NUKLEINSAVAKElső elkülönítés: Miescher 1869. (gennyből)

RNS (RNA)/ribonukleinsav/

DNS (DNA)/dezoxiribonukleinsav/

-sejtplazmában-peptid / fehérje szintézis vezérlése(messenger-, transfer-RNS)

-sejtmagban-genetikai információ tárolása

vízben és híg savban oldhatatlan, de lúgban oldódó, foszfortartalmú anyag

Két típus:

X

P

OH

G

P

A

OH

P

O

C(5')

C(4')

C(3')

O

P

adenilsav

guanilsav

2'3'

5'

5'

O

O

O

NH

NN

N

NH2

O

OH

PO O

O

O OH

N

N

NH2

N

N

O

PO O

O

2'3'

Az RNS felépítése

pGpA (pG-A)X

A segment of one DNA chain showing how phosphate ester groups link the 3'- and 5'-OH groups of deoxyriboseunits. RNA has a similar structure with two exceptions: A hydroxyl replaces a hydrogen atom at the 2' position ofeach ribose unit and uracil replaces thymine.

X

X

N

N NH

N1

2

34

56 7

8

9

N

N N

N1

2

34

567

8

9

H

N

Nb

a

c

d

4

51

2

3N

N

Purin

-szintelen tűkristály (op. 216 oC)

-savas (pKa: 8,9) és egybenbázikus természetű (pKb: 11,6) is

-rendhagyó számozás

-tautoméria:oldatban: 7H = 9Hszilárd fázisban: főleg 7H

9H-

7H-imidazo[4,5-d]pirimidin

X

N

NN

N

O

H

H

NH2 N

NN

N

OH

HNH2

Lactam formof guanine

Lactim formof guanine

X

A foszforsav a DNS-ben két, az RNS-ben 3 helyen észteresítheti acukor komponenst. A citidin esetében például:

NUKLEOTIDOK (bázis+cukor+foszforsav)

Enyhe hidrolízis:(enzimmel, híg lúggal/pl. 1n NaOH, 30oC, 20h/, vagyközepes savval/pl. 1n HCl, 100oC, 1h/)

citidin-2’-foszfát (2’-CMP) citidin-3’-foszfát (3’-CMP) citidin-5’-foszfát (5’-CMP)citidilsav

nukleotid = nukleozid+foszforsav

CMP = citidin-monofoszfát

O

OH O

HO

N

N

NH2

O

P

OH

O OH

2'3'

5'O

O OH

HO

N

N

NH2

O

PO OH

OH

2'3'

5'O

OH OH

O

N

N

NH2

OPHO

OH

O

2'3'

5'

X

5’-foszfátok

uridilsav timidilsav

citidilsav

I. Pirimidin nukleotidok:RNS DNS

2-dezoxicitidilsav

O

OH OH

O

HN

NO

O

P

OH

HO

O

2'3'

5'O

OH

O

HN

NO

O

CH3

P

OH

HO

O

2'3'

5'

O

OH OH

O

N

N

NH2

OPHO

OH

O

2'3'

5'O

OH

O

N

N

NH2

OPHO

OH

O

2'3'

5'

X

adenilsav

guanilsav

II. Purin nukleotidok:RNS DNS

2-dezoxiadenilsav

2-dezoxiguanilsav

2'

O

OH OH

O

N

N

NH2

N

N

PHO

OH

O

3'

5'

2'

O

OH

O

N

N

NH2

N

N

PHO

OH

O

3'

5'

2'

O

OH OH

O

NH

NN

N

PHO

OH

O

NH2

O

3'

5'

2'

O

OH

O

NH

NN

N

PHO

OH

O

NH2

O

3'

5'

X

(a) General structure of a nucleotide obtained from RNA. The heterocyclic base isa purine or pyrimidine. ln nucleotides obtained from DNA, the sugar component is2’-deoxy-D-ribose; that is, the─OH at position 2’ is replaced by─H. The phosphategroup of the nucleotide is shown attached at C5’; it may instead be attached at C3’.In DNA and RNA a phosphodiester linkage joins C5’ of one nucleotide to C3’ ofanother. The heterocyclic base is always attached through a b-N-glycosidic linkageat C1’. (b) Adenylic acid, a typical nucleotide.

