 0,00055 0,55

2 1 0,8978 0,8983 0,0005

3 2 0,8971 0,8978 0,0007 0,0006 0,6

4 2 0,9318 0,9323 0,0005

5 3 0,926 0,9268 0,0008 0,00075 0,75

11 3 0,9405 0,9412 0,0007

12 4 0,9032 0,9038 0,0006 0,00085 0,85

13 4 0,9023 0,9034 0,0011

14 5 0,899 0,9001 0,0011 0,00095 0,95

15 5 0,9044 0,9052 0,0008

21 6 0,9005 0,9016 0,0011 0,00115 1,15

22 6 0,9036 0,9048 0,0012

23 7 0,9278 0,9291 0,0013 0,00125 1,25

24 7 0,8997 0,9009 0,0012

25 24 0,9288 0,9322 0,0034 0,0036 3,6

31 24 0,9326 0,9364 0,0038

32 33 0,9344 0,9378 0,0034 0,00345 3,45

33 33 0,8983 0,9018 0,0035


IQ-2002-2-06

110



Peso


[h] [gr] [gr] [gr] 1 mL L

0 0 0,9282 0,9284 0,0002 0,00035 0,35

0 0 0,8956 0,8961 0,0005

1 1 0,9247 0,9262 0,0015 0,0006 0,6

2 1 0,9287 0,9293 0,0006

3 2 0,8959 0,8962 0,0003 0,00055 0,55

4 2 0,9042 0,905 0,0008

5 3 0,8955 0,8963 0,0008 0,00095 0,95

11 3 0,928 0,9291 0,0011

12 4 0,8961 0,8973 0,0012 0,00115 1,15

13 4 0,8963 0,8974 0,0011

14 5 0,8955 0,8963 0,0008 0,0008 0,8

15 5 0,9307 0,9315 0,0008

21 6 0,9338 0,9345 0,0007 0,0014 1,4

22 6 0,9274 0,9288 0,0014

23 7 0,9412 0,9427 0,0015 0,0015 1,5

24 7 0,8975 0,8983 0,0008

25 24 0,9005 0,9024 0,0019 0,00205 2,05

31 24 0,9315 0,9337 0,0022

32 33 0,8973 0,9003 0,003 0,003 3

33 33 0,906 0,909 0,003


IQ-2002-2-06

111

4. Fermentación Fed-Batch con 1 Pulso de sustrato


Peso



1 0 0,8956 0,8966 0,0010 0,00105 1,05

2 0 0,9035 0,9046 0,0011

3 1 0,8987 0,8994 0,0007 0,00085 0,85

4 1 0,8957 0,8967 0,0010

11 2 0,9037 0,9048 0,0011 0,0011 1,1

12 2 0,9002 0,9013 0,0011

13 3 0,8949 0,8961 0,0012 0,00115 1,15

14 3 0,8958 0,8969 0,0011

21 4 0,9 0,9018 0,0018 0,0018 1,8

22 4 0,9066 0,9084 0,0018

23 5 0,8946 0,896 0,0014 0,0014 1,4

24 5 0,8955 0,8969 0,0014

31 6 0,9007 0,9028 0,0021 0,0021 2,1

32 6 0,9302 0,9323 0,0021

33 7 0,9014 0,9041 0,0027 0,00275 2,75

34 7 0,9307 0,9335 0,0028

41 8 0,9325 0,9376 0,0051 0,0047 4,7

42 8 0,9301 0,9344 0,0043

43 9 0,9268 0,9311 0,0043 0,00435 4,35

44 9 0,9029 0,9073 0,0044

51 24 0,9334 0,9366 0,0032 0,00305 3,05

52 24 0,8929 0,8958 0,0029

53 28 0,9 0,9033 0,0033 0,00325 3,25

54 28 0,9017 0,9049 0,0032

61 33 0,9024 0,9074 0,0050 0,0056 5,6

62 33 0,9043 0,9095 0,0052

63 49 0,8982 0,9042 0,0060 0,0062 6,2

64 49 0,9261 0,9325 0,0064

IQ-2002-2-06

112

71 F 0,9007 0,9007 0,0000 0 0

72 F 0,8967 0,8967 0,0000

Tabla 50. Cuantificación de Biomasa Fed-Batch Pulso 1

