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PROCEDIMENTO OPERACIONAL
PADRÃO
POP LAB MIC - 015
I - CONTROLE HISTÓRICO
REVISÃO DATA Nº PÁGINAS HISTÓRICO
ALTERAÇÃO ELABORAÇÃO VERIFICAÇÃO APROVAÇÃO
00 15/01/2018 Página 1 de 15 Emissão
inicial Shinfay M. Liu Lourdes Pereira
Ana Marina Campas de Faria
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Campas de Faria
ASSINATURA E CARIMBO 1
TÍTULO: REALIZAR A PESQUISA DIRETA DE FUNGOS
1. Introdução
A observação de um fungo na amostra biológica tem grande valor diagnóstico, pois
demonstra a invasão do fungo no tecido e permite uma informação imediata ao médico, a
qual pode ser crucial para determinar a terapia apropriada ao paciente. No entanto, se a
quantidade da amostra biológica for insuficiente para o exame microscópico e cultura do
material, a cultura, na maioria das amostras, tem prioridade sobre o exame microscópico,
já que é método mais específico e em muitos casos, mais sensível. O exame microscópico
da amostra é realizado por várias técnicas, dependendo do tipo da amostra e suspeita
clínica.
A pesquisa direta para fungos é direcionada aos dermatófitos, implicados nas micoses
superficiais, bem como aos agentes causadores das micoses profundas.
2. Objetivo
Este procedimento Operacional Padrão foi elaborado pela Seção de Microbiologia e tem
como produto final a realização de pesquisas de fungos.
3. Campos de aplicação
Setor Microbiologia
4. Referências normativas
Resolução nº302, de 13 de outubro de 2005: Dispõe sobre Regulamento Técnico para
funcionamento de Laboratórios Clínicos.
5. Responsabilidade/ competência
Médico Patologista: orientar, avaliar, realizar a pesquisa de fungos e liberar os exames.
Bioquímico: orientar, avaliar, realizar a pesquisa de fungos e liberar os exames.
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Ana Marina Campas de Faria
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ASSINATURA E CARIMBO 2
TÍTULO: REALIZAR A PESQUISA DIRETA DE FUNGOS
Biomédico: orientar, avaliar, realizar a pesquisa de fungos e liberar os exames.
Técnico em Patologia Clínica: realizar a pesquisa de fungos.
6. Definições
Não se aplica.
7. Conteúdo do padrão
7.1 Recursos necessários
Microscópio de campo claro
Microscópio UV
Lâminas e lamínulas
Placas de petri estéreis
KOH a 20%
Corantes de Gram
Corantes de May-Grünwald e Giemsa
Tinta da China
Calcoflúor White 0,1%
7.2 Principais passos
A. Mnemônico(s): FUPB
B. Sinonímia: Pesquisa direta de fungos, exame direto.
C. Princípio: Identificação dos agentes etiológicos de micoses superficiais e profundas em
espécimes clínicos.
D. Fase pré-analítica:
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ASSINATURA E CARIMBO 3
TÍTULO: REALIZAR A PESQUISA DIRETA DE FUNGOS
1. Amostra:
i. Coleta, transporte e armazenamento: vide Manual de Coleta Microbiológica.
ii. Tipos de amostras:
a. Pelos, cabelos, escamas de unha e pele: devem ser previamente aliquotadas
para exame microscópico e cultura. Para exame direto as amostras são
clarificadas com solução aquosa de KOH a 20%, enquanto a cultura requer
amostras sem nenhum tratamento prévio, sendo por isso, inoculadas
diretamente na superfície do meio de cultura.
b. Líquor, secreções e fluídos corporais (líquido pleural, líquido ascítico, líquido
sinovial, líquido pericárdico, aspirado traqueal, lavado gástrico e lavado
broncoalveolar [BAL e mini-BAL]): devem ser concentrados por centrifugação
(1500 a 2000 rpm por 10 minutos). Os materiais coletados com “swabs”
devem ser eluidos em solução salina estéril e centrifugados. O sedimento
obtido é o material adequado para o exame microscópico e semeadura em
meios de cultura.
