nanoporos con aplicaciones genómicas y protéomicas

8/13/2019 Nanoporos con aplicaciones genmicas y protomicas

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Nanoporos con aplicaciones genmicas y protomicas

Rodrguez, M & Vega, R.

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Elaborado por Massiel Rodrguez

Estudiante de la Carrera de Qumica Industrial

Curso de Nanotecnologa

Carrera de Qumica IndustrialUniversidad Nacional

Profesor del curso

Dr. Jos Roberto Vega Baudrit

Catedrtico, Universidad Nacional

Coordinador Red NanoUNA, Universidad Nacional

Director del Laboratorio Nacional de Nanotecnologa LANOTEC-CeNAT-CONARE

Resumen

La nanobiotecnologa ha desarrollado la tecnologa de nanoporos la cual

emplea un agujero a nanoescala en una membrana aislante con un alto rendimiento

de molculas individuales en solucin. Los nanoporos estn abordando a una ampliagama de investigaciones dentro de las cuales destacan las implicaciones genmicas y

protomicas abarcando desde anlisis de la estructura, biosensores, y caracterizacin

vinculante. La siguiente revisin presenta un aborde de los nanoporos, desde su

descripcin y distintos tipos como nanoporos biolgico, nanoporos en estado slido y

nanoporos hbridos, as como diferentes aplicaciones; dentro de estas aplicaciones se

destacan los biosensores estocsticos con nanoporos, y muchas aplicaciones en el

campo de la medicina tales como poros biolgicos para el tratamiento del cncer,

poros biolgicos para la entrega de las macromolculas en las clulas, deteccin de

nanoporos basados en polinucletidos, uso de nanoporos para sondear la carga

superficial y el valor de pH cerca de las membranas lipdicas, uso de las grabaciones

en nanoporos para supervisar la actividad enzimtica, deteccin de polipptidosbasados en nanoporos y secuenciacin del ADN usando nanoporos.Palabras clave: Nanobiotecnologa, nanoporos, biosensores, polinucletidos.

Introduccin

La biotecnologa utiliza ensambladores disponibles en las clulas vivas para construir miles de

molculas diseadas a medida segn las especificaciones atmicas, como la construccin de

nuevas ensambladoras. El principal obstculo que ha tenido la biotecnologa ha sido la falta de

conocimientos bsicos de los procesos y mecanismos biomoleculares. Se nos ha dado una increble

caja de herramientas de la maquinaria molecular, y slo ahora se empieza a aprender cmo usarla.

(1)

La biotecnologa ha crecido y sigue creciendo, con cada nuevo descubrimiento en la biologamolecular. Nuevas investigaciones sobre la biologa viral han permitido mejorar los vectores para

la entrega de nuevo material gentico, una explosin de enzimas para recorte, edicin, ligando, y

la copia de ADN, as como las tcnicas eficaces para la sntesis qumica de ADN, ha permitido la

creacin de nuevos construcciones genticas complicadas. Las bacterias modificadas ahora crean

grandes cantidades de protenas naturales de uso medicinal, protenas mutadas para la

investigacin, protenas quimricas hbridas para aplicaciones especializadas y protenas

completamente nuevas, si un investigador se atreve a disear una protena a partir de cero. (1)


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1. NanobiotecnologaEn busca de mejorar los aportes realizados y buscar nuevos descubrimientos surge la

nanobiotecnologa, corresponde al uso de la biotecnologa a escala nano. Dentro de la

nanobiotecnologa se ha desarrollado la tecnologa de nanoporos la cual emplea un agujero ananoescala en una membrana aislante con un alto rendimiento de molculas individuales en

solucin. (1)