5. Fermentación Fed-Batch con 1 Pulso de sustrato (repetición)


Peso



1 0 0,9299 0,9335 0,0036 0,0035 3,5

2 0 0,9025 0,9059 0,0034

3 1 0,8974 0,9011 0,0037 0,0037 3,7

4 1 0,9310 0,9347 0,0037

11 2 0,8931 0,897 0,0039 0,0039 3,9

12 2 0,9064 0,9103 0,0039

13 3 0,9020 0,9051 0,0031 0,0031 3,1

14 3 0,9001 0,9032 0,0031

21 4 0,9015 0,9047 0,0032 0,00305 3,05

22 4 0,8934 0,8963 0,0029

23 5 0,9001 0,9034 0,0033 0,0033 3,3

24 5 0,8959 0,8992 0,0033

31 6 0,9060 0,9099 0,0039 0,0038 3,8

32 6 0,8949 0,8986 0,0037

33 7 0,9065 0,9105 0,0040 0,00405 4,05

34 7 0,9286 0,9327 0,0041

41 8 0,8961 0,9006 0,0045 0,00455 4,55

42 8 0,8998 0,9044 0,0046

51 24 0,9278 0,9334 0,0056 0,00535 5,35

52 24 0,9270 0,9321 0,0051

53 28 0,9299 0,9363 0,0064 0,0068 6,8

54 28 0,8990 0,9062 0,0072

61 33 0,9282 0,9354 0,0072 0,008 8

IQ-2002-2-06

113

62 33 0,9036 0,9112 0,0076

63 48 0,9013 0,9097 0,0084 0,00835 8,35

64 48 0,8928 0,9011 0,0083

F 71 0,906 0,906 0,0000 0 0

F 72 0,9073 0,9073 0,0000 0 0

Tabla 51. Cuantificación de Biomasa Fed-Batch Pulso 1 R


Muestra

Peso

inicial

Peso

final

Peso

Biomasa Promedio Promedio Corrección Vol = 4.3 LCodificación

[h] [gr] [gr] [gr] 1mL gr/L gr/L

1 0 0,9016 0,9040 0,0024 0,00235 2,35 3,06

2 0 0,9061 0,9084 0,0023

3 1 0,9328 0,935 0,0022 0,00235 2,35 3,06

4 1 0,9032 0,9057 0,0025

11 2 0,8959 0,8982 0,0023 0,00245 2,45 3,19

12 2 0,9033 0,9059 0,0026

13 3 0,9268 0,9295 0,0027 0,00275 2,75 3,58

14 3 0,8961 0,8989 0,0028

21 4 0,9061 0,9094 0,0033 0,00335 3,35 4,37

22 4 0,8957 0,8991 0,0034

23 5 0,9023 0,9058 0,0035 0,00365 3,65 4,76

24 5 0,9341 0,9379 0,0038

31 6 0,8999 0,9026 0,0027 0,00275 2,75 3,58

32 6 0,9070 0,9098 0,0028

33 7 0,9349 0,9374 0,0025 0,00225 2,25 2,93

34 7 0,9014 0,9034 0,0020

41 24 0,9328 0,9360 0,0032 0,0033 3,3 4,30

42 24 0,9028 0,9062 0,0034

43 28 0,8950 0,8980 0,0030 0,0029 2,9 3,78

IQ-2002-2-06

114

44 28 0,8973 0,9001 0,0028

51 32 0,9034 0,9051 0,0017 0,00165 1,65 2,15

52 32 0,9015 0,9031 0,0016

53 48 0,9008 0,9036 0,0028 0,0026 2,6 3,39

54 48 0,8979 0,9003 0,0024

71 F1 0,9399 0,9401 0,0002 0,0002 0,2 0,26

72 F2 0,8951 0,8954 0,0003 0,0003 0,3 0,39


7. Fermentación Fed-Batch con 2 Pulsos de sustrato (repetición)

Muestra

Peso

Inicial

Peso

Final

Peso

Biomasa Promedio Promedio Corrección Vol = 4.8 LCodificación

[h] [gr] [gr] [gr] 1mL L [gr/L]