c. Escarro: pode ser digerido com enzima (v/v) N-acetil-L-cisteina (250 mg de
enzima dissolvidas em 1 L de solução-tampão citrato ou solução fisiológica),
que fluidifica e facilita a manipulação da amostra e formação de sedimento
após centrifugação. Porém, não foi comprovado que esse tratamento melhore
a recuperação de fungos da amostra sendo, portanto, opcional. Pode-se
utilizar, como alternativa à digestão da amostra, a solução de KOH 20%. A
porção purulenta da amostra é preferível e porções liquefeitas não são
adequadas para isolamento do agente patogênico. A porção da amostra
tratada com KOH, porém, só pode ser usada para exame microscópico, pois
a potassa destrói, após algumas horas, as estruturas do fungo, inviabilizando
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ASSINATURA E CARIMBO 4
TÍTULO: REALIZAR A PESQUISA DIRETA DE FUNGOS
seu isolamento em meio de cultura. Neste caso, outra porção da amostra
deve ser centrifugada e o sedimento usado para cultura.
d. Tecidos obtidos por biópsia: requerem fragmentação, com o auxílio de uma
lâmina de bisturi estéril ou maceração (gânglio) com pistilo em almofariz
estéreis; a fragmentação com lâmina de bisturi pode ser feito dentro de uma
placa de Petri estéril. Esse procedimento visa aumentar a área de superfície e
expor o microrganismo ligado ao tecido com o meio de cultura.
e. Sangue e aspirado de medula óssea: não necessitam preparação, sendo que
o exame microscópico tem baixa sensibilidade e, portanto a cultura é
importante para identificação do agente. O sangue e os aspirados de medula
óssea não devem ser coletados em seringas ou tubos contendo EDTA, pois
esta substância se combina com elementos da parede dos fungos, diminuindo
a sensibilidade do exame. Os frascos de cultura automatizados geralmente
utilizam anticoagulantes a base de quelantes de íons, o que pode prejudicar o
crescimento de vários espécimes de fungos. O anticoagulante ideal é a
heparina.
E. Fase analítica:
1. Após conferência da amostra e recebimento do exame no sistema MV, colar uma
etiqueta no caderno de registro (dados brutos).
2. Procedimento das amostras:
i. Raspado de unhas, escamas epidérmicas e pelos:
a. Aplicar uma gota de KOH aquoso a 20% em uma lâmina de microscopia e
sobre esta, uma porção da amostra a ser examinada
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ASSINATURA E CARIMBO 5
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b. Cobrir a preparação com uma lamínula e examinar a preparação após 20
minutos em câmara úmida ao MO em campo claro, com objetiva de 10x e
40x, em busca de pseudohifas, hifas e leveduras.
ii. Amostras respiratórias (escarro, lavado broncoalveolar e aspirado traqueal ou
transtraqueal):
a. Dividir o material em alíquotas para exame direto, Gram e cultura;
b. Colocar uma porção da amostra em lâmina. Optar por porções do material
com aspecto purulento, caseoso, sanguinolento ou mucogelatinoso;
c. Para o lavado broncoalveolar, centrifugar 3 a 5 ml, em um tubo cônico,
graduado e com tampa. Centrifugar a 2000 rpm durante 10 minutos;
d. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento para homogeneizar o
material; usar esta parte do material para executar o exame. Colocar com a
alça de secreção (10 microlitros), uma porção da amostra em lâmina
e. Adicionar 1 a 2 gotas de KOH aquoso a 20%, misturar com a alça, cobrir com
lamínula. Examinar ao MO, em campo claro, com objetiva de 10x e 40x;
quando necessário, diminuir a luminosidade fechando o diafragma do
condensador;
f. Pesquisar a presença de pseudo-hifas e blastoconídeos (candidiase),
estruturas arredondas, gemulantes com cápsulas (criptococoses), hifas
septadas hialinas e conidióforo com vesícula e fiálides (aspergilose).