La generalidad del principio de deteccin de nanoporos y la facilidad de deteccin de la molcula

individual sugiere muchas aplicaciones potenciales de nanoporos en la biotecnologa. Se han

hecho progresos recientes con fabricacin de nanoporos y sofisticacin, as como aplicaciones en

el mapeo de ADN/protena, anlisis de la estructura biomolecular, deteccin de la protena, y la

secuenciacin del ADN. Adems, los conceptos para dispositivos de secuenciacin del ADN se han

sugerido, y se han hecho esfuerzos computacionales. El estado del campo de los nanoporos est

madurando, teniendo en cuenta el tipo de condiciones y funcionamiento de nanoporos, casi todas

las aplicaciones podran revolucionar la medicina en trminos de velocidad, costo y calidad. (2)

2. NanoporosLos nanoporos se producen en la naturaleza, y en la literatura biolgica se conocen simplemente

como poros cuando son ms de 1nm o menos de dimetro o canales cuando son ms estrechos.

Las clulas tambin contienen poros solubles, tales como chaperoninas y enzimas que manejan los

cidos nucleicos, que pueden ser de inters en el futuro en el contexto de la catlisis de ingeniera

en nanoporos. Los nanoporos de transmembrana se encuentran en todas las clulas vivas, su

funcin natural es la creacin de conductos para cruzar material a travs de la pared celular y las

paredes de organelas intracelulares. (3) Estos componentes celulares son de gran importancia

para la funcin celular y la vida. Una clase de poros permiten que las clulas mantengan diferentes

concentraciones internas de solutos desde el medio ambiente exterior, 2 mantener su equilibrio

osmtico y la estabilizacin de su volumen. (4) El correcto funcionamiento de estos poros estambin de vital importancia para ambas clulas individuales y de todo el organismo.

Por ejemplo, los miocitos cardacos utilizan poros de potasio y sodio que son integrales para

mantener el ritmo de las contracciones de la clula muscular. (5) Los virus pueden inyectar su

informacin gentica a travs de un nanoporo en las clulas del husped para replicar an ms, y

las bacterias pueden producir poros de toxinas utilizadas para lisar las clulas para sus nutrientes

intracelulares. (6) Estos poros cada uno han evolucionado a lo largo de un gran nmero de

generaciones, tienen diversas estructuras qumicas que les permiten alcanzar sus tareas

especficas.

El anlisis de protenas usando nanoporos se pueden clasificar en las siguientes grandes reas de

investigacin: anlisis de la estructura, biosensores, y caracterizacin vinculante. Los experimentos

con Biosensores se llevan a cabo mediante el diseo de un poro que se adapta con un sitio deunin especfico capaz de mantener la protena analito dentro del poro. La caracterstica de unin

se lleva a cabo mediante el clculo de constantes de velocidad de unin y el tiempo de vida media.

(7) La motivacin de estos estudios incluyen aplicaciones en la ingeniera de protenas, la ciencia

farmacutica, y biosensores (deteccin de enfermedades - biomarcadores). (8)

Otro campo en el que la tecnologa de nanoporos se ha introducido es la ultrafiltracin. La

capacidad de fabricar matrices ordenadas de nanoporos en las membranas ultrafinas ha hecho

posible el desarrollo de dispositivos de separacin molecular altamente eficientes.


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La selectividad de tales dispositivos se puede adaptar para aplicaciones especficas de la

modificacin de la superficie qumica o mediante la modificacin de la capa alrededor de los

poros utilizando incrustado de electrodos. (9)(10) La selectividad de tales membranas es ms o

menos un orden de magnitud mayor que la dilisis convencional de membranas. (11) Se investiga

la cintica de la digestin enzimtica directa de molculas de ADN nicas atrapadas por

exonucleasa usando una membrana de almina nanoporosa, elaborado a travs de la modificacinelectroqumica (anodizacin) de almina de alta pureza.