1 0 0,9063 0,9105 0,0042 0,00415 4,15 6,04

2 0 0,8974 0,9015 0,0041

3 1 0,9011 0,9052 0,0041 0,00425 4,25 6,18

4 1 0,8956 0,9000 0,0044

11 2 0,8997 0,9041 0,0044 0,00445 4,45 6,47

12 2 0,9065 0,911 0,0045

13 3 0,9027 0,9069 0,0042 0,0044 4,4 6,40

14 3 0,9305 0,9351 0,0046

21 4 0,9032 0,9073 0,0041 0,00455 4,55 6,62

22 4 0,8990 0,9040 0,0050

23 5 0,898 0,9028 0,0048 0,00475 4,75 6,91

24 5 0,8953 0,9000 0,0047

31 6 0,8955 0,9000 0,0045 0,00505 5,05 7,35

32 6 0,9020 0,9076 0,0056

33 7 0,9281 0,9328 0,0047 0,00515 5,15 7,49

34 7 0,9415 0,9471 0,0056

41 8 0,9029 0,9081 0,0052 0,00525 5,25 7,64

IQ-2002-2-06

115

42 8 0,9031 0,9084 0,0053

51 24 0,9008 0,9069 0,0061 0,00565 5,65 8,22

52 24 0,8988 0,9040 0,0052

53 29 0,903 0,9098 0,0068 0,00625 6,25 9,09

54 29 0,9408 0,9465 0,0057

61 33 0,9272 0,9331 0,0059 0,00715 7,15 10,40

62 33 0,9021 0,9105 0,0084

63 48 0,9345 0,9444 0,0099 0,0108 10,8 15,71

64 48 0,8951 0,9068 0,0117

F1 71 0,8976 0,8978 0,0002 0,0002 0,2 0,29

F2 72 0,9346 0,9349 0,0003 0,0003 0,3 0,44

Tabla 53. Cuantificación de Biomasa Fed-Batch Pulso 2R


Muestra

Peso

inicial

Peso

final

Peso

Biomasa Promedio Promedio Correccion Vol = 4.8 LCodificación

[h] [gr] [gr] [gr] 1mL gr/L gr/L

1 0 0,8985 0,9025 0,004 0,00425 4,25 6,18

2 0 0,8989 0,9034 0,0045

3 1 0,9258 0,9305 0,0047 0,0048 4,8 6,98

4 1 0,9325 0,9374 0,0049

11 2 0,9013 0,9066 0,0053 0,00555 5,55 8,07

12 2 0,8956 0,9014 0,0058

13 4 0,9002 0,9062 0,006 0,006 6 8,73

14 4 0,9015 0,9075 0,006

21 5 0,9292 0,9359 0,0067 0,0075 7,5 10,91

22 5 0,8984 0,9067 0,0083

23 6 0,8998 0,9093 0,0095 0,00885 8,85 12,87

24 6 0,8992 0,9074 0,0082

IQ-2002-2-06

116

31 7 0,9000 0,9092 0,0092 0,0093 9,3 13,53

32 7 0,9034 0,9128 0,0094

33 8 0,8976 0,9074 0,0098 0,00965 9,65 14,04

34 8 0,8954 0,9049 0,0095

41 24 0,9024 0,9112 0,0088 0,00875 8,75 12,73

42 24 0,9287 0,9374 0,0087

43 28 0,9305 0,9397 0,0092 0,0102 10,2 14,84

44 28 0,8976 0,9088 0,0112

51 32 0,9000 0,9101 0,0101 0,0105 10,5 15,27

52 32 0,9327 0,9436 0,0109

53 48 0,9412 0,9536 0,0124 0,01185 11,85 17,24

54 48 0,9070 0,9183 0,0113

71 F1 0,9012 0,9018 0,0006 0,0006 0,6 0,87

72 F1 0,9328 0,9334 0,0006

73 F2 0,8979 0,8987 0,0008 0,00075 0,75 1,09

71 F2 0,9034 0,9041 0,0007

72 F3 0,9289 0,9307 0,0018 0,00175 1,75 2,55

73 F3 0,8979 0,8996 0,0017


IQ-2002-2-06

117

Anexo F

Grafica comparativa de Biomasa Total

1. Fermentaciones Batch

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

0 3 6 9 12 15 18 21 24Tiempo [h]

Bio

mas

a [g

r/L

]

