특수영역에서의 진단검사의학

• 노인 및 소아과 영역에서 진단검사의학

• 임신관련 검사

• 약물유전학과 맞춤약물요법

• 세포유전학 및 분자생물학적 검사기법- 염색체검사(conventional cytogenetics)- 형광동소보합결합(fluorescence in situ hybridization, FISH)- 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 및 정량 PCR

• 개인식별 분자진단검사

• 맞춤의학 분자진단검사 소개

노인 및 소아과 영역에서 진단검사의학

Biological influences-Age

1. Newborn- Hemoglobin A (mature infant) vs. HbF (immature infant)-출생직후혈관에서혈관외공간으로 fluid가이동하여혈장단백농도증가- Activities of CK, GGT, and AST are high at birth.- ↑bilirubin due to enhanced RBC destruction: peak at 3-5 days- Physiological jaundice: serum bilirubin< 5 mg/dL- Physiological hyperthyroidism gradually decline over the first year of life

2. Childhood to puberty-어른에비해혈당이낮으며근골격계가성장하면서 ALP와크레아티닌수치가증가

3. Adult: usually taken as the reference- Serum total cholesterol and TG conc. increase at a rate of 2 mg/dL per year to a maximum between ages 50 and 60 years.

- The activity of most enzymes in serum greater during adolescence than during adult life

4. Elderly adult- The plasma conc. Of many constituents increase in women after menopause- Ccr may decline↓ Thyroxine secretion and degradation thyroxine conc.↓ PTH and aldosterone conc. ↓ cortisol secretion with aging↓17-OHCS, 17-KS (U)

Changes in selected clinical chemistry analytes with aging

Increased DecreasesGGTAlkaline phosphatase, women onlyAlpha-1-antitrypsinAmylaseASTBUNCreatine kinase, slightGamma-globulin, slightGlucose fastingHDLInorganic phosphateLactate dehydrogenasepCO2

Potassium, slightTotal cholesterolTriglyceridesTSH, slightUric acid

AlbuminAldosteroneBilirubinCreatinine clearanceDHEAGrowth hormonep O2

T3

Total proteinTransferrin

Biological influences-Sex

• After puberty, the serum activities of ALP, ALT, AST, CK, and aldolase are

greater in men than in women: due to greater muscle mass in men

• After menopause, ALP activity increases in women until it is higher than in men

• Higher conc. in men: albumin, calcium, magnesium, hemoglobin, iron, ferritin,

cholesterol, LDL cholesterol

• Pregnancy

- Increase in blood volume → reduced protein conc. (P)

- But, inc. of ceruloplasminand thyroxin-binding globulin → lead to an increase of

copper and thyroxin

- ↑ Cholesterol, triglyceride, urine volume, GFR, ESR

- ↓ iron, ferritin

임신진단검사

Human chorionic gonadotropin (HCG)1) serum, urine HCG 측정임신의지표

2) serum HCG : 배란후 6~12일째4~6mIU/mL 이상증가

3) urine HCG : 정성검출4) 임신이외증가원인

: trophoblastic tumor

Peak!10 weeks

임신관련검사

산전선별검사

- 신경관결손(neural tube defect)1) Maternal serum α-fetoprotein (MSAFP)2) MoM (multiples of the median)

: 해당분만주수의정상임산부의AFP 중앙값과비교2.0~2.5 MoM 기준

3) 초음파소견및양수의AFP, AChE(Acetylcholinesterase)- Down syndrome (trisomy 21)

1) 태아염색체선별검사: 임신 20주이내(미국산부인과학회) 2) Triple test: MSAFP & unconjugated estriol (uE3)↓, HCG ↑3) inhibin A ↑, pregnancy-associated plasma protein A↓

- Edward syndrome (trisomy 18)

신경관결손(Neural tube defect)