O N

OHOH

OPO

OH

OH N

N

N

N

NH2

O

OHOH

OPO

OH

OH

1

2

34

567

8

9

1'

2'3'

4'

5'

1'

2'3'

4'

5'

A nucleotide Adenylic acid(a) (b)

Heterocyclic base

β-N-Glycosidic linkage

Erélyesebb hidrolízis:(cc. lúg /pl. cc. NH3, 175 oC, 3h/)

NUKLEOZIDOK (bázis+cukor)

azaz a bázisok N-glikozidjai

dezoxicitidincitidin

timidinuridin

3-(2’-dezoxi-β-D-ribofuranozil)citozin

3-β-D-ribofuranozil-citozin

RNS DNS

O

OH OH

HO

N

N

NH2

O

2'

O

OH

HO

N

N

NH2

O

2'

O

OH

HO

HN

NO

O

CH3

2'

O

OH OH

HO

HN

NO

O

2'

I. Pirimidin nukleozidok:

X

II. Purin nukleozidok:RNS DNS

2'

O

OH OH

HO

N

N

NH2

N

N

2'

O

OH

HO

NH

NN

N

NH2

O

dezoxiadenozin

dezoxiguanozinguanozin

adenozin2'

O

OH

HO

N

N

NH2

N

N

2'

O

OH

HO

NH

NN

N

NH2

O

OH

X

RNS DNS

Még erélyesebb hidrolízis: (cc. sav /pl. 72 % perklórsav, 100 oC, 1h/)

1. Foszforsav :

3. Bázisok:

2. Pentózok: (D-Ribóz illetve 2-dezoxi-D-ribóz)

P OHO

OH

OH

O

OH OH

OHHO

1'

2'3'4'

5'O

OH

OHHO

1'

2'3'4'

5'

RNS DNS

timin (T)adenin (A) citozin (C) guanin (G)uracil (U)

HN

NH

CH3

O

O 12

3 4

5

6

N

N

NH2

NH

N1

2

34

56 7

8

9

N

NH

NH2

O1

2

34

5

6

HN

N NH

N

H2N

O

1

23

4

56 7

8

9

HN

NH

O

O 12

3 45

6

X

A nukleotidok szintetikus előállítása:

nukleozidok átalakítása foszforsav-észterré

dibenzil-foszfokloridát

O

OH OH

O

N

N

NH2

N

N

P

OH

O

HO

O

O O

O

N

N

NH2

N

N

P

O

O

O

CH2

H3C CH3

CH2

O

O O

HO

N

N

NH2

N

N

H3C CH3

1. H+ / H2O2. H2 / Pd

piridin

(H5C6 CH2O)2 C Cl

O

adenilsav

P

triacetyl α-D-ribofuranosylchloride

adenosine

chloromercury salt 6-acetylamino purine

α-chloro β-glucoside

1.

2'

O

OAc OAc

AcO

N

N

NHAc

N

N

2'

O

OH OH

HO

N

N

NH2

N

N

H2OOH

+

3'

5'

1'

2'

O

OAc OAc

AcO

H

Cl

N

NN

N

NHAc

ClHg

5

4

6

9

8

7

1

23 xilol

-HgCl2

xylene

A nukleozidok szintetikus előállítása:

2.

2,3,5-tri-O-benzoyl β-D-ribofuranosylamine

β-ethoxy-N-ethoxycarbonylacrylamide

H2OOHO

OBz OBz

BzONH2

O

OBz OBz

BzO

HN

NO

O

O

OH OH

HO

HN

NO

O

+ HN

O

O

OC2H5 OC2H5

- 2 C2H5OH

Bz = benzoil C

O

C6H5

cytidine

Bz = benzoyl

A nukleotidok fizikai és kémiai tulajdonságai:-magas op.-vízben jó oldódás-színtelen kristályok-a dihidrogénfoszfát csoport miatt erős savak -lúgos hidrolízis során foszfátsó és nukleozid keletkezik-savas hidrolízis során pedig bázis és pentózfoszfát keletkezik

H2OOH

H2OH

O

OH OH

O

N

N

NH2

N

N

P

OH

O

HO

O

OH OH

HO

N

N

NH2

N

N

O

OH OH

OP

OH

O

HO

OH+

Na3PO4

N

N

NH2

NH

N

+

adenilsav

adeninadenozin

+O

OH OH

HO

OH

N

NH

O

NH2

N

N

NH2

NH

N

+ O

O

CH2 CH2

COOH

O

H3C

0,01N H2SO4100 oC

10% H2SO4125 oC

CH2 CH2

COOH

O

H3C

O

OH OH

HO

N

NO

NH2

2'

2'

O

OH OH

HO

N

N

NH2

N

N

A nukleozidok fizikai és kémiai tulajdonságai:-magas op.; vízben jó oldódás; színtelen kristályok