Batch 1

Batch 2

Batch 3

Figura 22. Grafica Cuantificación de Biomasa Fermentaciones Batch

2. Fermentaciones Fed-Batch con 1 pulso de sustrato

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Tiempo [h]

Bio

mas

a [g

r/L

]

Pulso 1

Pulso 1 R

Figura 23. Grafica Cuantificación de Biomasa Fermentaciones Fed-Batch Pulso 1

IQ-2002-2-06

118

3. Fermentaciones Fed-Batch con 2 pulsos de sustrato

0,002,004,006,008,00

10,0012,0014,0016,0018,00

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Tiempo [h]

Bio

mas

a [g

r/L

]

Pulso 2

Pulso 2 R


4. Fermentaciones Fed-Batch con 3 pulsos de sustrato

0,00

3,00

6,00

9,00

12,00

15,00

18,00

21,00

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Tiem po [h]

Bio

mas

a [g

r/L

]

Pulso 3


IQ-2002-2-06

119

Anexo G

Datos Esporulación


Dilución

Muestra1x10-4 1x10-5 1x10-6

7 5 0 0 0 0 0 0 0 0

24 3 6 7 0 4 2 0 0 0

33 I 0 0 I 0 0 60 0 0

Tabla 55. Datos Esporulación Batch 1

Dilución

Muestra1x10-4 1x10-5 1x10-6

7 5 0 0

24 5.33 3 0

33 I I 60

Tabla 56. Promedio Esporulación Batch 1

IQ-2002-2-06

120


Dilución

Muestra1x10-4 1x10-5 1x10-6

7 5 1 3 2 0 0 0 0 0

24 14 5 9 10 5 5 0 1 0

33 I I I 35 I I 7 82 64

Tabla 57. Datos Esporulación Batch 2

Dilución

Muestra1x10-4 1x10-5 1x10-6

7 9 2 0

24 9.33 6.66 1

33 I I 82

Tabla 58 Promedio Esporulación Batch 2

IQ-2002-2-06

121


Dilución

Muestra1x10-4 1x10-5 1x10-6

7 0 0 0 0 0 0 0 0 0

24 30 8 0 10 12 0 0 1 2

33 I I I I I I 7 2 3

Tabla 59 Datos Esporulación Batch 3

Dilución

Muestra1x10-4 1x10-5 1x10-6

7 0 0 0

24 30 11 1.5

33 I I 7

Tabla 60. Promedio Esporulación Batch 3

IQ-2002-2-06

122

4. Fermentación Fed-Batch Pulso 1

Dilución

Muestra1x10-5 1x10-6 1x10-7

28 I 5 3 0 4 0 0 0 0

33 15 2 I 0 6 0 0 0 0

49 I I 30 2 I 15 3 0 0

Tabla 61 Datos Esporulación Fed- Batch pulso 1

Dilución

Muestra1x10-5 1x10-6 1x10-7

28 4 4 0

33 15 6 0

49 I 15 3

Tabla 62 Promedio Esporulación Fed- Batch pulso 1

IQ-2002-2-06

123

5. Fermentación Fed-Batch Pulso 1 Repetición

Dilución

Muestra1x10-5 1x10-6 1x10-7

28 1 0 0 0 0 0 0 0 0

33 18 I 0 0 2 2 7 0 1

42 I I 10 0 8 5 9 13 8

Tabla 63. Datos Esporulación Fed- Batch pulso 1R

Dilución

Muestra1x10-5 1x10-6 1x10-7

28 1 0 0

33 I 2 7

42 I 6.5 10

Tabla 64. Promedio Esporulación Fed- Batch pulso 1R

IQ-2002-2-06

124


Dilución

Muestra1x10-5 1x10-6 1x10-7

28 0 0 0 0 0 0 0 0 0

32 0 0 0 0 0 0 0 0 0

42 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Tabla 65. Datos Esporulación Fed- Batch pulso 2

