metodos de recuento

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VI WORKSHOP MRAMA

El pasado noviembre, tuve laoportunidad de asistir alWorkshop sobre Métodos

Rápidos y Automatización enMicrobiología Alimentaria que, bajo ladirección de los doctores MartaCapellas Puig y Josep Yuste Puigvert,se celebra anualmente en la Facultadde Veterinaria de la UniversidadAutónoma de Barcelona. Se trata deun curso muy interesante que permiteadquirir una amplia visión de losmétodos de detección e identificaciónrápida de los microorganismos pre-sentes en los alimentos, así comoconocer los últimos avances aplica-bles al análisis microbiológico en laindustria alimentaria. El curso constade: (i) conferencias impartidas pordestacados científicos españoles yextranjeros; (ii) presentaciones acargo de expertos de importantesempresas de microbiología, incluyen-do “rotaciones” en las que gruposreducidos de participantes en el cursoasisten a la demostración del funcio-namiento de equipos y productos; y(iii) dos sesiones prácticas de labora-torio, un taller y una visita a unaempresa de Biología Molecular. Entrelos conferenciantes que intervinieronen el curso, destaca la figura del Dr.Daniel Y. C. Fung, profesor de laKansas State University enManhattan (Kansas) y director delmundialmente conocido Workshop onRapid Methods and Automation inMicrobiology que se celebra anual-mente en la mencionada universidaddesde 1980. El Dr. Fung, autoridadinternacional en el campo de losMétodos Rápidos en Microbiología yautor de más de 800 artículos científi-cos en la materia, impartió seis intere-santes conferencias basadas en suartículo Rapid Methods andAutomation in Microbiology (1), cuyosaspectos más destacados presento acontinuación.

El desarrollo de métodos rápidos yautomatizados para la detección, ais-lamiento, identificación y enumera-ción de microorganismos (y/o susmetabolitos) relacionados con la alte-ración y seguridad de los alimentos esuna subdivisión del área de la micro-biología aplicada con una importanciacada vez mayor. En este sentido,según investigaciones de mercadorealizadas en 2003 por StrategicConsulting Inc.´s, del total de ensayosmicrobiológicos realizados por laindustria en el mundo (1.136,5 millo-nes), el 58% (660, 5 millones) corres-pondieron a la industria de la alimen-tación (49%) y bebidas (9%).Aproximadamente, el 20% de los aná-lisis se dirigieron a la detección de losmicroorganismos patógenosSalmonella y Escherichia coliO157:H7 y el 80% restante fueronanálisis rutinarios (recuento total, decoliformes, de mohos y de levaduras).A nivel mundial, el porcentaje deensayos realizado en Europa,América del Norte y el resto delmundo fue de un 33% en cada uno delos casos. No obstante, se estima queen un futuro próximo el porcentaje deensayos realizados en el resto delmundo podría incrementarse hasta el50% debido a la concienciación queestán experimentando países coneconomías en desarrollo sobre lagran importancia de la seguridad ali-mentaria (1, 2, 3). Así por ejemplo, lasautoridades sanitarias de China, paísque se ha visto envuelto en variasocasiones en escándalos debidos a laexportación de alimentos con condi-ciones higiénico-sanitarias no ade-cuadas, están tomando las medidasnecesarias para asegurar el suminis-tro de alimentos seguros a los más de10.000 atletas y 3 millones de espec-tadores que se calcula asistirán a losJuegos Olímpicos que se celebraránen agosto de este año en Beijing (4).

Los métodos microbiológicos “con-vencionales”, empleados actualmenteen numerosos laboratorios de todo elmundo y establecidos en muchoscasos como métodos estándares deanálisis microbiológico de los alimen-tos, se caracterizan por ser laborio-sos, emplear grandes volúmenes demedios de cultivo y requerir un tiempoconsiderable para la obtención y elanálisis de los resultados. Por el con-trario, los métodos rápidos requierenun tiempo reducido para la obtenciónde los resultados y/o permiten proce-sar un número elevado de muestraspor unidad de tiempo, y son en gene-ral fáciles de usar, precisos (sensibili-dad y especificidad adecuadas y lími-tes de detección bajos) y económica-mente rentables (aunque, en algunoscasos, pueden requerir una inversióneconómica inicial considerable).Conviene destacar que, en la mayoríade los casos, el empleo de métodosrápidos no excluye la etapa de enri-quecimiento del microorganismodiana ni la necesidad de obtener culti-vos puros, así como que los resulta-dos positivos obtenidos con métodosalternativos (distintos del método dereferencia) deben ser confirmados.Asimismo, es de suma importancia, aligual que en el caso de los métodostradicionales, una adecuada toma ypreparación de las muestras a anali-zar. En lo que se refiere a este últimoaspecto, destacan los siguientesavances: (i) para muestras sólidas,instrumentos gravimétricos que reali-zan automáticamente las dilucionesprogramadas (Dilumat, AESChemunex; Dilumacher, PBI; LabproGravimetric Diluter, Spiral Biotech) yhomogeneizadores que funcionanmediante ondas de choque y unaintensa agitación para transferir losmicroorganismos del alimento al dilu-yente, produciendo una mínima des-trucción de la muestra (Pulsifier,

MÉTODOS RÁPIDOS Y AUTOMATIZACIÓN ENMICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA

Carmen Herranz Sorribes

Dpto. de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de Madrid

([email protected])

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Microgen); (ii) para muestras líquidas,sistemas rápidos para realizar dilucio-nes seriadas (sistema Dilucup,LabRobots Products AB); (iii) paramuestras de superficie, esponjas pre-hidratadas con un medio de transpor-te o enriquecimiento diseñadas paraobtener muestras de lugares de difícilacceso (SpongeSicle y Extend-a-Sicle, Biotrace International) y elmétodo “manos libres” para la obten-ción de muestras de la superficie decanales mediante el empleo de cintaadhesiva (5); y (iv) para muestras deaire, instrumentos portátiles que aspi-ran un volumen determinado de aire yrecogen los microorganismos en lasuperficie del agar de placas de con-tacto para la estimación de la calidadmicrobiológica aire (SAS sampler,Bioscience International; MicroBio AirSampler, Parrett).Los métodos rápidos utilizados enmicrobiología de los alimentos pue-den dividirse en cinco grandes gru-pos, incluyendo los empleados parael recuento de células viables, para lamedición de la biomasa, los sistemasminiaturizados y kits de diagnóstico,los inmunológicos y los genéticos. Enlos siguientes apartados se tratan lasinnovaciones introducidas reciente-mente en cada uno de estos grupos.

RECUENTO DE CÉLULASVIABLES

El recuento de células viables, tantode los alimentos como de las superfi-cies en contacto con los mismos y delaire de las industrias alimentarias, esuno de los parámetros más importan-tes a la hora de determinar la calidady seguridad de los alimentos.Tradicionalmente, el recuento decélulas viables se ha realizadomediante el método estándar derecuento en placa, que, aunque sen-cillo, es laborioso, requiere un volu-men considerable de tubos de ensayoy medio de dilución, y espacio para elalmacenamiento y la incubación delas placas de cultivo. En lo que serefiere a la preparación de placas decultivo, destacan las siguientes mejo-ras: autómatas para la preparación ydistribución de medios de cultivo(Masterclave, AES Chemunex); siste-

mas que incluyen pectina como agen-te gelificante en lugar de agar, evitan-do así la necesidad de calentar elmedio para fundirlo (Redigel, 3M); ymedios liofilizados que utilizan comosoporte una película plástica de tama-ño y grosor similar al de una tarjeta decrédito que contiene geles solublesen agua fría que se rehidratan aldepositar la muestra en su superficiey que requieren un espacio mínimopara su almacenamiento e incubación(Petrifilm, 3M), existiendo asimismoinstrumentos para la lectura rápida yautomática de los resultados (Lectorde placas 3M Petrifilm, 3M). En esteapartado cabe asimismo destacar eldesarrollo de numerosos medios decultivo cromogénicos que acortan eltiempo necesario para la obtención deresultados (RAPID´ ChromogenicMethods, Bio-Rad; BBL CHROMagar,BD; medios cromogénicosbioMérieux; medios cromogénicosAES Chemunex). En cuanto a losmétodos de siembra, existen sembra-dores automáticos en espiral quereducen o eliminan la necesidad derealizar diluciones seriadas de lamuestra (Autoplate 4000, SpiralBiotech; WASP, Don Whitley ScientificLimited) y que facilitan el recuentomediante el empleo de contadoresautomáticos de colonias (Q Count,Spiral Biotech; EasyCount2, AESChemunex). Con respecto a la enu-meración de microorganismos, exis-ten sistemas basados en la simplifica-ción de la técnica del número másprobable (NMP), que poseen unrango de enumeración amplio enausencia de diluciones, tales como elsistema de filtración Isogrid/Neo-Grid(Neogen), que emplea una membranacon 1.600 celdillas o “compartimentosde crecimiento” delimitados por unarejilla hidrofóbica, y la placa SimPlate(Biocontrol), que permite recuentosde hasta 738 ufc (frente a las 300 ufcde una placa de cultivo convencional).Recientemente se ha miniaturizado yautomatizado el método NMPmediante el empleo de tarjetas dematerial plástico que contienen 3 gru-pos de 16 pocillos, con 1 logaritmo dediferencia en volumen para cadagrupo de pocillos, y medios de cultivocon indicadores fluorescentes(Tempo, bioMérieux). Este sistema

disminuye considerablemente lanecesidad de reactivos, espacio ytiempo con respecto al método NMPconvencional. Aunque la mayoría delos métodos de recuento menciona-dos están diseñados para la enume-ración de microorganismos aerobios,en los años 80, el Dr. Fung desarrollóun método ingenioso y sencillo para elrecuento de microorganismos anaero-bios, conocido como “doble tubo deFung”, que permite lograr instantáne-amente condiciones de anaerobiosisen el medio de cultivo y que norequiere sistemas generadores dehidrógeno ni jarras de anaerobiosis(6).Los métodos citados en esta secciónfacilitan de diversas maneras la reali-zación del recuento microbiano y/odisminuyen el tiempo necesario parala obtención de resultados. Sinembargo, necesitan un tiempo deincubación variable para que losmicroorganismos crezcan y puedanser detectados y enumerados. Por elcontrario, existen métodos para larealización de recuentos microbianosprácticamente en tiempo real basadosen el empleo de colorantes fluores-centes que permiten distinguir célulasvivas de muertas mediante un micros-copio de epifluorescencia (DEFT, delinglés Direct Epifluorescent FilterTechnique), escáner (ScanRDI, AESChemunex), o citómetro de flujo digi-tal (BactiFlow ALS, AES Chemunex).

MEDIDA DE LA BIOMASAMICROBIANA

Puesto que el método “convencional”de recuento de microorganismos enplaca es muy laborioso, se han des-arrollado métodos para estimar demanera indirecta el número de micro-organismos presentes en los alimen-tos. El desarrollo de dichos métodosestá íntimamente ligado al de la ins-trumentación necesaria para detectarlas señales relacionadas con el creci-miento microbiano. El principio en elque se basan estos sistemas es quedichas señales (niveles de ATP, enzi-mas específicas, pH, impedancia,conductancia y capacitancia eléctri-cas, etc.) se modifican paralelamentecon el crecimiento microbiano.

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Conviene destacar que para que lasmediciones sean significativas esnecesario establecer la correlaciónentre estos parámetros y el recuentode células viables. Todas las células vivas contienenATP, que se degrada muy rápidamen-te mediante autolisis al morir las célu-las. En presencia de la enzima lucife-rasa y el sustrato luciferina (proce-dentes de la luciérnaga), oxígeno ymagnesio, el ATP facilita el paso de laluciferina a oxiluciferina, generándoseluz (bioluminiscencia) que puede serdetectada mediante un luminómetro.La cantidad de luz emitida en estareacción es directamente proporcio-nal a la cantidad de ATP presente enla muestra, es decir, al número decélulas vivas, y está correlacionadacon la biomasa celular (la cantidad deATP de 1 unidad formadora de colonia–ufc- oscila entre 0,22 y 1,03 fg). Estemétodo (por ejemplo, el sistemaPromicol) puede emplearse para ladetección específica de ATP microbia-no en productos líquidos tales comoleche UHT, zumos, postres lácteos,etc., en los que es necesario determi-nar la presencia/ausencia de microor-ganismos. No obstante, la principalaplicación de este principio en laindustria alimentaria se encuentra enla monitorización de la higiene desuperficies. En este caso, la presen-cia de altos niveles de ATP de cual-quier origen (microbiano o no) es indi-cativa de una limpieza deficiente. Enla actualidad, existen numerosos sis-temas que utilizan dispositivos deltipo escobillón o hisopo para la tomade muestra y luminómetros portátiles,robustos, sensibles y fáciles de utili-zar que ofrecen lecturas rápidas (enmenos de 1 min) del nivel de ATP(Ultrasnap y systemSURE Plus,Hygiena; Accupoint, Neogen;Lightning MVP, Biocontrol; Clean-Trace y Uni-Lite, 3M) lo que permiteaplicar las acciones correctoras esta-blecidas en el plan de Análisis dePeligros y Puntos de Control Crítico(APPCC) antes de que se contamineel producto. Asimismo, existen siste-mas para la detección rápida de res-tos de proteínas o azúcares en lassuperficies que actúan como fuentede nutrientes para los microorganis-mos. Estos sistemas se basan en la

reacción de dichos nutrientes con losreactivos presentes en hisopos espe-ciales, lo que origina un cambio decolor (reacción semicuantitativa) quepuede detectarse visualmente (PRO-TECT, Biotrace International; PRO-Clean y SpotCheck plus, Hygiena;Clean Test, LiofilChem). De manerasimilar, puede detectarse la presenciade Listeria spp. en muestras ambien-tales de la industria alimentariamediante el uso de escobillones a losque se les añaden antibióticos, sus-tancias enriquecedoras del crecimien-to y compuestos indicadores quecambian de color en aproximadamen-te 30 h en caso de un resultado posi-tivo (InSite, Hygiena; Listeria superfi-cies PDX-LIB/Enviroswab, ParadigmDiagnostics/Tecra). Además, existenotros sistemas para la detección delcrecimiento microbiano que se basanen el empleo de instrumentos más omenos sofisticados para la monitori-zación continua de los cambios decolor del medio de cultivo relaciona-dos con la actividad metabólica micro-biana y que permiten obtener resulta-dos en pocas horas (BacT/Alert 3D,bioMérieux; Soleris, Neogen). Otro grupo de técnicas para la medidade la biomasa son las basadas en ladetección de cambios en la conducti-vidad eléctrica y la resistencia delmedio de cultivo producidas comoconsecuencia del metabolismo denutrientes de gran tamaño a molécu-las de menor tamaño y químicamentemás activas durante el crecimientomicrobiano (Bactometer, bioMérieux;RABIT, Don Whitley ScientificLimited). Puesto que se conoce quepara que estos cambios tengan lugardebe alcanzarse una población críticade aproximadamente 106 ufc/g, esposible estimar la población inicial dela muestra a partir del tiempo necesa-rio para la detección de dichos cam-bios.

