nuovi approcci all’identificazione e caratterizzazione di...
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Nuovi approcci all’identificazione e
caratterizzazione di geni regolati
P
P
P
P
Nuovi approcci all’identificazione e caratterizzazione di geni regolati dallo Scatter Factor HGF e dal suo recettore Met
METASTASI
Trasformazione
Crescitainvasiva
HGF
Y
Y
Y
Y
Met
MORFOGENESI
P
P
PGab1
Grb2 PLC-γ
Ezrina
PI3Kp85
STAT
Bag1
SosRas
PI3Kp85
Sopravvivenza
Scatter
Proliferazione Grb2
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La risposta trascrizionale all’HGF
mRNA presenti allo stato basale
mRNA presenti dopo stimolazione con HGF
mRNA basaliStimolazione con HGFmRNA basali
mRNA repressi mRNA indotti
stimolazionemRNA basali mRNA basali
mRNA repressi mRNA indotti
1. DIFFERENTIAL DISPLAY
2. SUBTRACTED LIBRARIES
3. PROFILO DI ESPRESSIONE GENICA SU MICROARRAY
4. TECNICA DEL “GENE TRAP”
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SOPPRESSI INDOTTI
INVARIATI
10000 cDNA
Estrazione dell’RNA,sintesi del cDNA
e marcatura.
Campione di controllo
Campione stimolato
3. PROFILO DI ESPRESSIONE GENICA su MICROARRAY o MACROARRAY
MICROARRAY
Image from Gene-Chips (Microarray)
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2x suppressed
2x induced
Unstimulated
stim
ulat
ed
10 100 1000 10000 10000010
100
1000
10000
100000
MACROARRAY
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Molto complessacomplessaAnalisi dati
Elevati (attrezzatura)contenutiCosti
Fino a 15.000500-9000Geni analizzati
2-10 µl5-40 ml (come un Northern)Volume ibridizzazione
Sullo stesso vetrinoSu due filtri diversiIbridizzazione
Laser confocalephosphorimagerAnalisi di immagine
Fluorescenza (Cy3, Cy5)33P , 32PSistemi di rivelazione
50-100 µg RNA totale10 µg mRNA
5 µg RNA totale0.5 µg mRNA
Dimensioni campioni
MICROARRAY SU SLIDESMACROARRAY SU NYLON
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Major HGF-regulated genes and total cDNAs corresponding to extracellular matrix proteins contained on the microarray
Genes regulated by HGF >3-fold are listed in order of fold induction and italicized. In addition, all of the cDNAs corresponding to extracellular matrix proteins, extracted from a total of 8735 spotted cDNAs, are listed in alphabetical order. Average induction and SD were obtained from a triplicate comparison between unstimulated and HGF-stimulated (6h) cells.
To enrich for target genes associated with HGF-induced scattering, two experiments were performed in 0.1% serum and one in 2% serum.
MLP-29 cells respond to HGF and EGF by increasing OPN mRNA and protein
Western blot analysis of OPN protein expression by MLP-29 cells after different timesof HGF or EGF stimulation, as indicated. Total cell lysate (20 mg) was loaded per lane, followed by fractionation in 8% SDS-PAGE and immunoblotting.
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GFNR(Green Fluorescent Nitro-Reductase)
• quando una cellula esprime la proteina di fusione GFNR diventa al tempo stesso fluorescente e sensibile al Metronidazolo (MN)
GFNR
EGFP NTR
4. TECNICA DEL “GENE TRAP”
Vettore di espressione per GFNR
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Fluorescence and drug sensitivity of 293T cells transiently transfected with pEGFP, pGFNR, and pNTR. Relative pGFNR efficiency was estimated either by flow cytometric analysis (left) or by cell counting after 48 h of MN treatment (right). A fluorescence efficiency of 100% corresponds to the mean fluorescence intensity of the green fluorescent subpopulation in the pEGFP-transfected cells. A killing efficiency of 100% corresponds to the difference in cell number between mock-transfected and pNTR-transfected MN-treated cells. Error bars represent standard deviation of triplicates.
Validazione della proteina di fusione: fluorescenza e sensibilità al MN
Validazione della proteina di fusione: correlazione fra fluorescenza e sensibilità al MN
Correlation between fluorescence and MN sensitivity in stable transfectants. MLP-29 cells weretransfected with pGFNR, selected with G418, and FACS-analyzed for green fluorescence beforeand after 48 h of MN treatment. For the analysis, three classes of fluorescence were identifiedand defined as low, medium, and high. In the untreated population, the number of cells in eachclass was assigned the 100% value. After treatment, the abundance of each fluorescent subpopulation was compared with the respective control sample, and percentage of survival was estimated. Error bars are not present because data were obtained by a FACS-based population analysis.