2.1.Tipos de nanoporosLos nanoporos se clasifican en tres clases: 1. poros biolgicos incrustados en una bicapa lipdica;

2. nanoporos sintticos fabricados en sustratos slidos, tales como Si3N4, Al2O3, TiO2, y el grafeno,

y 3. hbrido de nanoporos biolgicos y sintticos. (12)

2.1.1. Nanoporos biolgicosA travs de los aos, los canales relativamente grandes en comparacin con los canales inicos se

han explorado para los fines de deteccin de nanoporos. El sustrato de eleccin para todos losporos biolgicos son membranas lquidas, liposomas o membranas de polmero alojado en el

interior de una cmara electroqumica. La produccin a gran escala y purificacin de diversas

protenas de los canales son posibles mediante el empleo de tcnicas estndar de biologa

molecular. En la mayora de los casos, los poros de los canales purificados son homogneos a

partir de diferentes lotes. Adems, la ingeniera explcita de los poros de los canales a travs de

mutagnesis directa es posible debido a la estructura de cristal disponible, de varias protenas del

canal. (12)

2.1.2. Nanoporos en estado slido sintticoLos nanoporos en estado slido se han convertido en una alternativa verstil a nanoporos

biolgicos debido a sus propiedades nicas, incluyendo geometras y dimensiones bien definidas,

robustez mecnica, facilidad de modificaciones, y la compatibilidad con varias tcnicas demedicin electrnica u ptica. En general, los nanoporos de estado slido en los materiales

dielctricos, como SiN, presentan estabilidad qumica y trmica sobre las membranas lipdicas. Sin

embargo, su estabilidad es dependiente de las condiciones utilizadas para formar estos poros. (13)

En cuanto a nanoporos basados en grafeno, a pesar de su estabilidad qumica y trmica no se ha

demostrado de manera concluyente, (14) sus propiedades elctricas nicas son una gran ventaja

sobre los homlogos biolgicos. En los ltimos aos, los nanoporos en estado slido han abierto la

puerta a una amplia gama de aplicaciones potenciales en la secuenciacin del ADN, interacciones

de protena, el control de transporte molecular, y la fabricacin de dispositivos nanofludicos. (15)

2.1.3. Nanoporos hbridosEl concepto de poros hbridos se demostr mediante la insercin del canal de hemolisina en los

poros de SiN. (16) La hemolisina posee una estructura de precisin atmica y el potencial para la

ingeniera gentica especfica del sitio o modificaciones qumicas. La hemolisina se basa en una

frgil membrana de bicapa lipdica de soporte mecnico, lo que limita en gran medida su

integracin en dispositivos. Pero esta limitacin se elude mediante la colocacin de un poro

biolgico dentro de un nanoporo de estado slido mecnicamente robusto creando de ese modo

un poro hbrido con ventajas de ambos.

El sistema hbrido se demuestra estable durante varios das bajo observacin. (16) Sin embargo, el

poro biolgico se deforma una vez en contacto con el poro de estado slido, pierde la capacidad


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de discriminar nucletidos individuales y las corrientes de fuga son significativas, los iones pueden

fluir a travs de las regiones entre el poro de estado slido y biolgico debido a un sellado

imperfecto. Estos factores limitan esta tecnologa. Un enfoque interesante y novedoso es la

insercin de las estructuras origami 3D de ADN en un nanoporo de SiN cnico reproducible y bajo

condiciones controladas. (17)

a) b)

Figura 1. a) Translocacin de AND a travs de un nanoporo hibrido. b) Representacin esquemtica de la insercin de un

origami nanoporo de ADN dentro de un nanoporo en estado slido.

Los nanoporos tambin se clasifican de acuerdo al tamao de su dimetro, como se muestra en la

siguiente figura, (a) paquete hlice en forma de una protena. (b) Una sola subunidad de la porina

trimrica OmpF (dimetro interior 2nm). (c) El poro -hemolisina (dimetro interior del canal 2

nm). (d) formada a partir de nanotubos de pptidos cclicos apilados (dimetro interior 0.75 nm).

(e) canal sinttico basado en las duelas de octifenil con pptidos adjuntos (dimetro interior 1.5

nm). (f) Micrografa electrnica de nanotubos de slice realizados en una plantilla de almina

porosa (dimetro interior 20 nm). (g) Micrografa electrnica de un nanoporos en nitruro de silicio

esculpido con un haz de iones de Ar (dimetro interior 2 nm). (18)

Figura 2. Ejemplos de diferentes clases de nanoporos (18)


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La construccin de un poro o canal biomimtico puede servir como un andamio para su posterior

modificacin artificial. Se tiene en cuenta que la denominacin de los poros/canales simplemente

reflejan la relacin de aspecto de la va de paso, un poro tiene un dimetro mayor que su

profundidad y un canal tiene una profundidad mucho mayor que su dimetro. Utilizando diversas

tecnologas de fabricacin, los nanoporos o canales se pueden obtener en una variedad de

diferentes formas y estructuras. Por ejemplo, los nanocanales pueden hacerse mediante litografaplana sencilla, pero tambin por grabado inico, lo que permite un control preciso del dimetro

del poro. En este ltimo caso, un solo ion de un metal pesado de un ciclotrn es disparado a travs

de una pelcula polimrica de espesor, seguido por ataque qumico hmedo, el cual elimina el

material daado ms rpido que el material sin daos, lo que resulta en un nanocanal cnico con

un dimetro de hasta 2nm. (19) De manera similar las membranas, con mltiples canales que van

en tamao desde 10nm a 10mm y densidad de 105 a 109 poros/cm2, los poros comercialmente

disponibles han demostrado ser tiles como biosensores de una sola molcula, por ejemplo, para

la deteccin de ADN, ARN, protenas, nanotubos de carbono, o las estructuras de protenas locales

a lo largo del ADN. (20)(21)

Un esquema qumico que se utiliza a menudo en el caso de membranas polimricas consiste en

recubrir la membrana con una capa de oro a travs de electrodeposicin, seguido por lafuncionalizacin a travs de la qumica de tiol. (22) Aunque este enfoque tambin es aplicable a la

slice o a las membranas de almina, las membranas polimricas tambin pueden hacerse

reaccionar directamente con silanos funcionalizados (23), lo que reduce el nmero de

tratamientos qumicos necesarios.

Figura 3. Biologa funcional de nanoporos. (a). Un nanoporo lpido sinttico recubierto (amarillo) en el sustrato Ansin

(gris) (24) (b) Seccin transversal de una membrana con una serie de nanoporos injertados con PNIPAM (25). (c) Vista

lateral de un nanoporos en estado slido funcionalizado con molculas de horquilla de ADN. (26) (d) Vista superior de

los dedos de zinc (verde) inmovilizado en un nanocanal. (27).

3. Aplicaciones de Nanoporos


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La siguiente tabla muestra distintas funciones de los nanoporos y su importante aporte al

desarrollo fisiolgico. (28)

Tabla 1. Funciones fisiolgicas de nanoporos biolgicos

Poro Funcin

Los pptidos antimicrobianos La lisis de las clulas microbianas; perturbacin de la

homeostasis de iones intracelulares, el transporte

de las protenas en las clulas diana.

Porinas Transporte de molculas solubles en agua a travs

de membranas de bacterias u orgnulos.

Aquaporinas Rpido transporte de agua a travs de membranas

lipdicas.

Complejo membrana- ataque La lisis de las clulas patgenas como un mecanismo

de defensa del sistema inmune innato.

Canal inico de protenas Transporte de iones a travs de membranas, la

regulacin del potencial de membrana,

transduccin de la seal y amplificacin, elmantenimiento de la homeostasis celular de las

concentraciones de iones.

Complejos de poros nucleares Transporte de nucletidos, protenas, y otras

molculas a travs de la envoltura nuclear.

Translocacin de protenas a travs de poros

del retculo endoplasmtico

Transporte de Protenas a Travs de la membrana

del endoplstico reticular.

Poros virales Transporte postulado de nucleocpsidos por

ejemplo virus del herpes simple (HSV) a travs de la

membrana nuclear.

Poros amiloide Funcin aberrante de las protenas amiloidognicas,

posiblemente implicado en la va patognica de las

enfermedades amiloidognicas.

3.1.Biosensores estocsticos con nanoporosLa modulacin de la corriente inica a travs de canales de protenas, como resultado de

estmulos biofsicos o qumicos externos, ha afectado profundamente a la ciencia de una sola

molcula y a los biosensores. Los biosensores estocsticos son una clase de detectores de una sola

molcula que se basa en la alteracin de la corriente elctrica por los analitos distintos que

interactan de forma transitoria o permanente con un grupo de reconocimiento funcional situado

dentro de un nanoporo. (29) El grupo de reconocimiento est diseado estratgicamente dentro

del lumen del poro de un canal de protena slida (Figura 3). Cada interaccin transitoria de un

solo analito con el grupo de reconocimiento genera un bloqueo de corriente, la duracin de la cualdepende de la fuerza de la interaccin entre el analito y el grupo reactivo (Figura 3b). (30)(31) Este

bloqueo actual se produce como resultado de la obstruccin del flujo inico de nanoporos

mediada por el analito. Por lo tanto, la dispersin de un analito en el lumen del nanoporo se

sondea por la tcnica de pulso - resistivo en tiempo real. Vale la pena mencionar que las tcnicas

de electrofisiologa, que hoy se emplean ampliamente en examinar el transporte de biopolmeros

a travs de nanoporos, se han utilizado anteriormente para la investigacin de los mecanismos de

translocacin de protenas. (32)


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Los biosensores estocsticos se han empleado para la deteccin no slo de las molculas

pequeas, sino tambin de biopolmeros largos.

Figura 5. Principio de deteccin estocstica de una molcula. Un poro en la protena transmembrana facilita el

transporte de los iones pequeos de una membrana lipdica aislante. (a) Cuando se aplica un voltaje de polarizacin, se

registra una corriente elctrica de un solo canal. (b) Los analitos aadidos, interactan de forma no covalente con el

grupo reactivo funcional situado dentro del lumen del poro, produciendo bloqueos transitorios de corriente de un solo

canal, la naturaleza de la cual depende de la fuerza de la interaccin entre las molculas de analito y el grupo reactivo.

3.2.Aplicaciones de poros biolgicos en nanomedicinaEn campo de la nanomedicina se aplica la nanotecnologa para abordar los desafos de relevanciamdica. Los nanoporos biolgicos atraen cada vez ms atencin a las aplicaciones en

nanomedicina, estas aplicaciones incluyen el tratamiento del cncer, el desarrollo de frmacos

antimicrobianos, y la administracin de frmacos. (33)(34)(35)

3.2.1. Poros biolgicos para el tratamiento del cncerLos enfoques actuales para el tratamiento del cncer, incluyendo la radiacin y la quimioterapia,

se enfrentan a obstculos tales como la metstasis tumoral y la resistencia. (33) Adems, los

efectos secundarios de estos enfoques teraputicos tienen el inconveniente de daar las clulas

sanas cuando se administran en dosis eficaces. (33)(36) Las estrategias teraputicas con mayor

especificidad y eficacia, as como la reduccin de la toxicidad siguen siendo buscadas. Una

estrategia potencial es la aplicacin de pptidos formadores de poros antimicrobianos para matar

las clulas cancerosas. La citotoxicidad de estos pptidos se ejerce ya sea a travs de la formacin

de poros en la membrana citoltica de las clulas cancerosas especficas, este mecanismo requiere

altas concentraciones del pptido. (37)

3.3.Poros biolgicos para la entrega de las macromolculas en las clulasLos poros biolgicos son atractivos para la mediacin del transporte de diversas molculas tales

como agentes teraputicos en las clulas. (33)(38) Cruzar la membrana plasmtica es uno de los

mayores desafos para la entrega de muchas molculas teraputicas, incluyendo frmacos polares


