modulaciÓn del dÍmero d1-d3 por la camkii en …
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CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS AVANZADOS
DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD ZACATENCO
DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍA
MODULACIÓN DEL DÍMERO D1-D3 POR LA CaMKII EN
CONDICIONES NORMALES Y DE PÁRKINSON
EXPERIMENTAL
T E S I S
Que presenta
SANTIAGO IVÁN LOYA LÓPEZ
Para obtener el grado de
MAESTRO EN CIENCIAS
EN LA ESPECIALIDAD DE FARMACOLOGÍA
Director de Tesis: Benjamín Florán Garduño
México, DF. Diciembre, 2012
ÍNDICE
ABREVIATURAS…………………………………………………………………………….A
RESUMEN……………………………………………………………………………………...B
ABSTRACT…………………………………………………………………………………….D
1. CONTROL MOTOR………………………………………………………………………1
1.1 Sistema extra-piramidal……………………………………………………………2
1.1.1 Cerebelo………………………………………………………………………………………2
1.1.2 Ganglios basales…………………………………………………………………………..2
1.1.2.1 Núcleo estriado………………………………………………………………….3
1.1.2.2 Núcleo subtalámico……………………………………………………………4
1.2.2.3 Globo pálido……………………………………………………………………….5
1.2.2.3 Sustancia nigra…………………………………………………………………6
1.1.3 Organización funcional de los ganglios basales………………………………7
2. LA DOPAMINA EN LOS GANGLIOS BASALES………………………………...9
2.1 Receptores a dopamina…………………………………………………………..10
2.2 Localización de los receptores a dopamina en los ganglios
basales……………………………………………………………………………………………………11
2.2.1 Receptores de la familia D1………………………………………………………..11
2.2.2 Receptores de la familia D2………………………………………………………..12
2.2.2.1 Receptores D2………………………………………………………………….12
2.2.2.2 Receptores D3………………………………………………………………….13
2.2.2.3 Receptores D4………………………………………………………………….14
2.3 Interacciones proteína-proteína de los receptores
dopaminérgicos……………………………………………………………………………………..14
3. INTERACCIÓN HETERODIMÉRICA DE LOS RECEPTORES
DOPAMINÉRGICOS D1-D3…………………………………………………………….17
3.1 Implicaciones transduccionales de la heteromerización
D1-D3………………………………………………………………………………………………….....18
3.2 Implicaciones conductuales de la heteromerización D1-D3…..19
4. ANTECEDENTES INMEDIATOS………………………………………………….21
4.1 El heterodímero D1-D3 en las terminales estriado nigrales…..21
5. JUSTIFICACIÓN…………………………………………………………………………26
6. HIPÓTESIS………………………………………………………………………………..26
7. OBJETIVO GENERAL…………………………………………………………………27
8. OBJETIVOS PARTICULARES……………………………………………………..27
9. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………………….28
Animales de experimentación…………………………………………………….28
Lesión con 6-hidroxidopamina……………………………………………………28
Prueba conductual (Conducta de giro)……………………………………….29
Obtención del tejido……………………………………………………………………29
Obtención de la fracción sinaptosomal……………………………………….30
Ensayo de co-inmunoprecipitación……………………………………………..30
Electroforesis……………………………………………………………………………...31
Transferencia…………………………………………………………………………..31
Incubación con anticuerpos……………………………………………………..32
Soluciones utilizadas………………………………………………………………..33
10. RESULTADOS……………………………………………………………………..34
Efecto de la despolarización en la estructura D1-D3 en el lado
intacto de ratas hemiparkinsónicas…………………………………………………..34
Efecto de la despolarización en la interacción CaMKII-D3 en el lado
intacto de ratas hemiparkinsónicas…………………………………………………...38
Efecto de la despolarización en la estructura D1-D3 en el lado
denervado de ratas hemiparkinsónicas……………………………………………...42
Efecto de la despolarización en la interacción CaMKII-D3 en el lado
denervado de ratas hemiparkinsónicas……………………………………………...46
11. DISCUSIÓN…………………………………………………………………………..50
Efecto de la despolarización en la interacción D1-D3……………….51
Impacto de la denervación dopaminérgica en la interacción
D1-D3………………………………………………………………………………………………….53
Efecto de la despolarización en la interacción CaMKII-D3………..56
Efecto de la denervación sobre la interacción CaMKII-D3………...58
12. CONCLUSIONES……………………………………………………………………60
13. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………..61
El presente trabajo fue realizado en el laboratorio # 4 del departamento de Fisiología,
Biofísica y Neurociencias del Centro de Investigación y Estudios Avanzados del Instituto
Politécnico Nacional, bajo la dirección del D.C Benjamín Florán Garduño y con el proyecto
financiado por CONACYT.
A
ABREVIATURAS
AADC Descarboxilasa de aminoácidos
aromáticos
AC Adenililciclasa
AMPc Adenosina monofosfato cíclico
AVT Área Ventral Tegmental
GB Ganglios Basales
DA Dopamina
DYN Dinorfina
ENK Encefalina
EP Enfermedad de Párkinson
EST Núcleo Estriado
FRET Fluorescence Resonance Energy
Transfer
GABA Ácido Gamma-Amino Butírico
GB Ganglios Basales
GPCRs Receptores acoplados a proteínas G
Gpe Globo pálido externo
Gpi Globo pálido interno
GRK Cinasas Reguladoras de GPCR´s
Ki Constante de inhibición
L-DOPA L-DIhidroxifenilalanina
MSN Neuronas espinosas medianas
NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido
fosfato reducida
SP Sustancia P
TH Tirosina Hidroxilasa
6-OHDA 6-Hidroxidopamina
B
RESUMEN
La proteína cinasa dependiente de Ca2+/calmodulina II (CaMKII) es un componente
central en la transmisión sináptica, a través de sus cuatro isoformas, α, β, γ y δ regula
procesos de plasticidad neuronal, así como procesos de aprendizaje y memoria. En
neuronas del núcleo accumbens la isoforma alfa de esta cinasa, al ser activada, es capaz
de fosforilar al receptor dopaminérgico D3 límbico en su tercer asa intracelular a través de
una unión física, dicha interacción lleva a la inhibición de las acciones de este receptor, lo
que es crítico para la integración de la señalización que lleva al control conductual.
Recientemente se ha aportado evidencia de la influencia de la CaMKII sobre la
actividad del heterodímero D1-D3, complejo proteico que ha sido identificado de manera
pre-sináptica en las terminales estriado nigrales, y cuya asociación conlleva a una
potenciación de los efectos que ejerce por si solo el receptor D1 sobre la liberación de
GABA. Esta enzima ejerce una regulación sobre dicho complejo de receptores de tal forma
que, al ser activada por influjos masivos de calcio, impide la señalización del dímero,
presumiblemente a través de su interacción sobre el receptor D3, el cual es señalado
como el responsable de conferir al receptor D1 mayor afinidad por su ligando.
Interesantemente, la actividad del dímero D1-D3 en denervación dopaminérgica no es
apreciable, de hecho la co-activación de ambos receptores produce un efecto antagónico
por parte del receptor D3 sobre la actividad de D1, y este proceso es independiente de la
actividad de la CaMKII.
C
El objetivo del presente trabajo fue establecer los procesos moleculares implicados
en la regulación del dímero D1-D3 por parte de la CaMKII en condiciones normales y
discernir si algunos de ellos se encuentran alterados en la denervación dopaminérgica.
A través de ensayos de co-inmunoprecipitación y Western Blot fue mostrado que,
en condiciones normales, la despolarización induce una mayor interacción de la CaMKII
con el receptor D3, lo que explica los efectos observados sobre la formación de AMPc y la
liberación de neurotransmisor. Esta unión, a pesar de obstaculizar la señalización del
dímero, no es capaz de producir su separación, como había sido hipotetizado.
Contrario a lo esperado, fue posible identificar la interacción D1-D3 en condiciones
de denervación dopaminérgica, de manera que, posiblemente se encuentre incluso
señalizando, pero sus efectos pueden verse ocluidos por la exacerbada señalización de los
receptores D3 reportada en dicha condición patológica. Se encontró también que, al ser
activada la CaMKII, esta es incapaz de interactuar de manera significativa con el receptor
D3, que puede atribuirse a una alteración en la actividad de la cinasa o bien a una
disminución en su expresión basal.
Los resultados de este trabajo permiten redondear el concepto de un dímero que
había sido evaluado solo a nivel funcional, y representan en conjunto un mecanismo
novedoso de regulación de receptores, más aún, a nivel de la liberación de GABA en el
circuito de los ganglios basales, y que adquiere mayor relevancia por el hecho de
presentar disfunciones en condiciones patológicas; por lo que puede constituir un blanco
terapéutico para la acción de fármacos encaminados al tratamiento de los desórdenes del
movimiento, principalmente la enfermedad de Párkinson.
D
ABSTRACT
Calcium–calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) is a central component
in synaptic transmission, through its four isoforms, α, β, γ and δ, regulates neuronal
plasticity, and learning and memory processes. In nucleus accumbens neurons, the alpha
isoform of this kinase, when activated, is capable of phosphorylating to dopamine D3
receptors in their third intracellular loop through a physical connection, such interaction
leads to inhibition of the action of these receptors, which is critical for integration of
signaling that leads to behavioral control.
Recently, evidence has shown a CaMKII influence on the activity of the
heterodimer D1-D3 protein complex, that has been identified in presynaptic striato-nigral
terminals, and whose association leads to a potentiation of the effects exerted by D1
receptor itself on GABA release. This enzyme has a regulation on the receptor complex
such that, when activated by massive influx of calcium prevents dimer signaling,
presumably through its interaction on D3 receptor, which is identified as responsible for
conferring the higher affinity D1 receptor by its ligand. Interestingly, the activity of D1-D3
dimer in dopaminergic denervation is not noticeable, in fact co-activation of both
receptors produced an antagonistic effect between D1 and D3 receptors, and this process
is independent of the activity of the CaMKII.
E
The aim of this study was to establish the molecular processes involved in the
regulation of D1-D3 dimer by CaMKII in normal conditions and discern if some of them are
altered in dopaminergic denervation. Through co-immunoprecipitation assays and
Western blotting was shown that in normal conditions, depolarization induces greater
interaction of CaMKII with D3 receptor, which explains the observed effects on cAMP
formation and release of neurotransmitter. This union, despite interferes dimer signaling
is unable to produce its separation, as had been hypothesized.
Contrary to expectations, it was possible to identify D1-D3 complex in
dopaminergic denervation conditions, so, even is possibly that dimer works, but its effects
can be occluded by the exacerbated D3 receptor signaling reported in this pathological
condition. It was also found that, when activated CaMKII, is unable to interact significantly
with D3 receptor, which is attributable to an alteration in the activity of the kinase or to a
decrease in basal expression of this protein.
