nukleinsavak kimutatása, szekvenálás
DESCRIPTION
Nukleinsavak kimutatása, szekvenálás. A nukleinsav kimutatás. etidiumbromid 3,8-diamino-5-etil-6-fenil-fenantrédiumbromid l g =254-366 nm l e =590 nm. Br -. X= O: YOYO-1 X= S: TOTO-1. AC. AGCT. OH. AC. G. 3’. 3’. 3’. P. P. P. P. P. OH. 5’. 5’. Rövidítések. bázis. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Nukleinsavak kimutatása, szekvenálás
N+
C2H5
NH2 NH2
A nukleinsav kimutatás
etidiumbromid3,8-diamino-5-etil-6-fenil-fenantrédiumbromid
g=254-366 nm e=590 nm
Br -
N+
X
CH3
CH N (CH3)2 N+
CH3
CH3
(CH2)3 N+
CH3
CH3
(CH3)2 N
N+
X
CH3
CH
X= O: YOYO-1X= S: TOTO-1
Rövidítések
A G C Tbázis
cukorrész
A C
P P OH
foszfodiészter kötés
3’ 3’
5’ 5’
A C
P P
3’ 3’
5’
G
P OH
3’
5’
pApCpG [ACG]
Rövidítések
A G C Tbázis
cukorrész
A C
P P OH
foszfodiészter kötés
3’ 3’
5’ 5’
A C
P P
3’ 3’
5’
G
P OH
3’
5’
pApCpG [ACG]
Szekvencia meghatározása
1. Fragmentálás restrikciós enzimekkel(W. Arber, H. Smith, D. Nathans)
5’ GAATTC 3’3’ CTTAAGC 5’ EcoRI
törzs
E.coli
5’ GGCC 3’3’ CCGG 5’ Hae III
Cél: feldarabolás
Bam HI G/GATCC Bacillus amyloliquefaciensH
Bst I G/GATCC Bacillus stearothermophilus1503-4R
Eco RI G/AATTC Escherichia coli RY 13
Fok I GGATGN9/CCTACN13/
Flavobacterium okeanokoites
Hind II GTPy/PuAC Haemophilus influenzae Rd
Hind I A/AGCTT Haemophilus influenzae Rd
Hpa II C/CGG Haemophilus parainfluenzae
Msp I C/CGG Moraxella spezies
Not I GC/GGCCGC Nocardia otitidiscaviarum
Sac I GAGC/TC Streptomyces achromogenes
Sau 3A /GATC Staphyllococcus aureus 3A
Sma I CCC/GGG Serratia marcecescens Sb
Xma I C/CCGGG Xanthomonas malvacearum
Néhány II-es tipusú restrikciós enzim (>2000)
2a. Kémiai módosítás/hasítás(A. Maxam, W.Gilbert, 1977)
Homogén „Single-stranded”DNS minta előállítása
1. lépés
5’ATTGACTTAGCC3’
2. lépés Jelölés 5’-végen 32P (*)(polinukleotid kináz)
*ATTGACTTAGCC 12 mer3. lépés
Kémiai hasítás
G reakció A reakció+
G reakcióT reakció
+C reakció
C reakció
*ATTGACTTAGCC *ATTGACTTA *ATT
*ATTGACTTAGCC *ATTGACTTA *ATTGACTT *ATTG *ATT
*ATTGACTTAGCC *ATTGACTTAGC *ATTGACTTAG *ATTGACT *ATTGAC *ATTGA *AT *A
*ATTGACTTAGCC *ATTGACTTAGC *ATTGACTTAG *ATTGA
4. lépés: elektroforézis5. lépés: autoradiográfia
6. lépés: szekvencia leolvasás
Kémiai hasítás: Purinok
G reakció
S
O
O
OCH3H3CO
NH
N
NHN
NH2
O CH3
C
O
H
NH2
+
C N+
CHCHCCH2
OH H
CH
OH
H
O
CH2O
P OO-
O
P
O
O-
OH
N+
5’
O-
O-
O
O
P5’
3’
NHN
NHN
NH2
O
OH
O
CH2O
P OO-
O
P
O
O-
OH
CH3
C
O
H
5’
3’
O-
O
O-
O
P
3’
5’
NN
NHN
NH2
O
OH
O
CH2O
P OO-
O
P
O
O-
OH
CH3
3’
+NN
NHN
NH2
O
OH
O
CH2O
P OO-
O
P
O
O-
O5’
3’
7
OH -
piperidin
OH -
Dimetilszulfát
A > G: A reakció
NN
NN
NH2
CH3
CCHCHCCH2 O
OH H
+
O-
O-
O
O
P5’O
-
O
O-
O
P
3’
S
O
O
OCH3H3CO
Dimetilszulfát
0 oC, 0,1 M HCl2 óra
CHOH
O
O
O
O-
O
P
P O
O
O-
O
5’
3’
N
OO
O
O
O-
O
PN
NN
NH2
P O
O
O-
5’
3’
N
OO
O
O
O-
O
P
N+
NN
NH2
P O
O
O-
CH35’
3’
3
pH 7 90 oC
OH -
Kémiai hasítás: Pirimidinek
NO
O
O
O
O-
O
P
NH
O
O
CH3
NO
O
O
O
O-
O
P
N
NH2
O
NHNH
OCH3
NNH
NH2
O
C
NH2 NH2
OHO
O
O
O-
O
PH
N NH2
OHO
O
O
O-
O
PH
N NH2
H
NH2 NH2hidrazin
+
piperidin
2-dezoxiribozil-hidrazon
4-Me-3-pirazolon3-amino-pirazol
Urea
timincitozin
Hasítás a 3’ végen
3’
3 3
21
3’3’
5’5’
A. C + T: T reakció
CCHCHCCH2 O
OH H
O-
O-
O
O
P5’O
-
O
O-
O
P
3’
N
NH2
O
O
CH3
OOO
O-
O
P
O
P O
O
O-
NH
NH
3’
5’
N
NH2
O
CHOH
OO
O-
O
P
O
P O
O
O-
3’
5’OH
O
O
O
O-
O
PH
N+
P O
O
O-
3’
5’
OHO
O
O
O-
O
PH
N NH2
P O
O
O-
3’
5’
N
NH
O
O
CH3
OOO
O-
O
P
O
P O
O
O-
3’
5’NH2 NH2hidrazin
piridin
NH
OH -
B. C reakció
N
N
NH2
O
OO
O
O
O-
O
P
P O
O
O-
N
NHNH2
N
NH2
O
OO
O
O
O-
O
P
P O
O
O-
N
NHNH2
NO
OO
O
O
O-
O
P
P O
O
O-
NH2
NO
CHOH
O
O
O
O-
O
P
P O
O
O-
CHOH
O
O
O
O-
O
P
P O
O
O-
N NH2
+
+
+
CCHCHCCH2 O
OH H
O-
O-
O
O
P5’
O-
O
O-
O
P
3’
OHO
O
O
O-
O
PH
N+
P O
O
O-
3’
5’
OH -
piridin
NH
NH2 NH2hidrazin
1 M NaCl
5’5’
5’
5’
5’
3’
3’
3’
3’3’
Példa: G hasítás után
13121110987654321
*ATTGAACTTAGCC
*ATTGAACTTAAACTTAGCC
AACTTA
*ATT
CC
Ele
ktro
foré
zis
Fragmens hossz
+ +
Színezékkel festett(minden csik)
Autoradiográfiás módszerrel jelzettgél („izotóp” csik)
Maxam-Gilbert módszer - kiértékelés
2b. Didezoxi beépítés-enzimes módszer
(F. Sanger et al., 1977)
2b.1 Didezoxi nukleotid jelölése
O
H
B
H
H
H
H
H
OPPO
H
B
H
H
H
H
H
OPPP32
Fluorofór (fluoreszcens jelölés, L. E. Hood, 1986)
32P
Radioaktív izotóp (32P)
2b.2 A DNS-polimeráz müködésének blokkolása
3’ GAATTCGCTAATGC 5’ CTTAA
szekvenálandó DNS
primer
DNS polimeráz IdATP, dTTP, dCTP, dGTP+ didezoxi analóg (ddATP)
3’ GAATTCGCTAATGC 5’ CTTAAGCGATTA
3’ GAATTCGCTAATGC 5’ CTTAAGCGA
+4 edény4 analóg
2b.3 Gélelektroforézis
Leolvasás - komplement szál
5’ 3’
3’ 5’DNS polimeráz
ddTTP ddCTP ddGTP ddATP
(32P)
T C G A
DENATURÁLÁS
ELEKTROFORÉZIS
AUTORADIOGRÁFIA