Miha ŠABERL: Povzetek pomembnejših poglavij iz predmeta Osnove genetike in genomike – 2. del

1. STRUKTURA KROMOSOMA: iz dveh kromatid, telomere in centromere. truktura je odvisna od faze celice. Centromera je struktura, ki drži skupaj kromatidi na specifičnem mestu na kromosomu. To mesto je specifično za vsak kromosom. Telomera je terminalna regija kromosoma in sestavljena iz kopij istega motiva. Telomereaze so encimi, ki zaščitijo konce kromosomov (Cap čepica) pred nukleazami, preprečujejo združevanje koncev kromosomov, preprečujejo krajšanje kromosomov, saj jih podaljšujejo. Krajšanje telomer pomeni hitrejše staranje

2. DNA 'PAKIRANA' V KROMOSOMU: jedrna DNA je povezana s proteini (histoni) v kromatin (DNA-histonski kompleks), ki je zaščiten pred nukleazami. Linker histoni so vezani na vsak nukleosom (DNA okoli vsakega ovita 2x, sestavljen iz 8 histonskih molekul) in tvorijo kromatosom ter delujejo kot sponka. Preprečujejo, da bi se zavita DNA izvila s proteinskega jedra. Vse skupaj je spakirano v kromatinska vlakna, ki so skondenzirana do kromosoma.

3. KAJ JE KROMATIN? Kromatin je DNA-proteinski kompleks, v katerega je v celici močno zapakirana DNA. Je zelo dinamična oblika DNA, ki se prilagaja potrebam celice. Osnovna enota kromatina so nukleosomi, ki so organizirani v kromatinsko fibrilo. Najbolj kompaktna oblika je metafazni kromosom.Heterokromatin: temno obarvana področja kromatina, vidna pod el. mikroskopom. Predstavlja DNA z relativno kompaktno organizacijo. Konstituivni: stalna struktura celice, ki predstavlja DNA z malo ali brez genov, vedno v kompaktni obliki. Fakultativni: pojavlja se občasno, vsebuje gene, ki so inaktivni v nekaterih celicah ali v obdobju cel. cikla, ko so aktivni, pa so kompaktni. Evkromatin: deli DNA, ki so manj kompaktni in na katerih se nahajajo geni, do katerih je omogočen dostop ekspresijskih proteinov.

4. KAKO JE SESTAVLJEN GENOM EVKARIONTA? 20-30% geni (eksoni, introni, psevdogeni, regulatorni geni) 70-80% izvengenska DNA

70-80% nizko ponovljive sekvence 20-30% visoko in srednje ponovljive sekvence

o ponovljive v skupinah – tandemsko ponavljajoča (60 %, sateliti, minisateliti, mikrosateliti)

o razpršene (40%)Sicer pa je 62% človeškega genoma intergenskega (deli med geni), ki nimajo poznane funkcije – junk DNA.

5. MUTAGENSKE DRUŽINE + PRIMER: skupine genov z identično ali zelo podobno sekvenco. Geni so lahko organizirani v klastre ali pa so razpršeni po genomu.

Imajo skupen izvorni (ancestralni) gen. Primer: rRNA geni so tipična multigenska družina. Kompleksnejši primer: geni globina pri sesalcih (α in β globin; vsak pripada svoji multigenski družini, ki sta si podobni, izražanje genov pa je odvisno od različnih razvojnih obdobij).

6. NASTANEK PSEVDOGENOV: Prevdogeni so nefunkcionalne kopije gena, so evolucijski ostanek. Navadni psevdogeni: gen, ki je inaktiviran zaradi mutacije, s časom postane genski ostanek, kjer se akumulirajo nove mutacije. Procesiran psevdogen + nastanek: ni ostanek evolucije, pač pa je posledica nenormalne genske ekspresije. Nastane iz mRNA kopije gena pri sintezi cDNA, ki se vključi v genom. Ker je kopija mRNA, ne vsebuje intronov in sekvence za začetek ekspresije, torej je tak gen nedelujoč. Okrnjeni geni: preostanek evolucije, odsotnost dela na enem delu gena. Fragmenti gena: kratke izolirane regije v notranjosti gena.