The results of this study allow complete the concept of a dimer, and taken
together represent a novel mechanism of receptor regulation, especially at the level of the
release of GABA in the basal ganglia circuitry, and it becomes more important by the fact
of presenting dysfunctions in pathological conditions, so it may be a therapeutic target for
the action of drugs aimed at treating movement disorders, particularly Parkinson's
disease.
1
1.- CONTROL MOTOR
El cerebro es el órgano mayor del sistema nervioso central y representa un centro
de control para el resto del organismo. Existe una gran cantidad de procesos regulados
por este sistema, uno de los de mayor importancia, debido a lo indispensable que resulta
para la realización de una buena parte de las actividades de los individuos, es sin duda la
generación del movimiento.
Para lograr la ejecución de cualquier movimiento, se necesita la interacción de las
estructuras del sistema nervioso motor, las cuales están organizadas jerárquicamente de
modo que comprenden tres niveles. El nivel más alto está representado por las áreas de
asociación de la neocorteza y los ganglios basales, cuya función es la de plantear la meta
del movimiento a realizar y que estrategia es la mejor para lograrlo. En el nivel medio se
encuentran la corteza motora y el cerebelo, a los cuales concierne la función táctica, es
decir, el control de las secuencias de las contracciones musculares, tanto en espacio y
tiempo, de tal forma que pueda ejecutarse de manera precisa el objetivo estratégico.
Finalmente, en el nivel inferior, a la médula espinal y el tronco cerebral
corresponde la función ejecutora: la activación de las motoneuronas e interneuronas
genera un movimiento dirigido hacia un objetivo y se realiza cualquier ajuste necesario en
la postura (Neuroscience: exploring the brain).
2
Como puede apreciarse en esta estructura jerárquica, aunque la orden para
moverse o no depende de la corteza cerebral, si los movimientos dependieran solamente
de su asociación directa con la médula espinal, estos serían muy torpes. Se precisa
entonces de la participación del llamado sistema extra-piramidal para lograr una
activación más fina de sistema ejecutor.
1.1 Sistema extra-piramidal
El sistema extra-piramidal está constituido por axones que descienden del
encéfalo a la médula espinal emitiendo colaterales que inervan a neuronas de órganos y
núcleos como el cerebelo y los ganglios basales, representa por lo tanto una vía indirecta.
1.1.1 Cerebelo
El cerebelo controla el tono muscular y, por lo tanto, la postura dinámica y la
coordinación sensitivo-motora. Entre sus funciones se encuentran la coordinación del
movimiento, el equilibrio, el tono muscular, el aprendizaje motor y la regulación de las
características del movimiento de los diferentes grupos musculares que intervienen en la
ejecución de un programa motor relativas a velocidad, dirección y magnitud.
1.1.2 Ganglios basales
Los ganglios basales son un conjunto de núcleos que se encuentran en la base
del encéfalo, debajo de los hemisferios cerebrales. Sus efectos sobre la médula espinal
son indirectos. Al no tener conexión directa con ella precisan de la mediación de la corteza
cerebral, pasando por el tálamo.
3
Tienen funciones concretas sobre el movimiento (circuito esqueletomotor) tales
como iniciación, velocidad, amplitud y selección: refuerzan un patrón y rechazan los no
compatibles.
Los núcleos cerebrales que conforman los ganglios basales son: la porción dorsal
del cuerpo estriado, localizado en el telencéfalo, conformado a su vez por los núcleos
caudado y putamen; el globo pálido, situado también en el telencéfalo, en él se distinguen
el segmento externo y el segmento interno; el núcleo subtalámico, en el diencéfalo y
finalmente la sustancia nigra, ubicada en el mesencéfalo, de la cual se diferencian dos
partes, una dorsal o compacta, y una ventral o reticulada (Figura 1).
Figura 1. Los ganglios basales. Esquema que muestra la posición de los de los ganglios basales en el cerebro.
1.1.2.1 Núcleo estriado
Es el núcleo más grande de los ganglios basales, comprende el caudado, el
putamen y el estriado ventral, incluyendo el núcleo accumbens. Esencialmente todas las
áreas corticales –sensitiva, motora y asociativa- proyectan hacia el estriado (Bolam et al.
2000, Gerfen et al. 2002).
4
El otro input glutamatérgico hacia el estriado proviene del tálamo,
particularmente del núcleo talámico intralaminar (Doig et al. 2010, Smith et al. 2004).
El estriado también recibe aferentes inhibidoras provenientes de colaterales de
axones de las neuronas espinosas medianas de proyección y de interneuronas
GABAérgicas. Otra aferente importante hacia el estriado es originada por neuronas
dopaminérgicas de la sustancia nigra compacta y del área ventral tegmental. Dicho núcleo
recibe también aferentes serotoninérgicas del núcleo dorsal del rafe y una aferente
dispersa noradrenérgica del locus coeruleus. Casi el 95% de la población de neuronas del
estriado son neuronas espinosas medianas (MSN) de proyección que utilizan como
neurotransmisor al GABA. Estas neuronas se dividen en dos subtipos de acuerdo a su
contenido neuroquímico y el núcleo hacia el que proyectan. Por un lado, el primer subtipo
proyecta hacia la porción reticulada de la sustancia nigra y expresa, además de GABA el
péptido sustancia P/dinorfina. Por otra parte, el otro subtipo de MSN proyecta hacia el
globo pálido externo y co-liberan GABA junto con los neuropéptidos denominados
encefalinas. Adicionalmente el 5% de la población neuronal del estriado corresponde a
interneuronas que expresan acetilcolina, somatostatina, diaforasa de NADPH o GABA
asociado a parvalbúmina o calretina (Gerfen & Surmeier, 2011).
1.2.2.2 Núcleo subtalámico
Estructura que posee neuronas fusiformes piramidales de carácter
glutamatérgico. Sus eferentes se dirigen principalmente hacia la sustancia negra
reticulada y al globo pálido interno. Otras eferentes del núcleo subtalámico se dirigen
5
hacia el globo pálido externo. La actividad de las neuronas subtalámicas está regulada
principalmente por la inervación GABAérgica del globo pálido externo (Shink et al., 1996) y
las proyecciones glutamatérgicas provenientes de múltiples áreas de la corteza (Maurice
et al., 1998). Recibe también entrada dopaminérgica que procede de la sustancia nigra
compacta (Hassani et al., 1997; Galván y Wichman, 2008; Blandini et al., 2000).
1.1.2.3 Globo pálido
Este núcleo es una estructura cuyas neuronas son de carácter GABAérgico;
anatómicamente se divide en dos segmentos: el globo pálido externo (GPe) y el globo
pálido interno (GPi).
Las neuronas de la porción externa proyectan hacia el núcleo subtalámico,
mientras que el globo pálido interno envía eferencias hacia la sustancia nigra reticulada y
los núcleos premotores del tálamo, en particular a los núcleos ventral anterior y ventral
lateral que a su vez proyectan difusamente a la corteza (Smith y Bolam, 1989). Las
aferencias GABAérgicas más importantes que recibe el globo pálido provienen del cuerpo
estriado, asimismo recibe inervación glutamatérgica procedente del núcleo subtalámico y
del núcleo parafasicular del tálamo (Kincaid et al., 1991; Mouroux et al., 1997).
Adicionalmente, recibe aferencias de carácter dopaminérgico de las colaterales de la vía
nigroestriatal (Lindvall y Jorklund, 1979; Debeir et al., 2005).
6
1.1.2.4 Sustancia nigra
Se extiende a largo de todo el mesencéfalo y la parte caudal del diencéfalo y se
encuentra formada por dos estructuras: la sustancia nigra compacta y la sustancia nigra
reticulada.
a) Sustancia nigra compacta (SNc)
Es una estructura densamente poblada cuyas neuronas sintetizan el
neurotransmisor dopamina, y algo que las caracteriza es la presencia de neuromelanina,
lo que les confiere un color oscuro, de ahí el nombre dado a este núcleo. Sus eferencias
se dirigen a todos los ganglios basales, inclusive a la parte reticulada de la propia sustancia
nigra.
Recibe entradas glutamatérgicas del núcleo subtalámico y del núcleo
pedunculopontino, mientras que el núcleo estriado, el globo pálido y la porción reticulada
de la sustancia nigra le envían aferentes GABAérgicas.
b) Sustancia nigra reticulada (SNr)
Esta estructura se compone principalmente de neuronas GABAérgicas y en ella
se integra la información de salida hacia los núcleos premotores del tálamo; recibe
proyecciones aferentes GABAérgicas procedentes del cuerpo estriado (vía estriado-nigral),
el globo pálido externo y, en menor proporción, aferentes glutamatérgicas del núcleo
subtalámico.
7
La sustancia nigra reticulada se caracteriza por poseer una baja densidad
neuronal, las células se encuentran interespaciadas y esencialmente son neuronas de
proyección. Aunque la mayoría de células de la SNr son GABAérgicas, ha sido reportada la
presencia de neuronas dopaminérgicas y colinérgicas en este núcleo (Richards et al., 1997;
González-Hernández y Rodríguez, 2000).
1.1.3 Organización funcional de los ganglios basales
Las estructuras que conforman los ganglios basales se encuentran
interconectadas entre sí, de manera que forman un circuito neuronal que procesa la
información proveniente de la corteza, donde el núcleo de entrada a este circuito es
representado por el cuerpo estriado y la sustancia nigra reticulada en conjunto con el
globo pálido interno representan los núcleos de salida de la información neuroquímica
que recorre a través de este sistema de organización funcional.
Entre el núcleo de entrada y los de salida divergen dos diferentes vías de
interconexión: la vía directa o estriado-nigral que se considera activadora del movimiento
y consiste en proyecciones monosinápticas del estriado hacia el complejo SNr/GPi; y la vía
indirecta, en la cual el cuerpo estriado se comunica hacia el globo pálido externo y este a
su vez proyecta hacia el núcleo subtalámico, el cual envía eferencias hacia la SNr y GPi;
el resultado de esta interacción es la inhibición del movimiento regulado por los ganglios
basales. De los núcleos de salida, los cuales son de naturaleza GABAérgica, son enviadas
proyecciones a los núcleos premotores del tálamo. Los núcleos talámicos después
8
proyectan eferentes glutamatérgicas hacia la corteza y de esta forma se cierra el circuito
motor (Blandini et al, 2000).
Las distintas vías de proyección estriatales contribuyen diferencialmente a los
circuitos excitatorios e inhibitorios que regulan los ganglios basales, resultando en efectos
funcionalmente opuestos: la vía directa conduce a la desinhibición de los núcleos de
salida, lo que implica una facilitación de movimiento; mientras que la indirecta conduce a
su inhibición.
