modul mikrobiologi lengkap
TRANSCRIPT
-
0
MODUL
ANALISIS MIKROBIOLOGI
Yusi Nurmayasari, S.Si
KELAS XI KIMIA ANALISIS
SMK BINA PUTERA NUSANTARA
-
1
DAFTAR ISI
DEFINISI DAN SEJARAH MIKROBIOLOGI ........................................................................... 3
ANGGOTA DUNIA MIKROBA ............................................................................................. 7
BAB 1 MEDIA PERTUMBUHAN ..................................................................................... 13
BAB 2 STERILISASI ......................................................................................................... 21
BAB 3 ISOLASI DAN INOKULASI MIKROORGANISME ................................................... 29
BAB 4 MORFOLOGI MIKROORGANISME ...................................................................... 36
BAB 5 PEMINDAHAN DAN PENGAWETAN MIKROORGANISME .................................. 58
BAB 6 PENGARUH LINGKUNGAN TERHADAP PERTUMBUHAN MIKROORGANISME ... 68
BAB 7 MENENTUKAN JUMLAH DAN UKURAN MIKROORGANISME ............................ 80
BAB 8 UJI REAKSI ENZIMATIS ....................................................................................... 95
BAB 9 ANALISA MIKROBA DALAM AIR ....................................................................... 108
BAB 10 ANALISA MIKROBA DALAM MAKANAN ........................................................... 115
BAB 11 DAYA KERJA ANTI MIKROBA ............................................................................. 125
BAB 12 MONITORING KESTERILAN ............................................................................... 134
-
2
KATA PENGANTAR
Puji syukur kami panjatkan ke hadirat Allah swt., karena atas ridha dan
hidayahNya penulisan modul Analisis Mikrobiologi untuk SMK Bina Putera
Nusantara ini dapat terselesaikan dengan baik. Tidak lupa kami ucapkan terima kasih
kepada semua pihak yang telah membantu terlaksananya penulisan modul hingga
dapat digunakan sebagai bahan ajar di jurusan Kimia Analisis SMK Bina Putera
Nusantara Tasikmalaya.
Modul ini kami susun dengan harapan dapat membantu siswa untuk
memahami materi dasar mikrobiologi dan menguasai cara-cara untuk melaksanakan
anlisis dalam mikrobiologi. Penyajian materi modul ini disesuaikan dengan silabus
pembelajaran sebagaimana tertuang dalam kurikulum SMK Bina Putera Nusantara.
Semoga modul ini dapat memberi motivasi baru kepada peserta didik untuk
belajar dengan lebih baik. Penulis menyadari bahwa penulisan modul ini masih jauh
dari sempurna. Oleh karena itu kami mengharapkan kritik dan saran yang sifatnya
membangun demi perbaikan modul ini di masa yang akan datang.
Tasikmalaya, Agustus 2010
Penyusun
-
3
Mikrobiologi adalah sebuah cabang dari ilmu biologi yang
mempelajari organisme yang terlalu kecil untuk dapat dilihat dengan jelas
menggunakan mata telanjang; kajian ini mencakup bakteri, archaea, protozoa, algae
mikroskopik, dan fungi. Beberapa mikroba (seperti algae dan jamur) cukup besar
untuk dapat dilihat dengan mata telanjang, namun kedua organisme masih
dimasukkan dalam kajian mikrobiologi, hal ini karena teknik yang digunakan untuk
mengkajinya (seperti isolasi, sterilisasi, kultivasi dalam media artifisial) sama seperti
anggota mikroorganisme lainnya. Virus sering juga dimasukkan walaupun
sebenarnya tidak sepenuhnya dapat dianggap sebagai makhluk hidup.
Mikrobiologi adalah ilmu yang mempelajari mikroba. Mikrobiologi adalah
salah satu cabang ilmu dari biologi, dan memerlukan ilmu pendukung kimia, fisika,
dan biokimia. Mikrobiologi sering disebut ilmu praktek dari biokimia. Dalam
mikrobiologi dasar diberikan pengertian dasar tentang sejarah penemuan mikroba,
macam-macam mikroba di alam, struktur sel mikroba dan fungsinya, metabolisme
mikroba secara umum, pertumbuhan mikroba dan faktor lingkungan, mikrobiologi
terapan di bidang lingkungan dan pertanian. Mikrobiologi lanjut telah berkembang
menjadi bermacammacam ilmu yaitu virologi, bakteriologi, mikologi, mikrobiologi
pangan, mikrobiologi tanah, mikrobiologi industri, dan sebagainya yang mempelajari
mikroba spesifik secara lebih rinci atau menurut kemanfaatannya.
Whittaker membagi jasad hidup menjadi tiga tingkat perkembangan, yaitu:
(1)Jasad prokariotik yaitu bakteri dan ganggang biru (Divisio Monera), (2) Jasad
eukariotikuniseluler yaitu algae sel tunggal, khamir dan protozoa (Divisio Protista),
dan (3) Jasadeukariotik multiseluler dan multinukleat yaitu Divisio Fungi, Divisio
Plantae, dan DivisioAnimalia. Sedangkan Woese menggolongkan jasad hidup
Definisi & Sejarah Mikrobiologi
-
4
terutama berdasarkansusunan kimia makromolekul yang terdapat di dalam sel.
Pembagiannya yaitu terdiri Arkhaebacteria, Eukaryota (Protozoa, Fungi, Tumbuhan
dan Binatang), dan Eubacteria.
Ciri Umum Mikroba
Mikroba di alam secara umum berperanan sebagai produsen, konsumen, maupun redusen. Jasad produsen menghasilkan bahan organik dari bahan anorganik dengan energi sinar matahari. Mikroba yang berperanan sebagai produsen adalah algae dan bakteri fotosintetik. Jasad konsumen menggunakan bahan organik yang dihasilkan oleh produsen. Contoh mikroba konsumen adalah protozoa. Jasad redusen menguraikan bahan organik dan sisa-sisa jasad hidup yang mati menjadi unsur-unsur kimia (mineralisasi bahan organik), sehingga di alam terjadi siklus unsur-unsur kimia. Contoh mikroba redusen adalah bakteri dan jamur (fungi).
Sel mikroba yang ukurannya sangat kecil ini merupakan satuan struktur biologi. Banyak mikroba yang terdiri dari satu sel saja (uniseluler), sehingga semua tugas kehidupannya dibebankan pada sel itu. Mikroba ada yang mempunyai banyak sel (multiseluler). Pada jasad multiseluler umumnya sudah terdapat pembagian tugas diantara sel atau kelompok selnya, walaupun organisasi selnya belum sempurna.
Setelah ditemukan mikroskop elektron, dapat dilihat struktur halus di dalam sel hidup, sehingga diketahui menurut perkembangan selnya terdapat dua tipe jasad, yaitu:
1. Prokariota (jasad prokariotik/ primitif), yaitu jasad yang perkembangan selnya belum sempurna.
2. Eukariota (jasad eukariotik), yaitu jasad yang perkembangan selnya telah sempurna.
Selain yang bersifat seluler, ada mikroba yang bersifat nonseluler, yaitu virus. Virus adalah jasad hidup yang bersifat parasit obligat, berukuran super kecil atau submikroskopik. Virus hanya dapat dilihat dengan mikroskop elektron. Struktur virus terutama terdiri dari bahan genetik. Virus bukan berbentuk sel dan tidak dapat membentuk energi sendiri serta tidak dapat berbiak tanpa menggunakan jasad hidup lain.
Sejarah Mikrobiologi 1626-1697 Francesco Redi, membantah konsep generasi spontan dengan menunjukkan
bahwa belatung pada daging busuk berasal dari telur lalat yang meletakkan
telur pada daging tersebut, bukan dari daging itu sendiri
1713-1781 John Needham, mendukung teori generasi spontan dengan menunjukkan
bahwa kaldu yang dipanaskan dalam labu dan kemudian ditutup masih
dapat memunculkan mikroorganisme.
-
5
1729-1799 Lazzaro Spallanzani, menunjukkan bahwa labu yang ditutup dan kemudian
dididihkan tidak ada mikroorganisme yang tumbuh, dan menyatakan bahwa
udara yang masuk ke labu medium membawa benih, dan udara mungkin
diperlukan untuk mendukung pertumbuhan organisme yang sudah ada di
medium.
1822-1895 Louis Pasteur, menjebak organisme yang terbawa udara dalam kapas, dia
juga memanaskan leher labu angsa, mensteril meida, membiarkan labu
terbuka; hasil percobaan menunjukkan tidak ada pertumbuhan organisme
sebab partikel debu yang membawa organisme tidak mencapai medium;
namun debu terjebak dalam leher labu; jika leher labu dipecah, debu akan
mencapai medium dan organisme akan tumbuh; dengan cara ini, Pasteur
telah mematahkan teori generasi spontan
1820-1893 John Tyndall, menunjukkan bahwa debu membawa mikroba dan jika debu
tidak ada, medium tetap steril, bahkan jika medium terkena udara. Tydall
juga memberikan bukti keberadaan bakteri yang resisten panas.
1773-1856 Agostino Bassi , menunjukkan bahwa penyakit ulat sutra disebabkan jamur
1845 M. J. Berkeley, menunjukkan bahwa penyakit kentang (the Great Potato
Blight) Irlandian disebabkan oleh jamur
1822-1895 Louis Pasteur, menunjukkan bahwa penyakit (pine) ulat sutra disebabkan
oleh parasit protozoa
1872-1912 Joseph Lister, menunjukkan suatu sistem pembedahan yang dirancang
untuk mencegah mikroorganisme menginfeksi luka bedah, sehingga pasien
jauh lebih sedikit yang terinfeksi pascaoperasi; Lister memberikan bukti
tidak langsung bahwa mikroorganisme adalah agen penyebab penyakit
manusia
1843-1910 Robert Koch, yang menggunakan kritetia yang dikembangkan oleh
gurunya, Jacob Henle (1809-1895), dapat menjelaskan hubungan
antara Bacillus anthracis and anthrax; kriterianya dikenal sebagai postulat
Koch dan masih digunakan untuk menjelaskan hubungan antara
mikroorganisme tertentu dengan penyakit tertentu.
Robert Koch dan kawan-kawan mengembangkan teknik, reagen, dan
materi lain untuk mengkultur patogen bakteri pada media padat
pertumbuhan, dengan demikian mikrobiologis dapat mengisolasi mikroba
untuk mendapatkan kultur murni (tunggal).