7. KAJ SO MIKROSATELITI? Minisateliti: ponavljajoči klastri, ki imajo enoto 25bp in so daljši od 20 bp. Povezani s strukturnimi lastnostmi kromosoma. Mikrosateliti: imajo enoto od 1-13 bp, dolgi pa so prb. do 150 – 250 bp. Mikrosateliti so pri človeku najpogostejša dinukleotidna ponovitev (največ CC in AAAAA ponovitev). Zelo variabilni in uporabni pri genetskih študijah. Delitev mikrosatelitov (glede na tip ponovitve osnovnega motiva): popolni (en sam motiv baz, ki se tandemsko ponavlja), popolni in prekinjen (osnoven motiv prekinjen z insercijo enega ali več baznih parov), sestavljen (vsaj dva različna osnovna motiva baz), sestavljen in prekinjen (poleg vsaj dveh različnih osnovnih motivov še krajša insercija baznih parov), kompleksen (širši izraz za popolne in sestavljene), prekinjen kompleksen (predstavlja alele na nekem lokusu, pri katerih znotraj osnovnih motivov prihaja do prekinitve). Lastnosti: prikrita enostavnost: zaporedja, ki predstavljajo propadajočo mikrosatelitsko regijo, izpostavljeno točkovnim mutacijam. Kriptične regije: mesta nastanka novih mikrosatelitov.Procesa izginjanja in nastajanja mikrosatelitov se ne izključujeta. Kratki mikrosateliti (protomikrosateliti) nastajajo po naključju, najprej z točkovnimi mutacijami, katerim sledijo zdrsi vijačnice med replikacijo. Prisotni v kodirajočih in nekodirajočih regijah genoma. V promotorskih regijah delujejo kot ojačevalci ekspresijskih vektorjev. Dedujejo se kodominantno (idealno za starševske analize).

8. PRIMER UGOTAVLJANJA OČETOVSTVA (gledamo vse mogoče kombinacije cifer – št. ponovitev STR motiva, ki je osebno specifična - od očeta in matere; če ima otrok cifro, ki je ni pri očetu, potem domnevni oče ni njegov pravi oče)

9. KAKO FORENZIKI DOLOČAJO SPOL: poznamo dve metodi: a) z reakcijo PCR (namnožimo del na kromosomu Y, kjer obstajajo regije, ki jih ima samo moški, torej bomo v reakciji marker namnožili samo pri moškemu, problem je, če je vzorec degradiran), b) pomnoževanje amelogenin gena (kodira protein v sklenini, gena na X

1

in Y se razlikujeta v dolžini, zato bodo produkti PCR različnih dolžin, pri ženski bo namnožen samo en fragment, pri moškemu pa dva).

10. KAJ SO TRANSPOZONI IN NJIHOV NASTANEK: transpozicija je sposobnost premikanje določene sekvence po genomu; encim transpozaza omogoča izrezanje sekvence. Transpozoni so mobilni segmenti DNA. So večji transponibilni elementi, dolžine 1.000-40.000 bp, običajno vsebujejo več genov. Premikajo se na dva načina: a) konzervativni proces (sekvenca se nekje izreže, sledi insercija kjerkoli na genomu, št. originalnih kopij se lahko poveča), b) replikativna transpozicija (poveča se št. kopij originalne sekvence, kopije se vključujejo kjerkoli na genomu, lahko tudi na drugem kromosomu). Replikativni transpozoni se delijo glede na to, če se prenašajo preko RNA (retrotranspozoni) ali ne (premikanje direktno z DNA na DNA). Transpozicija se prične s sintezo RNA kopije transpozona pri normalni transkripciji. Transkript se kopira v dvojno vijačnico DNA. Nazadnje se DNA transpozona vključi v genom na katerikoli kromosom, končni rezultat pa sta dve kopiji transpozona na različnih mestih v genomu.

