Obtencin y caracterizacin de pectina a partir de la cscara de parchita (Passiflora edulis f. flavicarpa Degener)

Se analiz la influenciadel estadode coloracin (verde-blanco, verde-amarillo y amarillo) y del agente de extraccin (HCl, H3PO4, H3PO4-(NaPO3)6) sobre la pectina de la corteza seca de parchita. El contenido de pectina se determin por el mtodo de hidrlisis cida, a las condiciones de extraccin pH: 3.0, temperatura: 90-95C y tiempo de calentamiento: 90 minutos. La calidad de la pectina se evalu mediante anlisis de humedad, cenizas, peso equivalente, metoxilo, cido anhidrournico, grado de esterificacin, tiempo de gelificacin, viscosidad relativa, espectros de infrarrojo y los minerales calcio (Ca), magnesio (Mg) y sodio (Na). El rendimiento mximo de pectina obtenido fue 18,45% al usarse como extractante H3PO4-(NaPO3)6; mientras que la pectina de mejor calidad fue extrada con HCl, con un contenido de cido anhidrournico y de metoxilo de 78% y 9,9%, respectivamente. La corteza de la parchita en el estado de madurez amarillo present el mayor contenido de pectina, mientras que la extrada en el estado de madurez verde-blanco exhibi las mejores propiedades gelificantes. La espectrometra de IR confirm que la pectina tiene alto contenido de metoxilo. El anlisis de los minerales arroj los siguientes resultados: calcio 0,10 a 0,15%, magnesio 0,05 a 0,08% y sodio 0,02 a 0,04%. La pectina de la corteza de parchita no presenta caractersticas inusuales que indiquen alguna desventaja potencial comercial.

Validacin de 2 mtodos espectrofotomtricos para la cuantificacin de taninos y flavonoides (quercetina) enPsidium guajaba,L.Yamilet Irene Gutirrez Gaitn,1Migdalia Miranda Martnez,2Noel Varona Torres3y Aida Tania Rodrguez4RESUMENSe realiz la validacin de 2 mtodos espectrofotomtricos que posibilitan cuantificar taninos y flavonoides en la droga cruda dePsidium guajaba,L., pues la literatura nocuentacon mtodos oficiales que permitan cuantificar dichos compuestos en esta planta. Se determin que ambos mtodos (mtodo del tungsto-molbdico-fosfrico para taninos descrito porMiranda My el mtodo espectrofotomtrico para flavonoides totales expresados comoquercetina, deKostennikova Zy modificado porMndez G) cumplan contodos losrequisitos de validacin propuestos para el control qumico de calidad de la especie (linealidad, precisin [repetibilidad y reproducibilidad], exactitud y especificidad).Descriptores DeCS:ESPECTROFOTOMETRIA/mtodos. TANINOS/anlisis; QUERCETINA/anlisis; HOJAS DE PLANTA.La validacin de un mtodo es aquel proceso por el cual se establece mediante estudios de laboratorio que su capacidad satisface losrequisitos paralas aplicaciones deseadas; esta capacidad se expresa en trminos de parmetros de anlisis, donde se tiene en cuenta la linealidad, precisin (repetibilidad y reproducibilidad), exactitud, especificidad, sensibilidad, entre otros, en dependencia del objetivo que se persiga.En laactualidadreviste gran importancia la validacin de mtodos, procesos, etc., que permitan mayor confiabilidad en los resultados, fundamentalmente cuando se trabaja con productos naturales, donde es necesario obtener datos y resultados experimentales que demuestren la aptitud para el uso que se destina; es por ello, que nos trazamos como objetivo la validacin de 2 mtodos espectrofotomtricos que permiten cuantificar los compuestos que segn referencias bibliogrficas, estn relacionados con la accin antidiarreica dePsidium guajaba, L.(taninos y el flavonoide quercetina), y de esta manera proponer ambos mtodos para el control qumico de calidad de la droga cruda de dicha especie.MTODOSComo material se emplearon hojas adultas dePsidium guajaba,L. procedentes de Ceiba del Agua, provincia La Habana, previamente secadas y molinadas. A partir de la droga cruda obtenida se prepararon las muestras para el proceso de validacin de los 2 mtodos espectrofotomtricos para cuantificar taninos y flavonoides totales expresados como quercetina, los cuales se describen a continuacin:Mtodo del tungsto-molbdico-fos-frico para cuantificar taninos (descrito por Miranda M en el Manual de prcticas de laboratorio de anlisis farma-cognstico. 1992:54-5):se agitan 10 g de muestra con 500 mL de etanol al 50 % durante 6 h, se deja en reposo 8 h y se agita nuevamente por 30 min, para pos-teriormente filtrar. Se transfieren 3 mL del filtrado a un matraz aforado de 50 mL y se diluye con agua destilada hasta enrase (Sm). Finalmente se preparan matraces aforados de 50 mL, los cuales contendrn:Reactivos Blanco Patrn Muestra