Postulat Koch:
o Mikroorganisme harus ada di setiap kasus penyakit tetapi tidak ada pada
individu sehat.
o Mikroorganisme yang dicurigai (suspected) harus dapat diisolasi dan
ditumbuhkan dalam kultur murni.
o Penyakit yang sama harus timbul jika mikroorganisme hasil isolasi
diinokulasi tersebut pada individu sehat.
o Mikroorganisme yang sama harus ditemukan lagi dari individu yang sakit
tersebut
-
6
1851-1908 Charles Chamberland, membuat filter (saringan) bakteri untuk menapis
bakteri dan mikroba yang lebih besar dari spesimen; melalui teknik ini juga
memungkinkan ditemukannya virus sebagai agen penyebab penyakit.
1798 Edward Jenner , menggunakan prosedur vaksinasi untuk melindungi
individu dari penyakit cacar (smallpox)
1822-1895 Louis Pasteur, mengembangkan vaksin lain untuk penyakit kolera ayam,
antraks, dan rabies
1854-1917 Emil von Behring dan Shibasaburo Kitasato (1852-1931), menginduksi
pembentuk antitoksin toksin diptera pada kelinci; antitoksin digunakan
secara efektif untuk mengobati manusia dan memberikan bukti imunitas
humoral
1845-1916 Elie Metchnikoff, menunjukkan keberadaan sel fagositik dalam darah, yang
menunjukkan imunitas dimediasi sel
1856-1953 Sergei Winogradsky, yang bekerja dengan bakteri tanah menemukan
bahwa bakteri tanah dapat oksidasi besi, belerang, dan amonia untuk
mendapatkan energi; Winogradsky juga mengkaji fiksasi nitrogen anaerobik
dan dekomposisi selulosa
1851-1931 Martinus Beijerinck, mengisolasi bakteri pengikat nitrogen aerobik, suatu
bakteri bintil akar yang mampu menambat nitrogen, and bakteri pereduksi
sulfat. Beijerinck and Winogradsky memperkenalkan pertama kali
penggunaan kultur yang diperkaya dan media selektif.
-
7
Bakteri Bakteri merupakan organisme yang paling banyak jumlahnya dan lebih tersebar luas
dibandingkan mahluk hidup yang lain . Bakteri memiliki ratusan ribu spesies yang
hidup di darat hingga lautan dan pada tempat-tempat yang ekstrim.
Bakteri ada yang menguntungkan tetapi ada pula yang merugikan. Bakteri memiliki
ciri-ciri yang membedakannya dengan mahluk hidup yang lain. Bakteri adalah
organisme uniselluler dan prokariot serta umumnya tidak memiliki klorofil dan
berukuran renik (mikroskopis).
Ciri-ciri Bakteri:
1. Organisme uniselluler
2. Prokariot (tidak memiliki membran inti sel )
3. Umumnya tidak memiliki klorofil
4. Memiliki ukuran tubuh yang bervariasi antara 0,12 s/d ratusan mikron umumnya
memiliki ukuran rata-rata 1 s/d 5 mikron.
5. Memiliki bentuk tubuh yang beraneka ragam
6. Hidup bebas atau parasit
7. Yang hidup di lingkungan ekstrim seperti pada mata air panas,kawah atau gambut
dinding selnya tidak mengandung peptidoglikan
8. Yang hidupnya kosmopolit diberbagai lingkungan dinding selnya mengandung
peptidoglikan
Bentuk Bakteri
Bentuk dasar bakteri terdiri atas bentuk bulat (kokus), batang (basil),dan spiral
(spirilia) serta terdapat bentuk antara kokus dan basil yang disebut kokobasil.
Berbagai macam bentuk bakteri :
1. Bakteri Kokus :
Anggota Dunia Mikroba
-
8
a. Monokokus/ mikrokokus, yaitu berupa sel bakteri kokus tunggal
b. Diplokokus, yaitu dua sel bakteri kokus berdempetan
c. Tetrakokus yaitu empat sel bakteri kokus berdempetan berbentuk segi
empat sebagai hasil pembelahan sel ke dua arah.
d. Sarkina/ sarsina yaitu delapan sel bakteri kokus berdempetan
membentuk kubus hasil pembelahan sel ke tiga arah
e. Streptokokus yaitu lebih dari empat sel bakteri kokus berdempetan
membentuk rantai sebagai hasil pembelahan sel ke satu atau dua arah
dalam satu garis.
f. Stafilokokus yaitu lebih dari empat sel bakteri kokus berdempetan
seperti buah anggur
2. Bakteri Basil :
-
9
a. Monobasilus, yaitu berupa sel bakteri basil/ batang tunggal
b. Diplobasilus, yaitu berupa dua sel bakteri basil/ batang berdempetan
c. Streptobasilus, yaitu beberapa sel bakteri basil berdempetan membentuk
rantai
3. Bakteri Spirilia atau lengkung:
a. Spiral/ spirillium yaitu bentuk sel bergelombang, spiralnya tebal dan kaku
b. Spiroseta / spirochaeta yaitu bentuk sel seperti sekrup, spiralnya halus dan
lentur
c. Vibrio yaitu bentuk sel seperti tanda baca koma
Archaea Archaea atau arkea dikenal juga sebagai arkeabakteria, merupakan
organisme uniseluler yang tidak mempunyai nucleus (inti selnya tidak memiliki
membran inti) sehingga digolongkan sebagai prokariot.
Dulu arkea digolongkan sebagai kelompok bakteri yang tidak biasa dan
dinamakan arkeabakteria, tapi karena ternyata arkea mempunyai system biokimiawi
yang berbeda dengan bakteri, maka arkea diklasifikasikan sebagai domain yang
berbeda.
Arkea dan bakteri mempunyai kesamaan dalam hal ukuran dan bentuk,
walaupun beberapa jenis arkea mempunyai bentuk yang sangat tidak biasa, seperti
bentuk rata dan kotak (seperti Haloquadra walsbyi.). arkea bereproduksi secara
aseksual dan melakukan pembelahan biner, fragmentasi atau pertunasan (budding),
tapi berbeda dengan bakteri dan eukariot lain, arkea tidak membentuk spora
-
10
Awalnya arkea ditemukan di lingkungan yang ekstrem, seperti di sumber air
panas dan danau air asin, tapi sekarang sudah banyak dijumpai di berbagai habitat
seperti lumpur, laut dan rawa-rawa. Belum ditemukan adanya arkea yang bersifat
pathogen atau parasite, biasanya arkea bersimbiosis secara mutualisme atau
komensalisme dengan organisme lain.
Protozoa
Istilah protozoa berasal dari bahasa Yunani, yaitu protos artinya pertama dan
zoon artinya hewan. Jadi,Protozoa adalah hewan pertama. Protozoa merupakan
kelompok lain protista eukariotik. Kadang-kadang antara algae dan protozoa kurang
jelas perbedaannya. Kebanyakan Protozoa hanya dapat dilihat di bawah mikroskop.
Beberapa organisme mempunyai sifat antara algae dan protozoa.
Protozoa dibedakan dari prokariot karena ukurannya yang lebih besar, dan
selnya eukariotik. Protozoa dibedakan dari algae karena tidak berklorofil, dibedakan
dari jamur karena dapat bergerak aktif dan tidak berdinding sel, serta dibedakan
dari jamur lendir karena tidak dapat membentuk badan buah.
Kelas Utama Protozoa:
Kelompok
Utama (Nama
Utama)
Cara Gerak
Cara
Berkembang
Biak
Ciri-ciri Lain
Mastighophora
(Flagelata)
Flagela (satu atau
lebih)
Pembelahan biner
membujur, pada
beberapa
kelompok ada
reproduksi seksual
Nutrisinya
fototropik,
heterotropik atau
keduanya
Sarcodina
(Amoeba) Pseudopodia
Pembelahan biner,
tak ada reproduksi
seksual
Kebanyakan
spesies hidup
bebas,
heterotropik
Ciliata (siliata) Silia (banyak)
Pembelahan biner
melintang,
reproduksi seksual
dengan konjugasi
Kebanyakan
spesies hidup
bebas,
heterotropik
-
11
Sporozoa
(sporozoa)
Gerak dengan
meluncur atau
tidak bergerak
Pembelahan
bahurangkap,
mungkin ada mikro
gamet berflagela
pada reproduksi
seksual
Semua spesies
parasit
Algae Mikroskopik
Algae adalah organisme eukariotik fotosintetik aerobic. Ukuran algae sangat
beragam, dari beberapa micrometer hingga beberapa meter. Organisme ini
mengandung klorofil serta pigmen-pigmen lain untuk melangsungkan
fotosintesis. Kebanyakan algae berukuran mikroskopis atau disebut sebagai
algae mikroskopis. Dan ilmu yang mempelajarinya disebut fikologi.
Algae biasanya terdapat sebagai sel tunggal yang berbentuk bola, batang,
gada atau kumparan. Ada yang dapat bergerak (dengan flagella) dan ada yang
tidak, bereproduksi secara asekaual dan seksual. Untuk yang berukuran makro,
ada yang multiseluler.
Di dunia mikrobia, algae termasuk eukariotik, umumnya bersifat fotosintetik dengan pigmen fotosintetik hijau (klorofil), coklat (fikosantin), biru kehijauan (fikobilin), dan merah (fikoeritrin). Morfologi algae ada yang berbentuk uniseluler, ada pula yang multiseluler tetapi belum ada pembagian tugas pada sel-sel komponennya. Algae dibedakan dari tumbuhan hanya karena hal tersebut.
Khamir
Pada umumnya, sel khamir lebih besar daripada kebanyakan bakteri, tapi
khamir yang paling kecil tidak sebesar bakteri paling besar. Ukurannya berkisar
antara 1-5 mikron (lebar) dan 5-30 mikron (panjang). Biasanya berbentuk bulat
telur tapi beberapa ada yang memanjang atau berbentuk bola. Khamir tidak
dilengkapi flagella atau alat gerak lainnya.
Pada dasarnya, tubuhnya hanya terdiri dari dua bagian, yaitu
miselium dan spora (sel resisten, istirahat atau dorman). Miselium merupakan
kumpulan beberapa filament yan g dinamakan hifa. Setiap hifa lebarnya 5-10
mikron (sel bakteri biasanya berdiameter 1 mikron). Ada tiga macam morfologi
hifa, yaitu aseptat, septat uninukleat dan septat multinukleat.