-lúggal nem, viszont híg savval hidrolizálható a glikozidos kötésnukleozid ⇒ bázis + cukor (vagy annak származéka)

pl.

adenin

citozin

ribóz levulinsav(γ-keto-valeriánsav)

furfurol levulinsav(γ-keto-valeriánsav)

(dezoxi)adenozin

(dezoxi)citidin

O

OH OH

HO

N

NO

NH2

6

O

OH OH

HO

N

NO

OH

6

O

OH OH

HO

HN

NO

O

6

HNO2

citidin uridin

CH2N2

cc. HNO3, cc. H2SO4

O

OH OH

HO

HN

NO

O

NO25

O

OH OH

HO

N

NO

O

H3C 1

1-metiluridin 5-nitrouridin

N

N

NH2

N

N

rib

N

N

O

N

N

ribNH2

adenozin

guanozin

rib = ribofuranozil

Adenozin-trifoszfát (ATP)

3' 2'

O

OH OH

O

N

N

NH2

N

N

P

OH

O

OR5'

Adenozin-monofoszfát (AMP) = adenilsav

Adenozin-difoszfát (ADP)

Adenozin-trifoszfát (ATP)

R = H

R = P

O

OH

OH

R = P

O

OH

O P

OH

OH

O

Nukleotid koenzimek

energiatermelõfolyamatok

energiafelhasználófolyamatok

ADP

ATP

30 kJ / mol(~126 kcal / mol)

X

3',5'-Cyclic adenylic acid (cyclic AMP) and its biosynthesis and laboratory synthesis.

N

N

N

N

NH2

O

OHO

P

O

O

O-

ATP

AMP

pyrophosphate

Adenylate cyclase

dicyclohexyl-carbodiimide

Cyclic AMP

Biosynthesis

ChemicalSynthesis

X

Koenzim-A (CoA) Lipmann 1946.

• acetilezéseket katalizáló enzim pl. anyagcsere folyamatokban; • in vitro az acetil-CoA a fehérjék poszt-transzlációs módosításának fontos

eszköze, mivel a biológiai hatást módosítani tudja az acetilezés;• a fehérjék azido-biotinnal és fém-alkinoáttal rézsók jelenlétében színes [3+2]

cikloaddíciós terméket adnak, amely diagnosztikai jelentőségű.

R=H : koenzim-AR=acetil : acetilkoenzim-A

3' 2'

O

OH OH

O

N

N

NH2

N

N

PO

PO

O O OHHOOH

O

NH

O

NH

SR 5'

X

Krebs-cyclus

+ CO2

COOH

C O

CH2

COOH

CH2

C

CH2

COOH

HO COOH

COOH

citromsavoxálecetsav

CH3C

O

COOH

piroszőlősav

CH3C

O

S CoA

acetil-CoA

citrát szintáz

CoA SH

NAD+

NADH

CoA SH

Pyruvic acid

Krebs cycle

Acetyl CoA

Citrate synthase

Oxalacetic acidCitric acid

Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)

N+

O

CH2OOHOH

P

C

O

NH2

O

O

O-

P O

O

O-

CH2 O

N

OHOH

N

N

N

NH2

AdenineNicotinamide

Ribose

Ribose(a sugar)

Pyrophosphate

Harden és Young 1904.

Biológiai oxidálószer: oxidálja (dehidrogénezi) pl. a cukrokat, zsírokat, azaz energiát termel

Az oxidáció mechanizmusa: /hidridanion átadás/

NAD+ NADH

oxidáció

NAD+

NADH

oxidálandómolekula

redukálandómolekulatermék

termék

redukció

N

NH2

O

R

H

N

NH2

O

R

H H

H+ +O

H

R+R

H

H

OH

X

O

CH3OH

O

N+

NH2

R

O

N

NH2

R

OH H

H++

NAD+NADH

OH

CH3OH

O

H

Pyruvic acid Lactic acid

Lactate dehydrogenase(regenerates NAD+ in muscleunder anaerobic conditions)

C OMeD

+

50% 50%

red.

Me

HD OH

Me

DH OH

S R

NADH + alkohol dehidrogenáz

proS

proR

Me

HSHR OH

C OHS

Me C OMeHR+

50% 50%

ox.

NAD+ + alkohol dehidrogenáz

-HR

R = rectus; S = sinister

proR

C

D

O

Me

NADHNAD+

Ha R királis, akkor Ha és Hb hidrogénekdiasztereotóp viszonyban vannak.

Az enzimtől függ, hogy a hidrogén a prokirálisNAD+ melyik oldalán lép be.