SISTEMASMINIATURIZADOS Y KITSDE DIAGNÓSTICO

Los sistemas miniaturizados surgen apartir del concepto de la placa micro-tituladora (96 pocillos, formato 8x12),que permite reducir el volumen de

reactivos y medio a emplear en losensayos, así como estudiar en un for-mato manejable el efecto de un com-puesto sobre un gran número de ais-lados o el de una serie de compues-tos sobre un aislado determinado.Esta línea de investigación ha permiti-do desarrollar algunos de los mediosde cultivo selectivos que se encuen-tran en el mercado actualmente.Entre los sistemas miniaturizados deidentificación microbiana disponiblesen la actualidad, basados en el meta-bolismo de sustratos específicos porparte de los microorganismos y sudetección mediante diversos sistemasindicadores, destacan los siguientes:tarjetas desechables para la identifi-cación sencilla de colonias sospecho-sas mediante pruebas bioquímicasrápidas (O.B.I.S., Oxoid); galerías quepermiten la identificación de más de800 especies de bacterias y levadu-ras (API, bioMérieux); tubos de plásti-co con compartimentos que contienenagar con distintos sustratos y con unaaguja en su interior que posibilita lainoculación del tubo de forma rápida ysencilla a partir de una única colonia(BBL Enterotube y Oxi/Ferm Tube,BD); y soportes plásticos con pocillosde fácil inoculación que contienensustratos cromogénicos y/o fluorogé-nicos en estado deshidratado que serehidratan en contacto con la muestra(BBL Crystal, BD; RapID systems yMicroID, Remel; Biochemical IDsystems, Microgen). Uno de los siste-mas miniaturizados y automatizadosmás conocidos y sofisticados es elsistema VITEK (bioMérieux) que,basándose en cambios de color delos sustratos o en la producción degas de los cultivos inoculados en lospocillos de una tarjeta plástica quecontiene los sustratos bioquímicos enforma deshidratada, puede identificarun cultivo típico de Escherichia coli en2-4 h. Una rapidez similar en la obten-ción de resultados puede obtenersecon el sistema Biolog (AESChemunex) que detecta la capacidadde los microorganismos para oxidar95 fuentes de carbono. Los 295

(4x1028) patrones metabólicos posi-bles permiten, además de la identifi-cación, el establecimiento de relacio-nes filogenéticas entre distintos aisla-dos. El empleo de un único cromóge-


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no como indicador rédox, el violeta detetrazolio, que se reduce de formairreversible a formazán (color violeta)como consecuencia de la actividadmetabólica bacteriana, facilita la lectu-ra visual de los resultados. En cual-quier caso, la mayoría de los sistemascitados en esta sección ofrecen laposibilidad de lectura e interpretaciónde resultados de manera automática.

MÉTODOSINMUNOLÓGICOS

Los métodos inmunológicos se basanen la reacción específica entre unantígeno y un anticuerpo policlonal omonoclonal. En microbiología de losalimentos, el método inmunológicomás empleado para la detección demicroorganismos o sus toxinas es elensayo ELISA (Enzyme-LinkedImmunosorbent Assay) tipo sándwich.En los últimos años, se han desarro-llado sistemas que permiten realizarel ensayo ELISA de manera automati-zada, dirigidos fundamentalmente a ladetección de Salmonella, E. coliO157:H7, Listeria monocytogenes,Campylobacter spp. y toxinas estafilo-cócicas (Assurance EIA y TRANSIAPLATE, Biocontrol; TECRA VIA,Biotrace International; SalmonellaUNIQUE, Tecra; Detex, MolecularCircuitry Inc.). Un número considera-ble de laboratorios de microbiologíade los alimentos emplea instrumentosautomatizados basados en unavariante de la tecnología ELISA cono-cida como ELFA (Enzyme-LinkedFluorescent Assay), en la que el pro-ducto final de la reacción es fluores-cente en lugar de cromogénico, parala detección de los patógenos alimen-tarios mencionados (VIDAS,bioMérieux). En ocasiones, se utilizala técnica de separación inmunomag-nética (SIM), que emplea partículasmagnéticas recubiertas de anticuer-pos específicos (Dynabeads, Dynal),para concentrar el antígeno de interéscomo etapa previa a la realización delELISA. La SIM permite reducir eltiempo requerido para el enriqueci-miento de la muestra, así como obte-ner suspensiones que contienenmenor cantidad de partículas del ali-mento, lo que facilita su procesado

posterior mediante distintas técnicas(hibridación con sondas génicas,PCR, etc.). Para laboratorios con unvolumen moderado de muestras aanalizar existen kits de diagnósticobasados en el principio de la inmuno-cromatografía de flujo lateral caracte-rizados por ser rápidos, sencillos y norequerir instrumentación especial(VIP, Biocontrol; Reveal, Neogen;RapidChek, Strategic Diagnostics).Otro tipo de ensayos inmunológicosrápidos y listos para usar son losbasados en la inmunodifusión en unvial de agar para la detección rápidade serovares mótiles de Salmonella(1-2 Test, Biocontrol) o en la aglutina-ción reversa pasiva con partículas delátex para la detección de microorga-nismos patógenos (Microscreen,Microgen Bioproducts) y toxinasmicrobianas (RPLA kits, Oxoid)

MÉTODOS GENÉTICOS

A diferencia de los métodos citadosen las secciones anteriores, quedetectan características fenotípicassujetas de manera natural a variación,los métodos genéticos se dirigen a ladetección de características celularesmucho más estables contenidas enlos ácidos nucleicos. Una técnicapara detectar dichas característicasen ausencia de instrumentación espe-cializada es la hibridación de ácidosnucleicos. Los ensayos comercialesactuales emplean sondas genéticas(oligonucleótidos sintéticos) marca-das enzimáticamente que, tras hibri-dar con regiones específicas del ARNribosómico (una célula bacterianapuede contener hasta 10.000 copiasde ARN ribosómico frente a una únicacopia de ADN cromosómico), catali-zan una reacción que da lugar a unproducto coloreado a partir de un sus-trato cromogénico, lo que es indicati-vo de la presencia del microorganis-mo en el alimento (GeneQuence,Neogen). En los últimos años es cadavez más frecuente en los laboratoriosde microbiología de los alimentos elempleo de la reacción en cadena dela polimerasa (PCR) para amplificar elADN de los microorganismos diana ydisponer así de una cantidad suficien-te que permita su detección. Se trata

de una técnica específica, sensible(en teoría, puede detectar una únicacopia del ADN diana en el alimento;en la práctica se necesitan unas 103ufc/ml para una detección reproduci-ble) y rápida, a lo que contribuye eldesarrollo de metodologías alternati-vas de detección de los productos dePCR que evitan el procesamientopost-reacción. Dichas metodologíasestán basadas en el empleo de agen-tes intercalantes (por ejemplo, SYBRGreen) o sondas específicas condoble marcaje fluorescente que, ade-más de posibilitar la “visualización”del progreso de la reacción, facilitanla automatización del proceso y per-miten la cuantificación de la cantidadde DNA diana presente inicialmenteen la muestra (PCR cuantitativo entiempo real). A pesar de tratarse deuna técnica sofisticada, el empleo dela técnica de PCR en tiempo real en ellaboratorio de microbiología de los ali-mentos se está viendo facilitado enlos últimos años por el desarrollo desistemas para la detección de patóge-nos de los alimentos que son fácilesde utilizar, requieren una manipula-ción mínima y reducen la necesidadde interpretación de los resultados(BAX Q7, Du Pont Qualicon; iQ-Check, Bio-Rad; TaqMan PathogenDetection Kits, Applied Biosystems;Roche/Biotecon DiagnosticsLightCycler, Roche; Warnex, AESChemunex). La técnica de PCR cuan-titativo en tiempo real es una de lasopciones más prometedoras en loslaboratorios de control de calidad delos alimentos, no solo para la identifi-cación y cuantificación de microorga-nismos, sino también para la determi-nación de la presencia de organismosmodificados genéticamente en mate-rias primas y productos terminados ypara la autentificación de productosen los que pueda producirse un frau-de por sustitución de especies porotras de menor valor comercial.La investigación epidemiológica debrotes alimentarios y la monitoriza-ción rutinaria de microorganismos enel ambiente requiere sistemas quesean capaces de identificar los micro-organismos más allá del nivel deespecie. Para ello, partiendo de unacolonia de cultivo puro, puedenemplearse procedimientos automati-

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zados basados en la hibridación desondas específicas con fragmentosde restricción del ADN (Riboprinter,DuPont Qualicon) o técnicas más difí-cilmente automatizables y que requie-ren analistas cualificados para su rea-lización e interpetación (Pulsed FieldGel Electrophoresis, PFGE;MultiLocus Sequence Typing, MLST).

SUMARIO YPERSPECTIVAS

Los métodos rápidos y automatiza-dos en microbiología de los alimen-tos representan un área de la micro-biología aplicada en continua expan-sión. La rapidez en la obtención deresultados es esencial en la indus-tria alimentaria para reducir los tiem-pos de espera en los procesos deproducción y liberar más rápidamen-te los lotes producidos. Además, larapidez es fundamental en un pro-grama de APPCC exitoso, ya quepermite la aplicación de accionescorrectoras durante el procesado delos alimentos. El tiempo ahorradomediante el empleo de estos méto-dos puede utilizarse para otras tare-as tales como revisar el plan deAPPCC, ampliar los planes de con-trol de patógenos y de análisis quí-micos (micotoxinas, antibióticos,

alérgenos, etc.), formar a los emple-ados en los riesgos microbiológicos,etc. Aunque en la actualidad la mayoríade las técnicas rápidas se dirigen ala detección de bacterias, es previsi-ble que se desarrollen nuevos méto-dos para la identificación rápida devirus y parásitos implicados en latransmisión de enfermedades a tra-vés de los alimentos. Asimismo, seespera que en el futuro próximo seincremente el uso de los biosenso-res en la industria alimentaria y delos microchips para la detecciónsimultánea de varios patógenos, asícomo de envases inteligentes quealerten a los consumidores sobre lapresencia de microorganismos alte-rantes o patógenos en los alimentos.Asistir a próximas ediciones delcurso sobre Métodos Rápidos yAutomatización en MicrobiologíaAlimentaria será sin duda una exce-lente manera de estar al día de losavances que se produzcan en estedinámico campo.

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6.- Fung, D.Y.C. y C.M. Lee (1981). Double-tube

anaerobic bacteria cultivation system. Food

Science, 7: 209-213.

NotaLa información contenida en este artí-culo se basa en las referencias cita-das en la Bibliografía y en el manualdel “VI Workshop sobre MétodosRápidos y Automatización enMicrobiología Alimentaria” (Bellaterra,20-23 noviembre de 2007). Los nom-bres de productos e instrumentoscomerciales y de las empresas quelos comercializan se citan únicamentea título informativo y no implican enningún caso la recomendación expre-sa de un producto concreto frente aotros de características similares.

Rapid methods and automationin microbiology is a dynamicarea in applied microbiology

dealing with the study of improvedmethods in the isolation, early detec-tion, characterization, and enumera-tion of microorganisms and their pro-ducts in clinical, pharmaceutical, food,industrial, and environmental sam-

ples. In the past 25 years this field hasemerged into an important sub-divi-sion of the general field of appliedmicrobiology and is gaining momen-tum nationally and internationally asan area of research and application tomonitor the numbers, kinds, andmetabolites of microorganisms relatedto food spoilage, food preservation,

food fermentation, food safety , andfoodborne pathogens.Medical microbiologists started to beinvolved with rapid methods aroundmid-1960's and started to acceleratein the 1970's and continue develop-ments in the 80's, 90's and up to thepresent day. Other disciplines such asFood, Pharmaceutical,

RAPID METHODS AND AUTOMATION INMICROBIOLOGY: 25 YEARS OF DEVELOPMENTS

AND PREDICTIONSDaniel Y.C. Fung

Ph.D., Professor of Food ScienceKansas State University, Manhattan, Kansas

University Distinguished Professor, UAB, Barcelona, Spain


VI WORKSHOP MRAMA

Environmental, and FoodMicrobiology were lagging about 10years behind. Many symposia andconferences were held nationally andinternationally to discuss the develop-ments in this important applied micro-biology topics. The current RapidMethods and Automation in FoodMicrobiology Workshop in Barcelona,Spain is an example of such an effortto provide up-dated information andconstructive discussions on this topic.

AAddvvaanncceess iinn VViiaabbllee CCeellll CCoouunnttss aanndd

SSaammppllee PPrreeppaarraattiioonn

The number of living organisms in theproduct, on the surface of manufactu-ring environment and the air of pro-cessing plants is very important forthe food science and industry. Colonyforming units (CFU) is the standardway to express the microbial loads. Inthe past 25 years several ingenioussystems in “massaging” or “pulsifying”the solid or liquid samples were deve-loped so that the samples are homo-geneously distributed in a disposablebag after 1 to 2 minutes of operation.Typically one ml (after dilutions) is pla-ced into melted agar to encouragemicroorganisms to grow into discretecolonies for counting (CFU/ml). Thesecolonies can be isolated and furtheridentified as pathogenic or non patho-genic organisms. In the past 25 years,convenient systems such as nutrienthoused in films (Petrifilm), mechanicalinstrument to spread a sample overthe surface of a preformed agar plate(Spiral plater), trapping microorga-nisms on a bacteriological membraneand look for growth of target microor-ganisms on selective and non-selecti-ve culture media (Isogrid), non-ther-mal Pectin-Ca gel system (Micrology,Inc.), etc. greatly help to reduce labortime in performing viable cell count.The 3 or 5 tube Most ProbableNumber (MPN) system has been inuse for more than 100 years in watertesting and food testing but the proce-dure is very labor intensive and utili-zes large amounts of test tubes andmedia. In 2007 a completely mechani-zed, automated, and hands-off 16tube, three dilution MPN systemnamed TEMPO by bioMerieux isbeing marketed for ease of operationof this tedious but yet powerful MPN

viable cell count procedure used inPublic Health, Pharmaceutical andFood laboratories around the world.Results indicated that TEMPO provi-ded equivalent data compared withstandard viable cell count methods.This author predicts that TEMPO willbe very successful in food and watermicrobiology in the near and far futu-re. As a guide the following FUNG scaleon viable cell counts has been develo-ped:

0 to 2 log CFU/ g, ml, or cm2

Low count, no concern


Intermediate count, slight concern


High count, definite concern

7 log CFU/ g, ml, or cm2

Index of Spoilage, serious concern


Odor, unacceptable


Slime, highly unacceptable


Discard immediately

This scale is for general microbialpopulation of food and water. No foodpathogens are allowed (e.g.Salmonella, Listeria monocytogenes,Escherichia coli O157:H7,Campylobacter jejuni, etc.) especiallyin cooked ready-to-eat foods.