Por lo mencionado anteriormente puede apreciarse que la SNr, como núcleo de
salida del circuito de los ganglios basales, desempeña un papel crítico en la transmisión de
información motora hacia las áreas corticales, y que cualquier cambio de en la actividad
neuronal de este núcleo tendrá implicación directa en el comportamiento motor.
Por lo tanto, las alteraciones de la descarga del complejo GPi/SNr dan lugar a la
modificación del comportamiento motor, ya sea aumentándolo (hipercinesia) o
disminuyéndolo (bradicinesia). De hecho, varios péptidos y neuromoduladores pueden
influenciar la actividad neuronal de las células nigrales. De entre estos agentes
moduladores uno de los que juega un rol central es el neurotransmisor dopamina, el cual,
a través de distintos subtipos de receptores, distribuidos de manera diferencial en la vía
directa e indirecta modula la actividad no solo de los núcleos de salida, sino de todas las
estructuras participantes en el circuito de los ganglios basales, lo que será descrito con
más detalle en el siguiente apartado.
9
2.- LA DOPAMINA EN LOS GANGLIOS BASALES
La dopamina es un neurotransmisor perteneciente a la familia de las
catecolaminas, se sintetiza a partir del aminoácido tirosina (Figura 2) y es la molécula
catecolaminérgica de mayor importancia en el sistema nervioso central pues participa en
un gran número de funciones como la cognición, memoria, reforzamiento positivo,
ingesta de alimento y la actividad locomotora, ejerciendo esta última a través de su acción
sobre los ganglios basales (Neve et al., 2004).
Figura 2. Síntesis de la dopamina. En la primera reacción la tirosina es convertida a DOPA por la enzima tirosina
hidroxilasa (TH), en presencia de tetrahidrobiopterina como cofactor. En la segunda reacción la DOPA es convertida a
dopamina por la enzima descarboxilasa de aminoácidos aromáticos (AADC).
Han sido descritos tres sistemas de inervación dopaminérgica en el sistema
nervioso central. El primero de ellos es el núcleo denominado área ventral tegmental
(AVT) el cual inerva al sistema límbico, núcleo accumbens y algunas áreas de la corteza,
este sistema está involucrado en emociones, cognición y reforzamiento, principalmente;
el segundo es el núcleo arqueado, que envía aferencias principalmente a la glándula
pituitaria y que está involucrado en procesos endócrinos.
10
Finalmente, la sustancia nigra compacta (SNc), que distribuye dopamina a través
de sus aferencias, situadas a todos los niveles del circuito de los ganglios basales,
coordinando funciones motoras.
Para ejercer sus acciones, en cualquiera de los sistemas mencionados, la
dopamina interactúa con una familia de receptores acoplados a proteínas G, los cuales
serán descritos a la brevedad y su conocimiento será de suma importancia para el
desarrollo y entendimiento del presente trabajo.
2.1 Receptores a dopamina
La transmisión dopaminérgica es mediada por integrantes de la súper familia de
receptores de siete dominios transmembranales acoplados a proteínas G, denominados
receptores a dopamina (Figura 3). Actualmente, los receptores dopaminérgicos se dividen
en dos familias dependiendo del tipo de proteína G al que se acoplen, de sus propiedades
farmacológicas, de la homología de su secuencia y de su estructura: los receptores D1 y
D5 (receptores D1- like) estimulan proteínas Gs y Golf, mientras que los receptores D2, D3
y D4 (receptores D2-like) estimulan proteínas Go y Gi.
Figura 3. Representación esquemática de los receptores para dopamina. Se caracterizan por poseer siete segmentos
transmembranales que se acoplan a proteínas G heterotriméricas.
11
2.2 Localización de los receptores a dopamina en los ganglios basales
2.2.1 Receptores de la familia D1
Los subtipos de receptores que integran la familia de receptores tipo D1, tanto
el receptor a dopamina D1 como el receptor D5, comparten un 80% de homología en sus
dominios transmembranales, su tercera asa intracelular y el carboxilo terminal son
similares en extensión, sin embargo difieren en su secuencia de aminoácidos(Missale,
1998). Se trata de receptores de siete pases transmembranales acoplados a una proteína
Gs, y su estimulación conlleva el aumento de la actividad de la enzima adenilato ciclasa, lo
cual incrementa la concentración de AMPc, lo cual activa a su vez a la proteína cinasa
dependiente de AMPc (PKA), la PKA fosforila canales de calcio, aumentando su
probabilidad de apertura, favoreciendo la propagación del potencial de acción y
aumentando la actividad neuronal. La respuesta funcional como consecuencia de la
activación de receptores D1 en los ganglios basales, es un aumento en la liberación de
GABA (Florán, et al., 1990), proceso dependiente del influjo de calcio a la neurona, por
activación de canales de calcio del tipo P/Q (Arias-Montaño et al., 2007).
Los receptores D1 se expresan de manera preferencial en la vía directa de los
ganglios basales, en el soma y sobre terminales de la vía estriado-nigral (Bordet, 2000),
mientras que la localización de los receptores D5 parece restringirse a hipocampo, núcleo
subtalámico y núcleo lateral mamilar y parafasicular del tálamo.
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2.2.2 Receptores de la familia D2
La familia de receptores a dopamina del tipo D2 está constituida por los
subtipos D2, D3 y D4. Los subtipos D2 y D3 comparten una homología del 75% en cuanto a
sus dominios transmembranales, mientras que los subtipos D2 y D4 solo comparten una
homología del 53%. Los receptores D3 y D4 presentan algunas diferencias que se acentúan
en la cola del COOH terminal (Nestler, 2001).El asa intracelular de los receptores a
dopamina tipo D2 es muy larga, característica común de aquellos receptores que
interactúan con proteínas Gi/o.
El resultado de la estimulación de estos receptores es una disminución en la
formación de AMP cíclico, debido a que activan canales de potasio, lo que deriva en la
inhibición de canales de calcio, que finalmente lleva a disminuir la actividad neuronal. La
consecuencia de la activación de los receptores de la familia D2 en el circuito de los
ganglios basales es la inhibición de la liberación de neurotransmisor.
La distribución de los receptores D2-like en las estructuras de los ganglios
basales ha sido estudiada extensamente debido al papel de estos receptores en el control
del movimiento y su relación con padecimientos tales como la enfermedad de Parkinson.
2.2.2.1 Receptores D2
El subtipo de receptores de dopamina D2 comprende dos isoformas, la isoforma
“corta” (D2short) de 414 aminoácidos y la “larga” (D2long) con 29 aminoácidos más en la
tercera asa intracelular.
13
Está distribuido ampliamente en el caudado putamen, en las terminales
estriado-palidales, con un patrón que va de medial a lateral, es decir, que la porción
lateral del estriado exhibe mayor población de receptores D2 con respecto a la porción
medial (Joyce et al., 1985; Fisher et al., 1994). También ha sido reportada la presencia de
los receptores D2 en neuronas del globo pálido externo y NST, así como en dendritas de la
SNc (Missale, 1998).
2.2.2.2 Receptores D3
El receptor D3 posee la mayor afinidad por la dopamina, Ki= 30nM (Sokoloff et
al, 1992) 1995). Al menos siete distintas variantes de splicing alternativo del receptor D3
han sido identificadas (Figura 4). Se conoce al receptor D3 de secuencia completa
(denominado simplemente como D3) y una isoforma más corta, descrita como D3S, la cual
carece de 21 aminoácidos en la tercera asa citoplasmática (Fishburn et al, 1993). Tanto el
receptor D3 como el D3S exhiben alta afinidad por la dopamina. Han sido descritas otras
cinco isoformas, las cuales no son capaces de unir dopamina y carecen de anclaje a la
membrana plasmática, por lo que su función se cree estar restringida a la regulación de las
dos isoformas más importantes (Snyderet al, 1991).
Figura 4. Esquema que muestra las distintas isoformas del receptor D3
14
Los receptores D3 se encuentran expresados de manera abundante en el núcleo
accumbens, islas de calleja, área ventral tegmental (AVT), además de la SNc y GPi .Sin
embargo, ha sido evidenciada la presencia de RNAm para el receptor D3 en el putamen
(Surmeier et al., 1996), no obstante, la expresión del receptor sólo ha sido reportada en la
SNr (Gurevich, 1999), lo cual sugiere que estos receptores son sinterizados en el soma de
neuronas estriatales y son enviados hacia la SNr, donde se ubican de manera pre-
sináptica.
2.2.2.3 Receptores D4
La expresión de los receptores D4 en el cerebro es baja, localizándose en áreas
como la corteza frontal, amígdala, hipocampo, hipotálamo, globo pálido, SNr y tálamo
(Beaulieu, JM., 2011; Defagot et al., 1997; Mrzljak et al., 1996).
Está demostrado que los receptores D4 también se expresan a nivel
presináptico en la SNr, a nivel de las aferentes palidales (Acosta-García et al., 2009),
regulando la liberación de GABA y la actividad locomotora (Erlij et al., 2012).
2.3 Interacciones proteína- proteína de los receptores dopaminérgicos
El concepto de que los receptores acoplados a proteínas G pueden existir como
complejos homoméricos o heteroméricos ha sido bien establecido en los últimos años
debido a la gran cantidad de evidencia encontrada sobre su interacción física con otros
receptores, canales iónicos e incluso proteínas del citoesqueleto. Como parte de la
superfamilia de GPCR´s, los receptores a dopamina no están exentos de este fenómeno.
15
Se ha mostrado que los receptores D2 pueden formar homodímeros D2-D2
(Rocheville et al., 2000) o bien heterodímeros D2-D3 (Rocheville et al., 2000). Ha sido
reportado también que tales receptores pueden interactuar con los receptores AMPA
kainato (Zou et al., 20005). Los receptores D2 también pueden formar heterómeros con
proteínas del citoesqueleto, como la proteínas 4.1 (Binda et al., 2002), la filamina A (Lin et
al., 2001) y la proteína de unión a PP1 llamada espinofilina (Greengard et al., 1999).
La única interacción que se ha demostrado para el receptor D5 es la que forma,
por medio de su carboxilo terminal, con el receptor GABAA, donde la activación de dichos
receptores dopaminérgicos es capaz de inhibir las corrientes GABAérgicas.
Con respecto a los receptores D1 se ha reportado que estos pueden interactuar
con la subunidad NR1 el receptor NMDA, induciendo la activación de la vía de señalización
de PI3K, con lo cual se activan vías antiapoptóticas y de sobrevivencia celular (Lee and Lui,
2004). También ha sido mostrado que la parte final del carboxilo terminal de los
receptores D1 interactúa con la subunidad NR2A (Lee et al., 2002). El heterodímero
conformado por el receptor D1 y el receptor A1 tiene como huella bioquímica que la
activación de los receptores a adenosina disminuye el estado de alta afinidad de los
receptores dopaminérgicos D1.