- glükóz ox. (NAD+ és májenzim): csak a Hb- etanol ox. (NAD+ és élesztőenzim): csak a Ha lép be

N

NH2

O

R

Ha Hb

N

NH2

O

R

P

OH

G

P

A

OH

P

O

C(5')

C(4')

C(3')

O

P

adenilsav

guanilsav

2'3'

5'

5'

O

O

O

NH

NN

N

NH2

O

OH

PO O

O

O OH

N

N

NH2

N

N

O

PO O

O

2'3'

Az RNS felépítése

pGpA (pG-A)

A segment of one DNA chain showing how phosphate ester groups link the 3'- and 5'-OH groups of deoxyribose units.RNA has a similar structure with two exceptions: A hydroxyl replaces a hydrogen atom at the 2' position of eachribose unit and uracil replaces thymine.

N

N

N

N

N

R

HH

N

N

CH3O

O

H

R

N

N

N

N

N

O

RH

H

H

N

N

N

O

HH

R

N

CH3

O R

O

HNNH

N

N

N

N

O

R

H

H

2-dezoxiadenilsav - timidilsav 2-dezoxiguanilsav - 2-dezoxicitidilsav

Bázispárok:

2-dezoxiguanilsav - timidilsavnem létezik

Következtetés: 1. A + G = T + C 2. A = T és G = C (Chargaff szabályok)

X

Chargaff pointed out that for all species examined:

1. The total mole percentage of purines is approximately equal to that of the pyrimidines,

that is, (%G + %A)/(%C + %T) = l.

2. The mole percentage of adenine is nearly equal to that of thymine (i.e., %A/% T = l),

and the mole percentage of guanine is nearly equal to that of cytosine (i. e., %G/%C = 1).

~

~

~

cukor foszforatom

Antimetabolitok:1. Fólsav-antagonisták

N

N N

N

1

2

3

4 5

6

7

8

pteridinsárga kristályok

(op. 140 oC)

N

N N

N

X

H2N

N

R

O

NH

COOH

COOH

2

4

6

N

N NH

N

OH

H2N

N

H

O

NH

COOH

COOH

2

4

6

H

N

N NH

N

OH

H2N

N

C

O

NH

COOH

COOH

O H2

4

6

H

fólinsav

tetrahidrofólsav

a timin C5-CH3 csoportjátvalamint az adenin/guaninC-2 és C-8 atomját adja

glutaminsav

pteridinp-aminobenzoil

fólsav reduktáz

X = OH, R = H : fólsav

X = NH2, R = CH3 : methotrexate

enzim bénítás: nem keletkezik fólinsav

X

Metotrexat

fólsavNH

N CH2-NH-H

tetrahidrofólsav (THFS)

H

NH

N CH2-N-

HC

O

fólinsav

(metiléntetrahidrofólsav)Uracil Timin

Purinszintézis(fólinsav = N10-formil-THFS)

Metotrexat (gátló)

N

N

N

N

OH

H2N

CH2 NH

1

2

3 45

6

7

8

Ar10

H

N

N

N

N

OH

H2N

CH2 NH

H1

2

3 45

6

7

8

Ar10

H

N

N

N

N

OH

H2N

CH2 NH

H

HH

1

2

3 4

56

7

8

Ar10 10

Methylengruppe

H

N

N

N

N

OH

H2N

CH2

H

HNAr

1

2

3 4

56

7

8

fólsav 7,8-dihidrofólsav

5,6,7,8-tetrahidrofólsav N5,N10-metilén-5,6,7,8-tetrahidrofólsav

metiléncsoport

H3C

Uracil Timin

N5,N10-metilén-5,6,7,8--tetrahidrofolát

7,8-dihidrofolát

10

Methylengruppe

H

N

N

N

N

OH

H2N

CH2

H

HNAr

1

2

3 4

56

7

8 H

N

N

N

N

OH

H2N

CH2 NH

H1

2

3 45

6

7

8

Ar10

Biológiai körülmények között – l. biokémia

metiléncsoport

2. Pirimidin-antagonisták2a. Timin-antagonisták

2b. Uracil-antagonisták

HN

NH

CH3

O

O 12

3 4

5

6O

HO

HN

NO

O

CH3

N3

2'3'

3’-azido-3’dezoxitimidinAZTAIDS

HN

N

O

O

F

R

O

O

HO

HO2'3'

1'