11. PROKARIONTI, PRENOSI DNA: 1. Konjugacija (kontakt in fuzija dveh različnih celic, konj. s prenosom plazmida ali konj. s delnim transferjem genoma, del DNA ali celoten genom se prenese v eno smer iz donorske celice v prejemniško), 2. Transformacija (bakterijska celica sprejme DNA iz okolja in jo vključi v svojo DNA), 3. Transdukcija (nekateri fagi lahko vzamejo del DNA ene bakterije in jo vključijo v kromosom druge bakterije).

12. ORGANIZACIJA DNA PRI E. COLI: Enojna krožna molekula DNA, genom je kompakten, med geni je malo praznih mest. Geni thrA, thrB in thrC so eden za drugim in se izrazijo kot ena enota, so primer OPERONa (skupine genov, ki se vključuje v eno biokemijsko pot – sinteza treonina).

13. KAKO STEČE REPLIKACIJA DNA: Pri evkariontih: sinteza v S fazi, prične se na različnih mestih (replikonih) hkrati. Podvojevanje poteka v obe smeri, dokler se sosedna replikona ne združita.Pri prokariontih se replikacija prične v eni točki krožnega bakterijskega kromosoma in poteka v obe smeri z enako hitrostjo, dokler se kromosom v celoti ne podvoji.14. MODEL REPLIKACIJE: Semikonzervativen način podvajanja: matrična vijačnica se odpre, ob vsaki verigi se formira ena nova komplementarna veriga (ena – matrična pa se torej ohrani). Poznamo še konzervativen (hčerinska dvojna vijačnica vsebuje dve novo nastali verigi) in disperziven (hčerinska vsebuje verige, sestavljene iz segmentov obeh starševskih verig in novo nastalih verig) način podvojevanja. REPLIKACIJSKE VILICE: Helikaza odvije matrično Dna, primaza naredi primer, kamor se veže DNA polimeraza III., ki kodira nukleotide. Vodilna veriga raste od 3' proti 5' koncu. Zastajajoča veriga raste od 5' konca proti 3' koncu s pomočjo

okazakijevih fragmentov. RNA polimeraza I. Odstranjuje primer, ligaza pa zlepi in naredi zadnjo fosfodiestrsko vez.

16. PROCES REPLIKACIJE: ima tri faze: 1. Iniciacija: prepoznavanje pozicije DNA, kjer se bo pričela replikacija (začne se v točno določenih izvornih točkah replikacije), 2. Podaljševanje (elongacija): vključuje dogodke v replikacijskih vilicah, ko se kopira starševska veriga, 3. Terminacija: zaključek prepisovanja starševske molekule.Replikacija pri E. coli: točka oriC, nanjo se veže protein DnaA, vijačnica se odpre, sekvenca bogata z AT. Replikacija pri višjih evkariontih: DNA-polimeraza ima sposobnost sinteze nove DNA v smeri 5' proti 3'.Ena veriga je tako vodilna veriga in se lahko kontinuirano sintetizira, druga pa se mora po delih – zastajajoča.Polimeraze pri bakterijah: DNA polimeraza I (encim, ki ima sposobnost dodajanja deoksiribonukleotidov na 3', pomemben za popravljanje in replikacijo DNA), DNA polimeraza III (glavni replikacijski encim). Polimeraze pri evkariontih: najmanj 9 polimeraz. Sinteza zastajajoče verige: po manjših segmentih – Okazakijevih fragmentih, potrebni so primeri – RNA polimeraze (primaze, ki nastanejo iz proteinov primosomov), nadaljevanje s polimerazo III (bakterije) oz. DNA polimerazo (evkarionti), na koncu še DNA ligaza.