-
12
Khamir atau disebut yeast, merupakan jamur bersel satu yang mikroskopik,tidak berflagela. Beberapa genera membentuk filamen (pseudomiselium). Carahidupnya sebagai saprofit dan parasit. Hidup di dalam tanah atau debu di udara, tanah,daun-daun, nektar bunga, permukaan buah-buahan, di tubuh serangga, dan cairan yangmengandung gula seperti sirup, madu dan lain-lain.Khamir berbentuk bulat (speroid), elips, batang atau silindris, seperti buahjeruk, sosis, dan lain-lain. Bentuknya yang tetap dapat digunakan untuk identifikasi.Khamir dapat dimasukkan ke dalam klas Ascomycetes, Basidiomycetes danDeuteromycetes.
Gambar sel Khamir:
-
13
Pengertian dan Fungsi
Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari
campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk
pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-
molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media
pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga
memanipulasi komposisi media pertumbuhannya.
Bahan-bahan media pertumbuhan
1. Bahan dasar
air (H2O) sebagai pelarut
agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media. Agar sulit
didegradasi oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu 45 oC.
gelatin juga memiliki fungsi yang sama seperti agar. Gelatin adalah polimer
asam amino yang diproduksi dari kolagen. Kekurangannnya adalah lebih
banyak jenis mikroba yang mampu menguraikannya dibanding agar.
Silicagel, yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. Fungsinya juga
sebagai pemadat media. Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan
media bagi mikroorganisme autotrof obligat.
2. Nutrisi atau zat makanan
Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk metabolisme sel
yaitu berupa unsur makro seperti C, H, O, N, P; unsur mikro seperti Fe, Mg dan
unsur pelikan/trace element.
Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa organik
atau anorganik esuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof memerlukan
sumber karbon organik antara lain dari karbohidrat, lemak, protein dan asam
organik.
Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa bernitrogen
lain. Sejumlah mikroba dapat menggunakan sumber N anorganik seperti
urea.
Vitamin-vitamin.
Bab 1 Media Pertumbuhan
-
14
3. Bahan tambahan
Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium dengan
tujuan tertentu, misalnya phenolred (indikator asam basa) ditambahkan untuk
indikator perubahan pH akibat produksi asam organik hasil metabolisme.
Antibiotik ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan mikroba non-
target/kontaminan.
4. Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media
Agar, agar dapat diperoleh dalam bentuk batangan, granula atau bubuk dan
terbuat dari beberapa jenis rumput laut. Kegunaannya adalah sebagai
pemadat (gelling) yang pertama kali digunakan oleh Fraw & Walther Hesse
untuk membuat media. Jika dicampur dengan air dingin, agar tidak akan
larut. Untuk melarutkannya harus diasuk dan dipanasi, pencairan dan
pemadatan berkali-kali atau sterilisasi yang terlalu lama dapat menurunkan
kekuatan agar, terutama pada pH yang asam
Peptone, peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti
otot, liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai.
Komposisinya tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara
memperolehnya.
Meatextract. Meatextract mengandung basa organik terbuat dari otak,
limpa, plasenta dan daging sapi.
Yeastextract. Yeastextract terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat
alcohol. Yeast extract mengandung asam amino yang lengkap & vitamin (B
complex).
Karbohidrat. Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan
asam amino dan gas dari karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya
digunkan dalam amilum, glukosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa, manitol, dll.
Konsentrasi yang ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah 0,5-1%.
Macam-Macam Media Pertumbuhan
1. Medium berdasarkan sifat fisik
Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah
dingin media menjadi padat.
Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4%
sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semi
solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke
seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika
tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB
-
15
(NitrogenfreeBromthymolBlue) semisolid akan membentuk cincin hijau
kebiruan di bawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini
dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk
mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media NitrateBroth,
kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi
bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media.
Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB
(NutrientBroth), LB (LactoseBroth).
2. Medium berdasarkan komposisi
Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan
takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.
Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui
secara pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar,
dekstrosa dan ekstrak kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak
dapat mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa penyusunnya.
Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak
dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan
dasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic
Extract.
3. Medium berdasarkan tujuan
Media untuk isolasi
Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan
mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar.
Media selektif/penghambat
Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu
sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan
merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Contohnya adalah Luria
Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E.coli resisten
antibotik dan menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline. Salt broth
yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang
toleran terhadap garam.
Media diperkaya (enrichment)
Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk
pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah,
serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba
tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya
membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi
-
16
membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar,
Serum Agar, dll.
Media untuk peremajaan kultur
Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur
Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik.
Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme
suatu mikroba. Contohnya adalah Kosers Citratemedium, yang digunakan
untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber
karbon.
Media untuk karakterisasi bakteri
Media yang digunakan untuk mengetahui kemempuan spesifik suatu
mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya
perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose Broth, Arginine
Agar.
Media diferensial
Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya
berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial, misalnya
TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria
berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di
sekeliling koloni.
Ciri-ciri beberapa bahan kompleks yang digunakan sebagai bahan pembuat media:
Bahan Mentah Ciri Nilai Nutrisi
Ekstrak daging sapi (beef extract)
Suatau ekstrak cair jaringan daging sapi yang empuk, dikonsentrasikan menjadi pasta
Mengandung karbohidrat, senyawa nitrogen organic, vitamin yang larut dalam air dan berbagai garam
Pepton
Produk yang dihasilkan dari bahan-bahan yang mengandung protein seperti daging, kasein, dan gelatin
Sumber utama nitrogen organic, dapat pula mengandung vitamin dan kadang-kadang karbohidrat, bergantung pada jenis bahan awal.
Agar
Suatu karbohidrat kompleks yang diperoleh dari algae marin tertentu (agar laut), diolah untuk membuang substansi yang tidak dikehendaki
Digunakan sebagai bahan pemadat media, bukan sumber nutrient bagi bakteri
Ekstrak khamir (yeast extract)
Suatu ekstrak cair sel khamir, tersedia juga
Suatu sumber yang sangat kaya dengan vitamin B,
-
17
dalam bentuk bubuk (komersial)
mengandung nitrogen organic dan senyawa-senyawa karbon
Pembuatan Nutrient Agar
1.Timbang komponen medium dengan menggunakan timbangan analitis untuk
volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi berikut:
Beefextract 3 g
Peptone 5 g
Agar 15 g
Akuades s.d 1000 ml
2. Akuades sebanyak 100 ml dibagi menjadi dua satu bagian
untuk melarutkan Beefextract dan peptone dan sebagian lagi
untuk melarutkan agar. Sebaiknya air untuk melarutkan agar
lebih banyak
3. Larutkan agar pada sebagian air tersebut dengan mengaduk secara konstan dan
diberi panas. Dapat menggunakan kompor gas atau hot plate stirrer (jangan sampai
overheat, karena akan terbentuk busa dan memuai sehingga tumpah).
4.Sementara itu sebagian akuades digunakan untuk melarutkan peptone dan beef
extract, cukup dengan pengadukan.
-
18
5. Setelah keduanya larut, larutan dituangkan ke larutan agar dan diaduk sampai
homogen. Kemudian pH media diukur dengan mencelupkan kertas pH indikator. Jika
pH tidak netral maka dapat ditambahkan HCl/NaOH.
6. Setelah itu media dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan disterilisasi dengan
autoklaf.
7. Tuang media steril ke cawan petri steril secara aseptis. Jika diinginkan media tegak
atau miring pada point ke 5, media langsung dituang ke tabung kemudian
disterilisasi.
Pembuatan Nutrient Broth
Komposisi untuk media NB sama dengan NA tetapi tidak memakai agar sebagai
pemadat. Proses pembuatannyapun lebih sederhana, tinggal melarutkan peptone
dan beef extract kemudian ditampung dalam labu Erlenmeyer atau tabung reaksi
dan siap disterilisasi. Proses pembuatan ini tidak memerlukan panas, peptone dan
beef extract akan mudah larut sempurna pada air suhu kamar jika diaduk
Pembuatan Potato Dextrose Agar (PDA)
1. Timbang komponen media dengan menggunakan timbangan analitis untuk
volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi berikut:
Potato/kentang 3 g
Peptone 5 g
Agar 15 g
Akuades s.d 1000 ml
(sebelum ditimbang, sebaiknya kentang dikupas dan diiris kecil-kecil)
2. Rebus kentang dalam sebagian akuades tadi selama 1-3 jam sampai lunak,
kemudian diambil ekstraknya dengan menyaring dan memerasnya
menggunakan kertas saring lalu ditampung di Beakerglass baru.
3. Agar dilarutkan dengan Hot Plate Stirrer dalam 50 ml akuades lalu setelah
larut dapat ditambahkan dekstrosa dan dihomogenkan lagi.
4. Setelah semua larut, ekstrak kentang dan agar-dekstrosa dicampur dan
dihomogenkan. Atur pH media menjadi 5-6 dengan meneteskan HCl/NaOH.
-
19
5. Media dituang ke dalam Erlenmeyer atau ke tabung reaksi kemudian siap
untuk disterilisasi.
2. 3. 4.
-
20
Pengertian
Sterilisasi yaitu proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan atau benda dari semua bentuk kehidupan.
Macam-macam sterilisasi
Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisik dan kimiawi.
1. Sterilisasi secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0.22 mikron atau 0.45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misal nya larutan enzim dan antibiotik.
2. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran.
Pemanasan
a. Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung, contoh alat : jarum inokulum, pinset, batang L, dll.
b. Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira 60-1800C. Sterilisasi panas kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer, tabung reaksi dll.
c. Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air lebih tepat menggungakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi.
d. Uap air panas bertekanan : menggunalkan autoklaf
Penyinaran dengan UV
Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Safety Cabinet dengan disinari lampu UV
3. Sterilisasi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain alkohol.
Bab 2 Sterilisasi
-
21
Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi)
Sterilisasi dengan penyaringan dilakukan untuk mensterilisasi cairan yagn mudah rusak jika terkena panas atu mudah menguap (volatile). Cairan yang disterilisasi dilewatkan ke suatu saringan (ditekan dengan gaya sentrifugasi atau pompa vakum) yang berpori dengan diameter yang cukup kecil untuk menyaring bakteri. Virus tidak akan tersaring dengan metode ini.
Sterilisasi dengan penyaringan dapat dilakukan dengan berbagai cara :
Non-disposable filtration apparatus
- Disedot dengan pompa vakum
- Volume 20-1000 ml
Disposable filter cup unit
- Disedot dengan pompa vakum
- Volume 15-1000 ml
Disposable filtration unit dengan botol penyimpan
- Disedot dengan pompa vakum
- Volume 15-1000 ml
Syringe filters
- Ditekan seperti jarum suntik
- Volume 1-20 ml
Spin filters
- Ditekan dengan gaya setrifugasi
- Volume kurang dari 1 ml
-
22
Cara kerja menggunakan Non-disposable filtration apparatus
Sterilkan saringan (dapat menggunakan saringan Bekerfeld, Chamberland Zeitz), membran penyaring (kertas saring) dan erlenmeyer penampung.