O

O

HO

P

OH

HO

O

HN

NH

O

O 12

3 45

6

R = H 5-fluoruracil PHTORURACIL

N 1-(2’-furanidil)-5-fluoruracilFTORAFUR

2-dezoxiribozil-1’-5-fluoruracilFLOXURIDIN

gátolja a timidilát

szintázt és beépül az

RNS-be

3. Purin-antagonisták3a. Adenin-antagonisták

N

NNH

N

2

34

56

7

8

9

1

O

OH OH

HO3PO

N

N

OH

N

N

O

OH OH

HO3PO

N

N

NH2

N

N

O

OH OH

HO3PO

N

N

NH

N

N

CH COOHH2CHOOC

CH CHHOOC COOH

adenilsavinozinsav

NH2

CH CH2HOOC COOH

aszparaginsav

fumársav

- H2O

+ aszparaginsav

+

N

N

SH

NH

N N

N

S

NH

N

CHH2C COOHHOOC

- NH3

6-merkaptopurin: reakcióba lép az aszparaginsavval

+ aszparaginsav

3b. Guanin-antagonisták

HN

N N

N

H2N

O

OHO

9

9-[(2-hidroxietoxi)metil]guaninACYCLOVIRHerpes simplex

4. Nukleozid-antagonistáknukleozidok módosított cukorrésszelpl.

O

OH

HO

N

N

NH2

O

OH

citozin-arabinozidARA-C

aracitidin-trifoszfát(DNS-polimeráz gátló)

PurinN

N NH

N

9

N

N N

N1

2

34

56

7

8

9

H

Purinvázas vegyületek előállítása

1. Mindkét gyűrű kialakításával

2. Csak az egyik gyűrű kialakításával

A lehetőségek vizsgálataretroszintézissel

N

N N

N1

2

34

5

N

N N

N

1

2

34

5

N

N N

N

28

A BC-2 és C-8 a hangyasav

oxidációs fokán van

adenin

purinH C

NH2

O N

N NH

N

9

H C NN

N

NH2

NH

N6

9

NH3

„A” út

„B” út

H2N

H2N N

N

O

R1

2

34

5

HCOOH HN

N N

N

O

R

purin guanin

4

RN

N NH2 4

RN

N NH2

N O5

4

RN

N NH2

NH25HNO2 red.

4-amino- 4-amino-5-nitrozó- 4,5-diamino-szárm.

4

N

N NH2

N O5N

N NH

NHCOOH

Zn

N

N NH

N

OH

H2N

HN

N NH

N

H2N

O

1

23

65

4

N

N NH2

NH2

H2N

OH

HCOOH

2,4,5-triamino-6-hidroxipirimidin

/Traube 1910/

X

Purin reakciói

1. Bázicitás

2. Alkilezés

N

NH

NH

N1

2

34

56 7

8

9

Az N-3 atomon protonálódik, de egybengyengén savas tulajdonságú (pKa: 8,9) is.

Az N-7 és / vagy az N-9 atomon alkileződik a reagenstől függően.

N

N N

N

CH3

CH37

9

N

N N

N

CH3

9

N

N N

N

9

N

N N

N 7

N

N NH

N 7

9

H3C C

O

O CH CH2CH3I

(CH3)2SO4

CH3OH

X

3. SNArN

N NH

NKNH2

foly. NH3 N

N NH

N

NH2

6

6-aminopurin

2

6

8

Cl

N

N NH

N

Cl

ClN

N NH

NH

H2N

O6

8

2

N

N NH

N

Cl

OH

Cl

2

6

8 NH3 N

N NH

N

OH

Cl

H2N

6

8

2

NaOHH2O

red.-HCl

guanin

8-klórguanin2,8-diklór-6-hidroxipurin

2,6,8-triklórpurin

Chichibabin-reakció

Halogénszubsztituensek esetén a halogénatomok lecserélhetők C-6, C-2, C-8 sorrendben:

2

4

Cl

N

NCl 2

4

Cl

N

NHO

NaOHH2O

+2

4

OH

N

NCl

2

4

Cl

N

NCl

NaOHH2O

2

4

OH

N

NCl

csak a 4-hidroxi származék képződik

a 2- illetve 4-hidroxi származék 1:1 arányban képződik

N

NCl

N

NOH

NaOHH2O

SN-Ar reakció csak erélyes körülmények közt kivitelezhető X

4. Dimroth-átrendeződés

1

3

6

24

5NH

NH

NH

N

NH

H3C

O

H

1

3

6

24

5H2N

NH

NH

N

N

O

H

H3C

1

3

N

N NH

N

NH

H3C 6

2 4

5 7

8

9

1

3

N

N NH

N

NHCH3

6

2 4

5 7

8

9

H2O / -OH

- H2O

- H+, + H+

6-imino-1-metil-1,6-dihidropurin

6-metilaminopurin

2. Xantin-származékok

Természetes származékok

HN

NH

NH

N

O

O

O

2

6

8

H

1. Húgysav

HHN

NH

N

N

O

O

2

67 N

N N

N

O

O

R1

R2R3

3. Purin-bázisok

xantin

adenin guaninN

N

NH2

NH

N6

9

HN

N NH

N

H2N

O

2

6

9

R1,R2 = CH3, R3 = H : teofillin/Thea chinensis/

R1,R3 = CH3, R2 = H : teobromin/Theobroma cacao/

R1,R2,R3 = CH3 : koffein/Coffea fajok/

X

A nukleotidsorrend meghatározása

Humán Genom Projekt (HUGO)

MAXAM és GILBERT kémiai szekvenálási módszere lebontással (1977):

DNS kettős hélix

Feldarabolás ún. restrikciós enzimekkel

kétszálú DNS fragmentumok

Láncvégi foszforsavak hasítása enzimmel

PP

32P izotóppal jelölt foszforsavval enzimatikusan újraészteresítik

PP

A két szál elválasztása egymástól

P PAz egyik szálat tartalmazó mintát négyfelé osztják

+

X

P P P PG és (A)

dimetilszulfát+ hidrolízis

A és (G)HCOOH

+ hidrolízis

C és TH2N-NH2

+ hidrolízis

csak C H2N-NH2 + NaCl

+ hidrolízis

Részleges hasítást idéznek elő a megadott reagensekkel a megadott nukleotidoknál. A reagensek amegfelelő bázisokkal reagálva idézik elő a szálhasadást. Így a négy „lombikban” különbözőhosszúságú fragmentumok keletkeznek, majd mind a négy mintát gélelektroforézisnek vetik alá.

Gélelektroforézis: géllel töltött csövecske vagy lemez, melyre rárétegzik a gélt. A lemez/cső egyikvégén van a minta (ld. VRK), majd a lemezre/csőre egyenfeszültséget kapcsolnak. A polianionoligonukleotidok a „+” töltésű anód felé vándorolnak, mégpedig annál gyorsabban, minél kisebb amolekulatömegük. A lemezt/csövet a kifejlesztés után valamilyen módszerrel előhívják.

32P GTTCTAGCCT nukleotidsorrend esetén

G és (A) A és (G) C és T csak C

GTTCTAGCCTGTTCTAGCCGTTCTAGCGTTCTAGGTTCTAGTTCTGTTCGTTGT

32P G X

SANGER „didezoxi” szekvenálási módszere (1979):Alapelve: az enzimkatalizált DNS szintézis irányított megszakítása 2’,3’-didezoxi-ribózzal

CTAG

4 részre osztás + DNS polimeráz

+ primer (3’-ATGCATG-5’)

5’-AGTTCTAGCCTTACGTAC-3’

5’-AGTTCTAGCCTTACGTAC-3’3’-ATGCATG-5’

5’-AGTTCTAGCCTTACGTAC-3’3’-TCAAGATCGGAATGCATG-5’

TCAAGATCGGACAAGATCGGA

AAGATCGGAAGATCGGA

GATCGGAATCGGA

TCGGACGGA

GGAGA

A

G-reakciódATPdCTPdGTP*ddGTPdTTP

C-reakciódATPdCTP*ddCTPdGTPdTTP

A-reakciódATP*ddATPdCTPdGTPdTTP

T-reakciódATPdCTPdGTPdTTP*ddTTP

X

Enzimatikus DNS szekvencia analízis (Sanger módszer)

5’ → 3’ nukleotidokN → C peptidek(terminális)

Aminosavak – 20 féle → peptidek (néhány száz aminosav)

Szerves bázis – 4 féle → Polinukleotid milliós nagyságrendű: vírusokban kb. 3 ezer mononukleotidE. Coli baktériumban 4,7 millió mononukleotid(4,7 megabázispár)emberi genom 3,5 milliárd mononukleotid (3,5 gigabázispár)

X

Elve a következő: a vizsgálandó szekvencia (elsődleges szerkezet)ismeretlen, ez a célszekvencia (target sequence, matrica).Ha megvan a 4 szerves bázis, akkor a DNS polimeráz enzim amononukleotidokat összekapcsolja a target komplementerénekmegfelelően. De ahhoz, hogy a DNS szintézis egyáltalánmegindulhasson, kell egy rövid nukleotid szekvencia, a primer,ugyanis a DNS polimeráz csak megkezdett láncot tud növelni,láncot nem tud elkezdeni. A primert vagy szintetizáljuk, vagyhidrolízissel nyerjük ki. Ez nem a sejtben, hanem a lombikban megy.P: primer, T: target. P rövidebb a T-nél, a T kilóg; folytatódik.P és T hidrogénhidakkal kapcsolódik egymáshoz.