Dilución

Muestra1x10-5 1x10-6 1x10-7

28 0 0 0

32 0 0 0

42 0 0 0

Tabla 66. Promedio Esporulación Fed- Batch pulso 2

IQ-2002-2-06

125

7. Fermentación Fed-Batch Pulso 2 Repetición

Dilución

Muestra1x10-5 1x10-6 1x10-7

29 0 0 7 0 0 1 2 0 1

33 I I 0 0 5 12 11 2 7

48 I I I 10 30 12 29 25 20

Tabla 67. Datos Esporulación Fed- Batch pulso 2 R

Dilución

Muestra1x10-5 1x10-6 1x10-7

29 7 1 1.5

33 I 8.5 9

48 I 17.33 25

Tabla 68. Promedio Esporulación Fed- Batch pulso 2 R

IQ-2002-2-06

126


Dilución

Muestra1x10-5 1x10-6 1x10-7

28 0 0 0 1 0 0 0 0 0

38 4 0 10 2 1 0 0 0 0

42 I 0 15 0 3 8 1 0 0

Tabla 69. Datos Esporulación Fed- Batch pulso 3

Dilución

Muestra1x10-5 1x10-6 1x10-7

42 15 5.5 1

38 30 11 1.5

42 I I 7

Tabla 70. Promedio Esporulación Fed- Batch pulso 3

IQ-2002-2-06

127

IQ-2002-2-06

128

Anexo H

Desempeño de la membrana

Procesos de filtración Volumen Tiempo Flujo Flux Presión

Agua [mL] [min] [mL/min] [mL/min*m2] [psi]

Bomba Muestra 1 3,30 1,00 3,30 4,40 3,37

Peristáltica Muestra 2 3,50 1,00 3,50 4,67 3,37

Pequeña Muestra 3 3,40 1,00 3,40 4,53 3,37

Promedio 3,40 1,00 3,4 4,53 3,37

Desviación Estándar 0,1 0 0,1 0,13 0,00

Bomba Muestra 1 500,00 2,10 238,10 317,46 3,37

Peristáltica Muestra 2 500,00 2,29 218,34 291,12 3,37

Grande Muestra 3 500,00 2,21 226,24 301,66 3,37

Promedio 500,00 2,20 227,56 303,41 3,37

Desviación Estándar 0,00 0,10 9,94 13,26 0,00

Tabla 69. Datos filtración agua

IQ-2002-2-06

129

Procesos de filtración Volumen Tiempo Flujo Flux Presión

Cultivo [mL] [min] [mL/min] [mL/min*m2] [psi]

1A 250 51,93 4,81 6,42 3,37Filtración 1

1B 250 60,28 4,15 5,53 3,37

1A 500 48,58 10,30 13,73 3,37

1B 500 56,57 8,84 11,79 3,37

2A 500 50,61 9,88 13,17 3,37

Filtracion 2

2B 500 52,06 9,60 12,80 3,37

1A 500 37,61 13,29 17,73 3,37

1B 500 64,59 7,74 10,32 3,37

2A 500 54,69 9,15 12,20 3,37

Filtración 3

2B 500 71,56 6,99 9,32 3,37

1A 500 44,58 11,22 14,96 3,37

1B 500 51,26 9,76 13,01 3,37

2A 500 41,07 12,17 16,23 3,37

Filtración 4

2B 500 58,47 8,56 11,41 3,37

1A 500 48,36 10,34 13,79 3,37

1B 500 53,49 9,35 12,46 3,37

2A 500 59,08 8,46 11,28 3,37

Filtración 5

2B 500 65,47 7,64 10,18 3,37

1A 500 5,12 97,66 130,21 3,37

1B 500 5,41 92,42 123,23 3,37

2A 500 6,19 80,78 107,70 3,37

Filtración 6

2B 500 6,51 76,80 102,41 3,37

1A 500 5 100,00 133,33 3,37

1B 500 4,32 115,74 154,32 3,37

2A 500 5,08 98,43 131,23 4,42

Filtración 7

2B 500 7,15 69,93 93,24 4,42

1A 500 4,05 123,46 164,61 3,37

1B 500 7 71,43 95,24 3,37

2A 500 6,54 76,45 101,94 4,42

Filtración 8

2B 500 9,5 52,63 70,18 4,42

1A 500 4,1 121,95 162,60 3,37

1B 500 5,7 87,72 116,96 3,37

2A 500 9,15 54,64 72,86 4,42

2B 500 15,57 32,11 42,82 4,42

3A 500 24,52 20,39 26,81 5,91

Filtración 9

3B 500 60 8,33 11,11 5,91

Tabla 70. Datos filtración cultivo

IQ-2002-2-06

130

Anexo I

Descripción del Biorreactor

1. Descripción del equipo

Bioflo 3000 es un reactor versátil que provee un equipo completo para procesos de

fermentación y sistema de cultivo en un solo paquete. Se puede utilizar para cultivos Batch

o cultivos continuos con un microprocesador de control para pH, DO2, agitación,

temperatura, bombas de alimentación, antiespumante y nivel del tanque.