iii. Amostra de urina:
a. Centrifugar a urina por 10 min a 2000x rpm;
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00 15/01/2018 Página 6 de 15 Emissão
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ASSINATURA E CARIMBO 6
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b. Colocar uma alíquota do sedimento em um uma gota de KOH aquoso a 20%
c. Examinar ao MO em busca de principalmente pseudo-hifas e blastoconídeos
(candidiase) e outras estruturas fúngicas.
iv. Amostra de líquido cefalorraquidiano (LCR):
a. Centrifugar toda a amostra por 10 min a 2000x G em tubo cônico estéril;
b. Reservar o sobrenadante para exame sorológico em busca de antígenos ou
anticorpos, quando necessário;
c. Retirar uma gota do sedimento com uma alça descartável e corar com tinta da
China (nanquim);
d. Examinar entre lâmina e lamínula ao MO em busca de estruturas
arredondadas gemulantes com cápsulas (criptococoses), mas as outras
estruturas fúngicas devem ser anotadas se observadas;
e. Ressuspender o restante do sedimento e utiliza-lo para cultivo.
v. Amostra de biópsia:
A. Fragmentar inicialmente as amostras em pequenos fragmentos com ajuda de
uma lâmina de bisturi estéril, empregando uma pequena quantidade de
solução salina estéril;
B. Colocar entre lâmina e lamínula com KOH aquoso a 20% e Calcoflúo;
C. Acondicionar a lâmina dentro de uma placa de Petri com algodão umedecido
(câmara úmida);
D. Examinar o material após 15 ou 30 minutos;
E. Examinar entre lâmina e lamínula ao MO, em campo claro e fluorescência.
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ASSINATURA E CARIMBO 7
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vi. Amostra de medula óssea, sangue, aspirados, secreção cutânea e “inprints” de
tecidos obtidos por biópsia para coloração de Giemsa (ou ainda, de Leishman ou
Wright): usadas para pesquisa de Histoplasma capsulatum
a. Coletar a amostra por aspiração da medula óssea em um frasco estéril com
0,5 ml de heparina;
b. Realizar um esfregaço semelhante ao usado para coloração de Gram.
c. Fixar com metanol e corar segundo o método GIEMSA (vide POP LAB HEM
018 – Passo a passo no equipamento ABX Pentra 120 DF e DX-SPS, item 8
da Fase Analítica, subitem v. Módulo SPS – Corador de lâminas) da Seção de
Hematologia.
d. Examinar ao MO em busca de formas arredondadas leveduriformes
intracelulares (histoplasma).
3. Coloração de Gram:
i. Coloração ao método de Gram:
a. Todos os fungos são Gram- positivos, assim a utilização da coloração não
visa a diferenciação dos microrganismos, mas possibilita discriminar
elementos fúngicos de artefatos existentes em urina, secreções e fezes e
indicar a necessidade de outros métodos de coloração mais eficientes. O
Gram pode ser útil, ainda, para o exame de esfregaços contendo Candida sp.,
Malassezia sp. e Sporothrix spp. Além disso, ele pode demonstrar a presença
de filamentos de Nocardia e Actinomyces spp., agentes que produzem sinais
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ASSINATURA E CARIMBO 8
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clínicos que lembram infecções micóticas. Vide no “POP LAB MIC 005 –
Processar, Semear e Incubar as Amostras Biológicas” como preparar os
esfregaços e no “POP LAB MIC 012 – Realizar Bacterioscopia pelo Método
de Gram” como corar as lâminas.
b. Espalhar a amostra de forma homogênea em uma lâmina de microscopia
aplicando movimentos circulares, deixar secar e submeter à coloração de
Gram.
ii. Reportando os resultados:
c. Reportar como NEGATIVO ou POSITIVO. Nos casos positivos descrever os
principais aspectos morfológicos das estruturas fúngicas observadas ao
exame microscópico (figura 1) e os possíveis agentes etiológicos de acordo
com a amostra biológica (figuras 2 e 3).