-혈청 α-fetoprotein (maternal serum AFP, MSAFP)의증가

임신중기태아의신경관결손선별검사

-결과를평가할때는아래와같은임상적인요소들을고려

①임산부체중: 임산부체중이증가할수록 MSAFP는감소

②인종: 미국에서는흑인이백인보다 MSAFP가 10~15%높음

③인슐린의존성당뇨병(IDDM): 당뇨환자는건강인보다 MSAFP가 20% 낮음

④다태아: 쌍태아에서는 MSAFP가높음

⑤임신주수결정: 신뢰성있는임신주수계측이필수

기형아검사

- triple test: 임신중기 MSAFP, unconjugated estriol (uE3), HCG 측정

- 모체혈청에서측정한표지자혈청검사결과를행당표지자의 임신주수별 중앙

값(median value)으로 나누어서 MoM (multiples of median : 중앙값의 몇

배를 의미함)을 구함

- 위험도 산출: 3가지 표지자 각각의 MoM과 임신부 체중, 당뇨병 유무, 쌍태

아 유무를 컴퓨터 프로그램(Alpha, AFP expert 및 Prenta 등)에 같이 입력하

여 위험도 산출

- Triple 검사에서 모체혈청 AFP값이 해당 임신주수별 중앙값의 2.0~2.5배

(MoM) 이상일 경우 개방성 신경관 결손(open neural tube defect)의 위험

성이 있어 양수 AFP 및 양수 Acetylcholinesterase와 같은 추가검사

- 쌍태아일 경우에는 모체혈청 AFP가 4.0~4.5 MoM 이상일때 고위험군으로

- 다운증후군태아를 임신한 경우: MSAFP, uE3 감소하고, HCG 증가

임산부 연령과 더불어 세가지 표지자를 이용하면 다운증후군의 검출률

약60%, 위양성률 약 5%

- inhibin A: 최근 네 번째 표지자로 등장. 다운증후군태아를 임신한 경우inhibin A도 증가

- 4가지 표지자를 이용하면 다운증후군의 검출률은 거의75%로 증가

임신합병증관련검사(I)

- 태아적모구증(erythroblastosis fetalis)1) 태아의심한용혈성빈혈2) Liley’s test: 양수 bilirubin

- 임신중독증1) 임신 20주이후, 고혈압과단백뇨특징!2) Thrombocytopenia, relative erythrocytosis3) Increase : BUN/Cr, uric acid, AST, LD, D-dimer4) HELLP syndrome: Hemolysis, elevated liver enzyme, low platelet

임신합병증관련검사(II)

• 임신성 당뇨병- 임산부에서 포도당 불내성

• 태아폐성숙도• 조기양막파수

- 질분비물 pH검사 (양수 중성pH)

- 양치형성(fern pattern): 질분비물 슬라이드 5분 방치 후 관찰- placental alpha-1 microglobulin- 태아 fibronectin

• 태아질식

태아폐성숙도(Fetal lung maturity)

-임신 35주이후표면활성제의주성분: dipalmitic lecithin-이후일주일후 phosphatidyl glycerol (PG) 나타나서임신말기까지증가꽈리의안정성유지

-임신후기동안에양수의 sphingomyelin은 일정-양수의표면활성제측정

• 참고방법: 박층크로마토그래피에의한 L/S 비율L/S 비율 > 2.0이면성숙, 1.5~2.0이면경계선, < 1.5이면미성숙

• PG 신속검사: 야간이나주말에크로마토그래피가안될경우이용신속라텍스응집방법

• Microviscosity test(형광편광): L/S 비율과상관성이좋아보편적으로사용

Cytogenetic Analysis (Amniotic fluid)

- 양수천자 : 임신 16주이후시행양수세포 7~10일정도배양후핵형분석

임신주수별검사

- 임신초기기본검사CBC, UA, ABO typing, Ab screening, Rubella Ab, Screening test for syphilis, hepatitis and AIDS

- 임신 14주~21주Triple /Quad test, 양수검사

- 임신 24주~28주임신성당뇨선별검사

약물유전학 (pharmacogenetics)

• 개인 및 인구집단에서의 약물 및 화학물질에 대한 대사와 그 반응의 차이를 유전학적으로 분석하는 분야

• 최근 분자진단적 분석방법의 발전에 따라 유전형 분석이 선호• 약물반응의 차이를 보이는 유전자적 특징은 다유전자적 양상으로 발현되고, 이 인자들은 크게 약물 대사, 약물 운반, 약물 표적에 관련된 유전자 다형성을 등으로 분류