X

Ezután a P-T egységet 4 kémcsőbe leosztjuk és mindegyik mintához olyanmononukleotidot adunk, amely dd nukleotidot, azaz 2’,3’-didezoxi-nukleotidot (dd) tartalmaz. De emellett 2’-dezoxi-nukleotid is van(feleslegben) a mintában. A dd hozzáadása azért szükséges, hogy aláncfelépülést leállítsuk abban a láncban, ahová ez a didezoxi nukleotidbeépül. Amint ez beépül, a láncszintézis megáll. A dd-ból csak kismennyiséget adunk hozzá, ha sokat adnánk, akkor minden lánc leállna ott,ahol dd lenne. Tehát d ATP+dd ATP, d GTP+dd GTP, stb. van akémcsövekben; így sok ilyen dd-lánc is fog képződni (és a láncszintézis istovább fog futni abban a láncban, ahol nincs dd – mindezek egy adottkémcsőben együtt mennek végbe, egymás mellett). A képződött láncokategymástól szét kell választani. Mivel töltéssel rendelkeznek,elektroforézissel szétszedhetjük. A dd építőkő foszforsav egysége 32P*radioaktív izotóppal jelölt az interferogram láthatóvá tétele miatt. Anégyféle mintát külön sávban futtatjuk, mivel tudjuk, hogy a sebesség alánchosszal fordítottan arányos, másrészt, amelyik láncban nincs 32P*izotóp, az nem világít a gélelektroferogramon. Poliamid gélen elektromoserőtérben fut a minta. Azért megy lassabban a hosszabb minta (lánc), merta diffúziós sebesség a relatív molekulatömeggel fordítottan arányos. X

A szintetizált szekvencia komplementer szekvenciája tehát az eredeti(target) szekvencia (matrica).

Azt tudjuk, hogy melyik kémcsőbe melyik dd-t (dd ATP, dd GTP, ddCTP, dd TTP) tettük, valamint azt is, hogy melyik oszlopban melyik dd-ttartalmazó mintát futtatjuk. Adott oszlopokon futtatott láncokban mindigcsak adott (egyféle) dd épülhet be (a kémcsövekbe való elkülönítés utánmidegyik kémcsőbe csak egyfajta dd-t adtunk). Így, ahol a szintetizálandószekvenciában az adott bázis előfordul, ott lesz:

a) egyrészt olyan lánc, amelynek a szintézise az adott nukleotidnál álltle;

b) másrészt olyan lánc, amelyiknek nem állt le a szintézise (mert abbaa láncba pl. nem dd ATP, hanem d ATP jutott).

X

Az a) esetben minden olyan helyen megáll a láncszintézis, ahol az adott ddnukleotidnak kell beépülnie (← az eredeti szekvenciához igazodva). Ha pl. többhelyen van A a láncban, akkor az egyik lánc szintézisénél − mondjuk az első A-nál − szakad meg a láncfelépülés, egy másik (ugyancsak ugyanebben akémcsőben menő reakciónál) lánc szintézisénél pedig a második A-nál: ezek aformák statisztikusan kiegyenlítődnek.

Ha az A gélelektroferogram-oszlopban van az első folt (vízszintes világító csík),akkor dd A épült be először. Mivel mind a négy kémcsőben azonos a felépült(felépítendő, szintetizálandó) szerkezet, megnézzük, hogy hol (melyikkémcsőből kitöltött oszlopban) van a következő folt – ha ez a T oszlopban van,akkor a sorrend AT (mivel ott csak dd T épülhet be; másrészt a két foltközvetlenül egymás után jön). A kicsit magasabban levő folt azt jelzi, hogy az alánc ez kicsivel hosszabb, mint az alatta levő. Alacsonyabban levő folt: amelyiklegtávolabb jut az elektroferogramon. A radioelektroferogramot automatávalhozzák létre, lefényképezik, computerben tárolják.

X

Ez az elsődleges szerkezet meghatározása volt, tehát az, hogy anukleotid-egységek milyen sorrendben kapcsolódnak egymáshoz.A másodlagos szerkezet a hélix csavarodása antiparalell(egymással szembeni) irányban.

Peptidekben 20 betűs abc (20 aminosav jelölése)Nukleotidokban 4 betűs abc (4 bázis)Szabályos térszerkezet → szabályos tulajdonságok

X

Az oligonukleotidok előállításaautomatizált szilárd fázisú szintézissel

N N

NN

H

DMTr OB3

O

O

PH3CO N(iPr)

I2 H+

B2O

O

HO

PH3CO

O

OB1

O

OCPG

OB3

O

O

PH3COB2

O

O

O

PH3CO

O

OB1

O

O

O

H

CPG

DMTr OB3

O

O

PH3COB2

O

O

O

PH3CO

O

OB1

O

OCPG

DMTr OB3

O

O

PH3COB2

O

O

O

PH3CO

O

OB1

O

O

O

CPG

B1, B2, B3 = bázisok

CPG "controlled pore glass"(szilárd fázis)

DMTr = dimetoxitritilC OCH3H3CO

tetrazol

foszforamiditszármazék

I. KAPCSOLÁS

II. OXIDÁCIÓ III. DETRITILEZÉS

N-Tetrazolil

X

X

X

X

Kémiai polinukleotid szintézis (Coronther módszer)

Foszfátészter kötés kialakítása a cél. Nukleotidokösszekapcsolásához legalább bifunkciós vegyületből kellkiindulni és tudnunk kell azt, hogy melyik mononukleotid melyrészét akarjuk a másik mononukleotid megfelelő részévelkapcsolni.

X

A lombikban először 3’-höz foszforegységet kapcsolunk, amellyelreaktívvá tesszük, majd ez fog reagálni egy másik egység 5’ szabadOH csoportjával.

Védelem: az aminocsoportot szelektíven nem lehet acilezni ahidroxilcsoport mellett, mert az aromás aminocsoport kevéssénukleofil. Lúggal csak az észterkötés bomlik, mivel a savamidstabilabb az észternél ← N védelem mindkét nukleotidban.

5’–OH csoport védelme: DMT–Cl-dal (dimetoxitritil-kloird)piridinben csak a primer OH csoport reagál, a szekunder OH nem,mivel előbbi reagenssel szemben reaktívabb. (Hasonlóan aszénhidrátok reakcióihoz, csak a primer OH csoport reagáltrifenilmetil-kloriddal, azaz tritil-kloriddal.) Másrészt a reagens nagytérkitöltésű, ezért is csak a primer OH-val lép reakcióba ← védett (ésaktivált) N2 nukleotidban. Így egyik nukleotidban a 3’ szabad és az 5’védett – de kell egy másik nukleotid, amelyben a 3’ a védett és az 5’ aszabad. X

3’–OH csoport védelme: védett N1 nukleotidban benzoilezéssel. ADMT csoportot az 5’–OH-ról száraz sósavgázzal le lehet szakítani,de csak ebben a nukleotidban kell lehasítani. Az 5’–OH csoportszabad, az összes többi funkciós csoport foglalt az N1-ben.Lehetne kapcsolni az N2 3’–OH csoportjával elvileg, de az nemelég reaktív. Ezért reaktívvá kell tenni.

3’–OH csoport reaktívvá tétele ← védett N2-ben foszforossav-észteramid-kloriddal vagy más csoporttal.

X

A gének szerepének kutatásaTradicionális módszer: a kísérleti állatokban mesterségesen előidézett mutációvalvéletlenszerűen módosítanak vagy törölnek géneket, majd megfigyelik a hatást azutód állatokban. Probléma: magasabb rendű állatokban (pl. gerincesek) számosnehézségbe ütközik a módszer alkalmazása (pl. kevés a leszármazott, hosszú 1-1generáció periódusa és a legérdekesebb mutációk gyakran letálisak).

Reverz genetika: (új megközelítés) klónozott gén manipulálásával találják ki, hogyanműködik a vizsgált gén. A manipuláció egyik módszere esetében olyan oligonuk-leotidot (kb. 15 bázisból álló „nukleinsav”) állítanak elő, mely a vizsgált génbizonyos részének kiegészítő (komplementer) párja. Ez az ún. antiszenz oligonukleo-tid, mely tehát képes a vizsgált DNS egyik szálának ún. szenz szekvenciájáhozkapcsolódni. Így módosulhat vagy akár meg is szünhet a gén aktivitása.

pl. ha a DNS szenz része: A-G-A-C-C-G-T-G-Gakkor az antiszenz oligonukleotid: T-C-T-G-G-C-A-C-C

Mivel számos vírus és baktérium a saját génjei közül többnek is hasonlóan végzi aregulációját, bizonyos vírusok (pl. HIV) kulcsfontosságú génjeinek dezaktíválásailyetén módon nagy gyógyászati lehetőségeket rejt magában.