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AUTARQUIA ASSOCIADA A UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Moojenina'DM INIBIDOR PROTÉICO DA
TROMBINA ISOLADO DO VENENO DA SERPENTE
Bothrops moojeni
LEONARDO MUSSI DA SILVA
Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do Grau de Mestre em Ciências na Área de Tecnologia Nuclear-Aplicações.
Orientadora: Profa. Dra. Nanei do Nascimento
São Paulo 2006
Instituto de Pesquisas Energéücds e NudearBS ipsn
AUTARQUIA ASSOCIADA À UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Moojenina - UM INIBIDOR PROTÉICO DA
TROMBINA ISOLADO DO VENENO DA SERPENTE
Bothrops moojeni
LEONARDO MUSSI DA SILVA
Dissertação apresentada como
parte dos requisitos para obtenção
do Grau de Mestre em Ciências
na Área de Tecnologia Nuclear -
-Aplicações
Orientadora:
Prof. Dra. Nanei do Nascimento
SÃO PAULO
2005
Este trabalho é dedicado aos meus amores
Ondina Soares, Murillo Severino da Silva
Filho, minha avó e meu pai {in memorian) e
Sônia Silêda Mussi, minha mãe, por andarem
sempre de mãos dadas comigo e serem os
melhores exemplos de sabedoria, honestidade,
respeito e amor.
Anjos da minha vida
Obrigado por tudo!
AGRADECIMENTOS
Emocionado, quero deixar registrado que o melhor de ter vindo trabalhar em
São Paulo, no Instituto Butantan e especialmente no IPEN, foi o fato de ter conhecido
pessoas tão especiais, as quais agora agradeço:
Prof . Dra. Nanei do Nascimento que nunca mediu esforços para me ajudar
durante o decorrer deste trabalho. A característica mais marcante da minha querida
orientadora está na sua irreverência e no seu incomparável bom humor. Obrigado
'Nan' por ter me acolhido incondicionalmente e me inserido em seu grupo de
trabalho.
Patrick Jack Speneer, meu amigo e co-orientador.
Certa vez, num congresso da Sociedade Brasileira de Toxinologia - (SBTx)
em São Pedro - SP em 1999, eu conheci um sujeito com pinta de maluco, cabelo
arrepiado, conhecido e querido por todos do congresso. Logo nos primeiros
minutos de conversa com aquele "maluco beleza", já comecei a aprender novidades
com relação ás toxinas. Depois vim a descobrir que se tratava de um certo gênio da
purificação de proteínas e biologia molecular.
Obrigado "três pra um", por ter me trazido para a toxinologia e me ensinado,
dentre inúmeras outras coisas, que para se fazer pesquisa é necessário ser mais
maluco do que eu já era. Obrigado "fi", pela sua notável irreverência, pelas nossas
viagens pro Rio e principalmente pela sua essencial ajuda no laboratório sem a qual
este trabalho não existiria.
Patrick ... 7 feei good" ...!
Obrigado por tudo!
Obrigado Tânia Rubia e demais integrantes do Laboratório de Hemostasia, do
Hospital das Clínicas de São Paulo que lá, pacientemente, me ajudaram com os
testes de agregação plaquetária e coagulação.
Prof. Dra. Maria Aparecida P. Gamillo. "Cidinha" também é uma pessoa
com um bom humor invejável. Sempre brincava com ela chamando-a de "tia" para
provocá-la, mas ela SEMPRE levava na bhncadeira e nunca se chateou... assim nem
tem graça. Cida saiba que só se brinca assim com quem a gente gosta muito.
Obrigado por ter me dado a chance de ser seu amigo. Obrigado pelos reagentes!
João Ezequiel de Oliveira "Jhonny Boy" - por toda ajuda e paciência com as
purificações e muito mais que isso, pela amizade e todas as conversas de bar as
quais sempre renderam ótimas idéias com relação às novas diretrizes para o meu
trabalho. Obrigado por tantas vezes ter me acolhido em sua casa. Obrigado pelos
conselhos.
Prof. Dr. João Luiz Costa Cardoso que foi quem começou tudo isso quando
no 3 ' Seminário Nacional de Zoonoses e Animais Peçonhentos em Guarapari - ES,
1998, convidou-me a fazer um estágio no Hospital Vital Brazil do Instituto Butantan,
deixando-me hospedado na enfermana. Graças a ele pude observar e acompanhar
inúmeros casos de acidentes. Doutor João Luiz consegue ser ao mesmo tempo
extremamente simples e uma das maiores autoridades do mundo no tratamento de
acidentes por animais peçonhentos.
Prof. Dr. Francisco Oscar de Siqueira França por me receber sempre tão
bem no Hospital Vital Brazil. "Chico", obrigado pelas nossas conversas no Hospital
as quais me foram muito proveitosas.
Prof. Dra. Marisa Manzzoncini de Azevedo-Marques por emanar
conhecimento" e passá-lo de forma clara, objetiva, além de conquistar a todos com
seu carisma. Junto com Dr. João Luiz é também um dos maiores nomes da
toxinologia e tratamento dos acidentados por animais peçonhentos que conhecemos.
Uma cientista sem precedentes! Obrigado pela estimulante e belíssima dedicatória
no livro "Animais Peçonhentos no Brasir.
Prof. Dr. José Carlos de Freitas "Zé Freitas" como gosta de ser chamado.
Sinto orgulho em ser seu amigo e poder te encontrar num mercado e ouvir os
conselhos sobre a Austrália de quem tem trinta anos como professor da USP.
Freitas, obrigado por dirigir a melhor disciplina que eu pude cursar em todo o
mestrado! Obrigado por proporcionar á turma, a chance única de conhecer e
mergulhar ao redor da Ilha de Alcatrazes em São Sebastião - SP. Indescritível,
inesquecível!
José Alberto Alves da Silva, carinhosamente chamado por nós do
laboratório de "Troxa". Por ser extremamente tímido, acredito que o Alberto tenha
dificuldade de expressar seus sentimentos por quem ele goste muito, a menos que
seja a IRA! Virei analista agora? Obrigado Alberto por tantas e tantas vezes ter me
defendido quando eu não estava presente! Você é REALMENTE um grande amigo!
Murilo Casare, o químico ocioso (assim denominado pelo Alberto) que de
ocioso não tem nada sendo um dos alunos que mais produz. Quero vê-lo cheio de
alunos (alunas de preferência). Obrigado MOM, por ter sido tão amigo, por ter
compartilhado tantas risadas e ter me ajudado em experimentos no laboratório.
Janaina Baptista Alves por ter ouvido as minhas histórias intennináveis. Para
quem não sabe, a Jana é especialista em "achar" as suas "porcanas" que você
esqueceu na bancada e devolvê-las. Esqueceu na bancada? Vai parar na sua mesa!
Agora, como ela descobre que foi você? Obrigado pela amizade Jana.
Renan Fernandes Loureiro - "Renan san" ou "oráculo". Poucas pessoas
conhecem o Renan tão bem quanto eu e vice-versa. Esse meu amigo é um guerreiro
e batalhador pelos seus ideais. Renan sempre esteve comigo nas horas mais
divertidas e nas mais tristes também. Acredito ter valido a pena tê-lo "arrastado" para
fazer o mestrado am São Paulo, não? Obrigado Renan por ter sido "meu irmão" por
todos esses anos. Caro "Renanzinho das Candongas", você gosta de jogar "Diablo"?
Porque você não aprende então?
Agradeço a amizade dos meus colegas de trabalho, Solange Gubbelini
(Sol), André Baceti, Rosa M. Chura Chambi, Danielle Borim Rodrigues, Tais L. de
Oliveira, Felipe Lino, Juliana Lully, Willian Sato, Camila Yonamine, Natalia Malavasi,
Lucelia Campos, Fátima Klingbeil, Prof^. Dra. Olga Higa, Prof .Dra. Ligia Morgante F.
Dias, José Maria de Souza, Claudia Cecchi, Fernanda Izilda, Fernanda Mendonça,
Adriana Ozaki, Prof. Dra. Kayo Okazaki, Prof. Dra. Teresa Ribela, Prof. Dr. Carlos
Soares, Prof. Dr. Paolo Bartolini, Prof Dra. Cibele Peroni, Miriam Suzuki, Prof Dra.
Márcia Silva, Dra. Andréa Rodas, Rute Batista, Eduardo Moura, Neide Mascarenhas,
Genivalda, Sr. Longino, Elenice "Nice", Calixto e Cicero e Luis Antonio Lobo "leão
lobo".
Ao amor e carinho dos meus tios Alfredo e Imaculada e meus primos
queridos Beatriz e Neto. Aos primos Alexandre, Patricia e Fernanda Cálvente. Aos
meus irmãos Marcos Pereira {in memorian), Murilo S. Neto e ao amor da minha
vida: minha irmã Lenise!
Agradeço a Elisângela Teixeira por ter sido a melhor companhia em São
Paulo. Obrigado pelo carinho, amizade e por ter permitido que eu fizesse parte de
sua vida para sempre.
Agradeço a Comissão de Pós Graduação, em especial a lize Puglia pela
eficiência em todos os processos burocráticos e pela amizade.
