natalia peralta – bioquímica parasitología y micología unsl
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IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS DE INTERÉS MÉDICO
Natalia Peralta – BioquímicaParasitología y Micología
UNSL
TRABAJO PRÁCTICO N° 8
Levaduras más frecuentemente asociadas a las infecciones
sistémicas:
Candida albicans Candida parapsilosis Candida tropicalis Candida glabrata Candida krusei Candida guilliermondii Cryptococcus neoformans Trichosporon spp.
Cuando se observa el desarrollo de
una colonia sobre cualquiera de los
tubos del primocultivo, se procede a
identificar el aislamiento.
El primer paso en el estudio de una
levadura es la obtención de un cultivo
puro a partir del cual se puedan iniciar
los estudios sistemáticos de sus
características morfológicas,
fisiológicas y sexuales bajo
condiciones estandarizadas.
Colonia cremosa de colorblanco amarillento, lustrosa, poco elevada y de bordes bien definidos.
La identificación puede variar desde unos
pocos test simples, para identificación
presuntiva de Cándida albicans y
Cryptococcus neoformans a una gran
variedad de pruebas necesarias para
identificar a todas las levaduras
comúnmente aisladas en los laboratorios
de micología.
Pruebas para identificación de levaduras:
1- Prueba de formación de tubo germinativo por Candida albicans.
2- Prueba de formación de Clamidosporas por Candida albicans.
3- Agar semillas de girasol para diferenciación de Cryptococcus neoformans.
4- Prueba de la producción de ureasa para Cryptococcus neoformans.
5- Crecimiento a 28 º C y 37 º C.
6- Crecimiento en extracto de malta para estudio micromorfológico.
7- Cultivo en lámina en agar morfología (Difco) para estudio micromorfológico.
8- Crecimiento en agar morfología (Difco) para macromorfología.
9 - Ensayo de asimilación de Glucosa, Galactosa, L-Sorbosa, Celobiosa, Trehalosa, Sacarosa, Maltosa, Lactosa, Melibiosa, Rafinosa, Melezitosa, D-Xilosa, L-arabinosa, D-ribosa, D-manitol, ácido cítrico, eritritol y m-Inositol.
10 - Ensayo de asimilación de nitrato de potasio y peptona.
11 - Ensayo de fermentación de Glucosa, Sacarosa, Galactosa, Maltosa, Trehalosa y Lactosa.
12 - Crecimiento en medio libre de vitaminas.
13 - Producción de ascosporas.
Reactivos comerciales
Permiten arribar a la identificación presuntiva: - Chromagar Candida - Chromagar ID
Permiten la identificación confirmatoria: - ID 32C - Yeast Star - API 20C - Auxacolor - Vitek - RapID Yeast Plus
system - Fungichrom
Algoritmo de identificación presuntiva
PRUEBAS PARA
IDENTIFICACIÓN
PRESUNTIVA DE
LEVADURAS
Prueba de formación de tubo germinativo
- Prueba más confiable para identificar
presuntivamente
a Candida albicans.
- Procedimiento: Realizar suspensión ligera de un
cultivo de 24 h de la cepa en estudio en 0,5 ml de
suero bovino. - Interpretación:El tubo germinativo se ve como una proyección filamentosa delgada, que no presenta constricción en el punto de origen.
Observación de la Micromorfología
- Se debe realizar siempre, ya sea para la
identificación presuntiva como para la
identificación completa.
- Se puede realizar en EXTRACTO DE MALTA
LÍQUIDO, para observación de las principales
estructuras que caracterizan a la reproducción
vegetativa.
- Se puede realizar en AGAR HARINA DE MAÍZ, que
permite la observación de la disposición de las
estructuras y además, en el caso de C. albicans, se
puede ver la formación de clamidoconidias.
C. albicans: Clamidosconidias ydisposición de blastoconidias ypseudomicelio.
Siembra en un agar cromogénico
- Especialmente CHROMagar Candida que permite
identificar:
C. albicans (verde)
C. tropicalis (azul)
C. krusei (rosa seca)
Prueba de ureasa
(Agar urea de Christensen)
- C. neoformans y otros Cryptococcus spp. e
incluso otras levaduras producen ureasa. C.
albicans y otras especies del género Candida no la
producen.
- El medio de urea que se usa contiene rojo de
fenol, que vira al color rojo cuando se hidroliza la
urea y se libera amonio alcalinizando el medio de
cultivo.
Agar semillas de girasol
- Para identificación de C. neoformans .
- C. neoformans produce un pigmento marrón en
el agar semillas de girasol a temperatura ambiente
debido a la actividad fenoloxidasa localizada en la
pared celular de este hongo. Ninguna otra especie
de este Género, ni otras levaduras, poseen esta
propiedad.
Prueba de asimilación de trehalosa
- Para identificar presuntivamente a Candida
glabrata, debido a que fermenta y asimila la
trehalosa. Sin embargo, otras levaduras
también fermentan la trehalosa, tal es el caso
de Candida tropicalis, por tal motivo deberá
basarse en la MICROMORFOLOGÍA para la
utilización de esta prueba.
En reumen:
Algorismo
de
identificaci
ón
presuntiva
de
levaduras
PRUEBAS PARA
IDENTIFICACIÓN
DEFINITIVA DE
LEVADURAS
Los métodos que existen actualmente en
el mercado son los siguientes:
ID 32C API 20C VITEK YBC system (bioMérieux-Vitek) VITEK 2 System Fungichrom Yeast Star Auxacolor RapID Yeast Plus system
• Método más comunmente usado.
• No pudieron ser identificadas:
C.albicans, C.guilliermondii,
C.neoformans, Rhodotorula spp y
S.cerevisiae.
• Mejor identificación de cepas
atípicas.
• Tira de plástico con 32 pocillos
con diferente sustratos
deshidratados.
• Lectura a las 48 hs (T° 30°C).
• Lectura visualmente .
Crecimiento: Turbidez en el
pocillo.
• Resultados: Biocódigo numérico
de 8 dígitos que permite la
identificación a través de un
manual de códigos.
• La identificación levaduras se basa en la
presencia o ausencia de ciertas enzimas,
que se visualiza mediante reacciones
colorimétricas.
• La actividad enzimática se revela con: 1.
Hidrólisis de sustratos cromogénicos. 2.
Asimilación de sustratos naturales. 3.
Oxidación de sustratos sintéticos
(fenoloxidasa).
• Tira de plástico con 16 pocillos con los
sustratos.
• Se prepara un inóculo y se siembran dos
gotas en cada una de las celdas.
• Se incuba 24 o 48 horas a30ºC .
• Lectura: Cambio de color.
• Interpretación de resultados: a través de
un sistema de códigos y utilización de una
tabla.