약물유전학과 맞춤약물요법

약물 대사에 관여하는 효소들

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약물유전학과 맞춤약물요법

인간에존재하는 cytochrome P450 약물대사에관여하는주요 cytochrome P450

대표적인약물대사 CYP450와주요약물들

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Cytochrome P450

Inhibition: 약물 간 상호 경쟁으로 발생하거나 효소 활성이 직접적으로 억제되어 나타남. CYP450 효소들은 기질 특이성이 낮아 약물을 병용 투여하면효소에 대한 약물의 경쟁적 결합 때문에 친화력이 약한 약물의 대사가 저해

Induction: 주로 특정 약물에 의해 효소 생산이 증가되어 나타나게 되며, 이로 인해 체내 약물 제거가 너무 빨리 일어나 혈중 농도가 전반적으로 낮아짐

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약물유전학과 맞춤약물요법

약물유전학의 활용

• 현재는 후양적으로 약물부작용을 진단하는 개인에 특이적인 검사에 주로 초점이 맞추어져 있음

• 향후에는 대상 인구 집단에서 선별된 자료를 바탕으로 약물 독성을 예방하고 치료를 최적화하여 치료제를 선택하는 전향적인 검사로 활용

약물유전학과 맞춤약물요법

염색체검사(conventional cytogenetics)

염색체DNA와핵단백질(nucleoprotein)로구성

1) 소아과영역: 선천성염색체이상, 다운증후군말초혈액림프구 (T lymphocyte) PHA-stimulated 72 hr 배양후염색체획득

2) 산부인과영역: 선천성염색체이상, 다운증후군양수천자에서얻은소량의Amniocyte자극없이 10-14일배양후염색체획득

3)혈액종양분야 : Ph + CML, t(8;21) AML, t(1;19) ALL암세포만갖는염색체분석

암세포배양 (0 hr -48 hr ), 자극제없이4) 기타 Chomosome breakage test (Fanconi anemia)

염색체검사활용분야

1) 혈액종양의진단t(8;21) AML; t(15;17) APL; inv(16) AML with eosinophilia; t(9;22)CML

2) 예후판정및치료방침결정AML good; t(8;21), t(15;17), inv(16) poor; t(9;22)ALL good; hyperdiploidy poor; t(9;22)포함한 hyperdiploidyMDS good; normal,del(5)(q), del(20)(q), -Y poor; complex karyotype, 7번

abnormalMM good; hyperdiploidy, t(11;14) poor; hypodiploidy,t(4;14), t(14;16 )

3) 치료효과판정및잔류병소측정

4) 조혈모세포이식후생착판정

5) 재발또는질환진행의진단

혈액질환에서염색체검사의유용성

검체 채취

• 검체 채취: 세포 손상 최소화, sterile

Sodium-heparin, 진공채혈관 이용시 반드시 decaping, needle 제거

• 검체는 절대 얼려서는 안되면 검체 접수가 지연될 경우

냉장보관 할 수 있으나 실온 보관도 추천

• 검체 채취 당일 처리해야만 세포배양 성공확률 높음

염색체분석을위한기본검사흐름도

Cell culture

Harvest

Slide preparation

Staining

Observation & Analysis

• A,F : 10-12 days• Blood :72hrs(PHA,PW)• B.M : direct, 24hrs

• Colcemide : 50min• Hypo.sol : 20min• Fixation :

methanol/acetic acid = 3/1

• Air dry• Warm dry

• GTG-banding

염색체분류방법(ISCN 표기법)

size centromere

group A (1-3)

Grouping 기준

Large

Medium

rShort

Short

metacentricsubmetacentri

cmeta or subacro

meta or sub

acrometa

group B (4-5)

group C (6-12, X)group D (13-15)

group E (16-18)

group F (19-20)

group G (21-22, Y)

Chromosome Identification

1 32 4 5

6 7 X 8 9 10

11

12

13

14

15

16 17

18

19

20 21

22 Y

› › ›

››

‹

8q24.28 : 8번염색체q : 장완2 : 영역4 : 밴드2 : 부밴드

• International System for Human Cytogenetic Nomenclature 표기법• 염색체의밴드는 landmark에의해 region으로구분된다• 번호는밴드와 region은동원체로부터바깥으로가면서번호가할당된다

centromere

p terminal

q terminal

BandNumbering

염색체밴드명명법

Tuner syndrome45,X

45,X,-X

46,Xc,+X

44,-Xc

48,XY,+21c,+21

Down syndrome47,XX,+21

48,XY,+21c,+21

Numerical aberrations

Duplication (중복)