Also in the case of food fermentationhigh number of good bacteria such aslactic acid bacteria, and yeasts are tobe expected and encouraged such asin cheese and yoghurt making, beerand wine, bread, sauerkraut, andother fermented foods.

AAiirr SSaammpplleess aanndd SSuurrffaaccee SSaammpplleess

The Food industry also needs to ascer-tain the air quality as well as surfacesfor product manufacturing, storage, andtransportation. An active air samplinginstrument can “suck” a known volumeof air and deposit it on an agar surface(impaction) or trapped it in liquid (impin-

gement) to obtain CFU/ m3 or ml. Avariety of swabs, tapes, sponges, con-tact agar methods have been develo-ped to obtain surface count of Foodmanufacturing environment.Fung scale for air and surface sam-ples:

Total Counts for Air Samples

0-100 CFU/m3

Acceptable count

100-300 CFU/m3

Intermediate count

>300 CFU/m3

Too high, need corrective action needed

Note: In Singapore >500 CFU/m3 isnot allowed in food plants.

Total Counts for Food ContactSurfaces such as forks, knives, dis-hes, spoons, chopping blocks, tabletops, glass for drinking water, etc.

0-10 CFU/cm2

Acceptable count

10-100 CFU/cm2

Intermediate count

>100 CFU/cm2

Too high, corrective actions needed

AAeerroobbiicc,, AAnnaaeerroobbiicc,, aanndd ““RReeaall TTiimmee””

VViiaabbllee CCeellll CCoouunnttss

By use of the correct gaseous envi-ronment or suitable reducing com-pounds one can obtain aerobic, anae-robic, facultative anaerobic microbialcounts of products. Typically microbialcounts were obtained in 24 to 48hours. Several methods have beendeveloped and tested in recent yearsthat can provide “real” time viable cellcounts such as the use of “Vital”stains (Acridine Orange) to reportliving cells under the microscope tocount fluorescing viable cells or mea-suring ATP of micro-colonies trappedin a special membranes. These realtime test can give viable cell counts inabout 1 to 4 hours.A simple Fung Double Tube systemusing appropriate agar and incubation

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conditions has been developed andtested in Hawaii recreational waters in2007 that can provide a Clostridiumperfringens count for water testing in 6hours. The Fung/Fujioka scale for beachwater in Hawaii, USA based on singlesample concentrations (CFU/ml) ofClostridium perfringens using theFung Double Tube (FDT) methods isas follows: Tabla 1.

AAddvvaanncceess iinn MMiinniiaattuurriizzaattiioonn aanndd

DDiiaaggnnoossttiicc KKiittss

Identification of normal flora, spoilageorganisms, clinical and foodbornepathogens, starter cultures, etc. inmany specimens is an important partof food microbiology. In the past 25years many miniaturized diagnostickits have been developed and widelyused to conveniently introduce thepure cultures into the system andobtain reliable identification in as shortas 2 to 4 hrs. Some systems can han-dle several or even hundreds of isola-tes at the same time. These diagnos-tic kits no doubt saved many lives byrapidly, accurately, and convenientlyidentifying pathogens so that treat-ments can be made correctly andrapidly. Fung is a pioneer in the deve-oopment of these type of system star-ting at around 1970's. There are about20 miniaturized systems on the mar-ket to identify pathogens ranging fromenterics (Salmonella, Shigella,Proteus, Enterobacter, etc.) to non-fermentors, anaerobes, gram positi-ves, and even yeasts and molds.

AAddvvaanncceess iinn IImmmmuunnoollooggiiccaall TTeessttiinnggss

Antigen and antibody reaction hasbeen used for decades for detectingand characterizing microorganismsand their components in medical anddiagnostic microbiology. This is thebases for serotyping bacteria such asSalmonella, Escherichia coliO157:H7, Listeria monocytogenes,

etc. Both polyclonal antibodies andmonoclonal antibodies have beenused extensively in applied foodmicrobiology. The most popular for-mat is the “Sandwiched” ELISA test.Recently some companies have auto-mated the entire ELISA procedureand can complete an assay from 45minutes to 2 hours after overnightincubation of the sample with suspecttarget organisms. Lateral FlowTechnology (similar to pregnancy testwith three detection areas on a smallunit) offers a simple and rapid test fortarget pathogens (e.g. E. coli O157)after overnight incubation of food orallergens (e.g. wheat gluten) The enti-re procedure takes only about 10minutes with very little training neces-sary. A truly innovative developmentin applied microbiology is the immu-no-magnetic separation (IMS) system.Very homogenize paramagneticbeads have been developed whichcan be coated with a variety of mole-cules such as antibodies, antigens,DNA, etc. to capture target cells suchas E. coli O157, Listeria,Cryptosporidium ,Giardia, etc. Thesebeads can then be immobilized, cap-tured and concentrated by a magnetstationed outside a test tube. Afterclean-up, the beads with the capturedtarget molecules or organisms can beplated on agar for cultivation or usedin ELISA, Polymerase Chain Reaction(PCR), microarray technologies, bio-chips, etc. for detection of target orga-nisms. Currently many diagnosticsystems (ELISA test, PCR, etc.) arecombining an IMS step to reduceincubation time and increase sensiti-vity of the entire protocol. Using thePathatrix system of capturing circula-ting enriched meat samples by IMSFung=s laboratory can detect E. coliO157:H7 in 5.25 hours from the timeof enriching the meat sample to thetime of ELISA results of the presenceor absence of the pathogen.

AAddvvaanncceess iinn IInnssttrruummeennttaattiioonn aanndd

BBiioommaassss MMeeaassuurreemmeennttss

Instruments can be used to automati-cally monitor changes (such as ATPlevels, specific enzymes, pH, electri-cal impedance, conductance, capaci-tance, turbidity, color, heat, radioacti-ve carbon dioxide, etc.) of a popula-tion (pathogens or non-pathogens)growth kinetic and dynamics in aliquid and semi-solid sample. It isimportant to note that for the informa-tion to be useful, these parametersmust be related to viable cell count ofthe same sample series. In general,the larger the number of viable cells inthe sample, the shorter the detectiontime of these systems. A scatter gramis then plotted and used for furthercomparison of unknown samples. Theassumption is that as the number ofmicroorganisms increases in the sam-ple, these physical, biophysical, andbiochemical events will also increaseaccordingly. When a sample has 5 logor 6 log organisms/ml, detection timecan be achieved in about 4 hrs. Someinstruments can handle hundreds ofsamples at the same time.

AAddvvaanncceess iinn GGeenneettiicc TTeessttiinnggss

Phenotypic expression of cells aresubject to growth conditions such astemperature, pH , nutrient availability,oxidation-reduction potentials, etc.Genotypic characteristics of a cell isfar more stable. Hybridization of DNAand RNA by known probes has beenused for more than 30 years. Morerecently Polymerase Chain Reaction(PCR) is now an accepted method todetect viruses, bacteria and evenyeast and molds by amplification ofthe target DNA and detecting the tar-get PCR products. By use of reversetranscriptase, target RNA can also beamplified and detected. After a DNA(double stranded) molecule is denatu-red by heat (e.g. 95C), proper primerswill anneal to target sequences of thesingle stranded DNA of the targetorganism, for example Salmonella ata lower temperature (e.g. 37C). Apolymerase (TAQ) will extend the pri-mer at a higher temperature (e.g.70C) and complete the addition ofcomplement bases to the single stran-ded denatured DNA. After one ther-mal cycle one piece of DNA will beco-

Tabla 1.

I 0 <10 CFU Uncontaminated II 1-10 CFU 10-100 CFU Non-point contaminationIII 11-50 CFU 110-500 CFU Sewage contamination IV >50 CFU >500 CFU Elevated Sewage Contamination

Pollution Extrapolatedcategory FDT FDT Scale of beach pollution


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me two pieces. After 21 and 31 cyclesone piece will become 1 million and 1billion copies, respectively. At thebeginning PCR products are detectedby gel electrophoresis . Now inge-nious ways to detect either the occu-rrence of the PCR procedure by fluo-rescent probes or special dyes, or byactually reporting the presence of thePCR products by molecular beacon.Since these methods generate fluo-rescence, the PCR reaction can bemonitored over time and provide “real-time” PCR results. Some systems canmonitor 4 different targets in the samesample (multiplexing). These methodsare now standardized and easy to useand interpret. To further characterize closely relatedorganisms, detail analysis of the DNAmolecule can be made by obtainingthe patterns of DNA of specific orga-nisms by pulse field gel electrophore-sis (DNA finger-printing) or by“Riboprinting” of the ribosomal genesin the specific DNA fragment. Sincedifferent bacteria exhibit different pat-terns (e. g. Salmonella versus E. coli)and even the same species can exhi-bit different patterns (e. g. Listeriamonocytogenes has 49 distinct pat-terns), these information can be usedto compare closely related organismsfor accurate identification of targetpathogens (such as comparing diffe-rent patterns of E. coli O157:H7 isola-ted from different sources in an out-break) for epidemiological investiga-tions.

AAddvvaanncceess iinn BBiioosseennssoorr,, MMiiccrroocchhiippss,,

aanndd NNaannootteecchhnnoollooggyy

Biosensor is an exciting field inapplied microbiology. The basic ideais simple but the actual operation isquite complex and involves much ins-trumentation. Basically, a biosensor isa molecule or a group of molecules ofbiological origin attached to a signalrecognition material. When an analytecomes in contact with the biosensorthe interaction will initiate a recogni-tion signal which can be reported in aninstrument. Many types of biosensorshave been developed. Sometimewhole cells can be used as biosen-sors. Analytes detected include toxins,specific pathogens, carbohydrates,insecticides and herbicides, ATP, anti-

biotics, etc. The recognition signalsused include electrochemical (e.g.potentiometry, voltage changes, con-ductance and impedance, lightaddressable, etc.), optical (such asUV, bioluminescence, chemilumines-cence, fluorescence, laser scattering,reflection and refraction of light , sur-face phasmon resonance, polarizedlight, etc.) and miscellaneous transdu-cers (such as piezoelectric crystals,thermistor, acoustic waves, quartzcrystal, etc. Recently, much attention has beendirected to “biochips” and “micro-chips” developments to detect a greatvariety of molecules including food-borne pathogens. Due to the advan-cement in miniaturization technologyas many as 50,000 individual spots (e.g. DNA microarrays) with each spotcontaining millions of copies of a spe-cific DNA probe can be immobilizedon a specialized microscope slide.Fluorescent labeled targets can behybridized to these spots and bedetected. Biochips can also be desig-ned to detect all kinds of foodbornepathogens by imprinting a variety ofantibodies or DNA molecules againstspecific pathogens on the chip for thesimultaneous detection of pathogenssuch as Salmonella, Listeria,Escherichia coli, Staphylococcusaureus, etc. The market value is esti-mated to be as high as $5 billion atthis moment. This technology is espe-cially important in the rapidly develo-ping field of proteomics and genomicswhich require massive amount of datato generate valuable information.Nanotechnology is starting to makemajor advances in pure and appliedsciences, including Food Science andApplied Microbiology.

TTeessttiinngg TTrreennddss aanndd PPrreeddiiccttiioonnss

There is no question that many micro-biological tests are being conductednationally and internationally in agri-cultural and food products, environ-mental samples, medical specimens,and water samples. The most populartests are total viable cell count, coli-form/E. coli count and yeast and moldcounts. A large number of tests arealso performed on pathogens such asSalmonella, Listeria and Listeriamonocytogenes, E. coli O157:H7,

Staphylococcus aureus, Campylo-bacter and other organisms.According to reliable sources in 1998,the worldwide microbiological testswas estimated to be 755 million testswith a market value of US$1 billion.The projection is that in 2008 the num-ber of tests will be about 1.5 billiontests with a market value of US$5billion. In 2007 about one third of thetests are being performed in NorthAmerica (USA and Canada), anotherthird in Europe, and the last third inthe Rest of the World. This author pre-dicts in twenty year the Rest of theWorld will perform 50 % of the testswith North America and Europe per-forming 25% each. This is due to rapideconomic developments and food andhealth safety concerns of the world inthe years to ahead.

PPrreeddiiccttiioonn ooff tthhee FFuuttuurree

The following are the ten predictionsmade by the author in 1995. Manypredictions have been correct in 2007.(+) is a good prediction. (?) is anuncertain prediction.

1. Viable cell counts will still be usedin the next 25 years. (+)

2. Real-time monitoring of hygienewill be in place. (+).

3. PCR, Ribotyping, and genetic testswill become reality in food laborato-ries. (+)

4. ELISA and immunological testswill be completely automated andwidely used. (+)

5. Dipstick technology will providerapid answers. (+)

6. Biosensors will be in place forHazard Analysis Critical ControlPoint programs. (?)

7. Biochips, microchips, and nano-technology will greatly advance inthe field. (+)

8. Effective separation, concentrationof target cells will assist rapid iden-tification. (+)

9. A microbiological alert system willbe in food and other packages. (?)

10. Consumers will have rapid alertkits for pathogens at home. (?)

In conclusion, it is safe to say that thefield of rapid method and automationin microbiology will continue to grow innumbers and kinds of tests to be done

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in the future due to the increase con-cern on food safety and public health.The future looks very bright for thefield of rapid methods and automationin microbiology. The potential is greatand many exciting developments willcertainly unfold in the near and farfuture in Food Microbiology and otherapplied microbiology areas.

References

1.- 1.- Fung, D. Y. C. 2002. Rapid Methods and

Automation in Microbiology. Comprehensive

Reviews in Food Science and Food Safety.

Inaugural Issue, Vol 1(1), 3-22 (www.ift.org).

2.- Fung, D. Y. C., R. Fujioka, K. Vijayavel, D.

Sato, and D. Bishop. 2007. Evaluation of Fung

Double Tube for Clostridium perfringens and

Easyphage Test for F-Specific RNA Coliphages

as Rapid Screening Tests for Fecal

Contamination in Recreational Waters in Hawaii.

Journal of Rapid Methods and Automation in

Microbiology, Vol 15(3), 217-229.

BiographicDetails

Daniel Y. C. Fung, M.S.P.H., Ph.D., is a

Professor of Food Science at Kansas State

University (KSU). He is the Founder and

Director of the world renowned International

Workshop of Rapid Methods and Automation in

Microbiology since 1981 at KSU. He has publis-

hed more than 800 papers and is a Fellow of

American Academy of Microbiology, Institute of

Food Technologists and International Academy

of Food Science and Technology. In 2006 he

was honored as Universitiy Distinguished

Professor at Universitat Autonoma de

Barcelona, Spain. In 2007 he completed 33

Ph.D. and 67 M.S. degree students as the Major

Professor. In 2007 he won the Inaugural

Outstanding Educator in Food Safety Award

given by Food Safety Magazine and ConAgra

Foods and presented at the 2007 International

Association for Food Protection Annual meeting

in Florida.

NORMAS PARA LOS AUTORESALIMENTARIA considerará para su publicación todos aquellos trabajos de carácter técnico y científico

relacionados con la tecnología, la elaboración y el control de los alimentos. La revista consta de las siguientes

secciones para la aceptación de trabajos: Artículos originales, revisiones y cartas al editor.