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Vettore di espressione per GFNR e trappola genica
Gene endogeno
PromotoreEsone1 Esoni 2,3...Introne1
mRNACoda di poliA
Meccanismo di intrappolamento genico
Geneintrappolato
PromotoreEsone1 SA
TRAPPOLA GENICA
GFNR
pAPGK prom
neoEGFP NTR
Cassetta Neo
mRNA ibridoGFNR
pAPGK prom
neo
SA
EGFP NTR
Cassetta NeoCoda di poliA
Esone1
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Un reporter per i geni regolati: GFNR(Green Fluorescent Nitro-Reductase)
• quando una cellula esprime la proteina di fusione GFNR diventaal tempo stesso fluorescente e sensibile al Metronidazolo (MN)
• le cellule in cui la trappola genica è integrata a valle di un promotore attivo possono essere identificate e selezionate positivamente al FACS
• le integrazioni a valle di promotori costitutivi possono essere controselezionate mediante trattamento con MN
• le integrazioni a valle di promotori regolati dall’HGF possono essere selezionate stimolando le cellule con HGF prima della selezione positiva (geni indotti) o negativa (geni soppressi)
GFNR
EGFP NTR
Ottimizzazione delle procedure di selezione positiva
infezioneselezione contemporanea con G418
e con MN
rimozione del MN
stimolazione con HGF e isolamento (“sorting”) delle cellule
fluorescenti
screening dei cloni sopravvissuti per identificare quelli indotti dall’HGF
sopravvivono tutti i cloni che hanno integrato il DNA nel loro genoma (G418 è un analogo della neomicina)
muoiono i cloni che hanno integrato la gene trapin un gene trascritto attivamente (geni housekeeping)
le cellule fluorescenti sono quelle che hanno integrato la gene trap in un gene indotto dall’HGF
SA
TRAPPOLA GENICA
GFNR
pAPGK prom
neoEGFP NTR
Cassetta Neo
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infezioneselezione con G418
isolamento (“sorting”) delle cellule fluorescenti
stimolazione con HGFe controselezione con MN
screening dei cloni sopravvissuti per
identificare quelli soppressi dall’HGF
SA
TRAPPOLA GENICA
GFNR
pAPGK prom
neoEGFP NTR
Cassetta Neo
sopravvivono tutti i cloni che hanno integrato il DNA nel loro genoma (G418 è un analogo della neomicina)
le cellule fluorescenti sono quelle che hanno integrato la gene trap in un gene attivamente trascritto (geni housekeeping)
Ottimizzazione delle procedure di selezione negativa
muoiono i cloni che hanno integrato la gene trap in un gene housekeeping o in un gene indotto dall’HGF
sopravvivono i cloni che hanno integrato la gene trap in un gene soppresso dall’HGF
Analisi al citofluorimetro di popolazioni di cellule “trappate”
HGF induced traps
First round
HGF induced traps
Second round
HGF suppressed traps
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ANALISI CITOFLUORIMETRICA DEI CLONI
Controllo
HGF
Clone E3.2 Clone HF-57
Responsività all’HGF dei cloni intrappolati
0
10
20
30
40
50
60
1.5 - 2 2 - 3 > 3
Livelli di induzione
Abb
onda
nza
rela
tiva
(%)
010
203040506070
1.5 - 2 2 - 3 >3
Livelli di soppressione
Abb
onda
nza
rela
tiva
(%)
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RACE = RAPID AMPLIFICATION OF cDNA ENDS
Geneintrappolato
PromotoreEsone1 SA
TRAPPOLA GENICA
GFNR
pAPGK prom
neoEGFP NTR
Cassetta Neo
mRNA ibridoGFNR
pAPGK prom
neo
SA
EGFP NTR
Cassetta NeoCoda di poliA
Esone1
add oligo poly G
PCR
retrotrascrizione con primer su GFNR
primer poly C
cDNA
prodotto di PCR
Identificazione dei geni intrappolati
CCCNCNTCNC GGCNTTGTTA CNACNGCTTG CCNAAAGTAT CCAGTGAGAG AGGCAGATGCCCTGGGTGGT AGAGCAGGCT GCTGGTCTGG TCCTCTCTTC AGGAGATTTG CAACCCTGGACAGTAGCGAT ACCGTCGATC CCCACTGGAA AGACGCGAAG AGTTTGTCCT CAACCGCGAGATGGNGGCGA CGGTAGCGCT
primer della RACE gene Tmp SA EGFP
Su 10 cloni sequenziati:
2 corrispondono a geni noti: Tmp e Sprr2h
3 corrispondono a EST: AA274109, AI931556 e C89509
4 corrispondono a sequenze ripetitive
1 non corrisponde ad alcuna sequenza nota
Sequenza del prodotto di 5’-RACE del clone 3E1.8
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Specificità delle traps
0.4
2.2 2.
6
4.6
1.6
1.5 1.
9
1.7
1.2
0.6
1.7 1.8
1.0
1.8
1.2 1.3
2.6
4.0
0.2
2.3
3.8
3.0
2.3
1.7 2.
2
3.7
2.2
0.10
1.00
10.00
HF-39 E3.2(Novel)
EST Tmp E4H-20-6 Sprr2H H5-16 H5-17 Unknown
HGF FBS HGF+FBS
Fold
Indu
ctio
n
0
200
400
600
Sprr2h
GAPDH
Tempo(ore)
0 1.5 3 6 16
Abb
onda
nza
rela
tiva
(%)
0
2040
6080
100
EST AI931556
GAPDH
Tempo(ore)
0 1.5 3 6 16
Abb
onda
nza
rela
tiva
(%)
Validazione della trappola
Northern blot (RNA di cellule MLP-29 stimolate con HGF a tempi diversi)
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Conclusioni e Prospettive
• è stato sviluppato un nuovo approccio di intrappolamento genico che consente di identificare in modo veloce ed efficiente i geni la cui trascrizione è regolata da stimoli esogeni (in questo caso l’HGF)
• l’ottimizzazione delle procedure permette lo screening funzionale dell’intero genoma; sono stati così isolati numerosi cloni responsivi all’HGF
• i cloni responsivi costituiscono un insieme di cellule reporter nelle quali si possono valutare, mediante analisi citofluorimetrica, le risposte trascrizionali dei geni intrappolati, usando anche stimoli diversi dall’HGF per una caratterizzazione funzionale più dettagliata