46,XY,dup(7)(q11.2q22)

Deletion (결실)

46,XX,del(1)(q24q31)

Structural aberrations (1)

Inversion (역위)

inv(3)(q24q27)

Translocation (전위)

Isochromosome (동완염색체)

i(17)(q10)

Ring chromosome (환염색체)

r(13) t(9;21)(q34;q11)

Structural aberrations (2)

General Principles of Karyotype Designation (1)

2. chromosome abnormalities 기술방법* constitutional sex chromosome은 언제나 기술한다* autosomal chromosome은 비정상 소견이 있는 경우에만 기술한다.

• 일반 기술 순서

① 성염색체(X Y)② 상염색체 번호 빠른 순서③ 개수변이가 구조변이 보다 먼저④ 단완 변이가 장완 변이보다 먼저 기술⑤ proximal한 변이가 distal 변이 보다 먼저⑥ constitutional 변이가 acquired한 변이보다 먼저⑦ 구조변이 약어의 알파벳 순으로⑧ recipient가 donor 보다 먼저 기술⑨ 명확하지 않은 것은 나중에 적는다(r, mar, dmin, inc)⑩ mosaicism이 관찰되는 경우 clone 변이가 단순할수록 먼저 & 정상 clone은 마지막

cf. constitutional 변이와 acquired 변이를 구분 위해constitutional chromosome에 소문자 c를 뒤에 붙인다.

cf. homologous chromosome의 구분이 필요한 경우 single underlining을 한다.

single chromosome

1. Normal Karyotype : 46,XX or 46,XY

General Principles of Karyotype Designation (2)

2. chromosome abnormalities 기술방법

1) 수적이상 (numerical aberrations) 기술방법

① 성염색체 constitutional인경우 숫자를 표시하지않고 있는 대로 써준다acquired 경우 개수 변이는 +, - 로 표시한다

② 상염색체 숫자가 빠른 순으로 +,-로 표시한다.

2) 구조이상 (structural aberrations) 기술방법

① single chromosome: 46,XX,inv(2)(p21q31)

② two or more chromosomes: 46,X,t(X;18)(p11.1;q11.1)

rearrangementtype (abbreviation)

(chromosome number) (band)

rearrangementtype (abbreviation)

(chromosome number;

chromosome numer)

(band;band)

t(9;22)(q34;q11.2)

t(8;21)(q22;q22)

염색체구조이상(1)

t(1;3)(p36.1;q21)

t(15;17)(q22;q21)

형광동소보합결합(fluorescence in situ hybridization, FISH)

형광동소보합검사원리( FISH; Fluorescence in situ Hybridization )

FISH 검사의유용성및 장점: 염색체분석법과비교

유 용 성 장 점

Aneuploide(수적이상) identification Rapid analysis

Microdeletion(미세결손) identification Intact cell morphology

Oncogene identification

- Translocation(전좌)

- Deletion(결실)

- Amplification(증폭)

Multi - targetQuantitative assayBoth interphase and metaphase

A variety of specimen

: blood, paraffin tissue, frozen tissue, touch print, cytospin

골수이식후의생착여부

FISH 검사흐름도

A. 검체(PB, BM, Tissue, 체액)

B. 세포제단백및고정

C. 형광소식자부착

D. 변성후보합결합

E. 세척

F. 대조염색

G. 검경

FISH 전용슬라이드

제단백 : 20XSSC,NP-40고정 : 에탄올(70%,85%,100%)

Probe 1ul + D.W 2ul + Buffer 7ul

Hybridization- 73℃ 2min (변성)- 37℃ overnight (16-18hrs)

0.4XSSC / 0.3%NP-402XSSC / 0.1%NP-40

DAPI II

D13S319

DNA

Chromosome Number

• 1 ~ 22, X, Y• 0 unknown• XY homologous of

X & Y

Unique Segment

SequentialNumber

DXZ1

Repetitive Segment

--F-

Small undefined families of homologous sequences found on multiple chromosomes

13.3 Prophase/Metaphase ish (4)

Dual Color, Single Fusion

Probes flank breakpoints

Estimated Cut Off ~ 10 %

ES (Extra Signal)