Pasang atau rakit alat-alat tersebut secara aseptis (sesuai gambar), lalu isi corong dengan larutan yang akan disterilkan.
Hubungkan katup erlenmeyer dengan pompa vakum kemudian hidupkan pompa.
setelah semua larutan melewati membran filter dan tertampung dierlenmeyer, maka larutan dapat dipindahkan kedalam gelas penampung lain yang sudah steril dan tutup dengan kapas atau aluminium foil yang steril.
Tyndalisasi
Konsep kerja metode ini merip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air dan tidak tahan tekanan atau suhu tinggi lebih tepat disterilkan dengan metode ini. Misalnya susu yang disterilkan dengan suhu tinggi akan mengalami koagulasi dan bahan yang berpati disterilkan pada suhu bertekanan pada kondisi pH asam akan terhidrolisis.
Cara kerja :
Bahan dimasukkan kedalam erlenmeyer atau botol dan ditutup rapat dengan sumbat atau aluminium foil.
Erlenmeyer/botol lalu dimasukkan kedalam alat sterilisasi (alat standar menggunakan Arnold Steam Sterilizen atau dandang).
Nyalakan sumber panas dan tunggu hingga termometer menunjukkan suhu 1000C kemudian hitung waktu mundur hingga 30 menit (uap panas yang terbentuk akan mematikan mikroba).
Setelah selesai alat sterilisasi dimatikan dan bahan yang steril dikeluarkan.
Setelah 24 jam, bahan tersebut di sterilkan lagi dengan cara yang sama, sedang waktu ini dimaksudkan untuk memberi kesempatan spora atau sel vegetatif yang belum mati untuk tumbuh sehingga mudah dibunuh.
Sterilisasi dengan udara panas (Dry heat sterilization) Sterilisasi dengan metode ini biasanya digunakan untuk peralatan gelas seperti cawan petri, pipet ukur dan labu erlenmyer. Alat gelas yang disterilisasi dengan udara panas tidak akan timbul kondensasi sehingga tidak ada tetes air (embun) didalam alat gelas.
-
23
Bungkus alat-alat gelas dengan kertas payung atau aluminium foil Atur pengatur suhu oven menjadi 1800C dan alat disterilkan selama 2-3 jam.
Prinsip kerja Biological Saferty Cabinet atau Laminar Air Flow
Biological Safety Cabinet merupakan kabinet kerja yang sterilkan untuk kerja mikrobiologi. BSC memiliki suatu pengatur aliran udara yang menciptakan aliran udara kotor (dimungkinkan ada kontaminan) untuk disaring dan diresirkulasi melalui filter.
BSC juga disebut biosafety hood, dan juga dikenal dengan Laminar flowhood atau Class II vertical flow cabinet yang menyediakan alat filtrasi dan aliran udara yang bersirkulasi didalam ruang kerja. Aliran udara diatur untuk menghambat udara luar masuk dan udara di dalam keluar, untuk mencegah kontaminasi dari luar dan pencemaran bakteri dari ruang BSC. Udara yang keluar disaring melewati penyaring sehingga sel-sel yang berbahaya tidak lepas keluar ke ruangan lain.
Berbagai kelas Biological Safety Cabinet.
TEKNIK KERJA ASEPTIS (TANPA KONTAMINASI)
Tehnik aseptis atau steril adalah suatu sistem cara bekerja (praktek) yang menjaga
sterilitas ketika menangani pengkulturan mikroorganisme untuk mencegah kontaminasi
terhadap kultur mikroorganisme yang diinginkan.
Dasar digunakannya tehnik aseptik adalah adanya banyak partikel debu yang
mengandung mikroorganisme (bakteri atau spora) yang mungkin dapat masuk ke dalam
cawan, mulut erlenmeyer, atau mengendap di area kerja. Pertumbuhan mikroba yang tidak
diinginkan ini dapat mempengaruhi atau mengganggu hasil dari suatu percobaan.
-
24
Mikroorganisme dapat juga jatuh dari tangan operator, sarung tangan atau jas
laboratorium karena pergerakan lengan yang relatif cepat. Penggunaan tehnik aseptik
meminimalisir material yang digunakan terhadap agen pengontaminasi. Pada kenyataanya
tehnik aspetis tidak dapat melindungi secara sempurna dari bahaya kontaminan. Namun
semakin banyak belajar dari pengalaman maka semakin mengurangi resiko yang
ditimbulkan.
Tehnik aseptis digunakan pada saat :
- Teknik aseptis seharusnya digunakan saat kita bekerja dengan mikroorganisme hidup dan
dengan segala media pertumbuhannya.
- Teknik aseptis sebaiknya digunakan ketika kita tidak ingin larutan dari suatu botol tidak
berubah sifat akibat aktivitas mikroorganisme, seperti saat membuat buffer meskipun
buffer dengan konsentrasi garam tinggi atau mengandung deterjen.
- Teknik aseptis disarankan pada saat kita bekerja menggunakan agen atau senyawa yang
berbahaya seperti bahan kimia beracun atau bahan radioaktif. Tentu saja perlindungan diri
sendiri dari bahaya senyawa ini lebih penting.
Beberapa contoh :
- Mentransfer biakan dari media satu ke media lainnya. Bakteri kontaminan yang tumbuh
tentu saja dapat mengganggu kemurnian biakan dan mungkin saja membuat rancu hasil
yang didapatkan.
- Memfilter media atau serum dan menghitung jumlah bakteri dengan cara filtrasi.
Kontaminasi yang ikut tersaring dapat tumbuh pada media baru yang membuat tidak
terpakainya media pertumbuhan tersebut atau mempengaruhi jumlah total bakteri.
- Membuka dan merehidrasi bakteri terliofolisasi. Teknik aseptis dapat menjaga sel yang
terrehidrasi dari bakteri kontaminan dan menjaga tidak keluarnya sel ke meja kerja.
- Melakukan reaksi restriksi atau PCR. Walaupun enzim restriksi pada umumnya disimpan
dalam gliserol 50% (bakteriostatik) tapi enzim yang diencerkan akan lebih rentan rusak
akibat aktivitas mikroorganisme atau dihambat oleh ion atau unsur tertentu. Kontaminasi
DNA asing yang masuk ke dalam tube PCR mungkin dapat teramplifikasi sehingga hasil yang
didapat membingungkan.
- Melabeli sel dengan (32P) fosfat. Pada kasus ini kerja aseptis ditujukan untuk melindungi
operator dari bahan kimia berbahaya. Jika menggunakan teknik aseptis maka Anda tidak
akan membiarkan tutup bahan radioaktif terbuka atau secara tidak sengaja menggunakan
pipet bekas bahan radioaktif.
Aturan umum tehnik aseptis:
- Meja kerja sebaiknya jauh dari sesuatu yang dapat menciptakan aliran udara, misalnya
tidak ada jendela yang terbuka, tidak dekat dengan pintu yang selalu dibuka-tutup dan jauh
dari lalu-lintas orang. Penggunaan kabinet biosafety dapat menjaga dan mengatur aliran
udara tetapi ini bukan merupakan suatu jaminan mutlak dari resiko terkontaminasi.
- Pastikan meja kerja bersih dari kotoran dan benda-benda yang tidak akan digunakan.
Kultur tua atau pipet bekas seharusnya tidak berada di meja kerja. Kotoran seringkali sulit
dibersihkan pada sudut-sudut ruang.
- Usap meja kerja dengan antiseptik atau senyawa pembersih lain sebelum digunakan. Di
-
25
sebagian besar laboratorium umumnya menggunakan etanol 70% untuk membersihkannya.
Sediakan etanol pada posisi selalu dekat dengan meja. Jika telah selesai bekerja, sebaiknya
meja kerja dikosongkan dari peralatan dan bersihkan lagi.
- Semua peralatan (pipet, cawan dll.) yang digunakan harus steril. Sebaiknya semua
peralatan yang telah disterilisasi diberi label. Jika menemukan alat yang sepertinya telah
disterilisai tapi masih ragu terhadap sterilitasnya maka sebaiknya jangan digunakan.
Bungkus peralatan baik alat steril sekali pakai atau bukan (pipet, syringe dll.)diperiksa
terlebih dahulu apakah terdapat kebocoran atau tersobek.
- Atur peralatan di meja kerja sedemikian rupa sehingga meminimalisir pergerakan
tangan. Alat-alat yang biasanya digunakan dengan tangan kanan (jarum inokulum, filler,
pipet dll.) letakkan disebelah kanan begitu juga sebaliknya (rak tabung, cawan petri,
erlenmeyer dll.) terkecuali untuk tangan kidal. Di bagian tengah meja kerja disediakan ruang
lapang untuk bekerja.
- Membakar mulut atau bagian tepi dari suatu alat dapat membunuh mikroorganisme yang
menempel.
- Telah siap dengan segala peralatan dan bahan yang dibutuhkan. Semua bahan dan alat
untuk prosedur tertentu telah dipersiapkan di meja kerja. Jangan sampai meninggalkan
meja kerja untuk mengambil sesuatu yang terlupa atau tertinggal. Perhitungkan semua yang
diperlukan beserta cadangannya.
- Pakai sarung tangan lateks dan ganti secara berkala. Sarung tangan membantu melindungi
dari tumpahan biakan atau bahan kimia berbahaya. Tidak menggunakan sarung tangan
dirasa tidak bermasalah jika materi dan bakteri yang diteliti dipastikan tidak berbahaya.
- Cuci tangan sebelum dan sesudah bekerja. Cuci tangan dengan desinfektan atau sabun
bila tidak ada desinfektan. Cuci tangan dapat membilas mikroorganisme yang ada di tangan.
Saran-saran tehnik aseptis:
- Minimalisasi gerak : pergerakan tangan dapat menciptakan aliran udara . semakin cepat
pergerakannya semakin cepat aliran udara yang ditimbulkan. Pergerakan lengan sebaiknya
dilakukan seperlu mungin dan bergerak secara lembut.
- Minimalisasi jarak: jarak antar peralatan diatur seefektif dan seefisien mungkn. Antar
peralatan jangan diletakkan terlalu jauh.