Figura 1 – Estruturas microscópicas básicas de fungos
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Figura 2 - Interpretação de aspectos morfológicos encontrados em exames microscópicos de amostras biológicas
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Figura 3 - Sumário das micoses
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ASSINATURA E CARIMBO 12
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G. Controle da Qualidade (CIQ)
1. Controle Interno da Qualidade (CIQ)
Análise quinzenal realizada por Interobservadores (não cego).
Uma amostra é avaliada por 2 examinadores. Os resultados são comparados e a
análise crítica da reprodutibilidade, para validação dos testes, é realizada por um
profissional habilitado para tal. O resultado é anotado em planilha (vide anexo 2).
2. Controle Externo da Qualidade (CEQ)
O Controle Externo da Qualidade é realizado por meio do PELM (Proficiência em
Ensaios Laboratoriais) que é um programa de comparação interlaboratorial. São
realizadas análises em materiais desconhecidos, fornecidos pela empresa
Controllab, que simulam casos clínicos. As avaliações fornecidas pela Controllab
resultam de estudos estatísticos realizados entre os laboratórios participantes.
Anualmente são realizadas quatro rodadas de CEQ para o exame.
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ASSINATURA E CARIMBO 13
TÍTULO: REALIZAR A PESQUISA DIRETA DE FUNGOS
7.3 Cuidados especiais
Uso de EPI.
8. Siglas
EPI: Equipamento de Proteção Individual
MO: Microscópio Óptico.
Rpm: rotação por mínuto
9. Indicadores
Desempenho no controle externo da qualidade (CEQ).
Recoleta (geral, por material impróprio, para confirmação, por acidente e diversas).
10. Gerenciamento de riscos
Categoria de risco
Falhas potenciais geradoras de
riscos Evento
Ações de prevenção
Ações frente ao evento
Assistencial Desatenção Identificação
manual do
paciente/sequenci
a incorreta no
caderno de
registro (fase pré-
analítica)
Treinamento Verificar se exame já
liberado;
Refazer exame;
SNA
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ASSINATURA E CARIMBO 14
TÍTULO: REALIZAR A PESQUISA DIRETA DE FUNGOS
Ocupacional Desatenção;
Falta de estrutura
adequada para
armazenamento
(recipiente
inadequado)
Transporte
inadequado das
amostras
biológicas
Treinamento de
pessoal/
adequação do
meio de
transporte
SNA;
Processamento com
ressalva
Assistencial Desatenção Controle de
Qualidade
vencido/atrasado
Conferir
semanalmente
planilha de
registro de
controle de
Qualidade (CG)
Refazer exame após
CQ
Assistencial Falha técnica
Identificação
errada de lâminas
Treinamento
SNA (se necessário);
Refazer exame
Assistencial Desatenção Digitação do
resultado do
paciente
(mnemônicos)
incorreta no MV
Treinamento Verificar se exame já
liberado/comunicar
médico e/ou paciente;
Gerar registro da
intercorrência na
retificação de laudos /
MV
Assistencial Desatenção Não avaliação
crítica do
resultado
Treinamento
Verificar se exame já
liberado/comunicar
médico e/ou paciente
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Ana Marina Campas de Faria
ASSINATURA E CARIMBO 15
TÍTULO: REALIZAR A PESQUISA DIRETA DE FUNGOS
11. Referências
HENRY, J.B. Diagnósticos Clínicos e Tratamento por Métodos Laboratoriais. 21ª
edição, São Paulo: Manole, 2013.
KONEMAN, E. W. et al. Diagnóstico Microbiológico: texto e atlas colorido. 6ª edição,
Rio de Janeiro: Medsi, 2008.
OPLUSTIL, C. P. et al. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica. 3ª edição,
São Paulo: Sarvier, 2010.
Manual de Micologia Médica, Paulo Murillo Neufeld,1999;
Micologia Médica, Marcio Biasoli Control-lab 1ª EDIÇÃO – 1996.
Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção Relacionada à Assistência à Saúde.
Módulo 8: Detecção e identificação de fungos de importância médica /Agência
Nacional de Vigilância Sanitária. Brasília: Anvisa, 2013.
12. Anexos
Não se aplica.