! Exclusivamente podrán remitirse para su publicación trabajos que no hayan sido editados previamente en otras

publicaciones, de cualquier naturaleza o contenido editorial.! El texto podrá ser redactado en español o en inglés, y deberá incluir un resumen (abstract) en ambos idiomas. La

extensión recomendada para los abstracts es de 12-15 líneas.! Se aconseja que la estructura de los trabajos sea la siguiente: Introducción, métodos, resultados, discusión/conclusiones,

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distribución, comunicación pública, o cualquier otra forma que Eypasa –Alimentaria pueda considerar oportuna.

90 � Alimentaria Junio 08

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INTRODUCCIÓN

La Directiva 98/83/CE (1) especificaun método oficial de análisis paracada uno de los parámetros microbio-lógicos del control de las aguas desti-nadas al consumo humano. En elcaso de las bacterias coliformes yE.coli, la metodología es la descritaen la norma ISO 9308-1:2000 (2),basada en el método de filtración demembrana utilizando el agar lactosaTTC Tergitol (en lo sucesivo, TTC)incubado a 36ºC. No obstante, estáprevista la posibilidad de utilizar méto-dos alternativos, siempre y cuandolos estados miembros faciliten toda lainformación de interés sobre dichosmétodos y su equivalencia.La Comisión Europea ha establecidoun comité (EMAG) para asesorarsobre los aspectos microbiológicos dela Directiva. Este grupo ha recomen-dado a la Comisión que los datos pre-sentados para demostrar la equiva-lencia de métodos alternativos debe-ría cumplir con los requisitos del pro-cedimiento ISO para los estudios deequivalencia de métodos microbioló-gicos (ISO 17994:2004) (3).Bajo los auspicios de la Comisión deNormalización y Validación (CNV) de laSociedad Española de Microbiología(SEM) y de la Comisión 2ª de laAsociación Española de Abastecimien-to y Saneamiento (AEAS) se han reali-zado (2004 – 2006) tres estudios enparalelo para comprobar si, con otrosmétodos alternativos (Colilert,Chromocult, m-Endo/m-FC), utilizadospor laboratorios españoles, se obtienenresultados equivalentes o significativa-mente más altos en el análisis de bacte-rias coliformes y E.coli que con el méto-do de referencia (TTC) descrito en lanorma ISO 9308.

Antes de iniciarse el estudio, los parti-cipantes fueron entrenados en la eje-cución de los distintos métodos y enla preparación de muestras desinfec-tadas para asegurar que, en lo posi-ble, el trabajo se llevara a cabo deforma idéntica en todos los laborato-rios (4). El análisis estadístico deequivalencia se realizó de acuerdocon el procedimiento ISO 17994 (3).De acuerdo con este procedimiento,la comparación debe hacerse entreresultados confirmados. El test deequivalencia estándar se ha efectua-do confirmando los resultados analíti-cos de acuerdo con los criterios deconfirmación del método de referen-cia (TTC): un coliforme es un presun-tivo confirmado como citocromo oxi-dasa negativo; una E.coli es un pre-suntivo oxidasa negativo e indol posi-tivo a 44ºC.Los resultados obtenidos para E.coli,de acuerdo con el test de equivalen-cia estándar, presentan un elevadonúmero de falsos positivos, lo cual haaconsejado tener en cuenta otros cri-terios alternativos para la identifica-ción de E.coli, basados en la actividaddel enzima ß-D-glucuronidasa sobreun substrato definido (en el Colilert,metil-umbeliferil glucurónido, MUG)De acuerdo con el EMAG, para queun método alternativo sea aceptadodebe demostrar ser equivalente omejor que el de referencia en el ejer-cicio de equivalencia, para lo cualdebe cumplirse la condición de que ladiferencia relativa media (x) entreambos métodos tenga una incerti-dumbre expandida (U) tal que secumpla que x-U > -0,10. Además,cuando se cumple esta condición,casi siempre x tiene valor positivo,pues, si fuera negativo, para que x-U> -0,10, la incertidumbre debería serinusualmente baja (U<0,10).

MÉTODOS

PPrreeppaarraacciióónn ddee mmuueessttrraass

Las muestras estudiadas se prepara-ron en su mayor parte (sin desinfectaro desinfectadas) mediante la dilucióncon agua de grifo de un efluentesecundario, hasta el rango esperadode 10-80 microorganismos por 100ml. También se utilizaron muestras deagua subterránea o de agua superfi-cial natural. En la preparación demuestras desinfectadas se utilizó casisiempre efluente de aguas residualesy no agua superficial. El procedimien-to usado para la preparación demuestras desinfectadas fue el descri-to en The Microbiology of DrinkingWater (4). Muy brevemente: efluentessecundarios decantados de agua resi-dual se diluyeron con agua de grifo aaproximadamente 1:10 - 1:20, paraproducir 10 L de muestra diluida y seañadió una solución de cloro libreapropiada (generalmente 10-15 mg).Tras una buena agitación manual delos frascos con las muestras, se pro-siguió de modo mecánico utilizandoun agitador magnético. Submuestrasde 500 mL se iban tomando a interva-los de un minuto, neutralizando elcloro presente con tiosulfato sódico.Las submuestras se cuantificaronpara bacterias coliformes y E. coli uti-lizando Colilert 18-Quantitray y sealmacenaron a 2-8ºC. Las dilucionesde las submuestras de las que seesperaba que dieran recuentos de 10-80 fueron las usadas para producir lasque se considerararon muestras parala comparación de ambos métodos,aunque se aprovecharon también lasque, en contra de lo esperado, pro-porcionaron recuentos en el intervalo0-10 por lo menos con uno de los dosmétodos a comparar (sobre todo para

EJERCICIOS DE EQUIVALENCIA ENTRE MÉTODOSDE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO: EL EJEMPLO DELEJERCICIO ESPAÑOL DE BACTERIAS COLIFORMES

Y ESCHERICHIA COLI Ferrán Ribas

Aigües de Barcelona, AGBAR – [email protected]

91

VI WORKSHOP MRAMA

E. coli). Es imprescindible efectuartodas las comparaciones entre losdos métodos utilizando alícuotas pro-cedentes del mismo frasco.

PPrroocceeddiimmiieennttooss ppaarraa eell rreeccuueennttoo ddee

bbaacctteerriiaass ccoolliiffoorrmmeess yy EE.. ccoollii

El método descrito en la norma ISO9308-1, basado en el agar lactosaTTC Tergitol 7 (5) incubando a 36ºC,fue utilizado tanto para la detecciónde bacterias coliformes como de E.coli. Aunque este procedimiento tengael inconveniente de presentar mem-branas con un crecimiento significati-vo de microbiota acompañante distin-ta a la diana, nos permitió llevar acabo una comparación usando lanorma ISO en las condiciones estric-tas descritas en su texto. Este métodoconsidera bacterias coliformes las lac-tosa positivas que son oxidasa nega-tivas y como E. coli las bacterias coli-formes capaces de producir indol deltriptófano a 44ºC. Para los tres ejerci-cios se utilizó TTC-Tergitol agar de lafirma Bio-Rad (Marnes-la-Coquette,Francia).El procedimiento en medio líquidocromogénico para la ß-D-galactosida-sa y fluorogénico para la ß-D-glucuro-nidasa, con recuento por el númeromás probable (NMP), elegido comoalternativa en el primer ejercicio hasido el Colilert®-18/Quanti-Tray“® (6)(IDEXX Laboratories, Inc.,Westbrook, Maine, EUA) y los análisisse efectuaron de acuerdo con las ins-trucciones del fabricante.En el segundo estudio se ha usado elChromocult® Coliformes Agar (7)

(Merck, Darmstadt, Alemania).Aunque para el análisis de muestrasde aguas de distribución se recomien-da el citado medio de cultivo sin adi-ción de antibióticos, el protocolo deobtención de muestras ha recomen-dado para este ejercicio la utilizacióndel medio con adición de 5 mg/L decefsulodina y 5 mg/L de vancomicina.

Los procedimientos basados en losmedios de cultivo m-Endo y m-FC (8)utilizan también la fermentación de lalactosa como criterio definitorio debacteria coliforme y el carácter indol-positivo a 44ºC como criterio definito-rio de E.coli. Ambos medios de cultivose utilizaron de la firma Biolife(Milano, Italia).Para cada uno de los citados mediosde cultivo, los distintos laboratoriosutilizaron el mismo lote. Todos los fil-tros de membrana de acetato de celu-losa de 0,45 mm utilizados para losanálisis en TTC, Chromocult, m-Endoy m-FC fueron de MilliporeCorporation (Bedford, MA, EUA)

CCoonnffiirrmmaacciióónn ee iiddeennttiiffiiccaacciióónn ddee llaass

cceeppaass aaiissllaaddaass

Se describen las necesidades de con-firmación de cepas únicamente basa-das en las comparaciones estándar,así como las confirmaciones e identi-ficaciones complementarias deriva-das de la voluntad de efectuar compa-raciones alternativas y un estudiomás exhaustivo de las cepas. Según el protocolo de laboratorio, seconfirmaron todas las colonias o"pocillos" (caso del Colilert) presunti-vos cuando el recuento estaba com-

prendido entre uno y diez. En el casode recuentos superiores a diez, seseleccionaron diez colonias o "poci-llos" al azar para llevar a cabo la con-firmación. En el caso del procedimien-to Colilert®-18, los cultivos selecciona-dos de los pocillos fluorescentes fue-ron un subconjunto de los (diez) poci-llos amarillos. En el caso del procedi-miento Chromocult, las colonias aconfirmar se repartieron de modo pro-porcional a su relativa abundanciaentre las de color rojo-salmón (pre-suntivas de ser un coliforme no-E.coli) y las de color azul-violeta (pre-suntivas de E. coli).

AAnnáálliissiiss eessttaaddííssttiiccoo

Según los principios del procedimien-to ISO 17994 (3), la comparación dedos métodos se basa en la diferenciarelativa media de los recuentos confir-mados. La diferencia relativa (xi) sedefine como

xi = ln(ai)-ln(bi), dondeai = recuento confirmado por el méto-

do alternativo en la muestra i

bi = recuento confirmado por el méto-do de referencia en la muestra i

Si uno de los recuentos confirmadoses cero, la fórmula que define la dife-rencia relativa se aplica comoxi = ln(ai+1)-ln(bi+1)Esto se hace para evitar la necesidadde omitir las muestras en las que sepresentan ceros. No obstante, se eli-minan las muestras en las cuales elresultado de ambos métodos es cero.La evaluación de la equivalencia sefundamenta en la diferencia relativamedia y la incertidumbre expandida

+ = diferencia positiva significativa; Eq = equivalente.Cuadro 1. Coliformes totales. Test estándar. Criterio de confirmación: oxidasa-negativos.

1 7 0,3399 0,2773 0,2095 0,1304 0,5494 +2 42 1,0644 0,8766 0,3285 0,7359 1,3929 +3 48 0,6941 0,6970 0,2012 0,4929 0,8953 +4 55 0,7604 0,9314 0,2511 0,5093 1,0115 +7 19 0,4001 0,6339 0,2908 0,1093 0,6909 +8 53 0,8966 0,7614 0,2091 0,6875 1,1057 +9 37 0,4149 0,5186 0,1705 0,2444 0,5854 +10 42 0,0907 0,4043 0,1247 -0,0340 0,2154 Eq.11 30 0,7894 0,6278 0,2292 0,5602 1,0186 +TOTAL 333 0,6612 0,7176 0,0786 0,5826 0,7398 +

Laboratorio n Diferencia Desviación Incertidumbrerelativa estándar expandida X - U X + U Evaluaciónmedia (X) (SD) (U)


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(U), basada en la desviación estándarde la media.A partir de la diferencia relativamedia (x) y la incertidumbre expandi-da, se calcula el intervalo de confian-za de la incertidumbre expandidaalrededor de la media (intervalo com-prendido entre x+U y x-U). Un méto-do alternativo es equivalente al dereferencia cuando x+U tiene un valorpositivo y x-U tiene un valor negativopero superior (inferior en valor abso-luto) a un valor D fijado de antemano.Para este tipo de ejercicios se consi-dera D = -0,10 (10 %). Si todo elintervalo entre x+U y x-U es positivo,se considera que existe una diferen-cia significativa en favor del métodoalternativo y si, por el contrario, todoel citado intervalo es negativo, ladiferencia significativa está a favordel método de referencia. Lasdemás posibilidades conducen aresultados inconcluyentes. Deacuerdo con el EMAG, para que unmétodo candidato a alternativopueda ser aceptado como tal debeser equivalente al método de refe-rencia o dar resultados significativa-mente superiores. Se consideran test estándar los quese han efectuado con recuentos con-firmados de acuerdo con los criteriosde confirmación de la norma ISO9308 y test no estándar o alternati-vos aquellos en que se han utilizadootros criterios de confirmación de losresultados.En las muestras en que no se confir-maron todos los cultivos presuntivos,el recuento confirmado de coloniasfue calculado, de acuerdo con el pro-tocolo, de la siguiente forma:

, donde b = recuento confirmado de coloniasp = recuento presuntivon = número de colonias ensayadasc = número de colonias confirmadas La fórmula general que se empleópara estimar el número más probable(NMP) de la serie Colilert®-18 de 51"pocillos", cuando se confirmarontodos los "pocillos" presuntivos, fue lasiguiente:

, dondea = recuento (NMP) confirmado por

el Colilert®-18c = número de pocillos presuntivos

confirmadosEn los casos en que se analizó soloun subconjunto de los positivos pre-suntivos, se aplicó la siguiente fórmu-la:

, dondea = recuento (NMP) confirmado por

el Colilert®-18p = número de pocillos positivos pre-

suntivosn = número de pocillos selecciona-

dos para su confirmaciónc = número de pocillos confirmados

EJERCICIO TTC-COLILERT

BBaacctteerriiaass CCoolliiffoorrmmeess

Los resultados del test de equivalenciaestándar se resumen en el Cuadro 1.La diferencia relativa media total de0,6612 indica un recuento total medio

de bacterias coliformes superior en un66% con el método Colilert®-18 encomparación con el método TTC. La mayor frecuencia de cepas lacto-sa-negativas y ß-D-galactosidasa-positivas (LAC-ONPG+) entre las ais-ladas del Colilert®-18 (5,67% vs.1,46%) no explica, por sí sola, la dife-rencia hallada de +66%. La propor-ción de falsos positivos fue de 2,02%en el Colilert®-18 y de 26,5% en elTTC. Este resultado concuerda con elhecho establecido de que el análisisde bacterias coliformes no requiereconfirmación cuando se lleva a cabousando el procedimiento Colilert®-18.En cambio, el método TTC requiereconfirmación, de acuerdo con elpárrafo 4.3 de la norma ISO 9308.