Aos mineiros (as) ou cariocas
O autor "mineiroca', pelo amor e amizade incondicional, agradece à:
Simone Gomes Nunes, Juliana Vargas (minha melhor amiga), João Rodrigues
(melhor amigo), Victoria e Luciana Schetino, Wladmir B. Barbosa, Stella Silveira
Cunha, Fabiane Brandão Capella, Rodolfo C. Oliveira, Felipe Batalha, Cristina
España, Leila Abboud e Antônio Marmo (meu segundo pai) e à algumas outras
poucas pessoas que acreditaram em mim.
Saibam que depois da minlia família, vocês mineiros (as) ou cariocas,
são algumas das pessoas mais importantes na minha vida!
Obrigado por tudo!
Leonardo Mussi da Silva
0 aluno foi bolsista da CAPES por dois anos do mestrado.
"... Don't be afraid to be weak
Don't be too proud to be strong
... Don't care wtiat people say
Just follow your own way
Don't give up
And use tfie ctiance
To return to innocence".
Michael Cretu
Moojenina - UM INIBIDOR PROTÉICO DA
TROMBINA ISOLADO DO VENENO DA SERPENTE
Botiirops moojeni
Leonardo Mussi da Silva
RESUMO
Os venenos das serpentes da família Viperidae são compostos por inúmeras
proteínas com atividade proteolítica. Várias dessas proteínas possuem atividade
sobre a coagulação sangüínea durante o processo de envenenamento de suas
vítimas. Algumas serpentes do gênero Bothrops, distribuídas por todo o Temtório
Nacional, possuem proteínas com atividade anticoagulante por inibirem trombina,
protrombina ou agregação plaquetária. No presente trabalho foi demonstrado que no
veneno da serpente Bothrops moojeni existe uma proteína com atividade
anticoagulante. A nova proteína isolada recebeu o nome de "moojenina" e foi
purificada por cromatografia de afinidade à trombina, seguida de troca iônica Mono Q
ou exclusão molecular. Testes revelaram que a "moojenina" inibe a trombina em sua
atividade pró-coagulante e pró agregante plaquetária e é desprovida de atividade
esterásica sobre substrato TAME. A análise eletroforética mostrou que a "moojenina"
tem massa molecular semelhante àquela descrita para botrojaracina, o mais potente
inibidor da trombina, isolada de veneno da serpente Bothrops jararaca. Foi
demonstrado que proteínas botrojaracina-símile são largamente distribuídas em
venenos botrópicos.
Moojenin - A PROTEIC THROMBIN INHIBITOR ISOLATED FROM
THE Bothrops moojeni SNAKE VENOM
Leonardo Mussi da Silva
ABSTRACT
Many snakes from the family Vipehdae have enzymes with proteolitic activity,
many of them acting on haemostatic system. Many of these proteins activate the
coagulation cascade. Some snakes from the Bothrops genus display proteins with
anticoagulant activity, inhibiting thrombin, prothrombin and platelet aggregation. In the
present work we purified "moojenin", a new anticoagulant agent from the venom of
the Brazilian pit viper Bothrops moojeni. "Moojenin" was purified from pooled
Bothrops moojeni venom using affinity chromatography on the CNBr 4B Sepharose-
thrombin column followed by ion exchange or size exclusion chromatography.
"Moojenin" was able to inhibit thrombin induced platelet aggregation as well as
coagulation. "Moojenin" did not show esterasic activity on TAME substrate. On SDS-
PAGE analyses, "moojenin" showed similar molecular mass to bothrojaracin, the
most potent thrombin inhibitor from Bothrops jararaca snake venom. It has been
shown that bothrojaracin-like proteins are widely distributed among Bothrops venoms.
SUMÁRIO
Página
1 - INTRODUÇÃO 1
1.1 - Atividade coagulante 5
1.2 - Inibidores da coagulação sangüínea 8
1.3 - Bothrops moojeni 9
2 - OBJETIVOS 11
3 - MATERIAL E MÉTODOS 12
3.1 - Confecção da coluna de trombina 12
3.2 - Cromatografia por afinidade 13
3.3 - Cromatografia por troca iônica ..14
3.4 - Cromatografia Líquida de Alto Desempenho 15
3.5 - Dosagem protéica 16
3.6 - Eletroforese em gel de poliacrilamida 12% 16
3.7 - Agregação plaquetária 19
3.8 - Atividade esterásica 20
3.9 - Tempo de trombina 20
4 -RESULTADOS 22
4.1 - Confecção da coluna de trombina 22
4.2 - Cromatografia por afinidade 22
4.2.1 - Efeito da temperatura na interação das proteínas do veneno 24
com a resina
4.3 - Cromatografia por troca iônica 25
4.4 - Cromatografia Líquida de Alto Desempenho 27
4.5 - Dosagem protéica 29
4.6 - Eletroforese em gel de poliacrilamida 12% 30
4.7 - Recromatografia do pico referente à "moojenina" 33
4.8 - Agregação plaquetária 35
4.9 - Tempo de trombina - T T 40
4.10 - Atividade esterásica 42
5 - DISCUSSÃO 43
6 - CONCLUSÕES 50
7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 51
1 - INTRODUÇÃO
O temor pelas serpentes - bem como a outros animais peçonhentos -
encontra-se impregnado no imaginário popular, muito embora esse medo não tenha
sido suficiente para motivar medidas eficientes no controle dos acidentes por eles
provocados {apud CARDOSO ef al, 2003). Deve-se a José de Anchieta lugar de
destaque pelo registro original e pioneiro, com enfoque de conotações "clínico-
epidemiológicas", na célebre e sempre citada carta de 1560, escrita em São Vicente:
"[...] E em primeiro lugar há diversos gêneros de cobras venenosas. Umas chamam-
se jararaca, muitíssimo freqüentes nos campos, nos matos e nas próprias casas, onde não
raro as encontramos e cuja mordedura mata no espaço de vinte e quatro horas [...] se foram
mordido uma só vez e escapam à morte, mordidos dai por diante, não só não correm risco
de vida, como até sentem menos dor[...Y (ANCHIETA, 1958).
As serpentes são os animais mais mistificados do mundo. Aparecem na Bíblia
como indutoras do pecado original. Surgem daí, inúmeras lendas envolvendo estes
animais. As lendas estendem-se ainda para os acidentes ofídicos. Aplicar folha de
fumo ou estrume de vaca no local da picada, fazer torniquetes, tentar (sem sucesso)
sugar o veneno são práticas quase sempre utilizadas pelos acidentados.Tudo isso
apenas piora a saúde do paciente e atrasa o tratamento correto que é a soroterapia
heteróloga (AZEVEDO-MARQUES, 2001; BRAZIL, 1903; FRANÇA, 1997).
O soro antiofídico é produzido a partir de imunoglobulinas de cavalos
imunizados com venenos. A radiação ionizante com ^°Co atenua ou cessa os efeitos
tóxicos dos venenos não prejudicando a produção nem a eficiência na produção dos
anticorpos quando estas toxinas são inoculadas enn animais (NASCIMENTO.1995;
NASCIMENTO etal, 1996; SPENCER, 1995).
Os pacientes acometidos, geralmente, são trabalhadores rurais. Medidas de
prevenção tais como calças comphdas e botas poderiam ajudar a diminuir o número
de casos, uma vez que mais de 70% dos acidentes ocorrem abaixo do joelho
(BRASIL, 1998).
Por sua dimensão continental, o Brasil possui uma heterogeneidade de
habitats, o que leva a significativa diversidade de espécies de serpente, aracnídeos,
insetos e peixes, muitos de importância médica por produzirem toxinas (PUORTO,
2005j
Cerca de 20.000 acidentes ofídicos ocorrem todos os anos no Brasil causados
por quatro gêneros de serpentes peçonhentas. O Ministério da Saúde infomna que
90,5% destes acidentes envolvem as serpentes do gênero Bothrops (jararacas),
7,7% dos acidentes são causados por Crotaius (cascavéis). As serpentes do gênero
Lachesis (surucucus) são responsáveis por 1,4% dos acidentes e finalmente 0,4%
dos acidentes correspondem àqueles causados pelas serpentes do gênero Micrurus
(corais verdadeiras). O índice de letalidade no Brasil é de 0,4% (BRASIL, 1998).
Os venenos ofídicos são constituídos por uma grande diversidade de
componentes químicos, tais como proteínas e peptídeos e, em menores
concentrações, carboidratos, lipídeos, nucleotídeos, aminoácidos e componentes
inorgânicos. A toxicidade dos venenos ofídicos é promovida por proteínas e enzimas
que estão diretamente relacionadas com a alimentação e defesa da serpente,
promovendo imobilização, morte e, na maioha das vezes, o início do processo
digestivo da presa (BARRAVIERA, 1994).
Serpentes do gênero Bothrops, popularmente conhecidas como jararaca,
jararacuçu, urutu, caiçaca, dentre vários outros nomes populares, possuem na
constituição de seus venenos uma gama bastante diversa e complexa de
componentes que atuam no sistema hemostático. Atribuem-se aos venenos dessas
serpentes as atividades proteolítica, hemorrágica e coagulante .
A atividade proteolítica ou inflamatoria (figura 1) provoca manifestações locais
de edema, dor, eritema, equimoses, bolhas e necrose (BRASIL, 1998). A atividade
hemorrágica do veneno botrópico é decorrente da presença de metaloproteases
(enzimas que contém Zn) responsáveis pela degradação da membrana basal das
células endoteliais (QUEIRÓS etal, 1985).
Acidente botrópico
632fl'
Figura 1. Fase evolutiva de acidente botrópico: picada no tornozelo há 2 dias com edema extenso e
equimose. (Gentilmente cedido por Dr. João Luiz C. Cardoso - Hospital Vital Brazil, Instituto Butantan.
Foto: Acen/o Hospital Vital Brazil / Instituto Butantan).
Inúmeros animais peçonhentos, de diferentes regiões da Terra, possuem, na
composição de seus venenos, substâncias capazes de provocar alterações do
sistema hemostático. Das diversas atividades farmacológicas dos venenos, as que
atuam sobre a hemostasia sempre suscitaram maior interesse nos pesquisadores,
quer pela possibilidade de aplicação terapêutica e diagnóstica, quer pela importância
dos envenenamentos ofídicos (KAMIGUTI & CARDOSO, 1989).
Os mecanismos fislopatológicos pelos quais os venenos causam distúrbios
hemostáticos são variados e complexos. Contudo, os componentes dos venenos
podem ser agrupados segundo as atividades que exercem sobre o mecanismo
hemostático. Assim, aquelas toxinas que atuam na coagulação podem ser
classificadas como coagulantes e anticoagulantes {apud CARDOSO et al, 2003). As
toxinas que agem diretamente sobre as plaquetas podem ser classificadas em
agregantes e antiagregantes plaquetárías. Finalmente, aquelas que causam lesão
vascular são denominadas fatores hemorrágicos ou hemorragínas (MOURA da
SILVA ef al, 1996). Muitas vezes uma mesma toxina pode apresentar mais de uma
atividade sobre a hemostasia.
1.1 - ATIVIDADE COAGULANTE
Os venenos que possuem a capacidade de ativar fatores da coagulação
sangüínea e de forniar um coágulo visível in vitro (figura 2) são tidos como
coagulantes. Genericamente, os componentes que ativam os fatores da cascata da
coagulação podem ser classificados como afivadores do tipo pró-coagulante ou
como ativadores do tipo trombina-simile (CASTRO et al, 2001).
Entendem-se como ativadores do tipo pró-coagulantes os componentes do
veneno que clivam o fator X ou fator II (protrombina) da cascata de coagulação,
gerando trombina, que por sua vez iiidrolisa o fibrinogênio em fibrina . No entanto, os
ativadores do tipo trombina-simile são aqueles que clivam diretamente o fibrinogênio
em fibrina, sem a necessidade de geração de trombina (BRAUD et al, 2000).
Figura 2: Microfotografia mostrando a rede de fibrina (em verde) e hemácias retidas (em vermelho)
caracterizando o coágulo. Foto: Dennis Kunkel Microscopy, lnc-\ Dennis Kunkel 2001.
6
A cascata da coagulação pode ser ativada pelos venenos das seguintes
formas: (1) promovendo a conversão do fator X em fator Xa; (2) conversão de
protrombina em trombina, na ausência de fator V (ativação direta); (3) conversão de
protrombina em trombina, na presença de fator V (ativação indireta) e (4) conversão
de fibrinogênio em fibrina (atividade trombina símile) (AMARAL ef al, 1980;
DENSON, 1969; DENSON & ROUSSEAL, 1970; NAHAS eía/,1979; OUYANG et
a/, 1987).
A coagulopatia de consumo ocorre quando o fibrinogênio é olivado em fibrina
pela gradativa absorção do veneno pela circulação sangüínea. A fibrina formada
prontamente ativa o sistema fibrinolítico que promove a degradação da mesma. A
deposição de microtrombos formados pode ocorrer nos capilares glomerulares e
contribuir para o quadro de Insuficiência Renal Aguda (IRA). Dentre os vários fatores
que desencadeiam a Insuficiência Renal Aguda (IRA) estão ainda o seqüestro de
líquidos para o local da picada no acidente botrópico e laquético, substâncias
vasoativas, vômitos, desequilíbrio hidreletrolítico e nefrotoxicidade direta. Este fato
desencadeia os quadros clínicos de oligúria, anúria e postenormente Insuficiência
Renal Aguda (IRA), principal causa mortis dos pacientes (AMARAL ef al, 1986;
AZEVEDO-MARQUES et al, 1985; CARDOSO ef al, 2003 ).
Os distúrbios da coagulação podem, de forma sinérgica, agravar os sintomas
de hemorragias, tanto locais quanto sistêmicas (OUYANG et al, 1987). A
trombocitopenia observada in vivo pode ser decorrente da Batroxobin, uma proteína
com atividade agregante plaquetária na presença de fator de von Willebrand
(KAMIGUTI ef al, 1986; READ ef al, 1978). Os pacientes acometidos por acidentes
ofídicos envolvendo serpentes dotadas de veneno com atividade sobre as plaquetas.
co^ssÃo miom- DÊ EMERSA Í41XI£AR/SP-ÍPE'̂
geralmente apresentam uma importante queda no número de plaquetas
(plaquetopenia), fato que é revertido após a administração do soro (CARDOSO,
J.L.C.; 2003)
A tabela abaixo mostra algumas proteínas com atividade sobre o fibrinogênio,
isoladas do veneno de serpentes.
Tabela 1: Principais serinoproteases isoladas do veneno de serpentes
Ancrod - Calloselasma hodostoma
Batroxobin - Bothrops atrox
Bilineobin - A. binlineatus
Botlirobin - 6. jararaca
Calobin - C. atrox
Crotalase - C. adamanteus
Flavoxobin - Trimeresurus flavoviridis
Giroxina símile - Lachesis muta
TM-VIG - T. mucrosquamatus
Fibrinogênio (A, [B])*, fator XII
Fibrinogênio (A, [B]), fator Xil
Fibrinogênio (B, [A])
Fibrinogênio (A), fator VIII
Fibrinogênio (A, [B])
Fibrinogênio (A, [B])
Fibrinogênio (A)
Fibrinogênio (A, [B])
Fibrinogênio (A)
* Entre parênteses, principal fibrinopeptídeo liberado do fibrinogênio. Entre colchetes, fibrinopeptideo
liberaco em menor velocidade. Modificada de MATSUI et al, (2000).
8
1.2 - INIBIDORES DA COAGULAÇÃO SANGÜÍNEA
Inibidores de proteases estão presentes em venenos ou ainda no plasma de
serpentes. Arni e colaboradores (2004) isolaram e cristalizaram uma proteína
denominada BmjMIP, oriunda do plasma de B. moojeni, capaz de neutralizar
algumas atividades enzimáticas, tóxicas e farmacológicas de várias fosfolipases
ácidas e básicas dos venenos de 6. moojeni, B. pirajai e B. jararacussu.
Foi demonstrado por ZlNGALl e colaboradores (1993) que a botrojaracina,
uma proteína de 27 kDa e pertencente à família das lectinas do tipo C, é capaz de
inibir 50% da atividade da trombina em agregar plaquetas, numa concentração
relativamente baixa (0,06 ^ig/mL), sendo o mais importante inibidor da coagulação
sangüínea, proveniente do veneno de serpente estudado até hoje.
A botrojaracina é uma proteína ácida (pl = 4,2) purificada do veneno de
6. jararaca que forma um complexo não covalente com a trombina. A botrojaracina
inibe a atividade da trombina sobre fibrinogênio, fator V, plaquetas, a ativação da
proteína G, a ligação da trombina com a trombomodulina e o complexo antitrombina-
heparina (AROCAS eí al, 1996; ZlNGALl ef al, 1993). A botrojaracina também se liga
à protrombina e inibe a trombina ligada ao coágulo. Diversas isoformas da
botrojaracina foram descritas para o veneno de Bothrops jararaca (MONTEIRO ef al,
1997 e 1998).
CASTRO e colaboradores (1999) isolaram e identificaram, no veneno da
serpente Bothrops alternatus (urutu), um novo inibidor da coagulação. A botralternina
é uma proteína com 95% de homología á botrojaracina nos primeiros 25 aminoácidos
analisados. Com 27 kDa de massa molecular, a botralternina é também uma lectina
com capacidade de inibir a atividade da trombina, ligando-se ao exositio da mesma.
Contudo, a botralternina mostra-se menos eficiente que a botrojaracina na
capacidade de inibir a trombina com um IC 50 de 0,19|ig/mL (CASTRO etal, 1998).
Componentes ativadores da proteína C foram descritos para os venenos de
Bothrops moojeni e Bothrops pradoi, atuando como agentes anticoagulante, uma vez
que a proteína C ativada inibe os fatores V e VIII ativados e também a trombina
(STOCKER, 1996). Frações isoladas dos venenos de algumas serpentes Bothrops
sp podem inibir a coagulação sangüínea ou agregação plaquetária (ANDREWS eí al,
2004). Algumas proteínas com esta propriedade foram isoladas do veneno de
Bothrops jararaca e Bothrops alternatus, contudo, pouco se conhece sobre qualquer
inibidor da trombina presente no veneno de Bothrops moojeni.
1.3 - Bothrops moojeni
Durante a construção de Brasília (DF), foram capturados inúmeros espécimes
de Bothrops moojeni e remetidos ao Instituto Butantan, propiciando sua identificação
como uma espécie nova. Trata-se da principal espécie de Bothrops dos cerrados do
Brasil central, distribuindo-se desde o Paraná até o Maranhão (FURTADO, M.F.;
1987). É uma das poucas espécies que tem crescido em importância médica, pois
consegue se adaptar bem aos ambientes modificados pelo homem, além de
apresentar comportamento extremamente agressivo e ter um porte avantajado
podendo, os exemplares adultos, superar 1,5 m de comprimento (figura 3).
10
Figura 3; Bothrops moojeni Foto: L. Mussi Distribuição geográfica da Bothrops moojeni
Sabe-se que a trombina constitui a principal enzima da cascata de coagulação
além de estar envolvida no desenvolvimento de processos patológicos como a
inflamação (SUO ef al, 2004). Distúrbios na produção normal de trombina podem
gerar quadros tromboemboliticos. Como já demonstrado na literatura, algumas
serpentes possuem, na constituição de seus venenos, proteínas capazes de inibir a
atividade da trombina ou mesmo evitar a sua formação a partir da protrombina
(ZlNGALl etal, 1993; MONTEIRO & ZlNGALl, 2000).
É cada vez maior a procura por fánnacos com a propriedade de modular a
formação de trombos, principalmente àqueles que evitam sua formação. Assim
pesquisas que buscam por componentes de venenos, envolvidos no processo de
coagulação, poderá contribuir sobremaneira para uma mudança substancial na
sobrevida dos pacientes vitimas dos acidentes tromboembólicos.
11
2 - OBJETIVOS
Os objetivos deste trabalho visam:
o Pesquisar, no veneno da serpente Bothrops moojeni, componentes com
capacidade de inibir a atividade da trombina em formar trombos ou agregar
plaquetas.
• Obtenção da proteína pura através de processos cromatográficos.
• Realizar testes de agregação plaquetária e Tempo de Trombina (TT) para
avallar a atividade biológica da proteína.
12
3 - MATERIAL E MÉTODOS
3.1 - Confecção da coluna de trombina
Para a realização da purificação de um inibidor da trombina optou-se como
primeiro passo, o processo cromatográfico por afinidade àquela proteína. Assim, a
primeira ação foi a de acoplar a trombina à resina adequada, para então dar início ao
processo de purificação.
Para tanto, foram pesados 10g de resina Sepharose 4B CNBr e esta foi
inchada em HCl 1mM por 1 hora rendendo cerca de 12 mL de gel. A resina foi
ativada com uma lavagem da mesma solução de HCl por 1 hora. Uma vez ativada, a
resina foi ambientada em tampão fosfato 50mM, pH 8,0.
Equilibrada a resina, o tampão foi substituído pela solução de trombina. Foram
pesados 65 mg de trombina (Sigma). Em seguida a trombina foi dissolvida em 25 mL
de Phosphate Buffer Saline (PBS). Antes da adição à resina, a solução de trombina
teve sua absorvância mensurada em comprimento de onda a 280 nm para
comparação dos valores antes e após o acoplamento da proteína à resina
Sepharose.
A trombina foi adicionada à resina e incubada durante 12 horas no rotator à
temperatura de 4° C. Para preencher possíveis sítios ativos da resina foi utilizado um
tampão com grupamento amina. Para tanto foi preparado um tampão contendo
50mM de glicina em pH 7,5 e adicionado à solução da resina contendo trombina por
1 hora no rotator (cerca de 20 mL da solução).
13
Após a adição da glicina e incubação por 1 hora no rotator em geladeira a 4°C,
a solução foi colocada em repouso para a sedimentação da resina e posterior
remoção do sobrenadante e substituição do mesmo por 30 mL de PBS. O
empacotamento ocorreu de forma lenta para evitar o surgimento de bolhas. A
solução com a resina foi elevada para um volume maior (de 30 para 100 mL)
também para evitar a formação de bolhas. Após o empacotamento foram passados 3
vezes o volume da coluna com tampão A: tris HCl 20 mM + 150 mM NaCI pH 7,5,
quando a coluna foi armazenada em geladeira a 4°C.
3.2 - Cromatografia por afinidade
O veneno total de Bottirops moojeni (100 mg) foi solubilizado com tampão A
(tris HCl 20 mM +150 mM NaCI, pH 7,5) e passou por um pré-tratamento com inibidor
de metaloproteases (ácido etilenodiamino tetracético - EDTA 8 mM) e inibidor de
serinoproteases (fenilmetilsulfonil fluoreto - PMSF 5 mM) como descrito por
AROCAS et al (1996) para evitar a clivagem da trombina acoplada à resina pelas
enzimas do veneno. Em seguida a solução foi centrifugada a 14000 RPM a 600g por
5 minutos para retirada de material insolúvel e o sobrenadante aplicado na coluna de
trombina (Sepharose CNBr 4B - trombina). O veneno aplicado permaneceu incubado
na coluna por 2 horas à temperatura ambiente. O produto não retido pela coluna foi
eluído com a adição de tampão A, sendo utilizados 3 vezes o volume da coluna.
14
As frações com afinidade foram eluidas com uma redução do pH de 7,5 para
pH 2,0 com uma solução HCl 0,01 N e 0,5M de NaCl. As frações foram coletadas em
tubos com volume de 1 mL /tubo e imediatamente neutralizadas com 100 |al de tris
1M pH 8,0. A absorvância a 280 nm foi obtida através da leitura das frações em um
espectrofotômetro (Pharmacia, Ultrospec III). Os tubos contendo a fração inibitória
da trombina foram reunidos e dialisados contra PBS ou contra água por 12 horas a
4°C. Após este processo a fração foi congelada a - 8 0 C° e liofilizado. As amostras
dialisadas contra PBS foram utilizadas para avaliar atividade biológica.
3.3 - Cromatografia por troca iônica
Foram pesadas 30 mg da terceira fração proveniente da cromatografia de
afinidade. Esta massa de proteína foi ressuspendida em 1,2 mL e injetada em uma
coluna de troca iônica Mono Q. A resina possui carga positiva, assim retém proteínas
com carga negativa. O tampão A constituía-se de (Tris HCl 50 mM pH 8,0). Após dez
minutos o tampão B (Tris HCl 50 mM + 1M NaCI pH 8,0) foi introduzido e chegou a
concentração de 50% em 45 mL. O coletor foi programado para 1mL/tubo.
15
3.4 - Cromatografia Líquida de Alto Desempenho
{High Performance Liquid Chromatography - HPLC)
A coluna CNBr Sepharose-trombina foi utilizada para pré purificar as frações
com afinidade por trombina, onde foram produzidos três picos (figura 3). O terceiro
pico, proveniente daquela coluna, promoveu a melhor atividade biológica ao inibir
trombina. Este pico foi submetido à cromatografia por exclusão molecular em coluna
TSK - 3000 no sistema HPLC. A resina da coluna era constituída de microporos o
que faz com que proteínas com pequena massa molecular e peptídeos entrem em
vários desses poros e sofram assim, atraso. Proteínas com maior massa molecular
não entram nos poros, não sofrem atraso e assim são eluidas mais rapidamente.
Conseqüentemente os primeiros picos do cromatograma são referentes ás proteínas
com maior massa molecular e os últimos picos, às proteínas com menor massa
molecular ou peptídeos.
O tampão utilizado para esta cromatografia foi bicarbonato de amónio 50
mM, pH 7,0. Cerca de 3 mg de massa do terceiro pico da coluna de trombina foram
ressuspendidos em 250 pL do tampão supracitado e aplicados em coluna TSK 3000
no sistema HPLC
16
3.5 - Dosagem protéica
A concentração protéica das amostras provenientes da cromatografia por
afinidade e troca iônica foi determinada através do método de Bradford (1976). Tal
método baseia-se na capacidade das proteínas de interferir com a absorvância do
corante Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 em meio altamente ácido, resultando
em modificação proporcional da cor, detectável em 595 nm. O reagente utilizado
nesse método consiste de uma mistura de Coomassie Briiliant Blue (CBB) G-250,
etanol absoluto, ácido fosfórico e H2O destilada.
Para a curva padrão fez-se uma diluição seriada de albumina bovina Img/mL
em solução salina, obtendo as diluições 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 e 1:32. Para a realização
da cun/a padrão, foram acrescentados lOO^L das amostras de albumina em 3mL do
reagente, em duplicatas. Os dados da curva padrão foram ajustados por regressão
linear e a equação y = ax + b, foi utilizada para calcular a concentração protéica das
amostras, sendo (y) a densidade óptica, (x) a concentração protéica, (a) o coeficiente
angular da reta e (b) o coeficiente linear.
3.6 - Eletroforese em gel de poliacrilamida 12%
Foi feita uma análise em Sodium Dodecil Sulfato - Poliacrilamide Gel
Electrophoresis (SDS-PAGE) segundo o método descrito por Laemmli (1970) para
determinar o conteúdo protéico dos picos obtidos do fracionamento pela coluna de
trombina e troca iônica e, assim estimar o peso molecular das proteínas das frações.
17
As amostras e padrões de peso molecular foram desnaturadas em tampão de
amostra (Tris HCl 0,08M, SDS 2%, glicerol 10%, azul de bromofenol 0,001%, 50%
v/v) 5 85=C por aproximadamente 5 minutos. O azul de bromofenol foi utilizado como
traçador e permitiu acompanhar a evolução da eletroforese.
Tabe a 2 - Soluções e reagentes utilizados no preparo do gel de poliacrilamida.
Soluções Resolução Empilhamento
(gel 15%) (gel 3.5%)
Solução A/B 7,5 mL 3,4 mL
"ampão resolução 3,8 mL -
Ta.mpão empilhamento - 0,63 mL
Água destilada 3,5 mL 3,4 mL
Solução PA 10% 0,15 mL 0,05 mL
TEMED 0,006 mL 0,005 mL
SDS 0,15 mL 0,05 mL
Relação dos reagentes utilizados para produção do gel de poliacrilamida com SDS: A/B Acrilamida
30%. í i s a c i a m i d a 0,8%, em água destilada; PA persulfato de amónio a 10% em água destilada.
Reagentes: Tampão de resolução Tris HCl 1,5M, pH 8,8 contendo 1% de SDS; Tampão de
empilhamento Tris HCI 1M, pH 6,8 contendo 1 % de SDS; SDS dodecil sulfato de sódio; TEMED
N.N.N N'-te:'-ametiletilenediamida (Sigma Chemical Co, USA).
18
Tabela 3 - Padrões proteicos utilizados para a curva de calibração de peso molecular em
SDS-PAGE.
Proteínas
Soro albumina bovina
Anidrase carbônica
Citocromo C
Peso Molecular
(Daltons)
66.000
29.000
12.400
Foram aplicados 20jag de massa protéica em cada poço do gel. Para a corrida
da eletroforese, foi utilizado o tampão Tris 0,025M glicina 0,20M, pH 8,3 e SDS 1%.
Foi aplicada uma voltagem de 80 Volts no gel por aproximadamente 1,5 horas à
temperatura ambiente. Após a corrida o gel foi corado em uma solução contendo
Brilliant Blue (CBB) R-250 0,4% em metanol 50% e ácido acético 7% por 1 hora e em
seguida descorado em uma solução de ácido acético 10% e etanol 30% por 12
horas, à temperatura ambiente.
19
3.7 - Agregação plaquetária
A agregação plaquetária foi realizada no Laboratório de Hemostasia da
Fundação Pró Sangue (Hemocentro de São Paulo) do Hospital das Clinicas - HC.
Os experimentos visavam avaliar a atividade inibitória da "moojenina" frente a
capacidade da trombina em ativar a coagulação e agregar plaquetas. Para tanto, foi
realizado o experimento onde plaquetas lavadas eram submetidas à agregação
induzida por trombina ou trombina com "moojenina".
Para a obtenção das plaquetas, amostras de sangue, de vinte doadores do
hemocentro, foram coletadas e submetidas à centrifugação por 6 minutos a 1000
RPM e 400g. O plasma rico em plaquetas (PRP) apresentou uma concentração de
560.000 plaquetas/mm^. Uma diluição foi realizada para se obter uma concentração
de 300.000 plaquetas/mm^ como protocolo utilizado pela Fundação Pró Sangue.
Todos os testes com agregação plaquetária foram realizados incubando as
frações das cromatografias com trombina por 5 minutos. Em seguida a solução foi
adicionada às plaquetas lavadas e a agregação assim mensurada. As plaquetas
foram obtidas através da centrifugação de 4 mL de sangue em cada um dos tubos
siliconizados. Cerca de 20 mL de sangue total foram centrifugados a 1000 RPM por 6
minutos. Para impedir a coagulação sangüínea, citrato de sódio 3,2% foi utilizado
uma vez que se trata de um quelante de cálcio, íon fundamental para o processo de
coagulação. Todo o processo ocorreu em tampão de lavagem Tyrode (137 mM NaCI,
2,7 mM KCI, 0,3 mM NaHCOa, 0,42 mM NaH4P04, 2mM MgCb) contendo 1% de
glicose, 0,25% de gelatina e 2 mM de EGTA em pH 6,1. Plaquetas foram
ressuspendidas em um tampão Tyrode modificado contendo 1 mM MgCb, 128 mM
20
NaCI. pH 7, 4 e sem EDTA. As plaquetas foram mantidas a temperatura ambiente e
utilizadas em menos de 6 horas.
3.8 - Atividade esterásica
Foi realizado um experimento para avaliar uma possível atividade esterásica
da "moojenina" segundo método descrito por NOLAN et al (1976). As frações
provenientes da coluna de afinidade por trombina e frações da coluna Mono Q, bem
como 'moojenina" foram submetidas ao teste. As amostras foram dissolvidas em
tampão tris HCl 8 mM, pH 8,0, contendo 20 mM de CaCla. Tripsina 1 mg/mL, em
solução com ácido clorídrico 1 mM, foi utilizada como padrão positivo. O substrato
Tosil Arginina Metil Ester - TAME (1 mL, 2,5mM) foi incubado com 10 pg das frações
das cromatografias e a densidade óptica mensurada a 247 nM por 5 minutos.
3.9 - Tempo de trombina
O tempo de trombina é utilizado para avaliar, em segundos, o tempo
necessário para aquela enzima olivar o fibrinogênio e formar um coágulo a partir dos
monomeros de fibrina. A trombina tem como alvo principal na cascata de coagulação
a molécula de fibrinogênio. Contudo é uma enzima multifuncional e diva também
fatores X, V, XIII, dentre outras proteínas.
21
O teste do Tempo de Trombina (TT) foi realizado no Laboratorio de
Hemostasia do Hemocentro de São Paulo - Hospital das Clínicas. Cerca de 10 mL
de Plasma Pobre em Plaquetas (PPP) foram obtidos de 20 doadores de sangue do
hemocentro e centrifugados a 1800 g por 15 minutos. O plasma assim estava livre
das plaquetas, contendo somente os fatores da coagulação. Diferentes
concentrações (0,10pg/mL, 0,20pg/mL, 0,50|jg/mL, Ipg/mL) das frações oriundas
das purificações ou "moojenina" foram incubadas com trombina 2 nM (concentração
final) como descrito por ZlNGALl ef al, 1993 e o complexo trombina e frações ou
trombina e moojenina foi adicionado a 200 pL de plasma pobre em plaquetas e a
coagulação monitorada em um coagulômetro.
22
4 - RESULTADOS
4.1 - Confecção da coluna de trombina
Os 10g de resina, quando inchados e ativados com HCL 1 mlVi produzem
cerca de 15 mL de gel. A dosagem protéica da solução contendo trombina, antes do
acoplamento, determinou a concentração de 1,335 mg em comprimento de onda de
280 nm. Após a reação o valor foi de 0,391 mg. As amostras de veneno adicionadas
a essa coluna foram pré-tratados com inibidor de sennoproteases como
fenilmetilsulfonil fluoreto e inibidor de metaloproteases como ácido etilenodiamínico
tetracético, como descrito em Material e Métodos.
4.2 - Cromatografia por afinidade
A nova coluna mostrou-se com resolução adequada mesmo depois de 30
cromatografias. A cromatografia por afinidade com trombina resultou em três picos
os quais foram testados para as atividades anticoagulante e antiagregante
plaquetária (figura 4).
23
100 mg de veneno total de S. moojeni em coluna de trombina
O 20 40 60
Frações
Figura 4; Cromatografia por afinidade em coluna Sepharose CNBr trombina. 100 mg de veneno total
de Botiirops moojeni pré-tratados com inibidores de serinoproteases e metaloproteases (PMSF e
EDTA; respectivamente. As setas indicam os picos com afinidade pela trombina. O pico 3 refere-se à
fração contendo a "moojenina",
24
4.2.1 - Efeito da temperatura na interação das proteínas do veneno
com a resina
Foi observado que hà uma significativa diferença na interação das proteínas
do veneno com afinidade pela coluna CNBr Sepharose-trombina, quando
considerada a variação de temperatura. Uma média da absorvância em comprimento
de onda de 280 nm entre 20 cromatografias realizadas em temperatura entre 12 e
15 °C (figura 5) e outras 20, em temperatura entre 26 e 29 °C ( igura 4) foi obtida.
Nota-se que o aumento da temperatura promove uma maior interação das proteínas
pela resina de afinidade.
Figura 5; Cromatografia com 100 mg de veneno de Bothrops moojeni pré-tratados, em coluna CNBr
Septiarose-trombina. Temperatura entre 12 e 15 °C.
25
4.3 - Cromatografia por troca iônica
O veneno de Bothrops moojeni fo\ fracionado em cromatografia por afinidade à
trombina (figura 6). As frações oriundas desta cromatografia eram diaiisadas contra 2
L de PBS ou água destilada, congeladas e finalmente liofilizadas. Foram então
pesados 30 mg de massa da fração 3, aquela com maior atividade inibitória da
trombina, diluída em tampão A e injetada numa coluna Mono Q. A coluna tem o seu
gel carregado com cátions (carga positiva), possui assim, afinidade por proteínas
com carga negativa. A eluição foi realizada com adição de tampão com alta
concentração de sal. O tampão A constituía-se de (Tris HCl 50 mM pH8). Após dez
minutos foi introduzido o tampão B (Tris HCl 50 mM + 1M NaCI pH 8,0) o qual atingiu
50% de sua concentração em 45 mL.
26
Figura 6: Cromatografia, em coluna de troca iônica, do terceiro pico da coluna de trombina (30 mg) em
coluna Mono Q. A seta indica o D;CO referente à "moojenina". Tampão A (Tris HCl 50 mM pH 8,0).
Após dez minutos foi introduzido o tampão B (Tris HCl 50 mM + 1M NaCI pH 8,0). Absorbance Unit
Full Sca/e (AUFS) = 1. Fluxo 0,5 mL'min. 1 mL/tubo.
Podem ser observados, na figura 6, os três picos da coluna Mono Q, onde o
segundo refere-se à "moojenina". As frações foram coletadas, dialisadas contra 2L
de PBS ou água destilada ;3or 12 horas. Amostras de 1 mL de cada pico toram
coletadas após o processo de diálise e mantidas congeladas até o momento dos
testes de atividade biológica. O restante dos produtos dialisados foi congelado a
- 8 0 C .
27
4.4 - Cromatografia Líquida de Alto Desempenho
{High Performance Liquid Chromatography- HPLC)
O terceiro pico, oriundo da cromatografia por afinidade a trombina, além de ter
sido submetido à cromatografia por troca iônica em coluna Mono Q (figura 6),
também foi cromatog rafado em uma coluna TSK utilizando sistema HPLC, onde o
sétimo pico daquela cromatografia refere-se à "moojenina" (figura 7). O sétimo pico
da cromatografia supracitada foi liofilizado e recromatografado na mesma coluna,
como mostrando a eliminação da maioria dos contaminantes (figura 10).
28
Pico 7 - Tempo de retenção moojenina = 25.80 minutos
Figura 7: Cromatografia Líquida de Alto Desempenho - HPLC utilizando coluna TSK 3000. Os traços
em vermelho indicam o começo e o término da coleta do sétimo pico. Tampão: bicarbonato de amonio
50mM, fluxo 0,5 mL/mlnuto.
O penúltimo pico (pico 7) da cromatografia em sistema HPLC (indicado pelos
cortes em vemfielho na figura 7) representa a "moojenina". A f r a ç ^ referente ao pico
7 foi coletada, dialisada contra 2L de PBS ou água destilada por 12 horas. Amostras
de 1 mL desse pico foram coletadas após o processo de diálise, iiofílizada e
29
mantidas a -20 °C até o momento dos testes de atividade biológica. O restante dos
produtos dialisados foi congelado a -80C.
4.5 - Dosagem proteica
Para a/aliar o conteúdo protéico eluído das cromatografias, foi construida uma
curva padrão utilizando albúmina de soro bovino. A correlação dos resultados foi alta
com = 0,9972. A construção da cun/a com os resultados das D.O. foi feita com o
auxilio do programa ORIGIN.
30
4.6 - Eletroforese em gel de poliacrilamida 12%
Sodium Dodecyl Sulfate - Poliacrilamida Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
Amostras com cerca de 20 de massa dos picos 2 e 3 da cromatografía por
afinidade, bem como o produto não retido naquela coluna, foram submetidos à
eletroforese em gel de poliacrilamida 12% para verificação do material protéico e
estimativa do peso molecular das proteínas. Amostra do veneno total de B. moojeni
também foi submetida ao mesmo teste.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
66 kDa
29 kDa
M 2,4 kDa
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Figura 8: SDS 10% - PAGE com 20 ou 40 |jg de massa em cada lane. A seta indica a fração
contendo "moojenina".
Lane 1 - padrão de peso molecular Lane 5 - pico 2 coluna de trombina
Lane 2 - veneno total de Bothrops moojeni Lane 6 e 7 - vazios
Lane 3 - não retido em coluna de trombina (40 pg) Lane 8 - vazio
Lane 4 - pico 3 coluna de trombina (40 pg) Lane 9 - padrão de peso molecular
31
Na figura 8 pode-se verificar SDS-PAGE 12% onde nos lanes 1 e 9 os
padrões de peso molecular com soro albúmina bovina (66 kDa), anidrase carbônica
(29 kDa) e citocromo C com 12.400 kDa. No lane 2 pode-se observar a presença de
inúmeras proteínas com variadas massas moleculares no veneno total de Bothrops
moojeni. O produto não retido na coluna de afinidade por trombina foi aplicado no
lane 3 (figura 8) mostrando proteínas que não estão presentes no lane 4 onde foi
aplicado o terceiro pico (figura 4) da coluna de trombina. No lane 5 é observado o
perfil eletroforetico do segundo pico da coluna de trombina e ausência de proteínas
na faixa de 66 küa como aparecem no lane 4. Não foi aplicado material nos lanes 6,7
e 8 .
1 2 3 4 5 6 7 8 1
•- f
66
29
I -2 3 4 5 6 7 8
Figura 9: Eletroforese em gel de poliacrilamida 12% com SDS. Seta indica "moojenina".
Lane 1 - 20 pg padrão de peso molecular Lane 5- 10 pg pico 1 da coluna de trombina
Lane 2 - 1 0 pg veneno total de fi. moojeni Lane 6 -10 pg não retido coluna Mono Q
Lane 3 - 5 pg pico 3 da coluna de trombina Lane 7 - 20 pg "moojenina" - coluna Mono Q
Lane 4 - 1 0 pg pico 2 da coluna de trombina Lane 8 - 1 0 pg pico 3 da coluna Mono Q
32
A figura 9 mostra SDS-PAGE 12% onde se se observa no lane 1 os padrões
de massa molecular como descrito em Material e Métodos. No lane 2 foram
aplicados 10 pg de veneno total de B. moojeni revelando proteínas com massas
moleculares entre 15 e 66 kDa. No lane 3 foi aplicada uma menor massa (5 pg) do
terceiro pico da coluna de trombina uma vez que 40 pg da mesma amostra, torna-se
difícil a verificação da banda correspondente à "moojenina". Aínda no lane 3 nota-se
uma banda protéica com massa molecular próximo a 30 kDa. O segundo pico da
coluna de trombina (figura 4) foi aplicado no lane 4 e revela proteínas com perfil
eletroforetico semelhantes ao pico 3 da cromatografia. O lane 5 mostra que o
primeiro pico da coluna de trombina possui proteínas com diferentes massas
moleculares variando de 70 a 15 kDa e possui atividade pró-coagulante. No lane 6
foram aplicados 10 pg do produto não retido na coluna de troca iónica Mono Q,
revelando três proteínas com massas moleculares em torno de 60 kDa, 29 kDa e 20
kDa. O lane 7 refere-se à "moojenina" purificada através da cromatografia por troca
iónica em coluna Mono Q.
33
4.7 - Recromatografia do pico referente à "moojenina"
Tempo de retenção da moojenina = 25.10 minutos
j L
Figura 10: Recromatografia do pico 7 proveniente da cromatografia em coluna TSK 3000 em sistema
HPLC, indicando "moojenina". Tampão: bicarbonato de amónio 50mM, fluxo 0,5 mL/minuto.
O sétimo pico proveniente da cromatografia por exclusão molecular em coluna
TSK 3000 em sistema HPLC (figura 7), foi recromatografado na mesma coluna para
avaliação de sua pureza. A figura 10 mostra a pureza do material coletado no pico
sete daquela cromatografia, com um tempo de retenção (25,1 minutos) próximo
àquele obtido quando se aplicou a terceira fração (pico 3) da coluna de trombina
(25,8 minutos - figura 7).
34
1 2 3
66 kDa
29 kDa
12,4 kDa
Figura 11: SDS10%-PAGE. Seta indica "moojenina" proveniente da recromatografia por gel filtração
(figura 10) em coluna TSK no sistema HPLC.
Lane 1 - 30 pg do padrão de peso molecular
Lane 2 - 30 pg de veneno total de Bothrops moojeni
Lane 3 - 5 pg da recromatografia do pico 7 da coluna TSK (HPLC)
Foi realizado teste em SDS 10%-PAGE para avaliar a pureza do material
("moojenina") recromatografado por exclusão molecular. A figura 11 mostra no lane
1, padrão de massa molecular como descrito em Material e Métodos. No lane 2 pode
ser observado veneno total de B. moojeni enquanto no lane 3 foram aplicados 7 pg
de "moojenina" oriunda da recromatografia por gel filtração mostrando a eliminação
da maioria dos contaminantes.
35
4.8 - Agregação plaquetária
Os três picos oriundos da cromatografia por troca iônica em sistema FPLC e
exclusão molecular em sistema HPLC foram testados para as atividades
anticoagulante e antiagregante plaquetária. Os resultados da atividade antiagregante
plaquetária e anticoagulante (tempo de trombina) mostraram que os picos 2 e 3,
provenientes coluna de trombina, assim como o segundo pico gerado pela coluna
Mono Q, são capazes de inibir a trombina em sua atividade pró agregante
plaquetária e pró-coagulante. Os testes de coagulação e agregação plaquetária
revelam que o terceiro pico possui a maior atividade inibitória da trombina.
Oamll C a a r a J a C h a m e l a Cha imeSA
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thr 0,7UI 75%
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o
Figura 12: Controle positivo nnostrando agregação plaquetária com diferentes concentrações de
trombina (0,7 e 0.07 U/mL), O gráfico refere-se ao tempo decorrido em minutos logo após a adição de
trombina em relação ao percentual crescente da agregação.
36
O controle positivo foi obtido através da adição de trobina 0,07 Ul
(concentração final) às plaquetas lavadas. No protocolo para agregação plaquetária
do Laboratorio de Hemostasia da Fundação Pró Sangue utiliza trombina 0,7 U/mL
como padrão para controle positivo. Todavia foi utilizada a concentração de 0,07
U/mL conforme descrito por ZlNGALl eí al (1993).
Em contato com plaquetas, a trombina tem a propriedade de ativá-las
(figura 12). Um processo em que a trombina diva a glicoproteína Ib (GPIb) ativando
plaquetas vizinhas. Isso faz com que estas emitam pseudópodes e liberarem
substancias (ADP, tromboxana A2, etc) que atuam na adesão e agregação
plaquetária. Todas as plaquetas envolvidas, assim tornam-se extremamente
viscosas, facilitando a adesão e agregação plaquetária. Um processo que requer
fator de von Willibrand.
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Figura 13: Controle negativo da agregação plaquetária utilizando PBS. O gráfico refere-se ao tempo
decorrido em minutos logo após a adição de PBS em relação ao percentual crescente da agregação.
37
1;0D ZOÜ 3;03 im S.BO ftW
Figura 14: Atividade pró-coagulante do pico 1 (5 pg) proveniente da coluna por afinidade à trombina.
Indução da agregação oiaquetána de 65%. O gráfico refere-se ao tempo decorndo em minutos logo
após a adição do pico " em relação ao percentual crescente da agregação.
Os resultados dos testes de agregação plaquetária revelam que mesmo
possuindo afinidade pela coluna de trombina, o pico 1 da coluna de trombina não
possui atividade antiagregante plaquetária e revela atividade pró agregante. Isso se
deve ao fato de nem todas as proteínas serem neutralizadas pelos inibidores de
serinoproteases.
No controle negativo pode-se observar que o PBS não é capaz de induzir a
agregação plaquetária. Todas as amostras de toxinas utilizadas encontravam-se em
presença de PBS.
CtiBhrwll Ctm\nH2 ChMnelS CSiam^K
38
ciiiuinel 1 Cianea ChartniHS Channct <
(l;30 1;3C 2áM 2:30 3:00 3:30 4 . » 5;CiD
Tiiij» {nninrsee)
Figura 15: Atividade antiagregante plaquetária do terceiro pico oriundo da cromatografia por afinidade
em coluna de trombina. Indução de 30% da agregação. O gráfico refere-se ao tempo decorrido em
minutos logo após a adição de trombina e o pico 3 {"!5 pg) da coluna de trombina em relação ao
percentual crescente da agregação (figura 12).
Como a fração do terceiro pico da coluna de trombina não se encontrava
totalmente pura, uma maior massa protéica da terceira fração da cromatografía por
afinidade à trombina foi utilizada pra promover a inibição da agregação plaquetária
induzida por trombina. Neste experimento 15 pg de massa do terceiro pico foram
utilizados para promover apenas 30% de agregação plaquetária.
39
O a m i l Cnanitel2 CJianneO Ctnm<<4
^:0a 2flO 3:00 *M S:0[)
Time ^imrBBc)
Figura 15: Atividade antiagregante plaquetária da "moojenina". Indução de 12% da agregação
plaquetána. O gráfico refere-se ao tempo decorrido em minutos logo após a adição de trombina e
"moojenina" (1pg) em relação ao percentual crescente da agregação.
Na figura 16 pode-se obsen/ar uma importante inibição da agregação
plaquetária induzida por trombina utilizando 1 ( Ipg) de "moojenina" purificada
através da cromatografia por troca iônica. O mesmo resultado é obtido com
"moojenina" purificada através da cromatografia por exclusão molecular utilizando
coluna TSK- 3000 em sistema HPLC. Dados não apresentados.
40
4.9 - Tempo de trombina - T T
O teste avalia quanto tempo em segundos é necessário para que a trombina
clive a molécula de fibrinogênio em fibrina formando coágulo. A trombina é a fomria
ativa do zimogênio protrombina (ou fator II) da coagulação. A "moojenina" foi testada
em sua atividade inibitória da trombina. Esta é a principal enzima da cascata de
coagulação tendo como substrato principal, a molécula de fibrinogênio. A trombina
ainda participa de diversos processos moleculares e celulares. A "moojenina" foi
incubada com trombina (0,07 U/mL) por 5 minutos e este complexo adicionado ao
plasma pobre em plaquetas.
Segundo os padrões utilizados pela Fundação Pró Sangue, valores com três
unidades (em segundos) acima do padrão são considerados Tempo de Trombina
(TT) prolongado. O padrão de TT do pool de plasma era de 14 segundos. Resultados
com "moojenina", 1pg/mL mostram TT incoagulável, apresentados aqui somente até
40 segundos.
41
T e m p o d e T r o m b i n a
45 -.
40 .
35 .
"> 3 0 o
c
(31 O)
CO
2 5
20
15
10
5
O
n
Figura 17: Gráfico do Tempo de Trombina (TT) utilizando diferentes amostras mostrando a
coagulação do plasma pobre em plaquetas em relação ao tempo em segundos. O agente indutor da
coagulação foi trombina 2 nM.
1 - controle (+) com trombina 2 nM
2 - Veneno total de Bothrops moojeni
3 - Pico 1 da coluna Mono Q
4 - Pico 2 da coluna de trombina
5 - Pico 3 da coluna de trombina
6 - "Moojenina" Ipg
42
4.10 - Atividade esterásica
0 . 2 5 -,
E c 0.2 -
es .ra
0 . 1 5 -
ü c <g 0.1 -1 -
o Vi 0 . 0 5 -
i. 0 . 0 5 - n
— — I I I — I I
1 2 3 4 5 6 7 8
F ra ç91 f
Figura 18; Gráfico da atividade esterásica em diferentes passos cromatográficos na purificação da
moojenina. Amostras com 5 pg do substrato TAME (2,5 Mm) e 10 pg das amostras das frações ou
"moojenina"; 5 minutos, temperatura ambiente.
1 - PBS
2 - Veneno total de B. moojeni
3 - Pico 1 da coluna de trombina
4 - Pico 2 da coluna de trombina
5 - Pico 3 da coluna de trombina
6 - Nao retido da coluna de trombina
7 - "Moojenina"
8 - Controle (+) com tripsina
9 - Trombina 2nM + "moojenina" 10pg
43
5 - DISCUSSÃO
Os venenos e peçonhas de diversas espécies animais possuem toxinas que
induzem o aparecimento de distúrbios hemostáticos durante o envenenamento de
suas vítimas. Determinados animais desenvolveram toxinas, altamente específicas e
eficientes, muitas vezes complexas, algumas únicas na natureza. O entendimento de
seus mecanismos de ação em diversos sistemas e/ou grupos celulares e
moleculares permite a compreensão de vários processos fislopatológicos, fenômenos
celulares e moleculares ocasionados pelas intoxicações agudas por esses venenos,
trazendo ainda a perspectiva da utilização dessas substâncias como ferramentas
farmacológicas (SANTORO & SANO-MARTINS,1993).
Os venenos ofídicos geralmente possuem uma variedade de substâncias,
dentre as quais estão fatores com atividade pró e anticoagulante, além de indutores
e inibidores da agregação plaquetária (LEE, 1979; STOKER, 1990; BRASIL, 1998;
ALVES DA SILVA, 2004).
Os venenos das serpentes da família Viperidae, distribuídas pelas Améhcas,
África e Europa, possuem na constituição de seus venenos, uma variedade muito
grande de enzimas. Aquelas pertencentes à família das sennoproteases são
hidrolases que possuem um resíduo do aminoácido serina, essencial para o
mecanismo de catálise. As proteínas da cascata da coagulação são, em geral,
sennoproteases e promovem proteolise limitada ao hidrolisarem seu substrato que é
um zimogênio (proteína na sua forma inativa).
A trombina constitui a principal enzima da cascata da coagulação além de
participar de diversos outros processos moleculares e celulares.
44
Na cascata da coagulação, esta enzima tem como principal substrato á
molécula de fibrinogênio. O fibrinogênio quando clivado, gera monomeros de fibrina,
ainda instáveis. Estes formam a malha disforme, conhecida como coágulo (figuras 2
e 19). A trombina ainda diva fator XIII que estabiliza o coágulo. Posteriomiente, o
coágulo retrai-se e limita o sangramento. Esta enzima também atua na hidrolise dos
fatores V, VIII, XI e plaquetas (MONTEIRO, 2000). A trombina é uma proteina
multifuncional uma vez que participa de processos inflamatórios além de estar
envolvida na cicatrização, anticoagulação quando ativa a proteina C, proliferação e
maturação celular e no desenvolvimento de algumas doenças tais como Acidente
Vascular Cerebral (AVC), Infarto Agudo do Miocárdio (IAM), coronariopatias, dentre
outras (AMARAL, C.F.S. (1986).; ZlNGALl, R. B. (1993); AZEVEDO-MARQUES,
M.M. (1995); FRANÇA, F. O. S. (1997); CARDOSO, J.L.C. (2003).