16
Una de las interacciones más estudiadas recientemente es la dada entre los
receptores D1 y D2 (Figura 5) los cuales, cambian radicalmente el acople de sus proteínas
G, Gs y Gi respectivamente, para incorporar una proteína Gq y activar la vía PLC-IP3 para
generar incrementos en el calcio intracelular, lo que activa a su vez otras vías de
señalización (Rashid et al., 2007).
Figura 5.Los complejos de receptores a dopamina desencadenan diferentes cascadas de señalización. La estimulación
del dímero D1-D2 (derecha) provoca un incremento súbito de calcio, haciendo a las neuronas sean más propensas a
disparar de nuevo y consecuentemente forjando nuevas conexiones neurales.
En el siguiente apartado serán remarcadas un par de interacciones proteicas las
cuales involucran a receptores dopaminérgicos, de la cuales no se tenía mucha evidencia y
cuyo conocimiento es de particular interés pues es parte medular para el desarrollo de
este trabajo.
17
3.- INTERACCIÓN HETERODIMÉRICA DE LOS RECEPTORES
DOPAMINÉRGICOS D1-D3.
En 1996, Surmeier y colaboradores mostraron que un porcentaje importante de
receptores D3, cuya ubicación había sido considerada exclusiva de neuronas de la vía
indirecta en los ganglios basales, se encontraba expresado junto con el receptor D1, en
neuronas estriatales que expresaban SP y dinorfinas. Reportes posteriores de estudios de
microscopía confocal y de transferencia de energía (FRET y BRET) en sistemas de
expresión heteróloga (Marcellino, 2008; Figura 6) sugirieron que ambos receptores, D1 y
D3, podían estar formando una estructura dimérica. Más aún, empleando anticuerpos
selectivos, fue encontrado que los receptores a dopamina D1 y D3 co-inmunoprecipitan
en neuronas estriatales (Fiorentini, 2008; Figura 6). Estudios de binding en células
transfectadas mostraron una característica única de la activación D1-D3: la estimulación
del receptor D3 incrementa la afinidad del receptor D1 tanto por la dopamina, como por
agonistas selectivos. Marcellino y colaboradores detectaron esta misma huella bioquímica
en preparaciones membranales del núcleo estriado y que el efecto de la co-activación de
estos receptores es tal que puede observarse a nivel conductual (Figura 6), evidenciando
fuertemente su interacción como estructura heterodimérica.
18
D1+ CXCR4
D1+D3
Figura 6. Huella bioquímica del dímero D1-D3. (Izquierda)Estudio de transferencia de energía en células HEK-293, los
círculos negros representan la transferencia de energía que resulta de la co-transfección de los receptores D1 y D3.
(Centro) Co-inmunoprecipitación de los receptores a dopamina D1 y D3 en estriado de rata, A, inmunoprecipitación D3R y
western Blot contra D1R; B, inmunoprecipitación D1R y western Blot contra D3R. (Derecha) Implicación conductual de la
interacción D1–D3 en ratones reserpinados wild type y knock- out del receptor D3.
3.1 Implicaciones transduccionales de la heteromerización D1-D3
Es ampliamente aceptado que el receptor D1 señaliza a través de proteínas Gs /
Golf, activando por tanto a la enzima adenilato ciclasa (AC), mientras que el receptor D3
preferencialmente interactúa con proteínas Gi/Go, inhibiendo la formación de AMPc. La
heteromerización D1-D3 sin embargo, resulta en la potenciación de la estimulación de AC
mediada por receptores D1 (Marcellino, 2008), donde la activación de los receptores D3
es requerida para potenciar los efectos del D1. Por lo tanto una de las funciones de la
dimerización entre ambos receptores es permitir un mayor acople del receptor D1 al
sistema de AMPc (Figura 7).
Figura 7. Diagrama esquemático que ilustra que la co- activación D1-D3 potencía los efectos en la vía de señalización del
receptor D1.
19
Las respuestas adaptativas de los receptores D1 y D3 a la estimulación por
agonistas son también modificadas por la heterodimerización. La fosforilación mediada
por cinasas de receptores acoplados a proteínas G (GRK´s), la unión con arrestina y la
posterior internalización es el mecanismo más común para terminar la señalización de los
GPCR´s y promover su reciclaje de la membrana plasmática, calibrando dinámicamente la
disponibilidad de receptores en función de los ligandos extracelulares.
Los receptores D1 y D3 se caracterizan por poseer mecanismos de
desensibilización diferentes. El receptor D1 sufre secuestro citoplasmático inducido por
agonista y rápidamente es retirado de la membrana plasmática.
Por otra parte, la prolongada estimulación de los receptores D3 deriva en la
disminución de su acople a sus proteínas G, con internalización parcial. La
heteromerización modifica también la plasticidad adaptativa de ambos receptores.
En particular, la internalización inducida por agonista del D1R es evitada debido
a su interacción con el D3R; mientras que, la co-activación promueve la internalización del
complejo D1-D3 (Fiorentini, 2008). Este fenómeno puede representar un mecanismo
neuronal para preservar la fuerza sináptica óptima durante la administración de drogas
dirigidas al receptor dopaminérgico D1.
3.2 Implicaciones conductuales de la heteromerización D1-D3
El papel del D3R en la regulación de la actividad locomotora ha sido
controversial debido a su localización en zonas pre-sinápticas y post-sinápticas.
20
Generalmente es aceptado que dosis bajas de agonistas D3 activan
preferencialmente los auto-receptores D3 llevando a una depresión de la actividad
motora, en cambio altas dosis de agonista conlleva a una activación motora, posiblemente
relacionada a la activación de los D2R post-sinápticos. Sin embargo, ha sido reportada
evidencia clara del papel post- sináptico del receptor D3 en el control de la conducta
motora. En este estudio, usando la depleción de dopamina por medio de reserpina como
herramienta para aislar mecanismos post-sinápticos, fue mostrado que la estimulación de
los receptores D3 resulta en la potenciación de la actividad locomotora mediada por D1, y
que esta respuesta fue abolida por el uso de antagonistas selectivos de D3R e incluso
indetectable en ratones con knock out de dicho receptor. En base a estos hallazgos, en
dicho trabajo se hipotetiza que este sinergismo conductual ocurre en las neuronas
GABAérgicas que expresan sustancia P, es decir, en la vía directa de los ganglios basales.
21
Con
trol
SKF 3
8393 P
D
SKF +
PD
50
75
100
125
150
175
cA
MP
Bas
al
Bas
al +
Nife
SKF+P
D+K
Cl
+KCl+
Nife
0
50
100
150
200
_________
SKF+PD
___________ns
_____***___________***
cA
MP
Accu
mu
lati
on
% B
asal
4. ANTECEDENTES INMEDIATOS
4.1 El heterodímero D1-D3 en las terminales estriado nigrales
Debido al hecho de que el RNAm del receptor D3 ha sido localizado en el núcleo
estriado (Surmeier, 1996), más no así la expresión de su proteína, se ha planteado la
hipótesis de que el receptor es sintetizado en el soma y transportado hacia las terminales
que comunican con la sustancia nigra (Gurevich, 1999), núcleo en el cual si ha sido
encontrado el receptor.
Avalos- Fuentes en 2008 evaluó la funcionalidad de la estructura dimérica D1-
D3 en las terminales estriado nigrales a diversos niveles de su vía de señalización.
Experimentos realizados en sinaptosomas de la sustancia nigra mostraron que la
activación del receptor D3 potencía los efectos del receptor D1 en la formación de AMPc y
que el complejo de receptores señaliza a través de la vía AMPc-PKA, activando a canales
de calcio de tipo L (Figura 8).
Figura 8. La activación del receptor D3 potencía los efectos del receptor D1 sobre la formación de AMPc (Izquierda). Los
efectos del dímero D1-D3 son llevados a cabo a través de la activación de canales de tipo L, evidenciado por el efecto del
nifedipino sobre la formación de AMPc mediada por el complejo de receptores (Derecha).
22
Sin embargo, interesantemente, al ser evaluada la liberación de
neurotransmisor en rebanadas de la sustancia nigra, la activación de los receptores a
dopamina D3 no tuvo efecto alguno sobre la liberación de GABA mediada por el receptor
D1.
Este fenómeno se atribuyó a un factor inherente al receptor D3, pues el
receptor D1 si señalizaba adecuadamente por si solo.
En dicho trabajo fue evidenciada la participación del calcio en la regulación de la
señalización del heterodímero D1-D3, pues los experimentos de liberación de GABA
radiactivo precisan la generación de un estímulo despolarizante, que deriva en un influjo
masivo de calcio a la terminal, lo cual aparentemente estaba impidiendo observar la
huella bioquímica del complejo de receptores.
Analizando la estructura del receptor D3 debe tomarse en cuenta que, como es
característico de los receptores de la familia D2, posee una tercera asa citoplasmática de
gran tamaño, lo cual, según diversos reportes hacen al receptor D3 un blanco ideal para la
interacción con proteínas sub-membranales, estas interacciones han mostrado ser críticas
en el control de la expresión del receptor en la membrana, así como en la eficacia de su
señalización.
Como miembro de la familia de receptores acoplados a proteínas G, el D3R
puede ser sujeto a modulación por fosforilación mediada por cinasas de proteínas en sus
dominios citoplasmáticos.
23
De hecho la cinasa 4 de receptores acoplados a proteínas G (GRK-4) interactúa
con el receptor dopaminérgico, fosforilándolo y regulando la eficacia de su señalización.
Previamente, Liu y colaboradores en 2009 habían identificado en el núcleo
accumbens un nuevo modelo de regulación sináptica del receptor D3 a través de un
mecanismo de asociación directa, que involucraba fosforilación mediada por una cinasa
activada por calcio: la cinasa dependiente de calcio y calmodulina II (CaMKII). La CaMKII es
una proteína cinasa de serina y treonina, encontrada esencialmente en todos los
compartimentos neuronales, presenta cuatro isoformas α, β, γ y δ de las cuales la
isoforma alfa es la más abundante y cuyas funciones han sido estudiadas más
ampliamente. Representa aproximadamente el 1% del contenido proteico total de las
neuronas y se localiza preferentemente en las sinapsis. La unión de calcio y calmodulina al
dominio regulatorio de la CaMKII revierte su autoinhibición, conduciendo a su activación.
La CaMKII activada exhibe una marcada afinidad por el receptor D3 y a través de
una autofosforilación en la treonina 286 es capaz de seguir actuando de manera
independiente a la presencia de calcio. Estudios de binding in vivo mostraron que la
interacción entre CaMKIIα y D3R sucede entre el dominio catalítico de la enzima y la
región N-terminal de la tercera asa citoplasmática del receptor a dopamina en una
secuencia motivo de 14 residuos (RILTRQNSQCISIR). Con base en lo anterior, el aumento
en los niveles de calcio recluta la CaMKII a la tercera asa citoplasmática del receptor D3,
esta es fosforilada en un sitio de serina específico, lo cual inhibe la disminución de la
formación de AMPc mediada por D3R.
24
A B
Figura 9. A, La CaMKIIα inmunoprecipita con el receptor D3 en homogenados de núcleo accumbens. B, El influjo de
calcio a las neuronas del Nac promueve la interacción CaMKII-D3, inhibiendo los efectos sobre la formación de AMPc
mediados por el receptor dopaminérgico.
La interacción CaMKII-D3 por tanto parece ser un fenómeno que pudiera estar
relacionado con el influjo de calcio y la regulación de la actividad del complejo D1-D3 en
las terminales estriado nigrales sobre la liberación de GABA. Así fue evidenciado en
experimentos de liberación de GABA radiactivo, donde, co-activando a los receptores D1 y
D3 y empleando un inhibidor selectivo de la CaMKII pudieron observarse los efectos
previamente descritos en la literatura del complejo D1-D3, lo que nos habla de la
participación activa de esta cinasa, no solo en la regulación de la función de
heterodímeros, sino también en regulación de la liberación de neurotransmisores.
Sin embargo el mecanismo exacto por el cual la cinasa bloquea la actividad del
receptor D3 y sus efectos sobre el receptor D1 permanece sin ser esclarecido. Una
interesante posibilidad a explorar es si la cinasa interactúa físicamente con el receptor D3
y si esto impide su dimerización con el receptor D1.
25
También de manera interesante este grupo de trabajo encontró que en la
denervación dopaminérgica como la que ocurre en la enfermedad de Parkinson la relación
funcional del dímero D1-D3 se modificaba, ya que la potenciación de receptor D3 sobre la
estimulación provocada por el receptor D1 se perdía, e incluso se tornaba antagónica, y
mas aún no estaba regulada por la CaMKII. Esto también lleva a posibilidades interesantes
para explicar estos fenómenos, uno puede ser la falta de dimerización D1-D3 en la
denervación dopaminérgica por un lado y la interacción física de la cinasa con el receptor
D3.
Estas especulaciones son objeto de nuestro trabajo y son de importancia no
solo para la fisiología de los receptores a dopamina, sino para la terapéutica experimental
basada en el uso de fármacos con acción selectiva sobre receptores a dopamina en la
Enfermedad de Parkinson o para las complicaciones de las terapias actuales como son las
discinesias inducidas por L-dopa.
26
5. JUSTIFICACIÓN
El mecanismo por el cual la CaMKII regula la actividad del dímero D1-D3 en las
terminales estriado nigrales se desconoce, por lo que se pretende dilucidar los procesos
moleculares implicados en este fenómeno, tanto en condiciones normales como en
denervación dopaminérgica.
6. HIPÓTESIS
La cinasa dependiente de calcio y calmodulina II (CaMKII) evita la dimerización
D1-D3 mediante su interacción física con el receptor D3 durante la despolarización,
evitando su dimerización con el receptor D1, mientras que en condiciones de denervación
este mecanismo no está presente.
27
7. OBJETIVO GENERAL
Proponer un mecanismo mediante el cual la CaMKII podría estar regulando la
actividad del dímero D1-D3 en las terminales estriado nigrales de ratas hemiparkinsónicas.
8. OBJETIVOS PARTICULARES
1.- Evaluar la interacción de los receptores D1-D3, por medio de co-inmunoprecipitación,
en condiciones normales y de Parkinson experimental, con y sin despolarización
2.- Evaluar el tipo de interacción de la CaMKII con el receptor D3 en el lado control y
denervado de ratas hemiparkinsónicas, a través de coinmunoprecipitación, con y sin
despolarización.
3.- Evaluar si la interacción de la CaMKII con el receptor D3 previene la formación del
dímero D1-D3.
28
9. MATERIALES Y MÉTODOS
Animales de experimentación
Para todos los estudios se utilizaron ratas macho de la cepa Wistar con un peso
de 210 a 230 gramos. Los animales fueron mantenidos en condiciones de habituación
controladas en bioterio: temperatura de 18-23°C, ciclos luz-oscuridad 12:12 horas,
alimentación y agua ad libitum. El uso y cuidado de los animales se realizó de acuerdo a
los lineamientos establecidos por el comité de ética de la UPEAL del CINVESTAV.
Lesión unilateral con 6-hidroxidopamina
Con la finalidad de generar el modelo de Párkinson experimental, las ratas
fueron anestesiadas con una mezcla de Ketamina y Xilazina (112.5/22.5 mg/kg i.p.) y
posteriormente colocadas en un aparato estereotáxico (Kopf, Tujunga, California, Estados
Unidos de América). Fue localizado el punto bregma y se ubicaron las coordenadas
correspondientes al haz del cerebro medio, obtenidas del atlas del cerebro de la rata de
Paxinos y Watson 1998 (antero-posterior, -1.8 mm; lateral, 2.4 mm y dorso-ventral, -7.0
mm), donde fue realizado un trépano con una fresa dental sobre el hueso temporal
derecho. En dicho sitio fue efectuada la infusión de 1μl del neurotóxico 6-
hidroxidopamina (16μg/μl, disuelta en ácido ascórbico al 0.1 %) a razón de 0.1 μl/min en
un periodo de diez minutos. Todas las ratas lesionadas fueron sujetas a un pre-tratamiento con
imipramina (10 mg/kg i.p.) cuarenta y cinco minutos antes de la infusión de 6-hidroxidopamina,
para proteger al sistema noradrenérgico de los efectos del neurotóxico.
29
Prueba conductual (conducta de giro)
Ocho días posteriores a la cirugía, se realizó la prueba conductual de giro para
corroborar el grado de lesión dopaminérgica (Ungerstedt y Arbuthnott 1970).
La conducta de giro fue inducida mediante la inyección de anfetamina (10
mg/kg i.p.), todas aquellas ratas que realizaron ocho o más giros ipsilaterales (hacia el lado
de la lesión) por minuto durante una sesión de una hora, fueron incluidas en los
experimentos posteriores.
Obtención del tejido
Las ratas fueron sacrificadas por dislocación cervical y rápidamente decapitadas,
fue obtenido el cerebro que posteriormente fue fijado al fondo de una caja de Petri
cubierta con Krebs- Hepes frío y previamente oxigenado en una mezcla 02 y CO2. La caja
Petri, se sujetó a un vibratomo (CAMPDEN instruments ltd, USA) con el cual se obtuvieron
rebanadas coronales de 300 micrómetros de espesor. Finalmente se realizó la disección de
la sustancia nigra, separando a su vez el lado intacto del lado lesionado obtenido de las
rebanadas.
30
Obtención de la fracción sinaptosomal
Las rebanadas de sustancia nigra fueron sometidas a homogeneización (10
golpes a velocidad de 400-500 rpm) en una solución HEPES-sacarosa (0.32M).
El homogenado fue centrifugado a 3750 rpm durante diez minutos a una
temperatura de 4°C, separando de esta manera núcleos y mitocondrias de las membranas.
El sobrenadante fue recuperado y posteriormente sometido a centrifugación a 15,000 rpm
durante 40 minutos. Se recuperó la pastilla (P1) y fue resuspendida en el mismo buffer de
sacarosa 0.32 M, la cual se colocó sobre una solución HEPES-sacarosa 0.8 M y centrifugada
nuevamente a 15,000 rpm durante 40 minutos. La fracción sinaptosomal obtenida (P2) fue
resuspendida en solución Krebs-Hepes y separada en alícuotas de 250 μl, a algunas de las
cuales les fueron adicionados 10 μl de solución de KCl [275 mM], para inducir la actividad
de la CaMKII. Después de transcurridos 10 minutos, las muestras fueron congeladas
durante 15 minutos con la finalidad de detener las reacciones enzimáticas para finalmente
ser resuspendidas las pastillas en RIPA en presencia de inhibidores de proteasas.
Ensayo de co-inmunoprecipitación
Una vez resuspendidos en RIPA, los sinaptosomas fueron sonicados tres veces
y se determinó la cantidad de proteína presente en cada muestra por medio del método
de Bradford. Para realizar los ensayos de co-inmunoprecipitación se agregaron 500 μg de
proteína total a un tubo conteniendo 2 μl del anticuerpo afín a la proteína de interés
(CaMKII, D1R ó D3R), dejándose incubar durante cuatro horas y posteriormente fueron
adicionados 30 μl de proteína A/G agarosa, dejándose agitar toda la noche a 4°C para
permitir la formación de complejos antígeno- anticuerpo acoplados a la matriz de agarosa.
31
Los inmunoprecipitados se colectaron por centrifugación a 13 000 rpm durante cinco
minutos a 4°C y lavándose cinco veces con 500 μl de regulador RIPA.
Electroforesis
Fueron adicionados 20 μl de buffer de muestra 4X, sin β-mercaptoetanol para
muestras de co-inmunoprecipitación y 200 μl con dicho agente reductor para muestras de
lisado total. Las muestras de lisado total se hirvieron durante 10 minutos y fueron aptas
entonces para su corrida en geles de poliacrilamida, mientras que las de
inmunoprecipitación fueron usadas directamente.
Se prepararon geles de poliacrilamida al 8% para la separación de las proteínas
en muestras sometidas a co-inmunoprecipitación y 10% para la detección de proteínas de
los lisados totales. Las muestras fueron colocadas en carriles de gel concentrador, las
proteínas corrieron en una cámara de electroforesis con buffer de corrida a 55 mA por
aproximadamente una hora.
Transferencia
Posteriormente el gel fue transferido sobre una membrana de PVDF
previamente hidratada con metanol, colocándose en sándwich, y puesto en una cámara
de transferencia húmeda durante toda la noche. Terminado ese período la membrana con
las proteínas transferidas se colocó en solución de bloqueo durante 6 horas.
32
Incubación con anticuerpos
Las membranas de PVDF fueron incubadas con los anticuerpos primarios
obtenidos de Sta. Cruz Biotechnology.
El anticuerpo primario contra D1R fue utilizado 1:2000. El anticuerpo contra D3
fue usado a razón de 1:2000. Por su parte, el anticuerpo contra CaMKII fue utilizado a
dilución 1:1000. En todos los casos los anticuerpos se dejaron incubar durante 12 horas.
Transcurrido este lapso las membranas fueron lavadas con solución TBS-Tween 0.02 %.
Posteriormente se incubaron las membranas con anticuerpos secundarios (1:3000 α-
rabbit, para D1R y D3R; 1:2000 α-mouse para CaMKII) durante un periodo de dos horas,
con agitación constante a 4°C. Después de efectuar los lavados correspondientes, las
membranas fueron teñidas con ECL-Prime (General Electric) y realizada una
autorradiografía mediante el método de revelado Kodak. Las bandas resultantes fueron
analizadas por densitometría mediante el empleo del software Kodak 1D, la densidad
óptica se obtuvo de la siguiente relación:
Los datos fueron graficados con ayuda del software Graph Pad Prism versión 5,
tomando la muestra no despolarizada como control, y expresando en porcentaje el
cambio inducido por la despolarización tanto en condiciones normales, como en
denervación.
33
Soluciones utilizadas
Krebs-HEPES: NaCl (115mM), KCl (15mM), MgSO4 (1.18mM), KH2PO4 (1.18mM), CaCl2
(1.8mM), HEPES (20mM), Glucosa (11mM) a pH de 7.4.
HEPES- Sacarosa (0.32M): HEPES (5mM) y sacarosa (0.32M) a pH de 7.4.
HEPES- Sacarosa (0.8M): HEPES (5mM) y sacarosa (0.8M) a pH de 7.4.
Solución para gel separador: Acrilamida 30%, Tris-HCl 1.5 M pH 8.8, SDS 10%, persulfato
de amonio (PSA) 10%, tetra metil, etil-diamida (TEMED) 0.0004%.
Solución para gel concentrador: Acrilamida 30%, Tris-HCl 1M pH 6.8, SDS 10%, persulfato
de amonio (PSA) 10%, TEMED 0.0001 %
Buffer de corrida: Tris- base (0.025M), Glicina (0.192M), SDS 0.1 % pH 8.3.
Buffer de transferencia: Tris-Base (50mM), Glicina (380 mM).
Buffer de muestra no desnaturalizante: Tris-Base (325mM), SDS 10%, Glicerol 50%, azul
de bromofenol 0.5%, pH 6.8.
Buffer de muestra desnaturalizante: Tris-Base (325mM), SDS 10%, Glicerol 50%, 2-β-
mercaptoetanol, azul de bromofenol 0.5%, pH 6.8.
Solución de bloqueo: Leche libre de grasa 10%, TBS-Tween 0.02%.
TBS: NaCl (100mM), Tris-HCl (10mM), Tween 20 (0.2%) a pH 7.5.
RIPA: Tris-HCl (40mM), NaCl (150 mM), EDTA (2mM), glicerol (10%), Triton X-100 (1%),
desoxicolato de sodio (0.5%), SDS (0.2%), pH 7.6.
34
10. RESULTADOS
Efecto de la despolarización en la estructura D1-D3 en el lado intacto de ratas
hemiparkinsónicas
Se estudió en principio el efecto de un influjo masivo de calcio a las terminales
estriado nigrales en el acople de los receptores D1 y D3, por medio de ensayos de co-
inmunoprecipitación. La primera estrategia experimental para lograr este objetivo fue
realizar la inmunoprecipitación del receptor D1 y Western Blot para el receptor D3 a fin de
colectar evidencia de su interacción. Como control para verificar la especificidad de la
inmunoprecipitación y descartar posibles artefactos, se incluyó un control negativo
consistente en una muestra de sinaptosomas con solo perlas de agarosa, omitiendo la
presencia de un anticuerpo. El primer hallazgo que resulta interesante es la confirmación
de la presencia de esta estructura dimérica en las terminales estriado nigrales, pues el
Western Blot para el receptor D3 resulta positivo, es observada una banda situada en un
peso molecular de ~ 50 KDa correspondiente con el peso del receptor. Cuando los
sinaptosomas fueron expuestos a un estímulo despolarizante, generado por la incubación
en una solución de cloruro de potasio al 15mM, esta no tuvo efecto en la estructura
dimérica, pues se pudo apreciar una expresión equivalente de complejo D1-D3 en esta
condición (Figura 10).
La cantidad de proteína cargada y por tanto la densidad de receptores D3
presentes en cada condición fue constante, así lo refleja el input, que representa el 10%
del lisado total usado para la co-inmunoprecipitación.
35
Figura 10. Inmunoprecipitación del receptor a dopamina D1 y Western Blot contra el receptor D3. Los ensayos fueron
realizados en lisados sinaptosomales de ratas hemiparkinsónicas. Las bandas observadas se encuentran
aproximadamente en 50 kDa y corresponden al peso del receptor D3 (Arriba). Se muestra el análisis densitométrico
realizado, en la barra de la izquierda (I ND) se muestra la expresión normalizada del receptor D3 y la banda a la derecha
(I Des) muestra la expresión del receptor D3 en condiciones de despolarización (Abajo).
WB D3
Intacto
~ 50 KDa
Input 10%
36
Para confirmar el resultado anterior se procedió a ejecutar la maniobra contraria,
es decir, ahora se realizó la inmunoprecipitación del receptor D3 y el Western Blot para el
receptor dopaminérgico D1 en muestras de lisados sinaptosomales provenientes de la
sustancia nigra.
Los resultados obtenidos fueron similares y complementaron a los descritos
anteriormente: por un lado se confirmó la ubicación del dímero D1-D3 a nivel de las
terminales de la vía estriado nigral, pues fue observada la presencia una banda que
aparece en ~ 70 KDa, correspondiente al peso molecular del receptor a dopamina D1. Por
otra parte, se vuelve a mostrar que la exposición de las terminales a un influjo masivo de
calcio, generado por la exposición de los sinaptosomas a una solución alta en potasio, no
tiene efecto sobre la interacción del complejo de receptores D1-D3 (Figura 11).
La cantidad de muestra y por tanto la densidad de receptores D1 presentes
en cada condición fue constante, así lo refleja el input, que representa el 10% del lisado
total usado para la co-inmunoprecipitación.
37
Figura 11. Inmunoprecipitación del receptor a dopamina D3 y Western Blot contra el receptor D1. Los ensayos fueron
realizados en lisados sinaptosomales de ratas hemiparkinsónicas. Las bandas observadas se encuentran
aproximadamente en 70 kDa y corresponden al peso del receptor D1 (Arriba). Se muestra el análisis densitométrico
realizado, en la barra de la izquierda (I ND) se muestra la expresión normalizada del receptor D1 y la banda a la derecha
(I Des) muestra la expresión del receptor D1 en condiciones de despolarización (Abajo).
Intacto
Input 10%
~ 70 KDa WB D1
Lado intacto
38
Efecto de la despolarización en la interacción CaMKII-D3 en el lado intacto de ratas
hemiparkinsónicas
Fue evaluada la interacción de la cinasa dependiente de calcio y calmodulina II con
el receptor a dopamina D3 y el efecto de la despolarización con alto potasio sobre esta
asociación. Se procedió a realizar la inmunoprecipitación del receptor D3 y la detección de
la CaMKII por medio de la técnica de Western Blot. Un hallazgo a remarcar es que la
CaMKII mostró tener una interacción basal con dicho receptor dopaminérgico, pues aún
en ausencia de un estímulo puede observarse una banda ubicada aproximadamente en
100 KDa, lo que corresponde a la suma del peso de ambas proteínas, esto debido a que los
ensayos fueron realizados en condiciones no reductoras, en las que se preserva la unión
de las proteínas (Figura 12).
Al ser aplicado un estímulo despolarizante con alto potasio pudo observarse que la
interacción de la CaMKII y el receptor D3 se ve aumentada, pues es evidente que la banda
resultante, situada también alrededor de los 100 KDa posee un tamaño mayor,
comparada con la condición control, lo que es confirmado por el análisis densitométrico
realizado, el cual muestra un aumento del 34% en la unión D3-CaMKII (Figura 12).
La uniformidad en la cantidad de proteína utilizada para los ensayos queda
reflejada en el input, que representa el 10% del lisado total usado para la realización de
los experimentos de co-inmunoprecipitación.
39
Figura 12. Inmunoprecipitación del receptor a dopamina D3 y Western Blot contra CaMKII-P. Los ensayos fueron
realizados en lisados sinaptosomales de ratas hemiparkinsónicas. Las bandas observadas se encuentran
aproximadamente en 100 kDa y corresponden al peso sumado de ambas proteínas (Arriba). Se muestra el análisis
densitométrico realizado, en la barra de la izquierda (I ND) se muestra la expresión normalizada de la CaMKII-P y la
banda a la derecha (I Des) muestra la expresión de dicha cinasa en condiciones de despolarización (Abajo).
WB CaMKII- P
Intacto
~ 100 KDa
Input 10%
40
Para corroborar los resultados observados en el experimento anterior fue realizada
su maniobra inversa: la inmunoprecipitación de la CaMKII y el Western Blot contra el
receptor a dopamina D3 en los lisados sinaptosomales obtenidos de la sustancia nigra.
Pudo apreciarse la interacción entre ambas proteínas aún en ausencia de estímulo,
evidenciada por la detección de una banda correspondiente a un peso molecular de 100
KDa, el peso sumado de la CaMKII y el receptor D3.
Al inducir un estímulo despolarizante con cloruro de potasio se pudo apreciar un
notable aumento en la interacción CaMKII-D3, lo cual fue confirmado por el análisis
densitométrico de las bandas obtenidas, el cual revela un 33% de cambio en el lado
despolarizado con respecto a la condición basal (Figura 13).
La uniformidad de la carga proteíca quedó evidenciada por el input, que
corresponde a un western Blot contra el receptor D3 y representa el 10% de la cantidad
de lisado total utilizado para los ensayos de co-inmunoprecipitación realizados.
41
Figura 13. Inmunoprecipitación de CaMKII-P y Western Blot contra el receptor D3. Los ensayos fueron realizados en
lisados sinaptosomales de ratas hemiparkinsónicas. Las bandas observadas se encuentran aproximadamente en 100 kDa
y corresponden al peso sumado de ambas proteínas (Arriba). Se muestra el análisis densitométrico realizado, en la barra
de la izquierda (I ND) se muestra la expresión normalizada del receptor D3 y la banda a la derecha (I Des) muestra la
expresión del receptor en condiciones de despolarización (Abajo).
WB D3
Intacto
Input 10%
~ 100 KDa
42
Efecto de la despolarización en la estructura D1-D3 en el lado denervado de ratas
hemiparkinsónicas
Se evalúo el impacto de la denervación dopaminérgica sobre el acople de la
estructura D1-D3, así como el efecto de la despolarización por alto potasio sobre la
formación de este dímero.
Para este fin se realizó la inmunoprecipitación del receptor D1 y el Western Blot
para la detección del receptor D3. Contrario a lo hipotetizado, de manera interesante
pudo apreciarse que el dímero D1-D3 se encuentra presente aún en lisados
sinaptosomales provenientes de ratas hemiparkinsónicas, pues es detectada una banda
en un aproximadamente 50 KDa, que corresponde al peso del receptor dopaminérgico
D3.
