next generation sequencing (ngs) revolution i den kliniska ... · wizard® genomic purification kit...
TRANSCRIPT
Next Generation Sequencing (NGS) –
Revolution i den kliniska vardagen?
Paula Mölling, Molekylärbiolog, Docent Laboratoriemedicinska länskliniken
Molekylärdiagnostik & FOU
Universitetssjukhuset Örebro
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
INNEHÅLL
BAKGRUND – DNA
HISTORA – DNA SEKVENSERING
NEXT GENERATION SEQUENCING
MISEQ - ILLUMINA
DATA ANALYS
KLINISKA APPLIKATIONER
FORSKNING till KLINISK APPLIKATION
NGS SOM RUTINANALYS
SAMMANFATTNING
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
BAKGRUND - DNA
1953 Dubbelhelix – Watson & Crick
James D. Watson, 1928
Francis Crick, 1916
Baser: G=Guanin
C=Cytosin
A=Adenin
T=Thymin
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
1975 Sanger sekvensering
(stoppnukleotider)
1977 Maximam - Gilbert sekvensering
(kemisk nedbrytningssekvensering)
1977 Utveckling av Sanger sekvensering
HISTORA - DNA SEKVENSERING
Walter Gilbert, 1932
Frederick Sanger, 1918
G* C* A* T*
G*
G*
G*
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
1977 Bakteriofag X174
1984 Epstein-Barr-virus, 170 tusen bp
1987 1:a Helautomatiska DNA
sekvenserings maskinen ABI 370
HISTORA - DNA SEKVENSERING
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
1995 1:a bakteriegenomet Haemophilus influenzae 1,8 miljoner bp
1996 Pyrosekvensering – Pål Nyrén & Mostafa Ronaghi,
KTH, Stockholm
2001 1:a Humana genomet >3 miljarder bp
HISTORA - DNA SEKVENSERING
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
NEXT GENERATION SEQUENCING
2000 MPSS – (Lynx Therapeutics) –
Massive Parallell Signature Sequencing
2010 SMRT (Pacific Bioscience) –
Single Molecule Realtime Technology
Referensgenom
http://www.pacificbiosciences.com/products/smrt-technology/
”massiv parallell sekvensering”
Ordlista
Sekvenseringsdjup = x coverage, dvs hur många gånger samma bas ”täcks in”
De novo sequencing = sekvensering av ”okända” organismer
Resequencing = sekvensering av känd organism där ett referensgenom
används i analysen, se bild ovan.
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
Bibl. prep
2 h
hands-on
4-6 h
MiSeq sekv
20 min
hands-on
1-2 dygn
Analys
Helt automatiserad på
MiSeq eller alt. mjukvara
~1 dygn
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
Tagmentering – fragmentering och inmärkning
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
Kluster generering -
Flödescell
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
Sekvensering
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
Ex. MiSeq run
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
Flödesschema - NexteraXT
DNA preparation
Tagmentering
PCR-amplifiering
PCR-rening
Normalisering
(kulor)
Poolning
MiSeq
Normalisering
(BioAnalyzer & qPCR)
MISEQ - ILLUMINA
Kritiska steg för kvalitén
på NGS data
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
DNA preparationen: kvalité + mängd
Wizard® Genomic
Purification Kit (Promega)
2 loopar of >1µL kollonier
resuspi Nuclei Lysis Solution
sedan enl protokoll
Eluera i Tris-HCL utan EDTA
Bra kvalité
(Även andra metoder fungerar,
tex QIASymphony)
Qubit ® 2.0 Fluorometer
(Invitrogen)
Qubit dsDNA BR assay
Kit (Molecular Probes)
Späd till 0,2 ng/µL
(mät mellan spädningar)
Exakt mängd: 1 ng (5µL)
MISEQ - ILLUMINA
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
Tagmentering
>1 ng DNA minskad fragmentering (för långa fragment)
<1 ng DNA ökad fragmentering (för korta fragment)
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
Libary quality check – Bioanalyzer with High Sensitivity DNA kit (Agilent)
1 µL ospätt bibliotek
Figuren visar ett lyckat sekvenserat
bibliotek.
Ett typiskt bibliotek visar en distribution
från ~250 bp till 1000 bp men även
fragment upp till 1500 bp går att
sekvensera.
qPCR Koncentrationen av varje bibliotek fastställs
med qPCR från KAPA vars primerar binder
in till Illuminas p5 och p7-indexar.
Samma mängd in i poolen – mer lika resultat
dvs antal reads per isolat
Normalisering
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
DATA ANALYS
Samarbete med Bioinformatiker?