17. RNA TRANSKRIPCIJA: stopnje: iniciacija, podaljševanje, terminacija. Uporabi se od 3'-5' koncu orientirana veriga DNA. Prokarionti: inf. iz RNA se prenese direktno v polipeptid s translacijo. Evkarionti: procesta transkripcije (jedro celice) in translacije (citoplazma) sta ločena. Procesiranje: kompleks splicesom odstrani introne in poveže eksone ('splicing'), dodatek CAP na 5' konec in poliadeninskega repa na 3'.Prokarionti + iniciacija pri E. coli: RNA polimeraza se veže na specifično sekvenco DNA – promotor. Nahaja se blizu startnega mesta prepisa, za zgornji strani gena. Transkripcije se prične v 5' neprevedeni regiji. 2 načina terminacije: dejanska (direktna, nastanek zanke) in rho (s pomočjo proteina).Transkripcija pri evkariontih: 1. Število genov in veliko nekodirajoče RNA, sodelovanje treh različnih RNA polimeraz pri transkripciji, potrebna je ureditev proteinov na promotorju preden polimeraza II začne s sintezo RNA. 2. Procesiranje primarnega transkripta pre-mRNA v mRNA (RNA polimeraza II). Zrela mRNA zapusti jedro. 3. Organiziranost genomske DNA v kromatinu: blokiran dostop RNA, specializirani mehanizmi za regulacijo ekspresije genov. Kompleksna iniciacija transkripcije pri evkariontih: GTF-ji + polimeraza II -> pre-iniciacijski kompleks.KAJ JE ALTERNATIVNI SPLICING? En gen lahko kodira več različnih proteinov. Različni proteini nastanejo zaradi združevanja različnih kombinacij eksonov. Pri človeku je prb. 70% genov alternativno združenih.

2

18. TRANSLACIJA: Mehanizem podoben, razlike le v mestih, kjer do translacije pride. Vezava antikod. na tRNA z kod. na mRNA. Kodoni se berejo v smeri 5' proti 3'.Sinteza proteinov steče, ko se mRNA in tRNA vežeta na ribosom. rRNA in protein = velika in mala podenota ribosoma. mRNA se prilega znotraj male podenote.Potek: Iniciacija: na določeno mesto na mRNA se vežejo ribosomi.Elongacija: ribosomi prepoznavajo kodone v mRNA, pride do interakcije med antikodonom tRNA s kodonom mRNA Terminacija: ribosomi zaznajo končni terminalni kodon (UAA, UAG, UGA) sledi razpad translacijskega kompleksaIniciacija pri prokariontih: iniciacijski kompleks (30S, mRNA in iniciacijske tRNA). Začetni triplet je vedno AUG, ki kodira aminokislino metionin. Vsak polipeptid se začne z metioninom. Mala podenota 16S rRNA se povezuje direktno s mRNA.Iniciacija pri evkariontih: iniciacijski kompleks (40S podenota, iniciacijska tRNA, iniciacijski faktorji, CAP struktura na 5' mRNA). Ne prihaja do parjenja 18s rRNA na mestu translacije. Metirlirana kapa, ki jo prepoznajo evkariontski iniciacijski faktorji, se najprej poveže z malo ribosomso podenoto z molekulo tRNA. Iniciacijska tRNA se loči od elongacijske tRNA. Elongacijski faktor ne prepoznava inicijascijske tRNA.Ni Shine – Dalgarnovega zaporedja.