Formação do Coágulo
Plaqueta ativada Rbrina
Figura 19; Formação do coágulo no local da injuria mostrando as plaquetas ativadas aderindo-se ao
local do sangramento e a malha disforme de fibrina envolvendo todas as células.
wvw.msd-brazil.com\...\m manual\mm sec14 155.htm
45
A trombina é a forma ativa do zimogênio protrombina ou fator 11 da
coagulação. Além de clivar o fibrinogênio em fibrina, a trombina ainda atua como um
fator anticoagulante quando ativa a proteina C que inativa a trombina. A proteina C
ainda se liga à trombomodulina e o complexo trombina - trombomodulina (T-TM)
inibe a maioria das ações coagulantes incluindo formação do coágulo, ativação de
plaquetas e do endotélio, além da inibição da ativação do fator V.
Como não se dispunha de uma resina com trombina acoplada para a
cromatografia por afinidade á mesma, foi desenvolvida pelo nosso grupo, uma coluna
com esta propriedade. A resina CNBr 4B Sepharose-Trombina constitui assim uma
nova ferramenta na purificação de compostos com afinidade à molécula de trombina,
uma vez que não era descrita a existência da mesma na literatura. Um resultado
pouco provável no presente trabalho é o fato de proteínas do veneno, ainda que pré-
tratadas com inibidores de proteases se ligam à resina contendo trombina (figuras 4
e 5). Esse dado é corroborado por CASTRO ef al (1999) onde foi verificado que
inúmeras proteínas de vários venenos botrópicos possuem afinidade por trombina
numa resina PPAK-a-thrombin-Sepharose. Ainda no trabalho citado, os venenos de
8. atrox, B. cotiara, B. jararacussu, B. moojeni e B. neuwiedi foram cromatografados
na coluna supracitada e também veneno Crotaius durissus terrificus e Lachesis muta.
Todos venenos possuíam proteínas com afinidade pela coluna de trombina com
massas moleculares variando entre 14 e 70 kDa, contudo, apenas aquelas com
cerca de 27 kDa possuíam atividade inibitóna da trombina.
Com exceção do veneno de Cd. terrificus, todos os venenos analisados
naquele trabalho, possuíam proteínas com massa molecular em torno de 27 kDa
reconhecidas por anticorpos antibotrojaracina em análise por Western blot. Foi
46
observado ainda no mesmo trabalho que em veneno de 6. moojeni, proteínas com
diferentes padrões de migração em SDS-PAGE, eram reconhecidas por anticorpos
antibotrojaracina. Esse dado sugere que no veneno de Bothrops moojeni, estão
presentes isoformas da "moojenina".
A "moojenina" foi primeiro purificada através de uma cromatografia por
afinidade utilizando uma resina CNBr 4B Sepharose-trombina e o terceiro pico dessa
cromatografia (figura 4) foi aplicado numa coluna de troca iônica (figura 6). O
segundo pico desta cromatografia refere-se a "moojenina".
O produto do terceiro pico da cromatografia por afinidade foi submetido à
eletroforese em gel de acrilamida 12% quando foi verificado que havia uma
significativa diferença entre as massas moleculares das proteínas (figura 8, linha 4).
Fato que levou a uma terceira cromatografia constituída por exclusão molecular com
coluna TSK - 3000 no sistema HPLC (figura 7).
Em gel SDS-PAGE, a banda majoritária correspondia a uma proteína com
cerca de 30 kDa, o que sugeria uma botrojaracina símile. Este dado é confirmado
quando o pico 7 da coluna TSK-3000 foi coletado e submetido à nova eletroforese
mostrando a pureza da proteina e sua massa molecular estimada.
A cromatografia por exclusão molecular constitui uma segunda forma de
purificação da "moojenina" que é eluída no sétimo pico (figura 7). CASTRO e
colaboradores (1999) sugerem que proteínas contendo maior massa molecular e
com afinidade à trombina, possam ser zimogênios (ou precursores) das proteínas
ativas como a botrojaracina, botralternina ou como no presente trabalho,
"moojenina".
47
A primeira fração eluída na cromatografia por afinidade a trombina,
provavelmente ocorra pela adição de sal com a solução B (0,01 N HCl, 0,5 M NaCI,
pH 2) uma vez que ao final da eluição do pico 1 o pH ainda encontra-se em 7. A
eluição do segundo pico pode ocorrer pela mudança de pH de 7 para 5 e finalmente
o terceiro pico, aquele com maior afinidade pela coluna, começa a ser eluído com
pH 2 (figuras 3 e 4). O terceiro pico da cromatografia por afinidade foi capaz de inibir
a trombina em sua atividade pró agregante plaquetária como observado na figura 15.
Acredita-se que as outras proteínas presentes naquela fração teniiam perdido sua
atividade pela adição dos inibidores de proteases como PMSF e EDTA. Este dado
sugere que a 'moojenina" não é uma enzima, pois mantém sua atividade biológica ao
se ligar à trombina e inibir sua atividade pró agregante plaquetária (figura 16). A
"moojenina" não só inibe a agregação como também a coagulação induzida por
trombina.
Nos testes realizados na Fundação Pró Sangue, pôde-se observar que em
plasma livre de plaquetas, contendo apenas as proteínas da coagulação, a
"moojenina" foi capaz de inibir a atividade pró-coagulante da trombina após uma
incubação por cinco minutos com esta enzima. Segundo protocolo utilizado peia
Fundação Pró Sangue, valores acima de três segundos do tempo normal de
trombina são considerados valores para Tempo de Trombina (TT) prolongados. O
tempo normal para o pool utilizado foi de 14 segundos. Quando a trombina era
incubada com o terceiro pico da coluna de trombina (15 pg), o TT foi prolongado para
cerca de 25 segundos como observado na coluna 5 da figura 17. Quando a
"moojenina" pura (1 pg) foi incubada com trombina (0,07U/mL) o TT foi incoagulável
e apresentado neste trabalho somente até 40 segundos (figura 17).
48
A "moojenina" ainda foi testada para possível atividade esterásica sobre ¡
substrato TAME que constituí o principal substrato sintético para enzimas
serinoproteases. Os resultados deste experimento mostram que a "moojenina" não
possui atividade esterásica mesmo em altas concentrações (coluna 7, figura 18). Por
outro lado o primeiro pico oriundo da cromatografía por afínidade diva o substrato
TAME tanto quanto o controle positivo com tripsina, mostrando assim uma potente
atividade esterásica (coluna 3, fígura 18). O mesmo pico quando submetido a testes
de agregação plaquetária, ativa plaquetas como mostrado na fígura 14.
Ainda é desconhecido o mecanismo pelo qual a "moojenina" inibe a trombina.
Em caso da "moojenina" ser uma botrojaracina símile, o mecanismo de inibição
poderia se dar através da ligação ao exosítio 1 e II da trombina, bloqueando a região
da trombina que atua no fíbrinogénio e que também é reconhecida pela antitrombina.
A botrojaracina ainda inibe os fatores IX e X e protrombina da cascata da
coagulação, atuando assim como uma possível droga preventiva de doenças como
trombose. Contudo a botrojaracina não é capaz de inibir a atividade proteolífíca da
trombina em olivar substratos sintéticos como S-2238.
Algumas enzimas têm a propriedade de inibir alguns peptídeos com atividade
na coagulação e podem ser reunidas em famílias de acordo com sua seqüência de
aminoácidos quando levado em consideração o ancestral comum (RAWLINGS ef al,
2004).
A descoberta de novos compostos capazes de interfenr e/ou prevenir a
formação de trombos pode representar uma mudança substancial no prognóstico dos
pacientes vítimas de acidentes tromboembólicos, cada vez mais freqüentes em
nossa civilização sendo algumas das doenças que mais levam ao óbito no mundo. O
49
isolamento de toxinas a partir de venenos ofídicos e de outros animais, bem como o
estudo sistemático dos seus efeitos, constitui uma estratégia de grande importância
para a identificação de novos compostos com potencial uso terapêutico. Este tipo de
abordagem já resultou na identificação de compostos, atualmente utilizados tanto no
tratamento, como no diagnóstico e acompanhamento de váhas doenças como o
composto Captopril, largamente utilizado no tratamento da pressão arterial ou ainda
Ancrod e Reptilase (LONGENEKER, 1991; ZlNGALl, 1993; BRAUD 2000).
50
6-CONCLUSÕES
O presente trabalho permite concluir que:
• A "moojenina" pode ser purificada em cromatografia por afinidade seguida tanto
por troca iônica quanto por exclusão molecular.
• A resina CNBr 48 Sepharose-trombina retém proteínas capazes de
inibir trombina bem como proteínas trombina-símile, capazes de ativar a
cascata da coagulação e plaquetas.
• A "moojenina" é um inibidor protéico da trombina, presente no veneno da
serpente Bothrops moojeni, com massa molecular de 27 kDa, similar à da
botrojaracina.
• As atividades coagulante e agregante plaquetária, induzidas por trombina, são
inibidas pela "moojenina".
s A "moojenina" é desprovida de atividade esterásica.
• A "moojenina" prolonga o Tempo de Trombina à incoagulabilidade.
51
7 - REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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