2. Descripción de vaso

El vaso esta diseñado para trabajar volúmenes de 1.25 a 5.0 Litros, consiste en una tapa de

acero inoxidable, el recipiente esta hecho en vidrio. La tapa superior esta enchaquetada para

la recirculación a temperatura controlada. El recipiente esta provisto de 4 puertos hechos en

polipropileno en la pared del recipiente en vidrio para la adición de antiespumante y

nutrientes; y para estudios en continuo, en la tapa hay puertos de entrada para: la

inoculación, adición de ácido y base, detección de temperatura, probeta para antiespumante,

para el difusor, saca muestras, condensador, oxigeno disuelto y electrodo de pH.

IQ-2002-2-06

131

3. Sistema de agitación

Posee un motor removible de corriente directa localizado en la parte de arriba del reactor,

este esta conectado al sistema de agitación con un acople (multi-jaw). Puede ser

desconectado mientras se esta auto clavando y remplazado después de la esterilización. El

motor provee un rango de agitación de 50 hasta 1200 rpm.

4. Control de temperatura:

La temperatura del cultivo se puede seleccionar entre un rango de –5ºC hasta 80ºC (±0.1ºC)

y es controlado mediante un microprocesador basado en un controlador. El sensor de

temperatura es RTD (Resístanse Temperature Detector) sumergido en la termocupla.

5. Aeración

El aire y el oxigeno se pueden introducir al medio mediante el difusor de anillo con

agujeros y la taza de flujo es controlado mediante una válvula de aguja localizada en la

parte derecha de la cabina del controlador.

El porcentaje de oxigeno es introducido en el medio y se puede determinar manualmente

por el usuario, para cultivos de alta densidad, se puede aplicar hasta el 100 % de oxigeno.

6. Control de pH

IQ-2002-2-06

132

El pH es controlado en un rango de 2.00-12.00 (±0.001). El sensor de pH tiene un electrodo

de vidrio. El controlador se lleva a cabo mediante un controlador (PID), el cual opera con

dos bombas peristálticas conectados a los dos puertos para el ácido y la base.

7. Controlador de Oxigeno Disuelto

Para el control del oxigeno disuelto existen dos métodos, uno es mediante el flujo

automático de aire y el otro es mediante un flujo manual de aire. Este se puede controlar en

un rango de 5-95% (±1%). Si el oxigeno disuelto es sensado por el electrodo de oxigeno

disuelto y el control se mantiene mediante un regulador PID, el cual puede cambiar con la

velocidad de agitación y el porcentaje de oxigeno en el flujo de aire.

8. Control de antiespumante

La espuma es controlada durante las fermentaciones Batch mediante una probeta de

antiespumante, la cual esta localizada en el plato superior. El controlador opera en la

adición del antiespumante mediante una bomba la cual adiciona antiespumante químico

dentro del vaso.

9. Sistema de salida de gases

IQ-2002-2-06

133

Los gases de salida pasan por un condensador externo el cual remueve l humedad y luego

son recirculados al tanque. El aire sobrante pasa por un filtro de 2 µm.

10. Sistema de muestreo

Sistema I

Este sistema tiene un dispositivo el cual esta adherido a tubo de muestra hasta la parte mas

baja del vaso. Este dispositivo esta provisto de una bomba (pera de caucho) de succión el

cual facilita la recolección de muestra sin contaminar.

Sistema II

Este sistema consiste en una línea e muestreo conectada a una bomba peristáltica, el cual

puede ser operarse desde la bomba modelo de operación.