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o cargados, protenas o cidos nucleicos en las clulas. Debido a su capacidad inherente para

permeabilizar la membrana plasmtica de las clulas, los pptidos formadores de poros y

protenas pueden facilitar la entrega teraputica en el citosol. Uno de los poros biolgicos que se

ha aplicado para la entrega de macromolculas es la gramicidina pptido antibitico. En este caso,

el empleo de un complejo de gramicidina - lpido - ADN hace posible la entrega de un plsmido de

ADN de una variedad de clulas de mamfero en cultivo incluyendo las clulas de pulmn humano.(39) Estudios han explorado la aplicacin de un poro biolgico, listeriolysinO (LLO), a partir de los

patgenos de bacteria Listeria monocytogenes, como un vehculo de entrega de macromolculas

tales como protenas en las clulas, tanto in vitro como in vivo(40). Estos estudios indican que una

concentracin relativamente alta de protones (rango de pH de 4.9 a 6.7) provoca la insercin en la

membrana y la actividad de formacin de poros de LLO. Demostrando que la encapsulacin de LLO

dentro de liposomas sensibles al pH, junto con otras molculas para ser entregados, permite la

liberacin citoslica de molculas de carga tales como antgenos. Otro estudio reciente emple

estos liposomas LLO como un sistema de administracin de vacunas eficaces. En este caso, los

liposomas que llevan a una protena antignica viral para generar la inmunidad antiviral protectora

(40) (41). La administracin dirigida de antgenos para la generacin de la inmunidad antiviral

protectora tambin se ha logrado con la toxina del ntrax (42); se emplea esta toxina paraentregar una porcin del virus de la inmunodeficiencia humana -1 (VIH -1) protena de la envoltura

al citosol de las clulas vivas (42).

3.4.Deteccin de nanoporos basados en polinucletidosLa secuenciacin basada en el uso de nanoporos, los biopolmeros ms estudiados en nanoporos

biolgicos son el cido desoxirribonucleico (ADN) y cido ribonucleico (ARN). Se ha propuesto que

las hebras de ADN o ARN podran ser impulsados por electroforesis a travs de un poro pequeo, y

las fluctuaciones de corriente resultantes podran permitir la secuenciacin en tiempo real de

polinucletidos. (43)(44) El uso de una hemolisina, ha demostraron que el ADN monocatenario

(ssDNA) y RNA podra ser detectado al pasar a travs de un poro [224]. En un paso hacia la

secuenciacin capaz de distinguir diferentes homopolmeros de poli-ADN y ARN de poli-(es decir,

poli -A a partir de poli -C), as como la transicin a partir de poli -A a poli -C ARN dentro de un

dibloque de polmero. (45)(46)

Explorado la translocacin de ADN bicatenario (dsDNA) a travs de una porina mitocondrial, el

canal de aniones dependiente de voltaje llamado (VDAC), y a travs de bicapas que contienen

canales inicos a partir de Bacillus subtilis. (47) El tamao de estos canales inicos y su carcter

dependiente de voltaje, lo hacen poco prcticos para aplicaciones de secuenciacin. Si bien estos

primeros estudios demostraron que las hebras largas de ADN y ARN pueden ser accionados

linealmente a travs de los poros biolgicos, tambin se revelan varios retos para lograr

secuenciacin rpida de ADN mediante sistemas de deteccin de pulso- resistivo.

3.5.Uso de nanoporos para sondear la carga superficial y el valor de pH cerca de lasmembranas lipdicas

Para los pptidos antibiticos ms naturales, la cintica de la formacin de poros y la conductancia

de un solo canal dependen de las propiedades de la membrana diana. Entre estas propiedades

incluyen la carga de la superficie o la elasticidad de la membrana. Como resultado, los pptidos

formadores de poros tienen el potencial de servir como sensores para las propiedades de su

entorno lipdico. Por ejemplo, la carga superficial de la membrana lipdica que rodea un poro


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puede influir en su conductancia inica. (48) En este escenario, la presencia de cargas elctricas en

la membrana lipdica conduce a una acumulacin de contra-iones cerca de la entrada del poro.