- Minimalisasi keterpaparan : semakin sering menggerakkan sesuatu (mis: cawan berisi
media) melewati udara maka semakin besar partikel udara untuk masuk. Semakin lama
tutup erlenmeyer terbuka juga semakin besar terkontaminasi.
Catatan penting dalam kerja aspetis :
- Tutup erlenmeyer, botol atau cawan sebaiknya dibuka kira-kira 450. tujuannya untuk
meminimalisasi udara masuk namun masih dapat mentransfer sesuatu.
- Jika diharuskan untuk membuka penuh dan tutup diletakkan di meja kerja, maka tutup
dapat diletakkan tertelungkup atau terlentang (muka menghadap ke atas). Jika tertelungkup
pastikan permukaannya bersih dan bila terlentang pastikan juga tidak ada gerakan di
atasnya.
- Untuk menghindari bakteri yang menempel pada jarum inokulum terpental/terciprat maka
diameter loops harus berkisar 2-3 mm dan untuk memperkecil getaran panjang kawat tidak
-
26
lebih dari 6cm.
- Tidak boleh menyedot cairan pada saat pippeting dengan mulut.
- Untuk menghindari penyebaran mikroba dari tetesan pipet yang terjatuh maka dapat
digunakan kain steril yang diberi desinfektan sebagai alas. Kain ini setelah selesai dibuang
sebagai limbah berbahaya.
UJI STERILITAS
Uji sterilitas dilakukan untuk mengetahui apakah bahan atau sediaan yang harus steril
sudah memenuhi syarat atau tidak. Uji sterilitas dilakukan secara mikrobiologi dengan
menggunakan medium pertumbuhan tertentu. Media untuk pengujian diperlukan dalam
uji ini. Beberapa media yang dapat digunakan dalam pengujian ini adalah :
1. Media Tioglikolat Cair
Komposisi :
L-sistin P 0,5 g
NaCl P 2,5 g
Glukosa P 5,5 g
Agar P Granul 0,75 g
Ekstrak ragi P 5,0 g
Digesti pancreas kasein P 15,0 g
Natrium tioglikolat atau P 0,5 g
Asam tioglikolat P 0,3 ml
Larutan natrium resazurin P 1,0 ml
Air 1000 ml
pH setelah sterilisasi 7,1 0,2
Campur dan panaskan hingga larut. Atur pH larutan hingga setelah sterilisasi 7,1 0,2
menggunakan NaOH 1 N. jika perlu saring selagi panas menggunakan kertas saring.
Tempatkan media dalam tabung yang sesuai, yang memberikan perbandingan
permukaan dengan kedalaman media sedemikian rupa sehingga tidak lebih dari
setengah bagian atas media yang mengalami perubahan warna sebagai indikasi
masuknya oksigen pada akhir masa inkubasi. Sterilisasi dalam autoklaf. Jika lebih dari
sepertiga bagian atas terjadi perubahan warna merah muda, media dapat diperbaiki
satu kali dengan pemanasan di atas tangas air atau dalam uap yang mengalir bebas
hingga warna merah muda hilang. Media siap digunakan jika tidak lebih dari
sepersepuluh bagian atas media berwarna merah muda.
2. Media Tioglikolat Alternatif
Komposisi :
L-sistin P 0,5 g
NaCl P 2,5 g
Glukosa P 5,5 g
Ekstrak ragi P 5,0 g
Digesti pancreas kasein P 15,0 g
Natrium tioglikolat atau P 0,5 ml
Asam tioglikolat P 0,3 ml
Air 1000 ml
pH setelah sterilisasi 7,1 0,2
Soybean-Casein Digest Medium
-
27
Komposisi :
Digesti pancreas kasein P 17 ,0 g
Digesti papaik tepung kedele 3,0 g
NaCl P 5,0 g
Kalium fosfat dibasa P 2,5 g
Glukosa P 2,5 g
Air 1000 ml
pH setelah sterilisasi 7,3 0,2
Tabel Jumlah Untuk Bahan Cair
Isi Wadah (ml)
Volume
minimum
(ml)
Vol. minimum untuk media Jumlah Wadah
Permedia Untuk inokulasi
langsung Untuk membran
< 1 < 10
10 50
50
-
28
ultraviolet atau pemaparan non lethal terhadap panas, tidak adanya stimulasi yang
seringkali perlu untuk membuat spora bervegetasi, dan kontak sebelumnya dengan
suatu zat bakteriostatik adalah beberapa efek yang biasa mengganggu pertumbuhan
organisme tersebut. Dalam hal seperti itu akan diperoleh hasil negative palsu.
Prosedur sterilisasi merupakan tahap penting dalam mencapai produk steril, namun
semua prosedur dan kondisi-kondisi lain yang dibutuhkan untuk pembuatan produk
tersebut harus dirancang untuk membantu tahap ini. Pembersihan ruangan yang baik,
lingkungan yang terkontrol dengan efektif, suatu muatan dari produk yang dapat
dikontrol dan diidentifikasi, proses produksi yang direncanakan dan dikontrol dengan
baik, serta personel yang ditatar dengan baik dan berdedikasi tinggi untuk produksi
dan pengujian sangat penting untuk produksi suatu produk steril. Hanya bila semua
factor ini melengkapi penemuan-penemuan dari uji sterilisasi, dapatlah disimpulkan
dengan penuh kepercayaan bahwa produk tersebut steril.
-
29
Pengertian
Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari
campuran berbagai macam sel. Di dalam laboratorium populasi bakteri inidapat
diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari
morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya.
Teknik Pengambilan Sampel
Sebelum melakukan isolasi terlebih dahulu dilakukan pengambilan sampel. Berikut
merupakan prosedur pengambilan sampel.
1. Sampel tanah
Jika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam tanah, maka
cara pengambilannya disesuaikan dengan tujuan dan kebutuhan. Misal jika yang
diinginkan mikroorganisma rhizosfer maka sampel diambil dari sekitar
perakaran dekat permukaan hingga ujung perakaran..
2. Sampel air
Pengambilan sampel air bergantung kepada keadaan air itu sendiri. Jika
beerasal dari air sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan
bibir botol melawan arus air. Bila pengambilan sampel dilakukan pada air yang
tenang, botol dapat dicelupkan dengan tali, jika ingin mengambil sampel dari air
keran maka sebelumya keran dialirkan dulu beberapa saat dan mulut kran
dibakar.
Bab 3 Isolasi & Inokulasi Mikroorganisme
-
30
Isolasi Dengan Cara Pengenceran (Dilution)
1. Teknik Preparasi Suspensi
Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril. Tujuan
dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari
substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Macam-macam
preparsi bergantung kepada bentuk sampel :
a. Swab (ulas), dilakukan menggunakan cotton bud steril pada sampel
yang memiliki permukaan luas dan pada umumnya sulit dipindahkan
atau sesuatu pada benda tersebut. Contohnya adalah meja, batu,
batang kayu dll. Caranya dengan mengusapkan cotton bud memutar
sehingga seluruh permukaan kapas dari cotton bud kontak dengan
permukaan sampel. Swab akan lebih baik jika cotton bud dicelupkan terlebih dahulu
ke dalam larutan atraktan semisal pepton water.
b. Rinse (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel
pada permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran kecil, misalnya daun
bunga dll. Rinse merupakan prosedur kerja dengan mencelupkan sampel ke
dalam akuades dengan perbandingan 1 : 9 (w/v). Contohnya sampel daun
diambil dan ditimbang 5 g kemudian dibilas dengan akuades 45 ml yang
terdapat dalam beakerglass.
c. Maseration (pengancuran), sampel yang berbentuk padat dapat
ditumbuk dengan mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada
dipermukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke dalam
air. Contoh sampelnya antar alain bakso, biji, buah dll. Perbandingan antar
berat sampel dengan pengenceran pertama adalah 1 : 9 (w/v). Unutk
sampel dari tanh tak perlu dimaserasi
2. Teknik Pengenceran Bertingkat
-
31
Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah
mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat
pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel.
Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan
selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel
mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya.
Cara Kerja :
a. Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung pengenceran
pertama (1/10 atau 10-1) secara aseptis (dari preparasi suspensi). Perbandingan
berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1 : 9 dan ingat akuades yang
digunakan jika memakai teknik rinse dan swab sudah termasuk pengencer 10-1.
Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya (pengocokan yang
benar dapat dilihat pada gambar disamping)
b. Diambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke tabung
10-2 secara aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan tabung ke telapak
tangan sampai homogen. Pemindahan dilanjutkan hingga tabung pengenceran
terakhir dengan cara yang sama, hal yang perlu diingat bahwa pipet ukur yang
digunakan harus selalu diganti, artinya setiap tingkat pengenceran digunakan pipet
ukur steril yang berbeda/baru. Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu diganti jika
memindahkan cairan dari sumber yang sama.
3. Teknik Penanaman
a. Teknik penanaman dari suspensi
Teknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan
suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan
isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran
terakhir.
a.1. Spread Plate (agar tabur ulas)
Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di
permukaan agar diperoleh kultur murni. Adapun prosedur kerja yang dapat
dilakukan adalah sebagai berikut :
-
32
Ambil suspensi cairan senamyak 0,1 ml dengan pipet ukur kemudian
teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat.
Batang L atau batang drugal diambil kemudian disemprot alkohol dan
dibakar diatas bunsen beberapa saat, kemudian didinginkan dan ditunggu
beberapa detik.
Kemudian disebarkan dengan menggosokannya pada permukaan agar
supaya tetesan suspensi merata, penyebaran akan lebih efektif bila cawan
ikut diputar.
Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat
menyebabkan sel-sel mikroorganisme dapat mati karena panas.
a.2. Pour Plate (agar tuang)
Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45oC) untuk dituang bersama
suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan
memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan
agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang
tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang
tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen. Adapun prosedur kerja yang
dilakukan adalah sebagai berikut :
Siapkan cawan steril, tabung pengenceran yang akan ditanam dan media
padat yang masih cair (>45oC)
Teteskan 1 ml secara aseptis.suspensi sel kedalam cawan kosong
Tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar cawan untuk
menghomogenkan suspensi bakteri dan media, kemudian diinkubasi.
-
33
Alasan diteteskannya bakteri sebanyak 0,1 ml untuk spread plate dan 1 ml untuk
pour plate karena spread plate ditujukan untuk menumbuhkan dipermukaanya saja,
sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya
sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread plate.
b. Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak)
Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan
kultur ke dalam medium baru.
b.1 Goresan Sinambung
Cara kerja :
Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai
setengah permukaan agar.