Por otra parte, al aplicar un estímulo despolarizante a los sinaptosomas pudo
apreciarse que esta no tiene efecto sobre la interacción basal del complejo de receptores
D1-D3, así lo revela el análisis densitométrico realizado a las placas fotográficas obtenidas
(Figura 13).
La uniformidad de la carga proteíca quedó evidenciada por el input, que
corresponde a un western Blot contra el receptor D3 y representa el 10% de la cantidad
de lisado total utilizado para los ensayos de co-inmunoprecipitación realizados.
43
Figura 13. Inmunoprecipitación del receptor D1 y Western Blot contra el receptor D3. Los ensayos fueron realizados en
lisados sinaptosomales de ratas hemiparkinsónicas. Las bandas observadas se encuentran aproximadamente en 50 kDa y
corresponden al peso del receptor D3 (Arriba). Se muestra el análisis densitométrico realizado, en la barra de la
izquierda (D ND) se muestra la expresión normalizada del receptor D3 y la banda a la derecha (D Des) muestra la
expresión del receptor en condiciones de despolarización (Abajo).
44
Al realizar la maniobra contraria, es decir la inmunoprecipitación del receptor D3 y
el western Blot contra el receptor D1 pudo darse confirmación al resultado anterior, esto
es que el heterodímero D1-D3 se encuentra preservado aún en condiciones de
denervación dopaminérgica, debido a la detección de bandas en un peso aproximado de
70 KDa, lo cual es correspondiente con el peso del receptor D1.
Conjuntamente fue observado que la despolarización, inducida por altas
concentraciones de potasio no tiene un efecto apreciable sobre la interacción física de los
receptores D1 y D3, pues la banda observada en aproximadamente 70 KDa y que
corresponde al receptor D1 no presentó diferencia en su densitometría comparado con la
condición basal (Figura 14).
La uniformidad de la carga proteíca quedó evidenciada por el input, que
corresponde a un western Blot contra el receptor D1 y representa el 10% de la cantidad
de lisado total utilizado para los ensayos de co-inmunoprecipitación realizados.
45
Figura 14. Inmunoprecipitación del receptor D3 y Western Blot contra el receptor D1. Los ensayos fueron realizados en
lisados sinaptosomales de ratas hemiparkinsónicas. Las bandas observadas se encuentran aproximadamente en 70 kDa y
corresponden al peso del receptor D1 (Arriba). Se muestra el análisis densitométrico realizado, en la barra de la
izquierda (D ND) se muestra la expresión normalizada del receptor D1 y la banda a la derecha (D Des) muestra la
expresión del receptor en condiciones de despolarización (Abajo).
WB D1
Denervado
Input 10%
~ 70 KDa
46
Efecto de la despolarización en la interacción CaMKII-D3 en el lado denervado de ratas
hemiparkinsónicas
Se evaluó la interacción de la CaMKII con el receptor a dopamina D3 en
sinaptosomas del lado lesionado de ratas con denervación dopaminérgica, así como el
efecto de la despolarización con alto potasio sobre esta asociación. Se procedió a realizar
la inmunoprecipitación del receptor D3 y la detección de la CaMKII por medio de la técnica
de Western Blot. Se puede observar la interacción basal de ambas entidades aún en
ausencia de un estímulo, pues se obtuvo una banda ubicada aproximadamente en 100
KDa, lo que corresponde a la suma del peso de ambas proteínas.
Al ser aplicado un estímulo despolarizante pudo observarse que la interacción
basal entre la CaMKII y el receptor D3 no se ve modificada, pues resulta evidente que la
banda obtenida, situada también alrededor de los 100 KDa posee un tamaño equiparable
a la encontrada en condiciones no estimuladas, lo cual se confirma por el análisis
densitométrico realizado (Figura 15).
La cantidad de proteína utilizada fue uniforme de acuerdo a los inputs, que
representan el 10% del lisado total usado para la realización de los experimentos de co-
inmunoprecipitación.
47
Figura 15. Inmunoprecipitación del receptor a dopamina D3 y Western Blot contra CaMKII-P. Los ensayos fueron
realizados en lisados sinaptosomales de ratas hemiparkinsónicas. Las bandas observadas se encuentran
aproximadamente en 100 kDa y corresponden al peso sumado de ambas proteínas (Arriba). Se muestra el análisis
densitométrico realizado, en la barra de la izquierda (D ND) se muestra la expresión normalizada de la CaMKII-P y la
banda a la derecha (D Des) muestra la expresión de dicha cinasa en condiciones de despolarización (Abajo).
Denervado
WB CaMKII- P ~ 100 KDa
Input 10%
48
Se realizó la inmunoprecipitación de la CaMKII-P y la posterior detección del
receptor a dopamina D3 por medio de Western Blot para corroborar la información
obtenida de la maniobra anterior.
Por un lado se observó una interacción basal CaMKII-D3 en condiciones donde no
había sido aplicado estímulo alguno. Se obtuvo una banda ubicada aproximadamente en
100 KDa, lo que es correspondiente al peso sumado de ambas proteínas.
De manera interesante, al generar un influjo de calcio a las terminales
sinaptosomales por medio de su incubación con una solución alta en potasio, se obtuvo
una banda en 100 KDa la cual no evidencia ninguna modificación en la interacción basal
de las proteínas analizadas. Esto lo confirma el análisis densitométrico realizado a las
imágenes de las bandas obtenidas gracias al Western Blot (Figura 16).
La uniformidad de la carga proteíca quedó evidenciada por los inputs, que
corresponden al western Blot contra el receptor D3 y representan el 10% de la cantidad de
lisado total utilizado para los ensayos de co-inmunoprecipitación que fueron realizados.
49
Figura 16. Inmunoprecipitación de la CaMKII-P y Western Blot contra el receptor a dopamina D3. Los ensayos fueron
realizados en lisados sinaptosomales de ratas hemiparkinsónicas. Las bandas observadas se encuentran
aproximadamente en 100 kDa y corresponden al peso sumado de ambas proteínas (Arriba). Se muestra el análisis
densitométrico realizado, en la barra de la izquierda (D ND) se muestra la expresión normalizada del receptor D3 y la
banda a la derecha (D Des) muestra la expresión de dicha receptor en condiciones de despolarización (Abajo).
WB D3
Denervado
Input 10%
~ 100 KDa
50
11. DISCUSIÓN
La heteromerización de los receptores acoplados a proteínas G es un concepto que
ha adquirido fuerza gracias a la gran cantidad de evidencia que pone de manifiesto la
importancia de la adaptación de los sistemas de señalización para llevar a cabo procesos
fisiológicos cada vez más complejos. Uno de los aspectos más fascinantes de la
dimerización de los GPCR´s es que poseen distinta farmacología y función, comparados
con los receptores expresados solo de manera individual.
Recientemente había sido demostrada la presencia del heterodímero D1-D3 en el
circuito de los ganglios basales, de manera específica en las terminales estriado nigrales,
donde tiene implicación en la liberación de GABA (Ávalos fuentes, 2008) y
consecuentemente en el control motor (Marcellino, 2008). También se había colectado
evidencia de que el influjo de calcio a la terminal estriado nigral, desencadenaba un
mecanismo de regulación mediado por la CaMKII cuyo blanco directo era el receptor D3,
impidiendo a este último potenciar los efectos del receptor D1 sobre la liberación de
GABA. No obstante, los eventos moleculares involucrados en este mecanismo novedoso
no habían sido dilucidados claramente.
En el presente trabajo fueron estudiados algunos de los procesos moleculares
implicados en la regulación de la señalización del complejo D1-D3. Más aún, fueron
evaluados estos mecanismos en un modelo de Párkinson experimental con la finalidad de
encontrar la explicación de porque no es observable el efecto de esta estructura en dicha
condición patológica.
51
Efecto de la despolarización en la interacción D1-D3.
El primer objetivo del presente estudio fue determinar el efecto molecular de la
despolarización inducida por alto potasio en la señalización D1-D3. Debido a que la
aplicación de un estímulo despolarizante impedía observar el efecto característico de este
complejo de receptores, se especuló que posiblemente la interacción de la CaMKII con el
receptor D3 podía inducir incluso el desacople del dímero y por ello no fueran apreciables
sus efectos sobre función del receptor D1.
A través de experimentos de co-inmunoprecipitación en lisados sinaptosomales se
obtuvo la primera evidencia molecular de la presencia del heterodímero D1-D3 en las
terminales estriado nigrales, lo cual correlaciona con los experimentos llevados a cabo por
Ávalos-Fuentes (Tesis de maestría, 2008), que había hecho evidente su existencia a nivel
funcional y esclarecido buena parte de su vía de señalización.
Este hallazgo viene a redondear un concepto que ha venido tomado forma desde
la postulación de que en la vía directa del circuito de los ganglios basales pueden
expresarse también receptores dopaminérgicos de tipo inhibitorio y tiene relevancia por
el hecho de presentarse como una explicación a fenómenos conductuales y
fisiopatológicos que no estaban bien esclarecidos, pues se consideraba a los receptores
dopaminérgicos como entidades individuales que se distribuían de manera rígida solo en
una u otra vía de los ganglios basales.
Otro hallazgo interesante de este trabajo es que la despolarización inducida por
alto potasio no tiene impacto en la inmunoprecipitación de ambas proteínas, sin embargo
52
debe tenerse cuidado con la interpretación de este resultado. Si bien indica que no es
necesaria la internalización del receptor D3 o un alejamiento físico tan drástico para
detener la señalización del complejo, es importante mencionar que el desacople de ambas
estructuras pudo haber ocurrido a nivel de sus dominios citoplasmáticos, pues ha sido
descrito que la CaMKII fosforilada se une a la tercera asa intracelular del receptor D3,
específicamente en la serina 229 (Guo, 2010) y que es precisamente en esta localización
subcelular donde ocurre la interacción con el carboxilo terminal del receptor D1 para
formar la estructura dimérica, por lo que es posible hipotetizar que la cinasa puede
impedir el acople adecuado de ambas estructuras a nivel intracelular, incluso formando un
complejo heterotrimérico con ellos, sin que esto impida la detección de ambos receptores
en una co-inmunoprecipitación.
Aún con este conocimiento resulta indispensable corroborar la migración de la
CaMKII hacia la membrana plasmática para su posterior interacción con el receptor D3,
por lo que deben realizarse los ensayos de co-inmunoprecipitación correspondientes en
lisados obtenidos de fraccionamiento subcelular donde pueda garantizarse la
manipulación de las membranas de las terminales estriado nigrales.