Este efecto es particularmente pronunciado a bajas fuerzas inicas y dependiendo de la

selectividad de poro y la carga de iones acumulados, este efecto puede aumentar o disminuir la

conductancia del canal. (48)

Estos aportes cientficos, demuestran investigaciones en el efecto de la carga en la superficie de lamembrana de la conductancia de canales de gramicidina y demostraron que a baja fuerza inica,

la conductancia de los poros de gramicidina embebidos en una membrana cargada negativamente

fue significativamente mayor que la conductancia de poros gramicidina incrustados en una

membrana compuesta de neutro lpidos. (48)

3.6.Uso de las grabaciones en nanoporos para supervisar la actividad enzimticaUna novedosa aplicacin de pptidos formadores de poros y protenas en nanobiotecnologa es

para detectar y monitorizar la actividad de enzimas in situ. Las actividades enzimticas pueden ser

indicativos de la funcin celular normal o anormal y se utilizan a menudo con fines de diagnstico.

(49) Por ejemplo, la actividad de la fosfatasa alcalina en el suero puede indicar una enfermedaddel hgado. (49) Los mtodos sensibles para detectar la actividad enzimtica son, por lo tanto,

importantes para muchos ensayos clnicos y para elucidar el papel de estas protenas en las redes

bioqumicas complejas. Mientras que muchos de los estudios actuales sobre las enzimas requieren

un etiquetado del sustrato (por ejemplo, con etiquetas fluorescentes), ensayos de iones basados

en canales ofrecen alta sensibilidad, as como mediciones rpidas y experimentos bien controlados

que no requieren etiquetado de sustrato.

3.7.Deteccin de polipptidos basados en nanoporosEl transporte de polipptidos es ms complejo que el transporte de polmeros uniformes y

polinucletidos, debido a la gran variedad de cadenas laterales de aminocidos, que pueden

presentar cargas positivas, cargas negativas, residuos neutros, o hidrfobos. (50) Para resolver el

efecto de estos residuos en la translocacin de polipptidos a travs de los poros de protenas,

varios grupos han realizado investigaciones sistemticas con los poros y polipptidos que

contienen segmentos de estos residuos. Se ha investigado la interaccin de los polipptidos

catinicos en una hemolisina. En estos experimentos, el aumento de tensin y la disminucin de

longitud del pptido prolongaron la duracin de la interaccin entre el lumen del poro y el

pptido. (51)

Por otro lado tambin se ha detectado que las cargas superficiales en el lumen de los poros de

hemolisina pueden resultar en trampas electrostticas que reducen la energa libre de la

translocacin de pptidos catinicos. (52) Y se demostr que la unin de un polipptido corto con

residuos cargados positivamente a una protena grande puede capturar selectivamente la protena

en la entrada de una modificacin de un poro de hemolisina con residuos de carga negativa en sulumen (Figura 6a). (53)

Con respecto a la translocacin de los pptidos naturales, se ha determinado recientemente que

el poro PA7 requiere una regin enriquecida en fenilalanina para facilitar la translocacin del

factor letal ntrax a travs de las membranas, estos residuos de fenilalanina interactan con las

regiones hidrofbicas del factor letal ntrax con el fin de desnaturalizar la protena chaperona de

una manera similar a la vez que facilita la translocacin del factor letal ntrax a travs de PA7. (54)

Figura 6b ilustra cmo un desplegado de una protena puede permitir su translocacin a travs de


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un poro. (55) Como apoyo de esta hiptesis, investigadores demostraron que la protena Hpr que

contiene histidina de Escherichia coli se desarrolla a medida que se transloca a travs de -

hemolisina y poros de aerolisina. Tambin demostraron que las mutaciones de aminocidos

individuales pueden cambiar dramticamente la magnitud y la duracin de la obstruccin de

corriente resultante. Estos resultados enfatizan la importancia de las interacciones entre los

aminocidos dentro de los poros y la protena transmembrana. (56)

Figura 6. Concepto de trampas para capturar protenas electrostticas en los poros biolgicos, as como la investigacin

del desarrollo de una protena durante la translocacin. (a) los residuos cargados negativamente en el lumen de los

poros de -hemolisina pueden capturar polipptidos que estn cargados positivamente. Este efecto se puede utilizar

para la captura selectiva de una protena grande en la entrada de un poro. (b) la ilustra el concepto de despliegue de una

protena en la entrada de un poro antes de la translocacin a travs del poro. El replegamiento de la protena al otro

lado del poro puede completar el proceso.