One large probe spans,

other flanks breakpoint

Estimated Cut Off ~ 1.5- 3 %

Dual Color, Break Apart

Probes flank one breakpoint

Estimated Cut Off ~ 1- 3 %

Dual Color, Dual Fusion

Two large probes span breakpoints

Estimated Cut Off < 1 %

FISH positive pattern

1O1G2F

1O1G1F

1O1G1F

2O1G1F

2O2G

2O2G

2F

2O2G

Normal pattern Abnormal pattern

중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)

및 정량 PCR

PCR의종류

1. 역전사중합효소연쇄반응(Reverse transcriptase PCR, RT-PCR)RNA를증폭하기위하여고안된방법.RNA-> reverse transcriptase(RT) 효소를이용한 cDNA 합성 -> PCR

2. 이중중합효소연쇄반응(Nested PCR)일차 PCR 후에두번째 primer set로이차 PCR을시행하는방법.민감도를높이고특이도를증가시킨검사법.

3. 다중중합효소연쇄반응(Multiplex PCR)둘이상의 Target부위를단일시험관내에서동시에증폭시키는방법.

4. 실시간중합효소연쇄반응(Real-time PCR)

Hydrogen Bonds

Cytosine (C)

Adenine (A)

Thymine (T)

Guanine (G)

Deoxyribose(Sugar molecule)

Phosphoric Acid(Phosphate molecule)

Cytosine (C)

Adenine (A)

Thymine (T)

Guanine (G)

핵산 추출 방법

DNA 추출방법 RNA 추출방법

Sample

Lysis buffer +ethanol

Proteinase K

Wash buffer AW1

Wash buffer AW2

Elution buffer

Pure viral nucleic acids

Dry spin

PCR에필요한구성성분

- DNA 또는 mRNA, DNA 중합효소및완충액, dNTP, 시발체, MgCl2 등그외온도조절장비,

전기영동장치등이필요

- PCR 반응에가장중요한성분은시발체(primer)

-증폭되는산물의크기: 일반적으로 2,000 bp까지가능. 200~500 bp 정도가가장효율적으로

증폭

①주형 DNA

②시발체

③열저항 DNA 중합효소 (예: Taq polymerase)

④ Deoxynucleoside triphosphates (dNTP)

: 동량의 dATP, dTTP, dCTP, dGTP 로구성

⑤이가양이온: Mg2+등

⑥완충액(Buffer): pH 8.3~8.8정도의 10 mM Tris-Cl

⑦일가양이: 50 mM KCl

HCV RNA

Anti-HCV HBS Ag

HBV DNA

1 2

2 4

3 8

4 16

5 32

6 64

20 1,048,576

30 1,073,741,824

No. of No. of TargetCycles Amplicon Copies

PCR의이론과실제

Cycle #

Log

Targ

et D

NA

이론적증폭

실제증폭곡선

Plateau Phase (평형기)

Exponential Phase (지수기)

Linear phase

정량 PCR

정량(real time PCR)은대상핵산증폭과검출과정을단일시험관내에서동시

에진행하면서 PCR 각주기마다실시간으로확인이가능한방법.

Real time PCR기법

① SYBR Green Ⅰ

② Taqman probe

③ Hybrization probe

④ Molecular beacon

5’ exo-nuclease activity of Taq DNA Polymerase and FRET

5’3’5’ 3’

5’3’5’3’

3’5’

3’

5’

3’5’

probe

5’Forward primer

3’Reverse primer

Reporter: FAM, VIC, TET, HEX

Quencher : TAMRA

Taq DNA polymerase

Emitting reporter

Excited quencher

Real time PCR결과분석

endpoint측정이 아닌 PCR의 증폭이 기하급수적으로 증가하는 지수기

(exponential phase )에서측정

Ct (Threshold Cycle)값을기초로함

초기 template의 양을 알고 있는 standard를 이용하여 Ct 값에 따른 standard

직선성을확보

미지샘플에서측정하고자하는 target의정량은 Ct값을측정함으로써가능

초기의 background를지나 fluorescence (형광)의양이급격하게

증가하는 시점의 PCR cycle 수를말한다

초기 template의양과정확하게비례한다

Threshold Cycle ,Ct (1)