Sm--1,0 mL

Solucin de referencia

de cido tnico-3,0 mL-

Agua destilada5,0 mL2,0 mL4,0 mL

Reactivo para taninos2,0 mL2,0 mL2,0 mL

Se agita y se deja en reposo 5 min

Solucin de carbonato de sodio al 20 %1,0 mL1,0 mL1,0 mL

Se completa con agua destilada hasta enrase, se mazcla bien y se lee cada uno a 700 nm.Solucin de referencia de cido tnico: se disuelven 25 mg de cido tnico en 100 mL de agua destilada, de ah se cogen 20 mL y se completa volumen hasta 100 mL.Reactivo para taninos:10 g de tungstato de sodio dihidratado, 0,2 g de cido fosfomolbdico y 5 mL de cido fosfrico al 85 % en 75 mL de agua destilada. Se refluja 2 h y despus se completa a 100 mL con agua destilada.La expresin para los clculos es la siguiente:

donde:X: contenido de taninos en la droga (%)P: masa de la sustancia de referencia (g)Am: absorbancia de la muestra (nm)Ap: absorbancia de la solucin de referencia (nm)PM: masa de la droga (g)p: humedad de la droga (%)Mtodo espectrofotomtrico para cuantificar flavonoides totales expresados como quercetina, descrito por Kostennikova Z1(este mtodo modificado por Mndez G en su Tesis de Maestra: Estudio farmacognstico y fitoqumico preliminar deCymbopogon citratus(DC) stapf y sus extractos, 1996:36-8):se refluja 0,5 g de muestra 2 h con 20 mL de cido sulfrico al 10 % y 20 mL de etanol al 50 %, luego se enfra y se filtra con ayuda de vaco. El residuo se lava con 30 mL de etanol al 50 % para desecharlo finalmente; el filtrado se evapora en bao de agua hasta la mitad del volumen inicial, se enfra sobre bao de hielo durante 30 min y luego se filtra, lavando el precipitado formado con 4 porciones de 10 mL de agua destilada fra (10--15 C). Se elimina el filtrado y los lavados, y el residuo tanto del filtro como del recipiente se disuelve con 70 mL de etanol al 96 %, calentando previamente a 50 C; la solucin se pasa a un volumtrico de 100 mL y se completa volumen con etanol al 96 % (solucin muestra). Poste-riormente se leen las absorbancias a 258 nm.Como patrn se emple 0,04 g de quercetina, los cuales se disolvieron con etanol al 96 % hasta completar un volumen de 50 mL; de esta solucin se toma 1 mL y se diluye a 100 mL con etanol al 50 %. El blanco consisti en una solucin de etanol al 50 %.La expresin empleada para el clculo fue la siguiente:

donde:X: contenido de flavonoides totales expresados como quercetina (%)Am: absorbancia de la solucin muestra (nm)PR: peso de la sustancia de referencia (g)AR: absorbancia de la solucin de referencia (nm)Los parmetros evaluados en el proceso de validacin (segn lo reportado por Fernndez A en Validacin de mtodos analticos. II Taller de validacin; 1996:10-29) fueron:Linealidad:se prepararon 5 soluciones muestras, cada una por triplicado a partir de la droga cruda, correspondiente al 50, 80, 100, 120 y 150 % del peso inicial indicado en cada mtodo y se determin la absorbancia de cada una. Posteriormente se construyeron curvas de absorbancia contra concentracin y se efectu un anlisis de regresin, calculando el coeficiente de regresin (r), el coeficiente de determinacin (r2), coeficiente de variacin de los factores de respuesta (CVf), las pendientes, interceptos y significacin de las pendientes e interceptos. El criterio establecido es: CVf 1,5 %; r3 0,99; r2 0,98; intercepto que no sea significa-tivamente diferente de cero y la pendiente significativamente igual a 1.Precisin: este parmetro incluye la repetibilidad y reproducibilidad. Se realiz una prueba de Fischer y una prueba t de Student.Repetibilidad:se repitieron los mtodos espectrofotomtricos sealados anteriormente, 6 veces cada uno, para la muestra correspondiente al 100 %, por el mismo analista, el mismo da y con el mismo equipo. El criterio establecido es: CV 1,5 %.Reproducibilidad:se efectu con la muestra correspondiente al 100 %, por triplicado, por 2 analistas, 2 d diferentes. El criterio establecido es: CV 3,0 %.Exactitud:se utiliz el mtodo de adicin de patrn. Se parti de una muestra de la que se tomaron 3 alcuotas y se les aadieron cantidades crecientes de patrn correspondiente al 80, 100 y 120 %, es decir, quercetina (16 m g/mL) para el mtodo de cuantificacin de flavonoides y cido tnico (3 m g/mL) para el de taninos. Los resultados se expresaron como porcentaje de recobro (R) y coeficiente de variacin (CV). El criterio establecido es: R=97-103 %; CV 3,0 %.Especificidad: se analizaron muestras que contenan solamente las sustancias de inters (quercetina y cido tnico), otras que contenan placebo y otras a las cuales al placebo se les agreg la sustancia de inters al 100 %. Todos los ensayos se efectuaron por triplicado y como criterio se establece que no debe existir absorbancia significativa del placebo en la longitud de onda de trabajo.El placebo para el mtodo de taninos fue etanol al 50 % y en el caso de flavonoides una solucin de cido sulfrico al 10 % y etanol al 50 %.Todos los resultados obtenidos fueron procesados de forma automatizada, con el empleo del programa estadstico Stat para Window, donde se realiz el anlisis de regresin de la curva de calibracin para determinar la significacin de las pendientes y los interceptos.RESULTADOSEn el primer parmetro evaluado que fue la linealidad (tabla), se obtuvieron valores de coeficientes de correlacin r igual a 0,9991 y 0,9928 para el mtodo de cuantificacin de taninos y flavonoides totales respectivamente, as como coeficientes de variacin de los factores de respuesta de 0,72 % para el primer caso y 0,56 % para el segundo.

Tabla.Resultados del proceso de validacin de los mtodos de cuantificacin de taninos y flavonoides totales expresados como quercetinaLinealidad (%)Parmetros determinados en la validacinEspecificidad

Repetibilidad(%)Reproducibilidad(%)Exactitud(%)

Mtodo para cuantificar taninosr=0,9991r2=0,9834CVf = 0,72 %CV = 0,50CV = 0,35R = 97,63 CV = 1,63El placebo no ab- sorbi de formaSignificativa en el rea de trabajo

Mtodopara cuantificar Flavonoides totalesr2 = 0, 9928r2=0,9834CVf = 0,56 %CV = 0,28CV = 0,49R = 97,44 CV = 1,89El placebo no ab- sorbi de formaSignificativa en el rea de trabajo

Criterios establecidosr30,99r2 0,98CVf 1,5CV1,5CV3,0R = 97-103CV3,0El placebo no ab- sorbi de formaSignificativa en el rea de trabajo

