Využití “Fluorescence Lifetime Microscopy” pro analýzu intracelulární lokalizace polymerních terapeutik nesoucích doxorubicin

Hovorka Ondřeja, Šubr Vladimírb, Větvička David a, Kovář Lubomíra, Strohalm Jiříb, Strohalm Martina , Benda Aleš c,Hof Martinc, Ulbrich Karelb, Říhová Blankaa

 a Mikrobiologický ústav, AVČR v.v.i, Vídeňská 1083, 142 20, Praha 4b Ústav Makromolekulární Chemie, AVČR v.v.i, Heyrovského nám. 2, 162 06, Praha6c Ústav Fyzikální Chemie J. Heyrovského, AVČR, v.v.i., Dolejškova 2155/3, 182 23 Praha 8

CH3CH2-C

CONHCH2CH-OHCH3

[ ]CH3

CH2-CCO[ ]

CH3CH2-C

CONHCH2CH-OHCH3

[ ]

SPACER

N-(2-hydroxypropyl)metakrylamid (HPMA)

CH3CH2-C

CONHCH2CH-OHCH3

[ ]CH3

CH2-CCO[ ]

CH3CH2-C

CONHCH2CH-OHCH3

[ ]

SPACER

N-(2-hydroxypropyl)metakrylamid (HPMA)

doxorubicinλex = 540nm, λem 612

CH3CH2-C

CONHCH2CH-OHCH3

[ ]CH3

CH2-CCO[ ]

CH3CH2-C

CONHCH2CH-OHCH3

[ ]

SPACER

N-(2-hydroxypropyl)metakrylamid (HPMA)

doxorubicinλex = 510nm, λem 590

MW = 20kDa

Intracelulární lokalizace doxorubicinu po inkubaci buněk s polymerním konjugátem

jaderná membrána

Intracelulární lokalizace doxorubicinu po inkubaci buněk s polymerním konjugátem

jaderná membrána

membrána andozómů

Intracelulární lokalizace doxorubicinu po inkubaci buněk s polymerním konjugátem

jaderná membrána

membrána andozómů

Golgiho aparát

7,8-dehydro-9,10-desacetyldoxorubicinone

7,8-dehydro-9,10-desacetyldoxorubicinone

Emisní spektra doxorubicinu a D* při 488nm excitaci ve vodě

kvantový výtěžek D* je 10-20 vyšší v závislosti na prostředí……

doxorubicin

D*

spektrální unmixing směsi Dox + D* (5:1) založený na naměřených spektrech

spektrální analýza polymerního konjugátu

spektrální unmixing založený na naměřených spektrech

Doxorubicin

D*

stanovené hodnoty „fluorescence lifetime“ pro Dox, D* a polymerní konjugát v roztoku bez buněk a v médiu zbaveném buněk

conjugate dox D* HPMA-Dox

average Lifetime

(ns)

cell-free system

1,1 3,9 1,2 / 4,1 *

average Lifetime

(ns)cellular system

1,5 4,1 2,3 / 4,4 *

distribuce hodnot „fluorescence lifetime“ pro Dox, D* a polymerní konjugát v buněčné kultuře

[ns]

doxorubicin D* Dox+D* (5:1) HPMA-Dox

ZÁVĚR

FLIM je technika která umožní oddělit i fluorochromy, jejichž emisní spektrální charakteristika se výrazně překrývá a algorytmy pro spektrální unmixing v takových případech selhávají

Stanovili jsme lifetime pro Dox, D* a polymerní konjugát a podařilo se nám upřesnit a potvrdit jeho intracelulární distribuci.

Šubr V.Strohalm J.Ulbrich K.

Mikrobiologický ústav, AVČR v.v.i,

Ústav Makromolekulární

Chemie, AVČR v.v.i, Ústav Fyzikální Chemie J.

Heyrovského , AVČR, v.v.i.,

Hovorka O.Cimburek Z.Větvička D.

Kovář L.Strohalm M.Říhová B.

Benda A.

Hof M.