EEsscchheerriicchhiiaa ccoollii

Para el ensayo de equivalenciaestándar (criterios de confirmacióndel método de referencia TTC)(Cuadro 2) la confirmación de E. colide las cepas presuntivas aisladas conambos métodos se ha basado en unresultado indol positivo a 44ºC. Lospresuntivos ensayados a partir delTTC fueron cepas aisladas de colo-nias LAC+ que se hallaron oxidasanegativas. Los presuntivos delColilert®-18 fueron cepas aisladas delos "pocillos" fluorescentes amarillosque se hallaron oxidasa negativas.(No obstante, en este último caso, nose observó ninguna cepa que resulta-ra ser oxidasa positiva.) La diferencia relativa media total de–0,3816 mostró que, en las compara-ciones realizadas de acuerdo con loscriterios de confirmación de la normaISO 9308, la recuperación de E. coli

o = no concluyente; - = diferencia negativa significativa.Cuadro 2. Escherichia coli. Ensayo estándar de equivalencia. Criterio de confirmación: indol-positivos.

1 7 - 0,0070 0,3425 0,2589 - 0,2659 0,2519 o2 39 0,0915 1,2116 0,3880 - 0,2965 0,4795 o3 41 - 0,6154 0,9871 0,3784 - 0,9938 - 0,2370 -4 42 - 0,3055 1,0356 0,3196 - 0,6251 0,0141 o7 17 - 0,8018 1,1861 0,5753 - 1,3771 - 0,2265 -8 42 -0,8420 0,9391 0,2898 - 1,1318 - 0,5525 -9 33 -0,3770 0,9619 0,3348 - 0,7118 - 0,0422 -10 33 - 0,3164 0,7406 0,2578 - 0,5742 - 0,0586 -11 21 0,0704 0,9459 0,4127 - 0,3423 0,4831 oTOTAL 275 -0,3816 1,0318 0,1244 - 0,5060 - 0,2572 -

Laboratorio n X SD U X - U X + U Evaluación

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VI WORKSHOP MRAMA

por el método Colilert®-18 era un 38%inferior en comparación con el méto-do TTC. En un test de equivalencia no están-dar (Cuadro 3), los ensayos especia-les con el enzima ß-D-glucuronidasa(metil-umbeliferil-glucurónido, MUG,como substrato) y otras observacio-nes efectuadas ofrecen una oportuni-dad para evaluar alternativas a la con-firmación por indol.En este caso, que se ajusta más a larealidad de E.coli, los resultados delejercicio de equivalencia experimen-tan un cambio total, pues el Colilertpasa a recuperar un 33% más E.colique el TTC.

EJERCICIO TTC-CHROMOCULT

BBaacctteerriiaass CCoolliiffoorrmmeess

Once laboratorios han analizado 364muestras (cuadro 4). Para bacteriascoliformes, la valoración estadística delos resultados, con una diferencia rela-tiva media positiva (+ 0,426) y todo elintervalo entre x-U y x+U positivo, per-mite afirmar que el Chromocult recu-pera casi un 43% más que el TTC.Esta diferencia no es tan grande comola hallada en el ejercicio anterior entreel Colilert y el TTC (+66%). La contri-bución a la diferencia del 43% a favordel Chromocult por parte de cepasLAC-ONPG+ apenas supera el 5%,pues éstas representan un 8,57% delas aisladas del Chromocult (5,67% enel caso del Colilert) y un 2,80% de lasaisladas del TTC (1,46% en el ejerci-cio Colilert).Al igual que en el ejercicio Colilert, sedetectó una diferencia significativa

en los falsos positivos entreChromocult y TTC: 3,87% elChromocult y 22,6% el TTC. Aunqueel porcentaje sigue siendo bajo, elChromocult presenta casi el doble defalsos positivos que el Colilert. En elinforme final del ejercicio, se handesestimado algunos datos de algúnlaboratorio con porcentajes de cepasoxidasa-positivas en Chromocultanormalmente altas, sin lo cual lasdiferencias a favor del Colilert seríanaún superiores.


En el caso de E.coli, de acuerdo conel test de equivalencia estándar(Cuadro 5), el TTC recupera un 43%más que el Chromocult y esta ventajaes significativa porque todo el interva-lo entre x-U y x+U es negativo. Esteporcentaje es muy semejante (ligera-mente superior) al obtenido en el ejer-cicio TTC- Colilert (38%).Los presuntivos ensayados a partirdel TTC fueron, como en el ejercicioTTC-Colilert, cepas aisladas de colo-nias LAC+ que se hallaron oxidasanegativas. Los presuntivos delChromocult fueron cepas aisladas delas colonias azul-violeta que se halla-ron oxidasa negativas. Al igual que en el ejercicio TTC-Colilert, se ha llevado a cabo un testde equivalencia alternativo, identifi-cando E.coli por el criterio de la b-D-glucuronidasa (Cuadro 6).En este caso, a diferencia de lo quesucedía en el ejercicio TTC- Colilert,en el cual la diferencia relativa mediase hacía claramente positiva (+ 21%),la diferencia relativa media es sololigeramente positiva (+ 1,9%), esdecir, el TTC da valores por término

medio ligeramente inferiores, lo cual,unido a una incertidumbre expandidade 0,1004, permite afirmar que ambosmétodos son equivalentes: x-U =–0,0850 (> - 0,10).

EJERCICIO TTC-MENDO/MFC

BBaacctteerriiaass ccoolliiffoorrmmeess

La combinación de m-Endo y m-FCes el método de referencia para filtrosde membrana de coliformes totales ycoliformes fecales en los StandardMethods norteamericanos (8).La diferencia relativa media total paracoliformes (Cuadro 7) de 0,2055 indi-ca un recuento total medio de bacte-rias coliformes superior en casi un21% con el método m-Endo en com-paración con el método TTC, es decir,una ventaja significativa del estándarnorteamericano respecto al europeo. No se ha detectado una diferenciasignificativa en falsos positivos entrelos métodos m-Endo (25,9%) y TTC(28,9%), pero en ambos casos se pre-cisa confirmación de las cepas pre-suntivas. Basándose ambos métodos en la fer-mentación de la lactosa, no se haencontrado ninguna explicación a lasuperior recuperación del m-Endorespecto al TTC, a no ser la mayorfacilidad en el desarrollo y aislamientode colonias presuntivas debido a losmenores problemas relacionados conla microbiota acompañante, a causade su mayor selectividad.


A pesar de que ninguno de los dosmétodos a comparar se basa en la

o = no concluyente; - = diferencia negativa significativa.Cuadro 3. Escherichia coli. Ensayo no estándar de equivalencia. Criterio de confirmación: b-D-glucuronidasa-positivos.

1 7 - 0,0070 0,3425 0,2589 - 0,2659 0,2519 o2 37 0,8765 1,3098 0,4306 0,4459 1,3071 +3 38 0,3226 0,8193 0,2658 0,0568 0,5884 +4 47 - 0,0141 1,0572 0,3084 - 0,3225 0,2943 o7 12 0,3845 0,9613 0,5550 - 0,1705 0,9395 o8 28 0,2167 1,0747 0,4061 - 0,1894 0,6228 o9 33 -0,0689 0,7914 0,2755 - 0,3444 0,2066 o10 33 - 0,0970 0,7521 0,2618 - 0,3588 0,1684 o11 21 0,1835 1,0073 0,4396 - 0,2561 0,6231 oTOTAL 256 0,2072 1,0178 0,1272 0,0800 0,3344 +



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b-D glucuronidasa para caracterizarE. coli, este enzima se ha utilizadocomo ensayo confirmativo alternativoporque en los ejercicios TTC-Colilerty TTC-Chromocult, desarrollados demodo teóricamente paralelo (perorealmente un poco antes, lo cual hapermitido obtener conclusiones deellos antes de iniciar el presente ejer-cicio), se ha demostrado que el MUGconstituye un criterio identificativopara E.coli mucho mejor que el indol.Para el ensayo de equivalenciaestándar (criterios de confirmacióndel método de referencia TTC) se hapodido disponer de los datos de 232muestras (Cuadro 8). En ambosmétodos a comparar, los presuntivosensayados fueron cepas aisladas decolonias LAC+ (incubadas a 36ºC enel TTC y a 44ºC en el m-FC) que sehallaron oxidasa negativas. La diferencia relativa media total de–0,5485 mostró que la recuperación

de E. coli por el método m-FC era un55% inferior en comparación con ladel método TTC.Mientras que el número de muestrasestudiado para bacterias coliformesrebasa el número mínimo recomen-dado de unas 256 muestras, en elcaso de E.coli el número de mues-tras estudiado es algo inferior. Noobstante, los resultados son tan cla-ros a favor del TTC que sería imposi-ble que, aunque se estudiaran algu-nas muestras más hasta llegar a las256, variaran los resultados globalesincluso si se invirtieran del todo lastendencias.De las 751 colonias presuntivas (747oxidasa-negativas) en m-FC ensaya-das, 639 (85,1% del total y 85,5% delas oxidasa-negativas) fueron indolpositivas a 44ºC. De las 1.896 colo-nias presuntivas en TTC, 783 (41,3%) fueron indol positivas a 44ºC.Dejando aparte la mayor selectividad

del medio m-FC respecto al TTCdebido a su composición, su mayor(más del doble) porcentaje de indol-positivos se debe con toda seguridadal hecho de su incubación a una tem-peratura superior (44ºC). No se hanefectuado ensayos utilizando el m-FC a 36ºC, pues no está previsto enel método alternativo cuya equiva-lencia estamos evaluando, por lo queen teoría es difícil conocer qué partedel mayor porcentaje de indol-positi-vos se debe a la selectividad de lacomposición del medio y qué parte ala selectividad de la mayor tempera-tura.No obstante, como la nota 2, párrafo8.3 de la norma ISO 9308 2 permiteincubar el TTC a 44ºC, en este ejer-cicio se han estudiado tambiénmuestras paralelas en TTC a 44ºC.Un motivo de este proceder ha sidola realización de tests de equivalen-cia alternativos, pero también ha ser-

o = no concluyente; - = diferencia negativa significativa.Cuadro 4. Coliformes totales. Test estándar. Criterio de confirmación : Oxidasa-negativos.

1 34 0,0842 1,8997 0,6516 - 0,5674 0,7357 o2 21 0,0138 0,4336 0,1892 - 0,1755 0,2030 o3 58 0,4702 0,6911 0,1815 0,2888 0,6517 +4 53 0,3005 0,6017 0,1653 0,1352 0,4658 +5 36 0,1636 0,1981 0,0660 0,0975 0,2296 +6 30 0,4414 0,4463 0,1630 0,2785 0,6044 +7 29 - 0,0101 0,5715 0,2123 - 0,2224 0,2021 o9 60 1,1805 1,3595 0,3510 0,8295 1,5315 +10 18 0,1104 0,4740 0,2234 - 0,1131 0,3338 o11 12 1,2765 0,2565 0,1481 1,1284 1,4246 +12 13 0,1342 0,8198 0,4547 - 0,3206 0,5889 oTotal 364 0,4260 1,0083 0,1057 0,3203 0,5317 +


o = no concluyente; - = diferencia negativa significativa.Cuadro 5. Escherichia coli. Test estándar. Criterio de confirmación: indol-positivos (en Chromocult, sólo de presuntivos: colonias azul-violeta).

1 30 - 0,7100 1,3701 0,5003 - 1,2103 - 0,2097 -2 19 - 0,2161 0,9476 0,4348 - 0,6509 0,2186 o3 52 - 0,1871 0,8602 0,2386 - 0,4256 0,0515 o4 48 - 0,6683 0,8400 0,2425 - 0,9108 - 0,4258 -5 36 - 0,3204 0,6004 0,2001 - 0,5205 - 0,1202 -6 30 - 0,2761 0,5573 0,2035 - 0,4796 - 0,0726 -7 29 - 0,6168 0,6356 0,2361 - 0,8529 - 0,3808 -9 45 - 0,0623 0,6423 0,1915 - 0,2538 0,1292 o10 18 - 1,6712 0,6930 0,3267 - 1,9979 - 1,3446 -11 8 0,1733 0,8013 0,5666 - 0,3933 0,7399 o12 3 - 0,3662 0,9396 1,0849 - 1,4511 0,7187 oTotal 318 - 0,4324 0,8967 0,1006 - 0,5330 - 0,3319 -


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vido para comparar la capacidadselectiva del TTC y el m-FC a lamisma temperatura (44ºC).De 910 cepas (831 oxidasa-negati-vas) presuntivas, 668 (73,4% del totaly 80,4% de las oxidasa-negativas)son indol positivas en el TTC incuba-do a 44ºC, lo cual sugiere que, ya enrazón de su propia composición, el m-FC es bastante más selectivo (másdel 85% de indol positivos). Estamayor selectividad también se mani-fiesta en que, a diferencia del TTC44,el m-FC apenas deja crecer bacteriasoxidasa-positivas.No obstante, a pesar de su mayorselectividad, el m-FC permite unarecuperación de E. coli significativa-mente inferior que la del TTC incuba-do a 36ºC. De cualquier modo, queda demostra-do que la diferencia entre el m-FC y elTTC a 36ºC en el porcentaje de recu-peración de indol-positivos se debemás a la diferencia de temperaturasque a posibles diferencias en la com-posición del medio. Al igual que en los ejercicios TTC-Colilert y TTC-Chromocult, se ha lle-

vado a cabo un test de equivalenciaalternativo (Cuadro 9), identificandoE.coli por el criterio de la ß-D-glucuro-nidasa, aunque en este caso ningunode los dos métodos a comparar sebase en la utilización de este enzima,porque, como ya indicamos, en los dosejercicios anteriores se ha demostradosu mayor idoneidad. En este caso, aunque la ventaja siguesiendo muy clara para el TTC, la dife-rencia relativa media aumenta de valorrespecto al test estándar (de –55% a–38%), va algo menos a favor del TTC,lo cual parece indicarnos que, siendoel m-FC más selectivo, también incre-menta su selectividad considerandopara E coli el criterio correcto, puesexperimenta en esas condiciones unaligera mejoría. No obstante, y a pesardel número de muestras aún ligera-mente más bajo que en el ensayoestándar (n=224), estamos aún lejosde una situación hipotética que pudie-ra alterar los resultados incluso conuna "racha" de valores a favor del m-FC si se estudiaran algunas muestrasmás hasta completar las 256 mínimasrecomendadas.

Aceptando como mejor criterio dedefinición de E. coli el MUG respectoal indol, es interesante considerarcuáles serían las tasas de confirma-ción con el criterio MUG:De los 751 colonias (747 oxidasa-negativas) presuntivas en m-FC ensa-yadas, todas desarrolladas a 44ºC,619 fueron MUG positivas (82,4% deltotal y 82,9% de las oxidasa-negati-vas, algo inferior a los 85,1% y 85,5%de las indol positivas). De las 1.896colonias presuntivas en TTC, 673 fue-ron MUG positivas (35,5%, bastanteinferior al 41,3% de indol positivas).No obstante, la diferencia entre 35,5 y82,4 es mayor que la diferencia entre41,3 y 85,1. De 910 cepas (831 oxidasa-negati-vas) presuntivas, 666 (73,2% del totaly 80,1% de las oxidasa-negativas)son MUG positivas en el TTC a 44ºC.En este caso, la cifra coincide prácti-camente con la de las indol positivas(668 cepas, que representaban un73,4% del total y 80,4% de las oxida-sa-negativas). Estos resultadossugieren que, si bien el m-FC es bas-tante más selectivo, para las cepas

o = no concluyente; + = diferencia positiva significativa; - = diferencia negativa significativa; Eq. = equivalente.Cuadro 6. Escherichia coli. Test no estándar. Criterio de confirmación: ß-D-glucuronidasa-positivos.

1 25 - 0,0756 1,3409 0,5363 - 0,6119 0,4608 o2 16 -0,0104 1,1845 0,5923 -0,6027 0,5819 o3 50 0,2146 0,8250 0,2333 -0,0187 0,4480 Eq.4 41 - 0,0265 0,8984 0,2806 - 0,3071 0,2541 o5 36 - 0,3825 0,6935 0,2312 - 0,6137 - 0,1513 -6 30 0,0594 0,5591 0,2042 - 0,1447 0,2636 o7 29 - 0,3126 0,7331 0,2723 - 0,5849 - 0,0403 -9 45 0,1208 0,7380 0,2200 - 0,0992 0,3409 Eq.10 15 0,5790 1,1650 0,6016 - 0,0226 1,1806 Eq.11 9 0,6931 0,8844 0,5896 0,1035 1,2828 +12 3 - 0,3662 0,9396 1,0849 - 1,4511 0,7187 oTotal 299 0,0194 0,9026 0,1004 - 0,0850 0,1238 Eq.


o = no concluyente; + = diferencia positiva significativa.Cuadro 7. Coliformes totales. Test estándar. Criterio de confirmación : Oxidasa-negativos.

2 5 0,7029 0,5377 0,4809 0,2220 1,1838 +3 9 0,7883 0,4745 0,3163 0,4720 1,1046 +4 85 -0,0040 1,0555 0,2290 -0,2250 0,2330 O5 63 0,7445 1,1220 0,2827 0,4618 1,0272 +6 68 0,0173 0,5409 0,1312 -0,1139 0,1485 O8 40 -0,0965 0,5521 0,1746 -0,2711 0,0781 OTotal 270 0,2055 0,9435 0,1148 0,0907 0,3203 +



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indol positivas, que el TTC a 44ºC,este último selecciona una mayor pro-porción de auténticas E.coli entre lascepas indol positivas.El hecho de haber analizado, en esteejercicio, las muestras por cuadripli-cado (TTC a 36ºC, TTC a 44ºC, m-Endo a 36ºC y m-FC a 44ºC) permiteefectuar múltiples comparacionesentre los distintos métodos tomadosde dos en dos. Las más interesantespueden verse en un Cuadro resumen(cuadro 10).Quizás una de las cosas más intere-santes a constatar es que el TTC a44ºC y el m-FC (también a 44ºC) sonequivalentes si se considera el m-FCcomo método de referencia (criterioStandard Methods norteamericanos).Si se considera como referencia elTTC a 44ºC (criterio de la nota 2,párrafo 8.3 de la normas ISO 9308-1:2000) ambos métodos siguen sien-do no significativamente diferentes,pero la evaluación del ejercicio debeconsiderarse no concluyente.

ESTUDIO DE LAS CEPASAISLADAS

A partir de las colonias presuntivas olos pocillos de Colilert presuntivos seaislaron las cepas a estudiar en agar

Mac Conkey. Cuando no se obtuvo uncultivo puro, se utilizaron para la confir-mación los aislamientos lactosa positi-vos, tras un subcultivo posterior en unagar nutritivo.De cada muestra, para cada medio decultivo se confirmaron todas las colo-nias o pocillos de Coliert positivos si sunúmero era igual o inferior a 10.Cuando su número era superior a 10,se confirmaron solo 10.Aunque para las comparaciones están-dar hubiera bastado confirmar las bac-terias coliformes presuntivas como oxi-dasa-negativas y E.coli como coliformeindol-positivo a 44ºC, la aplicación deun criterio alternativo para E.coli impli-caba también la necesidad de confir-mar las cepas por la ß-D-glucuronida-sa. El mismo medio utilizado para estu-diar la actividad de este enzima permi-te también detectar la actividad de la ß-D-galactosidasa, carácter definitorio delas bacterias coliformes que compartenmuchas más Enterobacteriaceae quela capacidad de fermentar la lactosa. Además, en los ejercicios Colilert yChromocult se obtuvo una mayor infor-mación de las cepas buscando posi-bles falsos positivos de bacterias coli-formes que fueran oxidasa-negativospero aminopeptidasa-negativos. Laconstatación de la actividad enzimáticade la aminopeptidasa (APD) sirve en

cierto modo como rápido sustituto de latinción Gram. En general, las bacteriasGram-positivas son APD-negativas ylas Gram-negativas suelen ser APD-positivas. No obstante, lasEnterobacteriaceae son siempre APD-positivas. Las escasas cepas APD-negativas detectadas son con gran pro-babilidad Gram-positivos, aunque algu-nas pueden pertenecer excepcional-mente a un grupo de Gram-negativosdistinto a las bacterias coliformes oEnterobacteriaceae.Finalmente, también en los ejerciciosColilert y Chromocult, en los que inter-viene como mínimo un medio de cultivono basado en la fermentación de la lac-tosa, se ha confirmado (para las cepasaisladas a partir de Colilert yChromocult) o reconfirmado (para lascepas procedentes de TTC) el posiblecarácter lactosa-positivo, tanto a 36como a 44ºC. El hecho de que algunascepas procedentes del TTC no sehayan podido reconfirmar como lacto-sa-positivas puede ser debido a unerror diagnóstico del presuntivo porparte del analista o a inconstancia enaislar un lactosa-positivo a partir de uncultivo no puro. Los protocolos de confirmación decepas y obtención de característicasbioquímicas que permitan distribuirlasen distintos fenotipos se ha efectuado

o = no concluyente; + = diferencia positiva significativa; - = diferencia negativa significativa.Cuadro 8. Escherichia coli. Test estándar. Criterio de confirmación: indol-positivos.

2 4 0,7945 1,3527 1,3527 -0,5582 2,1472 o3 8 0,6298 0,8270 0,5848 0,0450 1,2146 +4 68 -0,9569 0,9650 0,2340 -1,1909 -0,7229 -5 55 -0,1678 1,0960 0,2956 -0,4634 0,1278 o6 57 -0,6412 0,8106 0,2147 -0,8559 -0,4265 -8 40 -0,6191 0,9036 0,2857 -0,9048 -0,3334 -Total 232 -0,5485 1,0287 0,1351 -0,6836 -0,4134 -


o = no concluyente; + = diferencia positiva significativa; - = diferencia negativa significativa.Cuadro 9. Escherichia coli. Test no estándar. Criterio de confirmación: MUG.

2 4 1,3220 1,0289 1,0289 0,2931 2,3509 +3 8 0,2878 0,7019 0,4963 -0,2085 0,7841 o4 67 -0,8277 1,0036 0,2452 -1,0729 -0,5825 -5 51 0,1315 0,9893 0,2771 -0,1456 0,4086 o6 54 -0,4380 0,8273 0,2252 -0,6632 -0,2128 -8 40 -0,4967 0,9069 0,2868 -0,7835 -0,2099 -Total 224 -0,3781 1,0223 0,1366 -0,5147 -0,2415 -


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con dos protocolos distintos en los ejer-cicios Colilert y Chromocult (Figura 1) yen el ejercicio m-Endo/m-FC (Figura 2).En los Cuadros 11, 12 y 13 se indicanlos números y porcentajes de cadafenotipo encontrados respectivamentepara las cepas estudiadas en los ejerci-cios Colilert, Chromocult y m-Endo/m-FC.

ESTUDIO DE LAS CEPASAISLADAS

EL FALSO DILEMA DE ESCHERI-CHIA COLI: ¿INDOL O ß-D-GLUCU-RONIDASA?Como ya indicamos, el procedimien-to de referencia ISO no es muy selec-

tivo para E. coli y parece permitir quese confirmen otras especies de coli-formes de modo erróneo como E. coli,lo cual genera una proporción muyalta de falsos positivos. La distribución del conjunto de cepasidentificadas en API 20E en los tresejercicios de equivalencia se presentaen el Cuadro 14, en el que se indica,

Cuadro 10. Cuadro-resumen de las comparaciones efectuadas en los distintos ejercicios de equivalencia.

Colilert Coliformes lactosa 333 0,6612 0,7176 0,0786 0,5826 0,7398 +– TTC E.coli indol 275 -0,3816 1,0318 0,1244 -0,5060 -0,2572 -

E.coli ß-D-glucuronidasa 256 0,2072 1,0178 0,1272 0,0800 0,3344 +Chromocult Coliformes lactosa 364 0,4260 1,0083 0,1057 0,3203 0,5317 +– TTC E.coli indol 318 -0,4324 0,8967 0,1006 -0,5330 -0,3319 -

E.coli todos los indol + 329 0,1095 0,9421 0,1039 0,0057 0,2134 +E.coli ß-D-glucuronidasa 299 0,0194 0,9026 0,1004 -0,0850 0,1238 Eq

mEndo– Coliformes lactosa 270 0,2055 0,9435 0,1148 0,0907 0,3203 +TTC36 E.coli indol 241 0,0339 0,1265 0,1451 -0,1112 0,1790 o

E.coli ß-D-glucuronidasa 222 0,0121 1,0897 0,1463 -0,1342 0,1584 omFC – E.coli indol 232 -0,5485 1,0287 0,1351 -0,6836 -0,4134 -TTC 36 E.coli ß-D-glucuronidasa 224 -0,3781 1,0223 0,1366 -0,5147 -0,2415 -TTC 44 – E.coli indol 231 -0,5151 1,0662 0,1403 -0,6554 -0,3748 -TTC 36 E.coli ß-D-glucuronidasa 225 -0,3111 1,0754 0,1415 -0,4546 -0,1696 -mFC – E.coli indol 217 -0,0876 1,1089 0,1506 -0,2382 0,0630 oTTC 44 E.coli ß-D-glucuronidasa 218 -0,0741 0,8287 0,1123 -0,1864 0,0382 oTTC 44 – E.coli indol 217 0,0876 1,1089 0,1506 -0,0630 0,2382 EqmFC E.coli ß-D-glucuronidasa 218 0,0741 0,8287 0,1123 -0,0382 0,1864 Eq

Comparación Criterio n X SD U X - U X + U Eval.

Figura 1.- Protocolo utilizado para la confirmación de cepas en los ejercicios Colilert y Chromocult.


VI WORKSHOP MRAMA

asimismo, la proporción de los 4 feno-tipos correspondientes a las combina-ciones posibles entre INDOL+/- yMUG+/- dentro de las cepas aisladas(confirmadas) y dentro de las que hansido identificadas por el sistema API20 E.En el conjunto de los tres ejercicios, elfenotipo (IND-MUG-) es el que se haencontrado con mayor frecuencia(47,4%). No obstante, como no esprevisible identificar dentro del mismoninguna E. coli, el porcentaje de

cepas de este perfil elegido para suidentificación por el sistema API 20Eha sido, con respecto al total de cepasidentificadas, de solo un 2,0%.El perfil siguiente en orden de impor-tancia cuantitativa es el (IND+MUG+)(36,6%), que es de esperar quecorresponda a E. coli. En este caso,las cepas elegidas de este perfil paraidentificar con API 20E representanun porcentaje ligeramente inferior res-pecto al total de cepas identificadas(29,1%), pero resultan más que sufi-

cientes para comprobar que noshallamos, en efecto, en presencia deE. coli típicas.En cambio, en los otros dos perfiles,que a priori deberían ser los más pro-blemáticos, dudosos o controvertidosrespecto a la presencia de E. coli, sehan identificado, de modo deliberado,porcentajes dentro de las identifica-ciones API 20E que superan amplia-mente el porcentaje real de cada per-fil dentro del conjunto de cepas confir-madas.

Figura 2.- Protocolo utilizado para la confirmación de cepas en el ejercicio m-Endo/m-FC.

Cuadro 11. Número y porcentaje de cepas de los distintos fenotipos aislados en el ejercicio Colilert.

+ 42 (1,54) 636 (24,6)- - 13 (0,48) 50 (1,94)- + - 2 (0,07) 41 (1,59)- + + - - - - 122 (4,49) 21 (0,81)

- - + - 24 (0,88) 5 (0,19)- - - + 1 (0,04)- - + + 5 (0,18)+ - - - 836 (30,7) 570 (22,1)+ - + - 212 (7,79) 127 (4,92)+ - - + 15 (0,55) 5 (0,19)+ - + + 11 (0,40) 4 (0,15)+ + - - 532 (19,6) 437 (16,9)+ + + - 214 (7,87) 184 (7,13)+ + - + 33 (1,21) 24 (0,93)+ + + + 659 (24,2) 476 (18,4)

Total OXI-/APD+/ONPG+ 2663 (97,9) 1854 (71,8)TOTAL 2720 (100) 2581 (100)

Fenotipos Número de cepas (%)

OXI APD ONPG LAC37 LAC44 IND MUG Colilert TTC

99

VI WORKSHOP MRAMA

De este modo, el perfil (IND-MUG+),el de menor importancia cuantitativadentro de las cepas detectadas(2,3%), comprende el 8,5% de lascepas en que se ha llevado a caboidentificación API 20E. En teoría esascepas deberían corresponder a E.coli. En la realidad, aunque esta espe-cie ha sido la encontrada con mayorfrecuencia, solo corresponde a un35% de los casos identificados. Esprobable que las cepas identificadascomo Citrobacter sean E. coli citrato-positivas. De acuerdo con Farmer(1999) 9, solo un 2% de las cepas deE.coli serían indol-negativas. En elconjunto de nuestros ejercicios, den-tro de los MUG+ aislados con todoslos medios de cultivo utilizados, losindol negativos representan un 5%.Por otro lado, solo el 1% de cepas de

E. coli serían citrato-positivas 9. Secomprende que una base de datoscomo la del API 20E difícilmente iden-tifique un citrato-positivo como E. colicuando considera 10 que esta espe-cie tiene un 0% de cepas citrato-posi-tivas. Aunque el Bergey's Manual ofSystematic Bacteriology (11) alude alcarácter MUG+ de E. coli, no aportainformación sobre el pequeño porcen-taje de cepas de E. coli que son MUG-negativas, pero es sabido que cepaspatógenas muy conocidas como laO157:H7 lo son. Un estudio británicoque compara el Colilert con el TTC36y el TTC44 12 cita una referencia a un1% de cepas de E. coli MUG-negati-vas (2 de 200 estudiadas).Al perfil (IND+MUG-), al que pertene-cen solo el 13,7% de las cepas confir-

madas, corresponde el 60,4% deltotal de cepas identificadas. Según lanorma ISO 9308, todas las cepas(IND+MUG-) deberían ser E. coli, y larealidad es que con el sistema API20E apenas se ha identificado comotal el 10%. Este hecho, unido al deque la especie más abundante dentrodel perfil (IND+MUG-) es Klebsiellaoxytoca, a la cual corresponde el 51%de las cepas, demuestra que conside-rar, como hace la norma ISO 9308,que cualquier coliforme indol-positivoes E. coli es un criterio, además deerróneo, demasiado conservativo yclaramente alarmista en el contextode la evaluación de posibles riesgos.El criterio de la norma ISO solo apa-rentará ser correcto para las muestrasen que la mayor parte de bacteriascoliformes IND+ sean realmente

Cuadro 12. Número y porcentaje de cepas de los distintos fenotipos aislados en el ejercicio Chromocult.

+ 81 (3,10) 540 (21,6)- - 19 (0,73) 24 (0,96)- + - 11 (0,42) 12 (0,48)- + + - - - - 225 (8,61) 72 (2,88)

- - + - 32 (1,22) 9 (0,36)- - - + 6 (0,23) 1 (0,04)- - + + 3 (0,11) 1 (0,04)+ - - - 491 (18,8) 341 (13,6)+ - + - 107 (4,09) 44 (1,76)+ - - + 17 (0,65) 8 (9,32)+ - + + 9 (0,34) 1 (0,04)+ + - - 703 (26,9) 500 (20,0)+ + + - 251 (9,61) 251 (10,0)+ + - + 34 (1,30) 42 (1,68)+ + + + 621 (23,8) 656 (26,2)

Total OXI-/APD+/ONPG+ 2502 (95,8) 1926 (77,0)TOTAL 2613 (100) 2502 (100)

Fenotipos Número de cepas (%)

OXI APD ONPG LAC37 LAC44 IND MUG Colilert TTC

Cuadro 13. Número y porcentaje de cepas de los distintos fenotipos aislados en el ejercicio m-Endo/m-FC.

+ 516 (25,9) 547 (28,9) 4 (0,53) 79 (8,68)- - 30 (1,50) 27 (1,42) 20 (2,66) 7 (0,77)- + - - 725 (36,4) 519 (27,4) 73 (9,72) 121 (13,3)

+ - 147 (7,37) 131 (6,91) 36 (4,79) 37 (4,02)- + 45 (2,26) 24 (1,27) 19 (2,53) 35 (3,85)+ + 531 (26,6) 648 (34,2) 599 (79,8) 631 (69,3)

Total OXI-/ONPG+ 1448 (72,6) 1322 (69,8) 727 (96,8) 824 (90,5)TOTAL 1994 (100) 1896 (100) 751 (100) 910 (100)

Phenotypes Number of strains (%)

OXI ONPG IND MUG mEndo(37) TTC(37) mFC(44) TTC(44)


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MUG+, situación que puede darsecon relativa frecuencia, pero que nopuede preverse de antemano antesde analizar las muestras, lo querefuerza aún más el criterio de que lab-D-glucuronidasa es mejor definitoriode E. coli que el indol. Dentro del conjunto de cepas identifi-cadas por API 20E, se clasificaroncomo E. coli un 83% de las MUG+ ysolo un 38% de las INDOL +. Ciertoes que los anteriores porcentajes tie-nen una representatividad limitada,pues la selección de cepas para iden-tificar con el sistema API 20E no se haefectuado con criterios proporcionalesa la abundancia relativa de los distin-tos fenotipos en las muestras estudia-das. No obstante, permiten observarclaras tendencias. El sistema API20E, aunque no es definitivo, ofreceuna buena indicación de las proba-bles identidades de las especies deEnterobacteriaceae. Sin embargo, enlas consultas con el fabricante se hadetectado una dificultad en el sistemapara reconocer de modo correctoalgunas cepas de bacterias indolpositivas, a menudo identificándolascomo E. coli cuando en realidad serí-an miembros del género Klebsiella.Los anteriores resultados recomenda-ron como mínimo la necesidad de unainvestigación adicional sobre el tema.

En esta línea, ante los primeros datosprocedentes del ejercicio TTC-Colilert, el fabricante de este últimomedio propició la realización de unestudio en el Reino Unido (12), en elque un solo laboratorio ha comparadoen 125 muestras el Colilert, el TTCincubado a 36ºC y el TTC incubado a44ºC para la detección de E. coli, con-siderando como tal las dos alternati-vas anteriormente consideradas decriterio INDOL y criterio MUG.Utilizando el sistema de identificaciónVitek 2, del mismo fabricante que elAPI 20E y en teoría más fiable, se haconfirmado que el método ISO con laincubación de las membranas a 36oCproduce un número significativo defalsos positivos de E. coli. De 27 coli-formes del perfil (IND+MUG-) identifi-cados a partir de TTC incubado a36ºC, solo uno (3,7%) se identificócomo E. coli y 25 (92,6%) lo hicieroncomo K. oxytoca. Por otra parte, aun-que al incubar las membranas a 44oCse observó una reducción sustancialen el número de falsos positivos, lascepas pertenecientes al perfil(IND+MUG-), ahora mucho más esca-sas que las del perfil (IND+MUG+),seguían siendo predominantementeK. oxytoca. Los (IND+MUG+) eransiempre E. coli, tanto a 36ºC como a44ºC. El aislamiento menos frecuente

de K. oxytoca a 44ºC puede explicar-se por el hecho de que, aunque estaespecie sea capaz de crecer a 44oCen medios no selectivos (por ejemplo,en un caldo triptófano produciendoindol o en un caldo lactosa peptonafermentando la lactosa), su crecimien-to generalmente se inhibe cuando sesomete a la vez a los factores estre-santes de temperatura elevada yagentes selectivos. Asimismo, como consecuencia de losprimeros resultados obtenidos en elejercicio TTC-Colilert, en un solo labo-ratorio participante se ha efectuadoun estudio (13) siguiendo el mismoprotocolo de desinfección de efluen-tes secundarios para la obtención demuestras en los ejercicios de equiva-lencia, cuyo objetivo no ha sido con-seguir muestras sino la mayor partede cepas posibles de bacterias coli-formes del perfil (INDOL + MUG -). De180 cepas aisladas de este fenotipo,sólo una ha sido identificada por elsistema API 20 E como E. coli, apesar de que, según el protocolo de lanorma ISO 9308, todas hubieran sidoidentificadas como E. coli. Asimismo,la mayor parte de las cepas (139, un77,2%) se han identificado comoKlebsiella oxytoca.En otro estudio llevado a cabo previa-mente en el mismo laboratorio, relati-

Cuadro 14. Distribución y frecuencia de cepas OXI(-)ONPG(+) identificadas por el sistema API 20E.

Escherichia coli 40 19 183 242Other Escherichia spp. 1 1Klebsiella oxytoca 1 198 1 200Other Klebsiella and Raoultella spp 5 8 1 14Enterobacter spp. 3 11 6 20Pantoea agglomerans 11 11Other Pantoea spp. 1 66 4 71Citrobacter spp. 1 9 14 24Kluyvera spp. 17 17Leclercia adecarboxylata 7 7Serratia spp. 1 1 3 5Rahnella aquatilis 2 2Salmonella arizonae 2 2Hafnia alvei 1 1Unidentified 1 19 4 5 29Total 13 390 55 188 646% in API profile 2,01 60,4 8,51 29,1 100% of profile in confirmed strains 47,4 13,7 2,33 36,6 100Total confirmed strains 6287 1817 308 4854 13266

Especie/género IND(-) IND(+) IND(-) IND(+) Total

MUG(-) MUG(-) MUG(+) MUG(+)

101

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vo a una red de distribución de aguapotable (14), se habían efectuadoidentificaciones API 20E de los dife-rentes fenotipos de cepas de colifor-mes aisladas con TTC. Se identifica-ron 233 cepas (IND+MUG-) y ningunade ellas fue E. coli, mientras que 194(un 83,3%) eran K.oxytoca. En cam-bio, tanto la única cepa aislada delfenotipo IND-MUG+ como las 20cepas identificadas del perfilIND+MUG+ fueron E. coli.Es evidente que los resultados falsospositivos de E. coli representan unacarga financiera importante para lasempresas abastecedoras de agua y,si se siguiera utilizando para confir-mar E. coli tan solo la prueba delindol, se generarían datos estadísti-cos erróneos con respecto a la cali-dad del agua de consumo humano.Los métodos empleados en la evalua-ción de la calidad del agua potabledeben ser sensibles y específicos. Laincubación de placas de TTC conTergitol a 36oC no cumple con estosrequisitos. En cambio, el uso delColilert®-18 y del Chromocult, tanto enel presente estudio como en otrosprecedentes, sí los cumple.En otras palabras, si se tienen encuenta los numerosos falsos positivosde E. coli que se obtienen cuando sesiguen los criterios de confirmaciónpor el indol, preconizada por la normaISO 9308 (es decir, si se utiliza elMUG como criterio de definición deE.coli), el Colilert®-18 y el Chromocultdemuestran ser unos métodos acep-tables en comparación con el métodode referencia ISO para la recupera-ción de E. coli en agua. Los métodosbasados en la ß-D-glucuronidasa nosolo han detectado un mayor númerode E. coli que el procedimiento dereferencia, sino que lo han hecho conuna especificidad mucho mayor, locual es de extrema importancia parala protección de la salud pública. Enbase a los resultados del presenteestudio, el Colilert®-18 y el Chromocultpueden recomendarse como métodosalternativos aceptables e incluso másespecíficos para la detección de tantobacterias coliformes como de E. colien agua.Tanto el presente estudio de equiva-lencia como los otros estudios men-cionados han contribuido a crear una

masa crítica hacia un nuevo estadode opinión, dando importantes argu-mentos a favor de considerar la pose-sión del enzima ß-D-glucuronidasacomo un mejor carácter definitoriopara E.coli que la capacidad de pro-ducir indol del triptófano a 44ºC. Eneste sentido está trabajando el grupoISO para el análisis de bacterias coli-formes / E.coli en agua, que ya haintroducido enmiendas en la propiaISO 9008-1 recomendando la confir-mación adicional de E.coli por la ß-D-glucuronidasa, aunque solo sea anivel de nota a pie de página, y estáestudiando posibles futuros métodosISO basados en la ß-D-galactosidasapara coliformes y, especialmente, enla ß-D-glucuronidasa para E.coli.

CONCLUSIONES DELESTUDIO: MÉTODOSALTERNATIVOSACEPTABLES

• Tanto el Colilert como el Chromoculty el m-Endo recuperan un númerosignificativamente superior de bac-terias coliformes que el TTC.

• Esta superior recuperación se expli-ca, en las condiciones de los ejerci-cios, solo en una mínima parte porel hecho de que con los métodoscromogénicos y fluorogénicos seconsideran dentro de las bacteriascoliformes cepas lactosa negativaspero ß-galactosidasa positivas(ONPG +).

• La principal limitación de los ejerci-cios de equivalencia estándar paraE. coli es el criterio de la norma ISO9308 de considerar que es E. colicualquier coliforme indol-positivo,con el cual pueden darse comoE.coli muchos falsos positivos. Deacuerdo con este criterio, en el testde equivalencia estándar, tanto elColilert como el Chromocult presen-tarían resultados significativamentemás bajos que el TTC.

• Una situación más conforme a larealidad se asocia al criterio alter-nativo (por lo menos, en el momen-to en que se llevó a cabo el estudio)de definir E. coli como un coliformeb-D-glucuronidasa positivo (MUG+). Las confirmaciones de cepas

(INDOL+ MUG-) por el sistema API20E (en los propios ejercicios y enestudios paralelos) demuestran quesolo en una mínima parte son E.coli y en su mayoría son Klebsiellaoxytoca. El propio fabricante admiteproblemas de falsa asignación a E.coli de cepas (INDOL+ MUG-). Encambio, las cepas (INDOL+ MUG+)son E. coli. De acuerdo con el ensa-yo de equivalencia alternativo (crite-rio MUG), para E. coli el Colilert essignificativamente mejor que el TTCy el Chromocult es equivalente.

• La baja tasa de falsos positivos delChromocult y, sobre todo, delColilert permite su utilización en lascondiciones definidas por los res-pectivos fabricantes: sin confirma-ción. Esto implica una importanteventaja adicional en la rapidez delanálisis.

• Otras ventajas del Colilert respectoal Chromocult y aún más respectoal TTC son la menor interferenciade la microbiota acompañante y lamayor facilidad de recuento, ligadasa una menor subjetividad en lainterpretación de los resultados.

• El TTC, el m-Endo y el m-FC sonmedios de cultivo elaborados conformulaciones idénticas por distin-tos fabricantes. Por tanto, aunquepuedan existir pequeñas diferen-cias en su rendimiento en funciónde la calidad de las materias primasempleadas, los resultados obteni-dos en este ejercicio usando m-Endo y m-FC de Biolife son extra-polables a los que se hubieranobtenido utilizando medios de culti-vo de otro fabricante.

• No obstante, en el caso de losmedios líquidos cromogénicos yfluorogénicos y de los agares cro-mogénicos la situación es distinta:el Colilert y el Chromocult tienensus propias características y suscomposiciones no coinciden con lasde otros medios de cultivo basadosen las mismas reacciones enzimáti-cas. De ahí que, aunque sea muyprobable que este tipo de mediosen general sean equivalentes osuperiores al TTC, los resultados deeste ejercicio obtenidos en loscasos concretos del Colilert y elChromocult no son directamenteextrapolables a otros medios, ni


VI WORKSHOP MRAMA

siquiera al Chromocult sin antibióti-cos.

• Aunque en el ejercicio TTC-mEndo/mFC, el m-Endo recuperasignificativamente más bacteriascoliformes que el TTC, el m-FCrecupera significativamente menosE. coli que el TTC.

• La alta selectividad de la temperatu-ra es responsable de las recupera-ciones significativamente inferioresdel m-FC y el TTC44 respecto alTTC36 y m-Endo, aunque en losprimeros aumente la especificidadpara E. coli (pero no lo suficientecomo para no necesitar confirma-ción).

• En las condiciones del ejercicioTTC - mFC/mEndo, el TTC44 recu-pera significativamente menos E.coli que el método de referencia(TTC36). Aunque la norma ISO9308 contempla la posibilidad deusar el TTC44 para el análisis de E.coli, los resultados de este ejerciciode equivalencia parecen invalidar,por lo menos bajo determinadas cir-cunstancias, su posible considera-ción como método de referencia.De ahí que sea irrelevante que elm-FC sea muy semejante (equiva-lente si se considerara el m-FCcomo método de referencia) alTTC44 para la recuperación de E.coli. En el momento de efectuar elestudio, la comparación correctaparecía ser para E. coli la del m-FCcon el TTC36.