Jangan pijarkan loop, lalu putar cawan 180oC lanjutkan goresan sampai habis.
Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal,
melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru.
b.2 Goresan T
Cara kerja :
Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker
Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag
Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan streak zig-
zag pada daerah 2 (streak pada gambar). Cawan diputar untuk memperoleh
goresan yang sempurna
Lakukan hal yang sama pada daerah 3
-
34
B.3 Goresan Kuadran (Streakquadrant)
Cara kerja :
Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi
empat. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel
mikroorganisma.Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan
pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi
koloni tunggal.
Cara Kerja Isolasi Bakteri dari Sampel Tanah :
1. Tanah seberat 1 g dimasukan ke dalam tabung pengenceran 10-1 secara
aseptis dan selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat sampai 10-8
2. Tiga pengenceran terakhir diambil 0,1 ml untuk ditanam secara spread plate
pada medium NA, setelah selesai, diinkubasi pada 37oC selama 1x24 jam
3. Koloni akan tumbuh pada ketiga cawan tersebut kemudian dipilih koloni
yang relatif terpisah dari koloni lain dan koloni yang mudah dikenali
4. Koloni yang terpilih kemudian ditumbuhkan atau dimurnikan ke NA baru
dengan teknik streak kuadran
5. Inkubasi 1x24 jam.
-
35
Cara Kerja Isolasi Jamur dari Tanah :
1. Tanah dalam cawan petri dipanaskan dengan oven pada suhu 80oC selama 30
menit dengan cawan petri untuk membunuh sel vegetatiftetap bertahan
2. Tanah yang telah dioven diambil 1 g kemudian dimasukan ke dalam tabung
pengenceran bertingkat
3. Tiga pengenceran terakhir diambil untuk ditanama secara spread plate ke
media PDA yang ditambah streptomycin atau penicillin. Kemudian
diinkubnasi pada suhu ruang 5-7 hari
4. Koloni jamur yang tumbuh dimurnikan dan ditanam pada medium PDA baru,
5. Inkubasi pada suhu ruang 5-7 hari.
Biakan Penyuburan:
Digunakan untuk meningkatkan peluang terisolasinya suatu organisme yang
mempunyai beberapa ciri fisiologi atau biokimiawi yang unik. Langkahnya adalah
sebagai berikut:
Lakukan pemindahan biakan secara berturut-turut (5-6 kali) dalam medium
berisikan nutrient yang dikehendaki
Tanam pada media agar yang berisi nutrient yang sama lalu isolasi koloninya.
-
36
Mikroorganisme atau mikroba adalah organisme yang berukuran sangat kecil sehingga untuk mengamatinya diperlukan alat bantu. Mikroorganisme disebut juga organisme mikroskopik . Mikroorganisme seringkali bersel tunggal (uniseluler) maupun bersel banyak (multiseluler) . Namun, beberapa protista bersel tunggal masih terlihat oleh mata telanjang dan ada beberapa spesies multisel tidak terlihat mata telanjang. Virus juga termasuk ke dalam mikroorganisme meskipun tidak bersifat seluler .
Perbandingan ukuran sel prokariot dengan sel lain dan biomolekul (skala logaritma)
Bakteri
A. Mengamati Morfologi Bakteri
Struktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu:
1. Struktur dasar (dimiliki oleh hampir semua jenis bakteri)
Meliputi: dinding sel, membran plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula
penyimpanan
2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu)
Meliputi kapsul, flagelum, pilus, fimbria, klorosom, Vakuola gas dan endospora.
Struktur dasar sel bakteri: 1. Dinding sel tersusun dari peptidoglikan yaitu gabungan protein dan
polisakarida (ketebalan peptidoglikan membagi bakteri menjadi bakteri
Bab 4 Morfologi Mikroorganisme
-
37
gram positif bila peptidoglikannya tebal dan bakteri gram negatif bila
peptidoglikannya tipis).
2. Membran plasma adalah membran yang menyelubungi sitoplasma tersusun
atas lapisan fosfolipid dan protein.
3. Sitoplasma adalah cairan sel.
4. Ribosom adalah organel yang tersebar dalam sitoplasma, tersusun atas
protein dan RNA.
5. Granula penyimpanan, karena bakteri menyimpan cadangan makanan yang
dibutuhkan.
Struktur tambahan bakteri :
1. Kapsul atau lapisan lendir adalah lapisan di luar dinding sel pada jenis bakteri
tertentu, bila lapisannya tebal disebut kapsul dan bila lapisannya tipis disebut
lapisan lendir. Kapsul dan lapisan lendir tersusun atas polisakarida dan air.
2. Flagelum atau bulu cambuk adalah struktur berbentuk batang atau spiral
yang menonjol dari dinding sel.
3. Pilus dan fimbria adalah struktur berbentuk seperti rambut halus yang
menonjol dari dinding sel, pilus mirip dengan flagelum tetapi lebih pendek,
kaku dan berdiameter lebih kecil dan tersusun dari protein dan hanya
terdapat pada bakteri gram negatif. Fimbria adalah struktur sejenis pilus
tetapi lebih pendek daripada pilus.
4. Klorosom adalah struktur yang berada tepat dibawah membran plasma dan
mengandung pigmen klorofil dan pigmen lainnya untuk proses fotosintesis.
Klorosom hanya terdapat pada bakteri yang melakukan fotosintesis.
-
38
5. Vakuola gas terdapat pada bakteri yang hidup di air dan berfotosintesis.
6. Endospora adalah bentuk istirahat (laten) dari beberapa jenis bakteri gram
positif dan terbentuk didalam sel bakteri jika kondisi tidak menguntungkan
bagi kehidupan bakteri. Endospora mengandung sedikit sitoplasma, materi
genetik, dan ribosom. Dinding endospora yang tebal tersusun atas protein
dan menyebabkan endospora tahan terhadap kekeringan, radiasi cahaya,
suhu tinggi dan zat kimia. Jika kondisi lingkungan menguntungkan endospora
akan tumbuh menjadi sel bakteri baru.
B. Mengamati Morfologi Koloni Bakteri
Kegiatan ini merupakan tindakan pertama kali jika ingin mempelajari suatu jenis
bakteri lebih lanjut, khususnya untuk tujuan identifikasi. Setelah mendapatkan
kultur murni maka biakan yang diinginkan ditumbuhkan ke berbagai bentuk
media untuk dikenali ciri koloninya.
Cara Kerja :
Tumbuhkan biakan pada media NA cawan dengan streak kuadran
Tumbuhkan biakan pada media NA miring dengan pola inokulasi yang tegak
lurus
Tumbuhkan biakan pada media NA tegak dengan stabinoculation
Tumbuhkan biakan pada media NB
A.1. Pertumbuhan pada Cawan Petri
Ciri-ciri yang perlu diperhatikan adalah sebagai berikut :
Ukuran; a
a. pinpoint/punctiform (titik) b
b. Small (kecil)
c. Moderate (sedang) c
d. Large (besar) d
Pigmentasi :
mikroorganisme kromogenik sering memproduksi pigmen intraseluler, beberapa
jenis lain memproduksi pigmen ekstraseluler yang dapat terlarut dalam media
-
39
Karakteristik optik : diamati berdasarkan jumlah cahaya yang melewati koloni.
a. Opaque (tidak dapat ditembus cahaya)
b. Translucent (dapat ditembus cahaya sebagian)
c. Transparant (bening)
Bentuk :
a. Circular a
b. Irregular
c. Spindle
d. Filamentous b
e. Rhizoid c
d
e
- Elevasi :
a. Flat a
b. Raised
c. Convex b
d. Umbonate
c
d
Permukaan :
a. Halus mengkilap
b. Kasar
c. Berkerut
d. Kering seperti bubuk
-
40
Margins : 1
1. Entire 2
2. Lobate
3. Undulate
4. Serrate 3
5. Felamentous
6. Curled 4
6
A.2. Pertumbuhan pada Agar Miring
Ciri-ciri koloni diperoleh dengan menggoreskan jarum inokulum tegak dan lurus
Ciri koloni berdasarkan bentuk:
A.3 Pertumbuhan pada Agar Tegak
Cara penanaman adalah dengan menusukkan jarum inokulum needle ke dalam
media agar tegak.
Ciri-ciri koloni berdasar bentuk :
-
41
Ciri koloni berdasar kebutuhan O2 :
A.4 Pertumbuhan pada Media Cair
Pola pertumbuhan berdasarkan kebutuhan O2
A. Mengamati Morfologi Bakteri
Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan
perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa
pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel
bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat
mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan
sekelilingnya ditingkatkan.
Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa,
bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai
muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan
zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena
muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna
-
42
asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite
Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll.
Pewarnaan
Pewarnaan sederhana Pewarnaan diferensial Pewarnaan khusus pewarnaan positif pewarnaan gram pewarnaan endospora pewarnaan negatif pewarnaan acid fast dll. pewarnaan flagella dll.
B.1. Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif)
Merupakan pewarnaan yang hanya menggunakan satu jenis zat pewarna (tunggal).
Misalnya metylen blue, Carbol fuchsin, dll.
Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang
kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi
jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari
bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan
melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya.
Cara Kerja :
Bersihkan object glass dengan kapas
Jika perlu tulislah kode atau nama bakteri pada sudut object glass
Bila menggunakan biakan cair maka pindahkan setetes biakan dengan pipet tetes
atau dapat juga dipindahkan dengan jarum inokulum. Jangan lupa biakan dikocok
terlebih dahulu. Jika digunakan biakan padat, maka biakan dipindahkan dengan
jarum inokulum, satu ulasan saja kemudian diberi akuades dan disebarkan supaya
sel merata.
Keringkan ulasan tersebut sambil memfiksasinya dengan api bunsen (lewatkan di
atas api 2-3 kali)
Setelah benar-benar kering dan tersebar selanjutnya ditetesi dengan pewarna
(dapat digunakan Methylen blue, Safranin, CrystalViolet) dan tunggu kurang lebih 30
detik.
Cuci dengan akuades kemudian keringkan dengan kertas tissue
Periksa dengan mikroskop (perbesaran 100 x 10).
-
43
B.2 Pewarnaan Negatif
Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. Tapi mudah dilihat dengan
pewarnaan negatif. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan mewarnai
lingkungan sekitarnya, sehingga sel tampak transparan dengan latar belakang hitam.