Lägga ihop sekvenser till Contigs ”assembla”: SPAdes, CLC, Velvet Optimiser m.fl.
contigs.fasta
databaser för Typning av bakterier: BIGSdb, SeqSphere m.fl.
databaser för Antibiotikaresistens tex ResFinder, BLAST m.fl.
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
DATA ANALYSIS
MiSeq BaseSpace Apps
+
OR
+
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
DATA ANALYSIS
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
DATA ANALYSIS
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
DATA ANALYSIS
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
DATA ANALYS
BIGSdb = Bacterial Isolate Genome Sequence Database
http://pubmlst.org/databases/
Neisseria locus/sequence definitions database – Extract finetype from whole genome data
Assembled FASTQ file
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
KLINISKA APPLIKATIONER
Mikrobiologi:
Utbrottsutredningar – smittspårning, källan till smitta
Epidemiologisk typning – övervakning och rapportering
Karaktärisering av resistensmarkörer – koll på mutationer, hitta nya
Identifiera “okända” organismer – kända/okända
Detektera kända virulensfaktorer – ident. sjukdomsframkallande bakterier
Patologi/kemi:
Cancerpaneler – ta reda på cancertyp och sen rikta behandlingen
SNP analys – analysera enstaka positioner i gener kopplade till viss sjukdom
Transkriptom analys – karaktärisera uttryck av gener ex kolla vilka gener som är
påslagna hos sjuka resp friska (RNA – cDNA – NGS)
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
KLINISKA APPLIKATIONER
http://www.bbc.co.uk/news/health-20314024
2013-10-14
Multiresistenta
Staphylococcus aureus
”SUPERBUG”
MRSA utbrott
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
KLINISKA APPLIKATIONER
EHEC - utbrott
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
KLINISKA APPLIKATIONER Ötzi = Ismannen
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
FORSKNING till KLINISK APPLIKATION
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Nu
mb
er
of
iso
late
s
Year
B
C
Y
W-135
SYFTE
Undersöka de genetiska grunderna till ökningen
av N. meningitidis serogrupp Y i Sverige
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010
Inc
ide
ns p
er
10
0,0
00
in
vå
nare
År
Övriga (n=44)
Klon YIII (n=6)
Klon YII (n=7)
Klon YI (n=28)
FORSKNING till KLINISK APPLIKATION
(n=85)
Finetyping
7 x MLST gener
porA
porB
fetA
fHbp
penA
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
Strain type YII
P1.5-1,2-2,36-2; F5-8; ST-23 (cc23);
2-55; 25; 22
Strain type YIII
P1.5-1,2-2,36-2; F5-8; ST-23 (cc23);
3-36; 25; 1
Strain type YI
P1.5-2,10-1,36-2; F4-1;
ST-23 (cc23); 3-36; 25; 22
Illumina HiSeq,
Oxford University
1995-2012 (n=185)
Subtype 1
2006-2012
Subtype 2
1995-2012
NGS
ger samma grova indelning som ”fintypning” av de 12 generna
YI består egentligen av två subtyper där Subtyp 1
är ansvarig för den stora ökningen av McY i sverige
FORSKNING till KLINISK APPLIKATION
Genome-Based Characterization of Emergent Invasive Neisseria
meningitidis Serogroup Y Isolates in Sweden from 1995 to 2012
Bianca Törös, Sara T. Hedberg, Magnus Unemo, Susanne Jacobsson, Dorothea M.C. Hill, Per Olcén,
Hans Fredlund, Holly B. Bratcher, Keith A. Jolley, Martin C.J. Maiden, Paula Mölling
Accepted in Journal of Clinical Microbiology April 2015
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
Finetyping
MLST (7)
MLVA
fHbp
fetA
penA
porB
Rutintypningar: genetiska/fenotypiska
- dagligen/veckovis
PCR
A B C
Y W-135
Kapselgener
VR1 VR2,3
porA
SP GBS MC 16S
HI LM
DNA prep Serogruppering/antibiogram
Identifiering Genogruppering Genosubtypning
Misstänkt bakteriell meningit
NGS
Epidemiol övervakning – 2 ggr/år
Utbrottsutredningar – i stunden
NGS SOM RUTINANALYS
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
SAMMANFATTNING
NGS – enorma möjligheter!!!
Epidemiologisk typning
Utbrottsutredningar
Karaktärisera resistensmarkörer
Identifiera okända organismer
Hitta virulensgener
Cancerpaneler
etc
Begränsningar
Saknar Bioinformatiskt kunnande!!!
Dataanalysen tar ganska lång tid och datakraft
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
Tack!
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro