Generalidades de la PCR: MÉTODO DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE Foc RT4

1)  Bioversity International, Costa Rica 2)  INISAV – Cuba. 3)  Universidad de Costa Rica

Miguel Dita (1)

Einar Martínez de la Parte (2)

Monica Blanco (3)

Quevedo,  Ecaudor,  Diciembre  2013  

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AISLAMIENTO DE PROTEINAS O ADN

REACCIONES ENZIMATICAS

PREPARACION DEL GEL

ELECTROFORESIS

+ -

MUESTRAS

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Esquema de trabajo para el empleo de los Marcadores Moleculares

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AISLAMIENTO DE PROTEINAS O ADN

REACCIONES ENZIMATICAS

PREPARACION DEL GEL

ELECTROFORESIS

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MUESTRAS

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Esquema de trabajo para el empleo de los Marcadores Moleculares

Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K. B., Horn, G. T., Erlich, H. A., Arnheim, N. 1985. Primer-directed enzymatic amplification of β-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230, 1230-1350. Mullis, K.B. and Faloona, F. 1987. Specific sinthesis of DNA in vitro via polymerase catalysed chain reaction. Methods Enzymol. 55:335-350. Cetus Corporation, Department of Human Genetics, Emeryville, CA 94608.

Incluida en el título o resumen de más de 250000 publicaciones científicas

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

La PCR se realiza en un “Thermo Cycler” o Termociclador. Es una máquina que calienta y enfría la reacción en periodos cortos de tiempo.

TERMOCICLADOR

ü Amortiguador (Buffer 10x): 50mM KCl, 10mM Tris HCl (pH 8.3) y 1.5

mM MgCl2. ü MgCl2: Puede estar en forma de MgCl2, MgSO4. Se usa 25mM -Es un

cofactor para la función de la polimerasa. ü dNTP’s (Deoxyribonucleotidos trifosfatados): dATP, dGTP, dCTP,

dTTP. ü Cebadores o “primers”: Son secuencias cortas de 20-24 nucleótidos de

longitud, complementarias a una región del DNA que se quiere amplificar. ü DNA molde: El DNA puede emplearse a diferentes concentraciones, el

mínimo va de 10-100 ng. y el máximo entre 400-500 ng. ü Taq Polimerasa: DNA polimerasa de Thermus aquaticus

Reactivos necesarios para PCR:

TAQ ADN

dCTP

dATP

dGTP

dTTP

Primers

94°

50-65°

20°

72°

4°

Pasos o etapas de PCR:

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AISLAMIENTO DE PROTEINAS O ADN

REACCIONES ENZIMATICAS

PREPARACION DEL GEL

ELECTROFORESIS

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MUESTRAS

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Esquema de trabajo para el empleo de los Marcadores Moleculares

•  Agarosa / Bromuro de etidio •  Poliacrilamida / Nitrato de plata

Métodos de separación/detección

Marcadores  morfológicos  "  Influencia  del  ambiente  "  Bajo  número  "  Entrenamiento  y  subje@vidad  

Marcadores    moleculares  "  Sin  influencia  ambiental  "  Can@dad  ilimitada  "  Sencillos,  rápidos  y  obje@vos  

MARCADORES MOLECULARES vs

MARCADORES MORFOLÓGICOS

"  Marcadores bioquímicos-isoenzimas Formas moleculares múltiples de enzimas, que tienen orígenes genéticos similares y que poseen actividades catalíticas muy semejantes, no exactamente superpuestas. "  Marcadores basados en el polimorfismo del ADN

1.  Detectados por Hibridación-(RFLP)

2.  Detectados por amplificación-basados en PCR

(DAF, RAPD, AFLP, SCAR, CAPS)

MARCADORES MOLECULARES

"   DNA AMPLIFICATION FINGERPRINTING (DAF) "   RANDOM AMPLIFIED POLIMORPHIC DNA (RAPD)

Polimorfismo del ADN Amplificado al Azar. "   SEQUENCE CHARACTERIZED AMPLIFIED REGIONS (SCAR).

Regiones Amplificadas de Secuencia Caracterizada "   AMPLIFIED FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (AFLP).

Polimorfismo de Longitud de los Fragmentos Amplificados . "   CLEAVED AMPLIFIED POLYMORPHIC SEQUENCE (CAPS).

Secuencias Polimórficas Amplificadas y Cortadas, PCR-RFLP.

MARCADORES DETECTADOS POR AMPLIFICACIÓN

•  Estudios de diversidad genética •  Estudios taxonómicos (relaciones filogenéticas) •  Establecimiento de genealogías •  Determinación de pureza híbrida •  Elaboración de mapas genéticos •  “Etiquetado” de genes •  Identificación de material microbiológico •  Diagnóstico

APLICACIONES DE LOS MARCADORES MOLECULARES

Las regiones o genes más comúnmente empleados en estudios de variabilidad genética o en el diseño de cebadores para la identificación de especies fúngicas son:

• Los genes del ADN ribosomal nuclear (ADNr) y sus regiones espaciadoras ITS e IGS.

• Los genes del ADN mitocondrial (ADNmt) • El gen de la ß-tubulina, • El gen del factor de elongación 1 alfa (EF-1α o TEF). • Otros marcadores (secuencias ERIC y elementos de

transposición).

MARCADORES MOLECULARES

18s 5.8s 5s 28s

ITS 1 ITS 2 IGS 1 IGS 2

UNIDAD REPETITIVA DEL ADNr

"   Regiones que codifican para los genes 18S, 5.8S y 28S del ARNr

"   Espaciadores internos transcritos (Internal Transcribed Spacer; ITS1 e

ITS2) que se encuentran entre estos genes

"   Espaciadores intergénicos (Intergenic spacer; IGS1 e IGS2)

GENES DEL ADN RIBOSOMAL NUCLEAR(ADNr)

"  Codifica una parte esencial de maquinaria de traslación proteica, "  Tiene una gran utilidad filogenética ya que es : (i) altamente informativo a nivel de especie dentro del género Fusarium (ii) se han desarrollado cebadores o primers universales que funcionan

a través del género

GEN TEF EF-1α

Las razones para amplio uso en estos estudios reside en características intrínsecas de esta molécula tales como: "   Reducido tamaño "   Alta tasa evolutiva, "   Falta de bases metiladas, "   Alto contenido de residuos adenina-timina (AT) "   Molécula haploide donde la mayoría de los alelos poseen la misma

función e inclusive poseen regiones universalmente conservadas

Codifican para: "   Proteínas mitocondriales " ARNt "   Las subunidades del ARNr (LSU y SSU ARNr)

GENES MITOCONDRIALES

ü  Fusarium spp.- FUSARIUM-ID (Geiser et al., 2004) Amplificación y Secuenciación de TEF o IGS

ü  Fusarium oxysporum- Edel et al. (2000) POF2 y POF3 (dominios variables del ext. 5´del gen 28s del ARNr)

ü  Fusarium oxysporum f. sp. cubense

Foc-1 y Foc-2(fragmentos RAPD)- Lin et al.(2008) ü  Fusarium oxysporum f. sp. cubense RT 4

FocTR4-F y FocTR4-R(secuencias TEF e IGS por SNPs)- Dita et al. (2010)

EMPLEO DE MARCADORES MOLECULARES EN EL DIAGNÓSTICO DE FUSARIUM

FUSARIUM-ID v. 1.0-Esquema de trabajo

FUSARIUM-ID v. 1.0 http://fusarium.cbio.psu.edu

Resultado de la comparación de secuencias mediante la herramienta de búsqueda BLAST del servidor FUSARIUM-ID.

Electroforesis en gel de agarosa y visualización del producto amplificado

Cultivo monospórico

Aislamiento de la cepa Haces vasculares del pseudotallo de plantas enfermas

Extracción de ADN

Amplificación (PCR) con el empleo de los cebadores FocTR4-F/ FocTR4-R

IDENTIFICACION POR PCR DE Foc RT4

Primers: FocTR4-F: 5´- CACGTTTAAGGTGCCATGAGAG – 3´ FocTR4-R: 5´- CGCACGCCAGGACTGCCTCGTGA – 3´ 68C FocTR4-R: 5´- -----------GCCAGGACTGCCTCGTGA – 3´ 60C Temperatura de anillamiento: 60 C Amplicón: 463 pb

95°

60° 20°

72°

4°

30 ciclos

IDENTIFICACION POR PCR DE Foc RT4

0 1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 13 14 15 18 19 20 22 24 12 M M

242 bp

Lin  et  al.  (2008)-­‐  Foc-­‐1/  Foc-­‐2  

Primers  -­‐  FocTR4-­‐F/  FocTR4-­‐F  (Dita  et  al.  2010)  

VCG 01213

Foc1/Foc2: Positivo aislados de Honduras, Brasil, Costa Rica, Australia, Indonesia, Taiwan

Diagnóstico molecular para TR4 (GVC01213)

Electroforesis en gel de agarosa de los productos de amplificación de 20 VCG de Foc mediante el empleo de Foc-1/ Foc-2 (Lin et al., 2008) panel superior y de FocTR4-F/FocTR4-R panel inferior (Dita et al., 2010): Línea 1-VCG 0120; Línea 2- VCG 0121, Línea 3 VCG 0122, Línea 4 -VCG 0123, Línea 5-VCG 0124, Línea 6-VCG 0125, Línea 7- VCG 0126, Línea 8-VCG 0128, Línea 9 -VCG 0129, Línea 10- VCG 01210, Línea 11- VCG 01211, Línea 12 -VCG 01212, Línea 13 -VCG 01213, Línea 14- VCG 01214, Línea 15 -VCG 01215, Línea 16 -VCG 01218, Línea 17- VCG 01221, Línea 18- VCG 01222, Línea 19- VCG 01223, Línea 20- VCG 01224. M: marcador de peso molecular

IDENTIFICACION POR PCR DE Foc

Electroforesis en gel de agarosa de los productos de amplificación de la reacción PCR duplex com plantas sanas e inoculadas con Foc RT4: Línea 1, Musa balbisiana cv. Buthohan (BB); 2, Musa acuminata cv. Pisang Mas (AA); 3, Grand Naine; 4, Silk (AAB); 5, Prata Ana˜ (AAB); 6, rizomas de plantas Gran enano no inoculadas; 7–9, rizomas de plantas Gran enano inoculadas con aislados de Foc TR4; 10-11, pseudotallos infectados de plantas Gran enano inoculadas con Foc TR4; 12, control positivo control usando ADN de cultivo puro de cepa VCG 01213 .

IDENTIFICACION POR PCR DE Foc

Gracias Preguntas?