Resultaría interesante también evaluar el grado de proximidad de los receptores
durante la despolarización a través de estudios de transferencia de energía tales como
BRET o FRET.
Otra alternativa experimental que surge a partir de estos resultados es evaluar la
posible formación de un complejo heterotrimérico D1-D3-CaMKII a través de ensayos de
53
co-inmunoprecipitación y Western Blot empleando anticuerpos específicos para cada una
de estas proteínas.
Impacto de la denervación dopaminérgica en la interacción D1-D3
El sistema dopaminérgico de los ganglios basales es sujeto de importantes cambios
plásticos y morfológicos cuando se encuentra expuesto a una condición patológica. Una
de las más comunes e intrigantes es la enfermedad de Párkinson, que afecta la movilidad
del individuo y que puede ser consecuencia de las múltiples modificaciones que sufre el
sistema catecolaminérgico más importante en el control del movimiento.
Un hecho importante que ocurre en la enfermedad de Parkinson y en modelos de
Parkinson experimental es la modificación de la población de receptores a dopamina y la
sensibilización de su vía de señalización en respuesta a su activación (Cai et al., 2002;
Gerfen et al., 2002), esto ha sido interpretado como un mecanismo compensatorio para
sobrellevar la carencia de dopamina en el sistema. Así pues, en la denervación
dopaminérgica se ha encontrando que los receptores de la familia D1 se encuentran
disminuidos, en tanto que se ha mostrado consistentemente que existe un aumento de
los de la familia D2 (Gerfen, 1990).
En base a estos conceptos, y a los estudios que sugieren que el dímero D1-D3 no es
funcional durante el estadío patológico que representa la denervación dopaminérgica
(Ávalos-Fuentes, 2008), resultó plausible plantear la hipótesis de que esta estructura se
encontraba disminuida en el Párkinson experimental, más aún, que ambos receptores a
dopamina ya no se encontraban interactuando entre sí.
54
Mediante experimentos de co-inmunoprecipitación en sinaptosomas de la
sustancia nigra de ratas lesionadas fue posible ensayar dicho planteamiento.
De manera muy interesante y opuesto a lo que se esperaba, fue posible detectar el
complejo D1-D3 en el lado lesionado de ratas con Párkinson experimental. Para este
fenómeno pueden proponerse varias alternativas que faciliten su explicación.
Sería lógico pensar que aunque el dímero esté presente en condiciones de
denervación, quizá el acople a sus sistemas de señalización sea deficiente, sin embargo
debe tomarse en cuenta que, la activación conjunta de los receptores D1 y D3, aunque
antagónicos, si produjo efectos en la liberación de neurotransmisor, por lo tanto la
funcionalidad de dichas entidades proteicas se encuentra preservada, por lo que se
descarta esta posibilidad.
Otra opción es que, a pesar de que el dímero se encuentre preservado en la
denervación e incluso este fuera capaz de encontrarse señalizando adecuadamente, sus
efectos pudieran verse enmascarados por la acción de otros receptores que se
encontraran sensibilizados, como ha sido descrito ampliamente en la depleción
dopaminérgica.
De hecho, existe evidencia de que la vía de señalización los receptores D3 se
encuentra sobre-activada en el Párkinson experimental (Prieto et al, 2011) y que ocurre
un desbalance entre la expresión estriatal del receptor D3 y su isoforma regulatoria D3nf,
la cual se encuentra disminuida y por lo tanto es incapaz de regular adecuadamente la
expresión del receptor D3 en la membrana, conduciendo en conjunto a generar una
55
respuesta funcional exacerbada. Por lo anterior, es posible proponer que la actividad
inhibitoria incrementada de los receptores dopaminérgicos D3 en la denervación impida
observar los efectos funcionales del heterodímero a pesar de encontrarse señalizando por
su cuenta.
Sobre este respecto resultaría interesante confirmar si a nivel de las terminales
estriado nigrales ocurre esta sobre-activación de los receptores D3. Dicho objetivo
pretende abordarse a través de experimentos de electrofisiología mediante la
cuantificación de las corrientes de calcio evocadas por agonistas selectivos de los
receptores D3. Otro punto a evaluar sería verificar si la interacción D3-D3nf se encuentra
disminuida en la denervación, interacción que no ha sido evaluada hasta el momento en
las sinapsis de la vía directa. De hecho, nuestro grupo de trabajo ha planteado ya estos
objetivos a corto plazo para generar una explicación mas completa de lo que sucede con la
interacción D1-D3 en la denervación dopaminérgica.
Efecto de la despolarización en la interacción CaMKII-D3
Los receptores de la familia D2 pueden interactuar con una gran variedad de
proteínas, debido a que poseen una tercera asa intracelular particularmente prominente.
El receptor dopaminérgico D3 no es la excepción y se conocen varias interacciones con
proteínas que regulan principalmente su función y disponibilidad en la membrana
plasmática.
En estudios previos había sido observado que la estimulación de la entrada de
calcio a las neuronas estriado nigrales frenaba la actividad del dímero D1-D3 y, a través de
56
estrategias farmacológicas basadas en el empleo de inhibidores selectivos, pudo
evidenciarse la participación de la CaMKII, una cinasa de serina treonina activada por
calcio y calmodulina en la regulación de la señalización de dicha estructura.
Liu y colaboradores (2008) sugirieron que la interacción de la CaMKII con el
receptor dopaminérgico D3 ocurría en un residuo de serina, ubicado en la tercera asa
citoplasmática, el cual era fosforilado y esto derivaba en la inhibición de los efectos del
receptor sobre la formación de AMPc. Sin embargo también aportaron evidencia de que
era necesaria la unión física de ambas proteínas para lograr el mecanismo de regulación
mencionado anteriormente. Este punto fue el objeto de esta serie de experimentos:
analizar, por medio de co-inmunoprecipitación, si la CaMKII debe asociarse directamente
al receptor D3 para bloquear sus efectos sobre la señalización del receptor
dopaminérgico. Los resultados obtenidos reflejan un detalle interesante: que el receptor
dopaminérgico D3 interactúa de manera basal con la cinasa dependiente de calcio en las
terminales estriado nigrales. Este fenómeno se explica porque el receptor D3 representa
un sustrato de alta afinidad para la CaMKII debido a sus sitios de fosforilación
citoplasmáticos (Liu et al, 2008), situados principalmente en la tercera asa
intramembranal, sin embargo esta unión en condiciones basales no es suficiente como
para inhibir la señalización del receptor.
Por otra parte, cuando se favorece la activación de la CaMKII a través de la
aplicación de un estímulo despolarizante, la interacción CaMKII-D3 se encuentra
aumentada, Gou y colaboradores (2010) explican este fenómeno por el hecho de que la
autofosforilación de la CaMKII hace a la enzima marcadamente más afín al sustrato que le
57
representa el receptor dopaminérgico. Puede hipotetizarse por tanto que es necesario el
reclutamiento de la CaMKII hacia la tercera asa citoplasmática del receptor, y que esta
interacción debe ser constante para que pueda ejercer sus efectos inhibitorios sobre el
receptor D3. En cuestión de la regulación del dímero D1-D3 es de destacar que, a pesar de
que no logra su separación, si representa un impedimento para ambos receptores de
actuar de manera sinergista, probablemente, como se enunció anteriormente, a través de
la formación de un complejo heterotrimérico. En conjunto, estos hallazgos representan un
mecanismo novedoso de regulación de la liberación del neurotransmisor GABA en el
núcleo de salida de los ganglios basales, y adquiere más importancia por ser un blanco
potencial para la acción de fármacos destinados a corregir alteraciones motoras, pero
sobre todo representa una contribución para el mejor entendimiento de la función y
regulación de las interconexiones neuronales.
Efecto de la denervación sobre la interacción CaMKII-D3
Uno de los puntos de mayor atención en este trabajo fue el hallazgo de que, en la
denervación dopaminérgica, la estimulación de la actividad de la CaMKII no tiene efecto
sobre la señalización del dímero D1-D3, lo cual quedó reflejado también en los
experimentos de co-inmunoprecipitación, donde la unión basal de CaMKII y el receptor
dopaminérgico D3 no se ve modificada por un estímulo despolarizante.
Podría plantearse la hipótesis de que, la isoforma corta del receptor D3, la cual
carece de 21 aminoácidos en la tercera asa citoplasmática, fuera expresada en la
denervación y que las secuencias de las cuales carece fueran aquellas a las cuales fosforila
58
la CaMKII activada, lo cual podría explicar su ausencia de interacción con el receptor
dopaminérgico. Sin embargo, tomando en cuenta que el motivo RILTRQNSQCISIR donde
se localiza la serina 229, el sitio de interacción con CaMKII, se encuentra preservada aún
en la isoforma D3 corta (Fishburn, 1993), por lo que no representa una explicación
satisfactoria para el fenómeno observado en el lado denervado de ratas
hemiparkinsónicas.
Es ampliamente conocido que la depleción de la dopamina nigroestriatal afecta la
morfología de las neuronas espinosas medianas y modula la plasticidad sináptica en
modelos de Párkinson. Se ha demostrado que la denervación induce cambios en la
fosforilación de las proteínas estriatales, involucradas en la señalización de algunos
receptores dopaminérgicos (Brown et al, 2005).
Por ello una hipótesis que puede explicar el fenómeno observado es que el estado
de fosforilación de la CaMKII haya sido alterado de tal forma que no pueda ejercer
adecuadamente su acción de cinasa en el modelo de Párkinson experimental y por ello no
sea capaz de migrar a la membrana para unirse a los receptores D3 e inhibir con ello su
señalización. Otra alternativa apunta a que la cantidad de CaMKII total haya disminuido en
la denervación y por ello, a pesar de ser activada por estímulos despolarizantes, la
expresión de la proteína no es suficiente como para frenar los efectos de los receptores
dopaminérgicos D3. Estas aseveraciones resultan plausibles y por lo tanto exigen su
comprobación, para lo cual se proponen experimentos de Western Blot en sinaptosomas
estriado-nigrales con anticuerpos específicos tanto para la CaMKII total, asimismo se
requiere de la realización de ensayos para su forma fosforilada, con lo cual puede
59
discernirse la causa de la ausencia de interacción CaMKII en la denervación
dopaminérgica.
60
12. CONCLUSIONES
• La interacción entre CaMKII y D3 durante la despolarización no afecta la
estructura dimérica D1-D3.
• El dímero D1-D3 se encuentra preservado aún en condiciones de denervación.
• En el lado intacto de una rata hemiparkinsónica la CaMKII interactúa físicamente
con el receptor D3 después de un estímulo despolarizante.
• En condiciones de denervación la interacción basal CaMKII- D3 disminuye y la
despolarización ya no promueve dicha interacción proteica.
61
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