IQ-2002-2-06

134

Especificaciones

Volumen Total 6.6 LitrosVaso

Volumen de Trabajo 5 Litros

Indicación Tablero Digital en unidades de 0.1ºC

Rango 4ºC hasta 80ºC (±0.1ºC)

Control PID con calentador PWM y agua de

enfriamiento

Temperatura

Sensor RTD de platino

Tipo Motor DC permanente

Rango 50-1200 rpm

Sensor disco óptico fotoplástico 1000 lineas/rev

Control Microprocesador PID

Impelers 6 impulsores de aspas de turbinas

Agitación

Indicación Tablero Digital en unidades de 1 rpm

Filtro 2 µm cartucho intercambiableCondensador

Condensador Acero inoxidable localizado en plato superior

Sistema 2-Gas Aire-O2 distribuido en el difusor

Flujometro 0-10 SLPM Flujometro de masa

Difusor Difusor de anilloAireación

Filtro Interno 2 µm cartucho intercambiable

Indicación Tablero Digital en unidades de 0.01 pH

Rango 2-12 pH

Control PIDpH

Probeta pH Ingold

Indicación Tablero Digital en unidades de 0.1%

Rango 0-200 %

Probeta Ingold Polarogrico

Oxigeno

disuelto

Control PID

Voltaje Universal 240-1000V

IQ-2002-2-06

135

Tabla 71. Especificaciones del Biorreactor

Figura 26. Partes del Biorreactor

IQ-2002-2-06

136

Partes del Reactor

Numeración Descripción

1 4 Puertos de proceso en Polipropileno

2 Vaso en Vidrio

3 Tubo ajustable de alimentación

4 Entra y salida de agua

5 Conectores

6 Chaqueta hemisférica de agua en Acero Inox.

7 Difusor en forma de disco

8 4 Bafles

9 Impellers

10 Puertos para el control de pH

11 Motor

Tabla 72 Partes del Biorreactor

Anexo J

IQ-2002-2-06

137

Membrana de flujo tangencial

IQ-2002-2-06

138

IQ-2002-2-06

139

IQ-2002-2-06

140

Anexo K

Descripción Bomba Peristáltica

1. Descripción del equipo

La bomba de velocidad variable MANOSTAT permiten el bombeo continuo de fluidos

mientras la corriente esta conectada. Las bombas de 115 V están homologadas por UL y

cUL. La gama de velocidad de las bombas para el modelo es de 24-720 rpm.

Modelo No: 72-310-000

Descripción: SIMON potenciómetro de velocidad analógico, 115V.

2. Controles

a. Interruptor de Alimentación: (encendido o apagado), Enciende o apaga la unidad,

tiene un brillo verde cuando la corriente esta encendida.

b. Perilla de control de velocidad de flujo: Fija la velocidad de la bomba. Cuando

mayor sea el numero seleccionado, mayor será la velocidad de la bomba.

c. Interruptor de sentido de flujo: Fija el sentido de giro de la bomba hacia la

derecha/apagada/hacia la izquierda.

IQ-2002-2-06

141

Figura 27. Partes bomba peristáltica

Especificaciones

Velocidad 24-720 rpmSalida

Par 8.6 Kg*cm

Entrada Voltaje 100-130 VCA, 60 Hz, 1.3 A

Temp. De operación 0 a 40ºC

Temp. De Almacenamiento -45 a 65ºC

Humedad 10% a 90% sin condensación

Altitud Menos de 2000 m

Ambiente

Nivel de contaminación Nivel 2 según IEC 664

Dimensiones (LxAxH) 30.5 cm x 22.9 cm x 15.2 cm

Peso 6.8 Kg

Color NegroConstrucción

Material Caja de acero pintada

Tabla 73. Especificaciones Bomba peristáltica

IQ-2002-2-06

142

Anexo L

Procedimiento de limpieza para la Membrana de filtración

Agua destilada y autoclavada

Hipoclorito 2 ppm


NaOH 0.1 N en 1 L de Agua


Formaldehído 1 % N


Recircular por30 min

Paradestapar

Hasta unpH neutro

Mínimo 1noche

Paradesinfectar

Figura 28. Procedimiento de limpieza para la membrana

IQ-2002-2-06

143

Anexo M

Equipos

Figura 29. Horno

Figura 31. Centrifuga para epphendors

Figura 30. Cámara de flujo laminar

Figura 32. Balanza de Precisión

IQ-2002-2-06

144

Figura 33. Desecador

Figura 35.Bomba peristáltica

Figura 34. Equipo Electroforesis.

Figura 35. Espectrofotómeto

IQ-2002-2-06

128

producciÓn de bacillus thuringiensis subesp kurstaki

Documents