Threshold Cycle, Ct (2)

연속적으로 증가하는 초기 template의 양에 대한 Ct 값의 결과를 log로 그리

면정확하게직선을이룬다

초기 template의양이같은샘플을여러개반응시키더라도같은 Ct값을보임

Fixed threshold

적응증

미세잔류백혈병 (MRD) 확인 TEL-AML1 gene in ALL (급성림프구성백혈병)

TCR & IG gene in ALL (급성림프구성백혈병)

AML1-ETO/CBFβ-MYH11 gene in AML (급성골수성백혈병)

PML-RARa gene in APL (급성전골수성백혈병)

BCR-ABL gene in CML (만성골수성백혈병)

Viral load : CMV, EBV, HIV, HCV, HBV etc.

특정유전자발현

돌연변이확인 : drug resistances

블롯: nitrocellulose 또는 nylon막(membrane)에 검체를 고정시키는 것

핵산블롯팅: 전기영동을 시행한 핵산 조각을 겔에서 막으로 옮기는 과정

세포에서 핵산을 추출하여 크기에 따라 전기영동을 시행한 후 nitrocellulose

또는 nylon에 고정 후 핵산에 특이적인 탐색자와 부합반응을 통하여 검출

탐색자에 부착되는 표지자에 따라

방사선동위원소법, 효소를 이용한 화학발광법, 발색법 등

PCR 개발 후 많은 검사에서 PCR로 대체. 특정 검사에서는 여전히 선호

핵산블롯부합법 (Nucleic acid blot hybridization)

1) 서던블롯부합법(Southern blot hybridization)

- 제한절편길이다형성(restriction fragment length polymorphism, RFLP)을이용하여

개인의식별에이용될수있고, 유전자의결손이나증폭, 돌연변이, 염색체의전좌,

메틸화된DNA 등과관련된질환의진단에이용.

- 유약엑스증후군(Fragile X syndrome), 근육긴장퇴행위축(myotonic dystrophy)에 이용

2) 노던블롯부합법(Northern blot hybridization)-기본원리와분석방법이서던블롯부합법과 동일하지만, DNA가아니라 RNA를분석

-신호의강도는특정유전자발현의정도에비례하기때문에정량적인분석이가능

-비정상적인 RNA의발현은특정유전질환과관련임상적진단과예후판정에이용

• 핵산부합원리를 기본으로 함

• 다량의 부합반응을 한 번에 시행할 수 있는

기술이 현실화된 것

• 수천 ~ 수 만개의 유전자를 한꺼번에 분석

개인식별검사

• 활용 분야– 친자 감별– 장기 이식시 조직적합성 검사– 조혈모세포이식 후 생착 평가– 임상 검체에서의 식별검사– 법의학 분야

• 유전표지자의 종류– SNP (single nucleotide polymorphism)– RFLP (restriction fargment length polymorphism)– VNTRs (variable numbers of tandem repeat loci) or minisatellite– STR (Short tandem repeat) or minisatellite

개인식별 분자진단검사

개인식별 분자진단검사

맞춤의학: 맞춤종양의학의 태동

• 분자적 수준에서 종양의 원인 규명

• 유전체 염기서열분석 및 단백체 분석

• 분자적 표적약물개발- HER2 양성 유방암: trastuzmab- BCR/ABL 만성골수성백혈병: imatinib- EGFR유전변이 비소세포폐암: gefitinib, erlotinib- BRAF유전변이 악성흑색종: vemurafenib

맞춤의학 분자진단검사 소개

Structure of Her-2/neu oncoprotein

Plasmamembrane

Cytoplasm

Plasmamembrane

Extracellular domain(Ligand-binding site)

Intracellular domain(Tyrosine kinase activity)

Transmembrane domain

Localization of Her-2/neu gene on chromosome 17

Normal Interphase Nucleus and Metaphase Spread

HER2Chromosome 17 Centromere

17 17

Immunohistochemistry of Her2

0

3+2+

1+

Serum HER2 assay

PMP

AE Anti-HER-2/neu Mab(TA-1)-AE

HER-2/neu

Anti-HER-2/neu Mab(NB-3)-F ITC

Flurorescein

Anti-Flurorescein Mab