19. EKSPRESIJA GENOV + LAKTOZNI OPERON: Promotor na DNA + protein, ki na to mesto veže RNA polimerazo. Regulacija s proteini: 1. Pozitiv. regulacija (aktivatorji -> vezava na tarčno DNA -> transkripcija). 2. Neg. regulacija (represorji -> vezava na operator -> transkripcije ne bo).Delovanje laktoznega operona: prvi odkriti in najbolj poznan operon. Vključuje 3 gene, ki omogočajo pretvorbo disaharida laktoze v monosaharida glukozo in galaktozo. Operon ne deluje, če ni laktoze, če pa je, pride do ekspresije vseh treh genov naenkrat. (Ti geni Z (permeaza), Y (β-galaktozidaza), A (transacetilaza) so pod negativno kontrolo produkta I gena, ki deluje kot represor. Ko se inicialna molekula (induktor) veže na represor, se operon izrazi v celoti. Na Lac promotorsko mesto se veže RNA polimeraza za iniciacijo transkripcije strukturnih genov.)

20. VRSTE MUTACIJ: mutacija je sprememba zaporedja nukleotidov na molekuli DNA. Omogoča evolucijo, prilagajanje in adaptacijo. Točkovna mutacija: mutacija enega nukleotida.1. Genske : tiha (nima efekta na funkcionalnost genoma), brezsmiselna (točkovna mutacija, povzroči spr. enega nukleotida, to lahko privede do sinteze druge AK), nesmiselna (spremeni kodon za določeno AK v STOP kodon -> skrajšanje proteinske sekvence), readthrough (spremeni terminalni kodon v kodon, ki determinira AK -> podaljšanje proteina), frameshift (adicija/delecija -> sprememba bralnega okvirja gena), mutacije v promotorskih regijah (pretirana ali zavrta ekspresija).2. Kromosomske (aberacije) : inverzija (spremenjen vrstni red genov), insercija (premik dela enega kromosoma na drug kromosom), duplikacija, delecija (del kromosoma se izgubi), translokacija (zamenjava dela kromosoma med dvema nehomolognima kromosomoma). 3. Genetske : večje mutacije.Glede na nastanek ločimo: a) spontane (nastanejo pri replikaciji DNA, mutacije neujemanja – nukleotidi nove verige se ne ujemajo z matrico), b) zaradi mutagenov (povzročijo strukturne spremembe, ki vplivajo na parjenje nukleotidov; insercije, delecije, pojav zdrsa polimeraze). Mutacije povzročajo kemijski (analogi baz se lahko vgradijo v DNA, reagiranje z DNA – struktur. spremembe, indirektno delovanje – npr. sinteza mutagenih peroksidov) in fizikalni (UV – dimerizacija sosednjih pirimidinskih baz, ionizacijsko sevanje, vročina – cepi vezi med sladkorjem in bazo) mutageni.

21. POPRAVLJALNI MEHANIZMI: v celici dnevno nastane 1000 napak, brez popravljalnih mehanizmov bi genom postal nefunkcionalen po nekaj cel. delitvah.1. Direktni popravljalni mehanizem (deluje direktno na poškodovano bazo). 2. Mehanizem izreza (izreže okvarjen del, sledi ponovna sinteza s pomočjo DNA polimeraze). 3. Mismatch popravilo (popravi napake replikacije z izrezom dela enojne DNA, sledi polnitev luknje). 4. Nehomologna vezava koncev (uporabi se za vezavo prekinitve dvojne DNA).

22. MARKERJI DNA: marker DNA je katerokoli nukleotidno zaporedje, ki ga lahko na molekuli DNA odkrijemo in lahko sledimo njegovemu delovanju. Različni markerski sistemi: RAPD (naključno namnožena polimorfna DNA, ti markerji omogočajo odkrivanje polimorfizmov na nivoju DNA, regijah, ki so naključno razporejene po genomu, v reakciji se uporablja začetne oligonukleotide s poljubnim zaporedjem, polimorfizme med genotipi opazimo glede na prisotnost oz. odsotnost določenega markerja v elektroforetskem profilu, genetske profile različnih genotipov primerjamo med seboj), SCAR (običajno pomnožujemo določene fragmente, ki so povezani z neko lastnostjo, jim določimo zaporedje in iz njih izdelamo začetne oligonukleotide, detekcija enaka kot pri RAPD), AFLP, RFLP, mikrosateliti, …

3