El anlisis estadstico de regresin mediante Stat para Window ofreci al mtodo de cuantificacin de taninos un intercepto que no es significativamente diferente de cero: 0,0008 con un error estndar de 0,001 y una probabilidad de 0,4915, o sea, mayor que 0,05. La pendiente result ser significativamente igual a uno: 0,9997 con un error estndar de 0,004 y una probabilidad menor que 0,05, o sea, 0,0001.Para el mtodo de cuantificacin de flavonoides el intercepto no es significativamente diferente de cero: 0,0006 con un error estndar de 0,0005 y una probabilidad de 0,3488 (> 0,05). La pendiente es significativamente igual a uno: 0,9998 con un error estndar de 0,0031 y una probabilidad de 0,0002 (< 0,05).Para la repetibilidad (tabla) se apreciaron valores de CV=0,50 y 0,28 % para el mtodo de taninos y flavonoides respectivamente. La reproducibilidad (tabla) dio como resultados el 0,35 % para taninos y el 0,49 % para flavonoides totales.Por su parte la exactitud (tabla), brind valores de coeficientes de recobro R de 97,63 y 97,44 %, as como CV de 1,63 y 1,89 %.Finalmente se determin la especificidad de los mtodos donde se obtuvo como resultado al aplicar ANOVA 1, para el 95 % de confianza, que el placebo no absorbi de forma significativa en la regin de trabajo, pues las absorbancias fueron casi cero, o sea, 0,0003 ( 0,010) para el mtodo de cuantificacin de taninos y 0,0007 ( 0,009) para el de flavonoides totales expresados como quercetina. Todo lo anterior se corrobor al comparar los valores de absorbancia de las sustancias de inters (cido tnico y quercetina) al 100 % y la del placebo con dichas sustancias, donde los resultados de absorbancias medidas fueron bastante similares: 0,267 ( 0,002) y 0,269 ( 0,003) para taninos y 0,150 ( 0,006) y 0,149 ( 0,009) en el caso del mtodo de cuantificacin de flavonoides.DISCUSINAl analizar los resultados obtenidos en la linealidad se pudo constatar que los valores de coeficientes de correlacin r para los 2 mtodos evaluados, se acercaron bastante a la unidad, adems de obtener coeficientes de determinacin r2, coeficientes de variacin de los factores de respuesta CVf, pendientes e interceptos dentro de los lmites exigidos. Todo lo anterior nos permite afirmar que existe una buena correlacin entre la concentracin y la respuesta obtenida (valores de absorbencia), lo cual demuestra linealidad en el rango de concentraciones estudiadas.La precisin, evaluada como respetabilidad y reproducibilidad, mostr resultados satisfactorios, pues los coeficientes de variacin determinados en ambos mtodos cumplieron con el criterio de aceptacin. Se realiz la prueba de Fischer, donde se apreci que no existan diferencias estadsticamente significativas entre la precisin alcanzada por ambos analistas. Tambin se aplic la prueba t de Student, la cual revel la ausencia de diferencias estadsticamente significativas entre las medias obtenidas por los analistas. El cumplimiento de ambos estudios nos permiten afirmar que el mtodo es preciso.Otro aspecto importante que se tuvo en cuenta en el proceso de validacin fue la exactitud, la cual se expresa por el coeficiente de recobro R y el coeficiente de variacin CV. Como se puede evidenciar en la tabla, los mtodos propuestos son exactos, ya que los valores de porcentajes de recobro y coeficientes de variacin se encuentran dentro del intervalo establecido.En el ltimo parmetro medido (especificidad) hay que sealar que los 2 mtodos son especficos, pues se comprob al aplicar ANOVA 1, para un 95 % de confianza, que no existan diferencias estadsticamente significativas entre los valores medios de absorbancia de las sustancias (cido tnico y quercetina) de inters al 100 % y la del placebo con dichas sustancias, lo cual demuestra que el placebo no absorbi significativamente en la longitud de onda de trabajo, pues las absorbancias fueron de 0,0003 para el mtodo de taninos y 0,0007 para el de flavonoides, valores muy cercanos a cero.Todo el estudio desarrollado nos permite afirmar que los mtodos espectrofotomtricos propuestos para la cuantificacin de taninos y flavonoides totales expresados como quercetina, validados para el control qumico de calidad de la droga cruda dePsidium guajaba, L.son fiables, pues demuestran mantener los criterios fundamentales de linealidad, precisin (repetibilidad y reproducibilidad), exactitud y especificidad.SUMMARYWe validated two spectrometric methods that facilitate to quantify tannins and flavonoids in a raw drug from Psidium guajaba L. Since literature does not provide official methods for quantifying such compounds from this plant. It was determined that both methods (tungsten-molybdic-phosphoric method for tannins by Miranda M., and spectrophotometric method for total flavonoids expressed as quercentin by Kostennikova Z as modified by Mndez G.) meet all the proposed validating requirement for a quality chemical control of the species (linearity, precision (repeatability and reproducibility) accuracy and specificity).Subject headings: SPECTOPHOTOMETRY/methods; TANNINS/analysis; QUERCETIN/analysis; PLANT LEAVES.REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS1. Kostennikova ZA. UV spectrophotometric quantitative determination of flavonoid in calendula tinture. Farmatsiya 1983;33(6):83-6.