Prosedur:
1. Ambil dua object glass, teteskan nigrosin atau tinta cina di ujung kanan salah
satu object glass
2. Biakan diambil lalu diulaskan atau diteteskan dalam tetesan nigrosin tadi,
lalu dicampurkan
3. Tempelkan sisi object glass yang lain kemudian gesekkan ke samping kiri
4. Biarkan preparat mengering di udara, jangan difiksasi atau dipanaskan di atas
api.
1 2
-
44
3 4
5. Setelah dilihat di mikroskop, maka akan tampak bentuk sel bakteri.
A.3. Pewarnaan Gram
Adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak
digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting
dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya
lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada
membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua
yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang
tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding
sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel. Berikut merupakan tabel
prosedur pewarnaan Gram:
-
45
Dengan metode ini, biasanya bakteri Gram (+) berwarna ungu dan Gram (-)
berwarna merah. Perbedaan tersebut karea perbedaan struktur dinding sel bakteri
Gram (+) yang mengandung peptidoglikan dan Gram (-) yang mengandung kadar
lipid yang tinggi sehingga terjadi perbedaan reaksi dalam permiabilitas zat warna
dan penambahan zat pemucat.
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sbb:
a. Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang
mengakibatkan CV-iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai
-
46
berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif
tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam
penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine
secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif.
b. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak
lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel
menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan
menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan
sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa species yang
memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan
Arthrobacter.
PERBEDAAN BAKTERI GRAM POSITIF DAN GRAM NEGATIF:
CIRI PERBEDAAN RELATIF
GRAM POSITIF GRAM NEGATIF
Sturktur dinding sel Tebal (15-80 nm), berlapis
tunggal (mono)
Tipis (10-15 nm), berlapis
tiga (multi)
Komposisi dinding sel
Kandungan lipid rendah (1-4
%), peptidoglikan ada
sebagai lapisan tunggal, ada
asam tekoat
Kandungan lipid tinggi (11-
22%), peptidoglikan ada di
dalam lapisan kaku
sebelah dalam, tidak ada
aam tekoat
Kerentanan terhadap
penisilin Lebih rentan Krang rentan
Pertumbuhan
dihambat oleh warna-
warna dasar (seperti
Kristal ungu)
Pertumbuhan dihambat
dengan nyata
Pertumbuhan tidak begitu
dihambat
Persyaratan nutrisi Relative rumit pada banyak
spesies Relative sederhana
Resistensi terhadap
gangguan fisik Lebih resisten Kurang resisten
Asam tekoat = polimer gliserol dan ribitol fosfat menempel pada peptodoglikan atau membran sitoplasma. Fungsi asam teikoat (muatan negatif) adalah : untuk transport ion positif dari dan keluar sel penyimpanan fosfor B.4. Pewarnaan Endospora
Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum dan Bacillus adalah
bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan
-
47
bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan
mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi
dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan
endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas.
Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa
pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika
dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi
(kedua-duanya transparan, sel vegetatif berwarna), sehingga diperlukan teknik
pewarnaan endospora. Berikut merupakan prosedur pewarnaan endospora dengan
metode Schaeffer-Fulton.
-
48
-
49
Berikut merupakan beberapa tipe endospora dan contohnya
B.5. Pewarnaan Khusus (Pewarnaan Bakteri Tahan Asam)/ BTA
Bakteri-bakteri tahan asam memiliki lapisan lipid/lemak yang tebal dalam
dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel bakteri tersebut relatif tidak
permeable terhadap zat warna yang umum sehingga sel-sel tersebut tidak terwarnai
oleh metode pewarnaan biasa. Pada pewarnaan ini, mikroorganisme dapat
menahan zat warna yang tidak terpucatkan oleh asam alcohol sehingga dikatakan
tahan asam dan tampak merah, sedangkan yang tidak tahan asam (terpucatkan)
akan berwarna biru. Metode yang paling sering digunakan adalah Zeihl-Nelssen dan
Kinyoun Gabbet/ Tan Thiam Hok.
C. Mengamati motilitas
C.1 Pengamatan Langsung
Cara Kerja :
-
50
Teteskan biakan bakteri motil seperti Bacillus atau E.coli ke object glass (sebaiknya
dari biakan cair). Jika digunakan biakan padat maka ulas dengan jarum inokulum lalu
ditambah akuades satu tetes, ratakan.
Tutup dengan cover glass
Amati menggunakan mikroskop dengan perbesaran maksimak. Bakteri akan
tampak transparan dan pola pergerakannya tidak beraturan. Hati-hati jangan salah
membedakan antara sel yang bergerak sendiri karena flagel atau bergerak terkena
aliran air.
C.2 Pengamatan tidak langsung
Cara Kerja :
Tanam biakan pada media NA tegak atau Media Motilitas dengan
cara tusuk (Stab inoculation) sedalam + 5 mm.
Inkubasi pada suhu 370 C selama 1x 24 jam
Hasil positif (motil) jika bakteri tumbuh pada seluruh permukaan
media, hasil negatif menunjukan bakteri hanya tumbuh pada daerah
tusukan saja
Bakteri motil akan bermigrasi ke seluruh permukaan agar dan bekas tusukan
ARKEA
Diameter arkea berkisar antara 0,1 mikrometer (m) hingga 15 m dan terdapat
dalam berbagai bentuk seperti bulat, berbentuk seperti tongkat, spiral, seperti
lempengan, filament seperti jarum atau persegi. Struktur selnya mirip bakteri gram
positif, tapi komponen selnya berbeda serta mempunyai flagella.
-
51
Salah satu jenis arkea yang hidup di sumber air panas sebuah gunung berapi.
PROTOZOA Ukuran tubuh protozoa biasanya berkisar antara 10-50 m, tetapi dapat tumbuh sampai 1
mm, dan mudah dilihat di bawah mikroskop. Protozoa ada yang bergerak dengan flagela da
nada yang menggunakan silia. Lebih dari 30.000 jenis telah ditemukan. Protozoa terdapat di
seluruh lingkungan berair dan tanah, tubuh protozoa amat sederhana, yaitu terdiri dari satu
sel tunggal (unisel). Namun demikian, Protozoa merupakan sistem yang serba bisa. Semua
tugas tubuh dapat dilakukan oleh satu sel saja tanpa mengalami tumpang tindih. Bentuk
tubuh macam-macam, ada yang seperti bola, bulat memanjang, atau seperti sandal bahkan
ada yang bentuknya tidak menentu.
Protozoa adalah mikroorganisme menyerupai hewan yang merupakan salah satu filum dari
Kingdom Protista. Seluruh kegiatan hidupnya dilakukan oleh sel itu sendiri dengan
menggunakan organel-organel antara lain membran plasma, sitoplasma, dan mitokondria.
Ciri-ciri umum :
Organisme uniseluler (bersel tunggal)
Eukariotik (memiliki membran nukleus)
Hidup soliter (sendiri) atau berkoloni (kelompok)
Umumnya tidak dapat membuat makanan sendiri (heterotrof)
Hidup bebas, saprofit atau parasit
Dapat membentuk sista untuk bertahan hidup
Alat gerak berupa pseudopodia, silia, atau flagela
Semua protozoa mempunyai vakuola kontraktil. Vakuola dapat berperan sebagai pompa
untuk mengeluarkan kelebihan air dari sel, atau untuk mengatur tekanan osmosis. Jumlah
dan letak vakuola kontraktil berbeda pada setiap spesies. Protozoa dapat berada dalam
bentuk vegetatif (trophozoite), atau bentuk istirahat yang disebut kista. Protozoa pada
keadaan yang tidak menguntungkan dapat membentuk kista untuk mempertahankan
hidupnya. Saat kista berada pada keadaan yang menguntungkan, maka akan berkecambah
menjadi sel vegetatifnya. Protozoa tidak mempunyai dinding sel, dan tidak
mengandung selulosa atau khitin seperti pada jamur dan algae.
-
52
Yeast / Khamir
A. Mengamati morfologi koloni yeast
Sel khamir dapat tumbuh setelah ditanamkan pada media agar selama 1
sampai 3 hari. Selama waktu tersebut, khamir akan menghasilkan koloni berwarna
pucat keruh dan umumnya mempunyai diameter anatar 0.5 sampai 3.0 mm.
Sebagaian kecil species dapat menghasilkan pigmen, tetapi kebanyakan hanya
menghasilkan warna krem. Dibawah mikroskop dan secara morfologi koloni ,
kebanyakan species khamir sulit dibedakan karena perbedaannya yang sangat kecil.
Untuk membedakannya seringkali harus dilakukan tes fisiologi. Ragi dengan nilai
ekonomi paling penting yang saat ini dikenal adalah khamir yang digunakan dalam
pembuatan roti (bakers) dan dalam pembuatan bir (brewers), yang merupakan
anggota dari genus Saccharomyces.
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam mengidentifikasi khamir adalah:
1. Ada tidaknya askospora, kalau ada bagaimana pembentukannya (konyugasi isogami, heterogami, atau konyugasi askospora), bentuk, warna, ukuran, dan jumlah spora.
2. Bentuk, warna, dan ukuran sel vegetatifnya. 3. Cara reproduksi aseksual (bertunas, membelah, dsb)
-
53
4. Ada tidaknya filamen atau pseudomiselium. 5. Pertumbuhan dalam medium dan warna koloninya. 6. Sifat-sifat fisiologi, misalnya sumber karbon (C) dan nitrogen (N), kebutuhan
vitamin, bersifat oksidatif atau fermentatif, atau keduanya, lipolitik, uji pembentukan asam, penggunaan pati, dan lain-lain.
Berikut ini merupakan cara pengamatan morfologi khamir:
a. Tanam biakan yeast (dapat berupa Sacharomyces cereviceae atau Candida
albicans) pada PDA dengan cara streakquadrant.
b. Inkubasi selama 2x24 jam.
c. Setelah didapatkan koloni tunggal, pengamatan ciri-ciri morfologi koloni
hampir sama dengan ciri morfologi bakteri.
B. Mengamati Morfologi Sel Yeast
Yeast merupakan fungi mikroskopik uniseluler, tidak membentuk hifa
(beberapa spesies dapat membentuk pseudohifa). Bentuk selnya bervariasi dapat
berbentuk bulat, bulat telur, bulat memanjang dengan ukuran 1-9x20 m. Beberapa
spesies yeast memiliki sifat dimorfisme yaitu bentuk sel tunggal dan bentuk hifa atau
pseudohifa. Pseudohifa adalah hifa yeast yang terbentuk dari rangkaian sel hasil
pembelahan aseksual secara budding, tetapi tidak melepaskan diri dari induk.
Morfologi internal sel mudah dilihat dan terdiri dari inti dan organel seperti
mitkondria, grannula lemak dan glikogen.
B.1 Melihat bentuk sel Yeast
Cara Kerja :
Tumbuhkan Sacharomyces cereviceae pada glukosa cair selama 24 jam.
Ulaskan suspensi biakan pada object glass lalu teteskan Methilene Blue hingga rata
(jangan difiksasi).
Tutup preparat dengan cover glass.
Amati dengan perbesaran 40x10 atau 100x10.
B.2 Melihat bentuk spora sel Yeast
Cara kerja :
Buat preparat ulas dari biakan yeast pada Goodkowa Agar yang berumur 10 hari.
Fiksasi dengan api bunsen.
Warnai dengan cara Shager dan Fulgen yaitu:
-
54
Tetesi preparat dengan MalachiteGreen dan biarkan 30-60 detik. Panasi preparat
dengan api bunsen selama + 30 detik (sampai timbul uap). Cuci preparat dengan air
mengalir. Keringkan dengan tissue kemudian biarkan pada udara terbuka. Amati di
bawah mikroskop. Perhatikan spora yang berwarna
Kapang / Jamur
Jamur merupakan mikroba dengan struktur talus berupa
benang-benang (hifa) yang terjalin seperti jala (myselium).
Hifa dapat berekat (septat) dengan inti tunggal/ lebih dan
hifa tidak bersekat (aseptat). Penampakan morfologi koloni
pada umumnya seperti benang (filamentous) yang
pertumbuhannya membentuk lingkaran. Morfologi
koloninya dapat dengan mudah dibedakan dengan bakteri walaupun ada beberapa
jenis bakteri yang koloninya mirip jamur, seperti dari kelompok Actinomycetes atau
Bacillus mycoides. Koloni kapang memiliki keragaman warna yang muncul dari
sporanya.
A. Mengamati morfologi koloni kapang
Cara kerja :
Tanam/pindahkan biakan kapang dengan jarum inokulum needle yang diletakan di
tenganh-tengah cawan petri.
Inkubasi selam beberapa hari.
Amati pertumbuhan koloni (miselium) yang menyebar.
B. Mengamati sel morfologi kapang dengan metode SlideCulture (Microculture)
Teknik ini bertujuan untuk mengamati sel kapang dengan menumbuhkan spora pada
object glass yang ditetesi media pertumbuhan. Pengamatan struktur spora dan
miselium dapat juga dilakukan dengan preparat ulas seperti yang telah diuraikan di
depan. Namun seringkali miselium atau susunan spora menjadi pecah atau terputus
sehingga penampakan di mikroskop dapat membingungkan. Dengan teknik ini,
spora dan miselium tumbuh langsung pada slide sehingga dapat mengatasi masalah
tersebut.
-
55
B.1 Metode Heinrichs, cara kerja :
a. Siapkan object glass, cover glass, tissue basah yang dimasukkan dalam cawan
dan sterilkan dengan autoclave.
b. Setelah selesai sterilisasi berikan lilin (parafin-petrolatum) steril pada sebelah
kiri dan kanan tempat yang akan ditutup cover glass (aseptis).
c. Tutup dengan cover glass.
d. Teteskan suspensi spora jamur dalam media cair pada media cover glass
yang tidak diberi lilin. Berikan sampai setengah luasan cover glass. Tekan
cover galss secara media merata.
e. Inkubasi pada suhu kamar selama 3x24 jam.
f. Ambil preparat dan amati di bawah mikroskop.
B. 2 Metode Riddel, cara kerja :
a. Persiapan sama seperti di atas
b. Setelah semua steril, potong media Saboraud Dextrose Agar steril berbentuk
kubus dan letakkan di atas object glass.
c. Inokulasikan spora jamur pada bagian atau potongan agar.
d. Tutup potongan agar dengan cover glass.
e. Inkubasi pada suhu kamar selama 3x24 jam.
f. Ambil preparat dan diamati di bawah mikroskop.
-
56
B.3 Prosedur yang lebih sederhana, cara kerja :
a. Sterilkan cawan petri yang berisi kapas yang di atasnya terdapat object glass
dan cover glass.
b. Siapkan media PDA dan dijaga supaya tetap cair.
c. Teteskan media PDA pada object glass secara aseptis lalu tunggu memadat
(teteskan jangan terlalu banyak).
d. Belah media yang memadat dengan jarum inokulum yang berujung L.
e. Ulaskan spora jamur yang akan diamati pada belahan tersebut.
f. Tutup dengan cover glass tepat di atas media dan tekan hingga merata.
g. Inkubasi selama 2x24 jam.
h. Amati pertumbuhan miselium dan spora pada object glass dengan
perbesaran sedang
-
57
MIKROBA YANG PENTING DALAM INDUSTRI FERMENTASI
1. BAKTERI
a. Acetobacter aceti. Bakteri ini penting dalam produksi asam asetat dengan
mengoksidasi alkohol sehingga menjadi asam asetat. Banyak terdapat
pada ragi tapai, yang menyebabkan tapai yang melewati dua hari
fermentasi akan menjadi berasa asam
b. Acetobacter xylinum.Bakteri ini digunakan dalam pembuatan nata de
coco. A.xylinum mampu mensintesis selulosa dari gula yang dikonsumsi.
Bakteri ini juga terdapat pada produk kombucha yaitu fermentasi dari teh
c. Bacillus sp. Merupakan genus dengan kemampuan yang paling luas. Pada
mulanya hanya digunakan untuk menghasilkan enzim amylase, namun
berkembang untuk bioinsektisida yang diwakili oleh Bacillus thuringiensis
maupun untuk penanganan limbah seperti B. subtilis dan B. megaterium,
juga digunakan untuk memproduksi bahan baku plastik ramah
lingkungan.
d. Bividobacterium sp. Bersifat anaerob dan digunakan sebagai mikrobia
probiotik, yaitu mikroba yang dikonsumsi untuk mengatur keseimbangan
flora usus.
e. Lactobacillus sp. Digunakan dalam produksi asam laktat, fermentasi
pangan seperti yoghurt, sauerkraut dan juga produk probiotik. Asam
laktat dari bakteri ini dapat juga dibuat poli asam laktat sebagai bahan
baku plastic ramah lingkungan.
2. KHAMIR
a. Saccharomyces cerevisiae, digunakan dalam industry wine dan
pengembang adonan roti
b. Saccharomyces roxii, digunakan dalam pembuatan kecap dan
berkontribusi pada pembentukan aroma
3. JAMUR/ KAPANG
a. Aspergillus niger,digunakan dalam pembuatan asam sitrat (pada
pembuatan permen dan minuman kemasan), sering mengkontaminasi
makanan misalnya roti tawar.
b. Rhizopus oryzae, penting dalam pembuatan tempe
c. Neurospora sitophila, merupakan sumber beta karoten pada fermentasi
tradisional seperti produksi oncom.
d. Monascus purpureus, dalam pembuatan angkak (fermentasi pada beras).
Jamur ini menghasilkan pewarna alami yang umumnya digunakan pada
masakan cina.
e. Penicillium sp., mampu menghasilkan antibiotic yang disebut penisilin.
-
58
Di samping beragam jenisnya, mikroba juga sangat mudah mengalami
perubahan sifat sehingga menjadi strain baru yang berbeda dengan aslinya. Dalam
melaksanakan kegiatan ilmiahnya, para pakar mikrobiologi dan pakar ilmu yang
terkait seperti pakar fitopatologi dan entomologi perlu mempunyai koleksi plasma
nutfah mikroba, baik untuk digunakan sehari-hari, untuk jangka menengah, maupun
jangka panjang.
Oleh karena itu, perlu melakukan koleksi, menyimpan, dan memelihara
mikroba dengan baik. Para ilmuwan tersebut perlu memiliki metode pembuatan dan
penyimpanan koleksi (preservasi) yang sesuai untuk menjaga agar biakan mikroba
tetap hidup, ciri-ciri genetiknya tetap stabil dan tidak berubah, serta hemat biaya
dan tenaga. Metode yang dipilih sangat tergantung pada sifat mikroba dan tujuan
preservasi. Sifat mikroba tercermin dalam:
(1) ciri-ciri morfologi mikroba yang beragam (virus, bakteri, jamur, nematoda,
algae, khamir, dan protozoa)
(2) ciri-ciri fisiologi dan biokimia mikroba
(3) kemampuan mikroba bertahan hidup baik dalam lingkungan alaminya
maupun lingkungan buatan.
Tujuan koleksi dan preservasi meliputi tujuan jangka pendek dan jangka panjang.:
1. Preservasi jangka pendek dilakukan untuk keperluan rutin penelitian yang
disesuaikan dengan kegiatan program atau proyek tertentu.
2. Preservasi jangka panjang dilakukan dalam kaitannya dengan koleksi dan
konservasi plasma nutfah mikroba, sehingga apabila suatu saat diperlukan,
dapat diperoleh kembali atau dalam keadaan tersedia.
Mikroorganisme
Bab 5 Pemindahan & Pengawetan
-
59
Keberhasilan pembuatan koleksi plasma nutfah mikroba tergantung pada tiga
faktor, yaitu:
(1) penguasaan teknologi
(2) ketersediaan fasilitas preservasi
(3) ketersediaan tenaga terampil, tekun, dan rutin.
Tujuan utama preservasi, yaitu:
(1) mereduksi atau mengurangi laju metabolisme dari mikroorganisme hingga
sekecil mungkin dengan tetap mempertahankan viabilitas (daya hidupnya)
(2) memelihara sebaik mungkin biakan, sehingga diperoleh angka perolehan
(recovery) dan kehidupan (survival) yang tinggi dengan perubahan ciri-ciri
yang minimum.
CARA PENYIMPANAN:
1. Penyimpanan jangka pendek mikroba dilakukan dengan memindahkan
secara berkala jangka pendek misalnya sebulan sekali dari media lama ke
media baru. Teknik ini memerlukan waktu dan tenaga yang banyak.
Beberapa teknik penyimpanan sederhana yang efektif untuk penyimpanan
isolat jangka pendek atau menengah, dan biasanya tidak sesuai untuk
penyimpanan jangka panjang. Di antara teknik tersebut ialah penyimpanan
dalam minyak mineral, parafin cair, tanah steril, air steril, manik-manik
porselin, lempengan gelatin, dan P2O5 dalam keadaan vakum.
2. Metode penyimpanan jangka panjang yang p