3.8.Secuenciacin del ADN usando nanoporosGran parte del crecimiento del campo en nanoporos pueden atribuirse a sus perspectivas

fascinantes como plataformas de secuenciacin de ADN. En la figura 7 se destacan dos de las

direcciones actuales de secuenciacin de ADN basada en nanoporos. La figura 7a muestra dos

esquemas para la lectura electrnica de una secuencia de ADN mediante la deteccin electrnica

transversal. La primera imagen, muestra la translocacin del ADN a travs de un poro de grafeno

mientras se pasan los electrones a travs de la cinta de grafeno. (57)(58) En este caso, la seal de

corriente a travs de la cinta se ve afectada por la identidad de la base; en el segundo caso, el ADN

se pas a travs de una separacin de los electrodos y corrientes de tnel. (59)(60)(61) La figura

7b muestra la secuenciacin de ADN basada en OPTIPORE, que se basa en la deteccin ptica de

fluorforos en nanoporos. En este esquema, una molcula de ADN que va a ser secuenciado se

convierte primero en una secuencia ms grande y se hibrid con sondas indicadoras. A

continuacin, los constructos se descomprimen usando una matriz de nanoporos montada en un

microscopio de fluorescencia inteligentemente diseado (62), y cada vez que un reportero se

elimina de la secuencia, que emite fotones del color que corresponde a la identidad del reportero.

La secuencia de las cuatro bases ya se ha medido usando el dispositivo (63). Aunque los pasos de

conversin de base son algo tediosos, se pueden realizar en paralelo para muchas secuencias.


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Figura 7. Secuenciacin de AND usando nanoporos.

4. ConclusionesEl campo de los nanoporos contina entregando nuevos e interesantes tipos de poros e ideas

biotecnolgicas. Los materiales basados en origami y otros materiales programables para el

desarrollo de poros pueden ser de gran ayuda para la aplicacin de estructuras de poro, as como

el acoplamiento de poros hbridos capaces de realizar la deteccin de cualquier especie

biomolecular. Los nanoporos han desempeado un muy importante papel en el campo de la

medicina, realizando aportes para el tratamiento y diagnstico de enfermedades, como el

tratamiento del cncer, el desarrollo de frmacos antimicrobianos, la administracin de frmacos

y ppticos como formadores de poros. Por ltimo, la secuenciacin de ADN basada en nanoporos

puede revolucionar la salud por lo que permite secuenciar genomas adecuadamente. Los

adelantos de estas tecnologas a buen trmino en los prximos aos, sin duda, influir la medicina

personalizada y la deteccin/ tratamiento precoz de enfermedades genticas.

Por otro lado a pesar de la complejidad de los experimentos y complicaciones inherentes, queprevn que el acoplamiento de nanoporos con otras plataformas pticas o de fluorescencia

proporciona informacin crucial en el proceso de translocacin, dando lugar a una mejor

comprensin de cmo las protenas se someten a transiciones conformacionales cuando

atraviesan el poro. Esto se debe a la translocacin y despliegue de una protena a travs de un

nico nanoporo relacionado con el proceso. Estos esfuerzos ayudarn a proporcionar una

evaluacin cuantitativa y comprensin del despliegue del poro, que es ms inmediatamente

pertinente para la importacin de protenas in vivo. Indudablemente estos esfuerzos

experimentales inspiran nuevas teoras y estudios computacionales sobre la dinmica de las

protenas a travs de nanoporos.

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