• Por tanto, la conclusión inequívocade los ejercicios TTC-Colilert yTTC-Chromocult es que, tanto parabacterias coliformes como para E.coli, el Colilert y el Chromocult sonmás específicos y permiten obtenerunos resultados reales significativa-mente más altos o, como mínimo,equivalentes a los del método dereferencia. En cambio, la combina-ción del medio m-Endo para bacte-rias coliformes con el m-FC para E.coli no parece adecuada, pues elm-FC proporciona recuentos de E.coli significativamente más bajos.

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103

VI WORKSHOP MRAMA

En esta charla se hace unabreve introducción teórica a lamicrobiología predictiva (histo-

ria, clasificación de modelos, utiliza-ción en el APPCC); en su segundamitad se muestra su aplicaciónmediante ejemplos usando el softwa-re COMBASE de libre acceso en lared.

INTRODUCCIÓN A LAMICROBIOLOGÍAPREDICTIVA

EELL RREEGGLLAAMMEENNTTOO ((CCEE)) nnºº 22007733//22000055

El Reglamento (CE) de la Comisiónde 15 de noviembre de 2005, relativoa los criterios microbiológicos aplica-bles a los productos alimenticios,establece una serie de criterios paraalgunos alimentos y tipos de microor-ganismos que, de forma complemen-taria a las normas nacionales, impli-can un nuevo enfoque, dado queintroduce conceptos dinámicos rela-cionados con los controles de produc-ción, la vida útil del alimento, el usoque se va a hacer del mismo, asícomo el riesgo asociado al microorga-nismo a controlar.

Artículo nº 5, sobre normas especí-ficas para las pruebas y la tomade muestras:“Se autorizará el uso de métodosanalíticos alternativos cuando losmétodos estén validados con res-pecto al método de referenciaestablecido en el anexo I y si seutiliza un método registrado, cer-tificado por terceros conforme alprotocolo de la norma EN/ISO16140 u otros protocolos simila-res internacionalmente acepta-dos.

Si el explotador de la empresaalimentaria deseara utilizar méto-dos analíticos distintos a los vali-dados y certificados tal como seha descrito en el párrafo anterior,los métodos deberán validarseconforme a protocolos internacio-nalmente aceptados y su usodeberá ser autorizado por la auto-ridad competente”.

Artículo 3, punto 2, sobre condicionesgenerales y Anexo II:“Cuando sea necesario, los explota-dores de las empresas alimentariasresponsables de la fabricación delproducto realizarán estudios confor-me a lo dispuesto en el anexo II parainvestigar el cumplimiento de los cri-terios a lo largo de toda la vida útil.Esto es aplicable especialmente alos alimentos listos para el consumoque puedan permitir el desarrollo deListeria monocytogenes y puedansuponer un riesgo para la saludpública en relación con dicha bacte-ria”.“Cuando sea necesario, basándoseen los estudios antes mencionados,el explotador de la empresa alimen-taria realizará estudios complemen-tarios, entre los que pueden incluirselos siguientes:• Elaboración de modelos matemá-

ticos de pronóstico establecidospara el alimento de que se trate,utilizando factores críticos de cre-cimiento o supervivencia aplica-bles a los microorganismos encuestión presentes en el producto.

• Pruebas para investigar la capaci-dad que tiene el microorganismoen cuestión, adecuadamente ino-culado, para crecer o sobrevivir enel producto en diferentes condicio-nes de almacenamiento razona-blemente previsibles.

• Estudios para evaluar el creci-miento o supervivencia de losmicroorganismos en cuestiónque puedan estar presentes enel producto durante su vida útilen condiciones razonablementeprevisibles de distribución,almacenamiento y utilización”.

DDEEFFIINNIICCIIÓÓNN

“Every model is wrong. The quesionis, how much wrong still useful it canbe” (Box and Draper)

El término Microbiología Predictivasurgió al aplicar una serie de técnicasmatemáticas y estadísticas a laMicrobiología que permitían predecirla respuesta de una población micro-biana a partir de observaciones pre-vias. Whiting (1995) la describe comoel campo de estudio que combinaelementos de microbiologia, mate-máticas y estadística para desarro-lar modelos que describan y predi-gan matemáticamente el crecimien-to o muerte de microorganismos,cuando se les somete a condicio-nes ambientales específicas.Hoy en día, la MicrobiologíaPredictiva se engloba dentro de laemergente Ecología MicrobianaCuantitativa, que comprende todasaquellas técnicas que permiten cuan-tificar un proceso microbiológico enun ecosistema. El interés generadoen esta área ha conducido a la rápidacreación de una subespecialidad enmicrobiología alimentaria caracteriza-da por su interdisciplinariedad: micro-biólogos, tecnólogos alimentarios,matemáticos, estadísticos o ingenie-ros colaboran compartiendo ideas,conceptos, técnicas matemáticas ybases de datos para generar y validarmás modelos y más efectivos.

APLICACIÓN DE LA MICROBIOLOGÍA PREDICTIVAEN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA

Monterrat Vila Brugalla

Facultad de Veterinaria. Universidad Autónoma de [email protected]


VI WORKSHOP MRAMA

En Microbiología Alimentaria, losmodelos predictivos constituyen unmétodo rápido, relativamente econó-mico y no invasivo para la determina-ción objetiva de la calidad de los ali-mentos. Se adopta generalmente unpunto de vista reduccionista y las res-puestas de los microorganismos sonmedidas bajo condiciones controla-das. Los resultados se resumen enforma de ecuaciones matemáticasque, por interpolación, pueden prede-cir respuestas en condiciones nuevas,no testadas anteriormente.

HHIISSTTOORRIIAA

La posibilidad de predecir el compor-tamiento microbiano en los alimentosno es nueva, y ya se pueden encon-trar referencias al uso de la microbio-logía predictiva en literatura de losaños 1920, cuando Esty y Meyer(1922) establecieron la metodologíapredictiva para un enlatado seguro dealimentos bajos en acidez con res-pecto al C. botulinum. La industriaconservera adoptó el concepto de las12 reducciones decimales propuestopor ellos (12D). En sus trabajos pre-sentaron numerosas combinacionesde tiempo y temperatura capaces decausar 12 D en C. botulinum. Estosvalores D eran predecidos a partir demodelos matemáticos. En los años1930, Scott (1937) escribió sobre elefecto de la temperatura sobre el cre-cimiento de microorganismos en mus-culatura de buey. En la introducciónde su artículo demuestra entenderperfectamente el uso potencial delconocimiento de la cinética del creci-miento microbiano para predecir lavida útil y la seguridad de los alimen-tos. Tras esos primeros años, el usode modelos matemáticos en microbio-logía alimentaria se ha extendido,hallándose bien establecidos en pro-cesos productivos de fermentación dealimentos y conservación mediantetratamientos térmicos. Durante los años 1960 y 1970, sedesarrollaron dos líneas de investiga-ción distintas en microbiología predic-tiva:• El control de la alteración del pesca-

do, (Spencer and Baines, 1964).• La prevención del botulismo y otras

intoxicaciones microbianas. Elgrupo de Genigeorgis en la

Universidad de California buscó enel trabajo de otros investigadorescombinaciones de factores quepodrían prevenir el crecimiento depatógenos y la formación de toxi-nas. Modelizaron la reducción deci-mal del recuento microbiano comoconsecuencia de factores intrínse-cos y extrínsecos de la comida,como la temperatura, el pH, la con-centración de NaCl, etc. La reduc-ción decimal fue entonces relacio-nada con la probabilidad de creci-miento bacteriano o de producciónde toxina. Estos estudios desarro-llaron los llamados modelos pro-babilísticos, basados en un cálcu-lo de probabilidades: de iniciaciónde crecimiento de un microorganis-mo o de producción de una toxina apartir de una célula. (Genigeorgis1993).

Pero no fue hasta los años 1980cuando surgió un nuevo interés en lamicrobiología predictiva, debido a trescausas principales (Buchanan, 1993):• La disponibilidad de ordenadores

cada vez más potentes.• El incremento de la demanda por

parte de los consumidores de ali-mentos más frescos, menos proce-sados. Esto ha resultado en la apli-cación de sistemas de preservaciónmulti-barrera en los que la combina-ción de varios factores, más que laacción individual de cada uno deellos controla la alteración del ali-mento. En estos casos, los modelosmatemáticos ayudan a tratar cuanti-tativamente la interacción entremúltiples factores.

• La imposibilidad, tanto científicacomo económica, de tener la infor-mación microbiológica cuantitativade todos los alimentos presentesen el mercado necesaria para latoma de decisiones sobre la segu-ridad de los productos alimenta-rios. Esta limitación está siendocompensada por la identificaciónde un número limitado de factoresclave responsables en gran partedel comportamiento de los micro-organismos en la comida. A travésde la cuantificación sistemática yla comprensión del impacto deestos factores en sistemas modeloy productos prototipo, es posiblegenerar modelos efectivos que

estimen el comportamiento micro-biano en un rango amplio de pro-ductos.

En este contexto, uno de los factoresclave que ha contribuido al rápidoprogreso de la microbiología predicti-va en los últimos años ha sido laidentificación de modelos que descri-ben las curvas del crecimiento bacte-riano. Se trata de los llamadosmodelos cinéticos que, bajo condi-ciones ambientales determinadas,describen curvas sigmoideasmediante parámetros con significadobiológico como la duración de la fasede latencia (2), la velocidad máximade crecimiento (3max) o la densidadmáxima de población (3max), entreotros. El recuento de microorganis-mos puede llegar a presentar unafase de decrecimiento o declivio, quenormalmente no es considerada porestos modelos.Pero los modelos deben de ser usa-dos con cautela. En su fase de des-arrollo es necesario ser especial-mente cuidadoso con las etapas devalidación, y realizar un muestreocontrol de forma paralela (Campden& Chorleywood Food ResearchAssociation, 1997). Los que sonescépticos con la microbiología pre-dictiva tienen argumentos en lavariabilidad que presenta el creci-miento microbiano, causada tantopor factores intrínsecos como extrín-secos. Conviene tener en cuenta quelos experimentos basados en condi-ciones laboratoriales pueden noreflejar el comportamiento de losmicroorganismos en los alimentos.La flora microbiana de un alimentoes un sistema complejo: las interac-ciones microbianas pueden cambiarcon variaciones de temperatura y lascondiciones fisiológicas previas delmicroorganismo pueden afectar sucomportamiento en el nuevo ambien-te. Esto plantea un dilema en los quequieren aplicar la microbiología pre-dictiva al crecimiento microbiano enlos alimentos: o se trabaja con mode-los complejos, que tienen en cuentalas propiedades conocidas del siste-ma, o se hacen ciertas simplificacio-nes justificables biológicamente,modelizando medidas relativamentesimples en función de pocas varia-bles ambientales. Esta segunda

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VI WORKSHOP MRAMA

aproximación ha conducido a estima-ciones útiles de la respuesta de losmicroorganismos en un amplio mar-gen de alimentos y circunstanciasrelativas tanto a la microbiologíacomo en la industria alimentaria(Baranyi i Roberts, 1995).

CCLLAASSIIFFIICCAACCIIÓÓNN DDEE MMOODDEELLOOSS

Diferentes esquemas han sido pro-puestos para categorizar los mode-los predictivos. A continuación sedescriben cuatro de ellas, que no sonexcluyentes entre sí.Según el suceso microbiológicoque describen, encontramos:• Modelos de crecimiento: Modelan

el crecimiento de la poblaciónmicrobiana.

• Modelos de in activación: Modelanla destrucción microbiana o la inactivación de sus toxinas.

En función de la aproximaciónmatemática usada, se dividen en:• Modelos probabilísticos: La varia-

ble en estudio es la probabilidadde inicio de crecimiento de unacélula, o la probabilidad de produc-ción de una toxina.

• Modelos cinéticos: Las variablesson una serie de parámetros de lacinética microbiana y sus transfor-maciones.

La metodología usada en su crea-ción los divide en:• Modelos empíricos: Derivan de

una perspectiva esencialmente

pragmática. Simplemente descri-ben los datos mediante una expre-sión matemática adecuada; poreso, a menudo dan poca o ningunainformación del proceso subyacen-te.

• Modelos mecanicistas: Tambiénllamados deterministas, se cons-truyen desde una base teórica y, sison correctamente formulados,pueden permitir la interpretaciónde la respuesta modelada en tér-minos de fenómenos y procesosconocidos.

El número y tipos de variables queincluyen, los diferencian en:• Modelos primarios: Describen los

cambios en el recuento microbianoo en otras respuestas microbianasen el tiempo. El modelo puedecuantificar las unidades formadorasde colonias por ml, la formación detoxina, o los niveles de substrato(que son medidas directas de larespuesta), o absorbancia o impe-dancia (que son medidas indirectasde la respuesta). Una ecuación ofunción matemática describe elcambio en la respuesta en el tiem-po dadas unas condicionesambientales determinadas. Sonejemplos de modelos primarios lacurva de crecimiento exponencial,la función de Gompertz, y la inacti-vación térmica de primer orden.

• Modelos secundarios: Describen elimpacto de las variables ambienta-

les como la temperatura, el pH o laaw en las características de creci-miento o supervivencia del micro-organismo. Ejemplos de modelossecundarios son la relación deArrhenius o el modelo de la raízcuadrada.

• Modelos terciarios: Son resultadode la incorporación de modelos pri-marios, secundarios o una combi-nación de ambos en aplicacionesinformáticas y sistemas expertos.Estos programas pueden calcularla respuesta microbiana a condi-ciones ambientales que fluctúan,comparar el efecto de diferentescondiciones o contrastar el com-portamiento de varios microorga-nismos. Un ejemplo de modelo ter-ciario es el llamado PathogenModelling Program, creado porUSDA.

MMIICCRROOBBIIOOLLOOGGÍÍAA PPRREEDDIICCTTIIVVAA YY AAPPPPCCCC

Muchos microbiólogos y responsa-bles del control de calidad en lasindustrias alimentarias intuyen quelos modelos predictivos publicadostienen un gran potencial de uso,pero desconocen cómo aplicar unmodelo particular a sus procesos yproductos. La generación de mode-los predictivos con programas infor-máticos accesibles (user-friendly)potenciará en el futuro su aplica-ción.En el diseño e implantación de sis-temas APPCC, los modelos deMicrobiología Predictiva constituyenuna buena herramienta para:• La toma de decisiones respecto a

la valoración del riesgo asociadoa cada peligro detectado.

• La toma de decisiones respecto ala determinación de PCC, apor-tando información para respondera cuestiones qe aparecen en elárbol de decisión respecto a pro-babilidad de ocurrencia de un peli-gro, o el nivel aceptable /inacep-table de un peligro.

• El establecimiento de límites críti-cos. Decidir respecto al destino deun producto que se ha desviadode un límite crítico.

• Valorar la seguridad de un pro-ducto tras un cambio en la formu-lación o procesado sin necesidadde realizar análisis laboratoriales.

Figura 1.- Parámetros clásicos del crecimiento bacteriano (Baranyi y Pin, 2001)


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Los modelos predictivos proporcionanayuda a los equipos APPCC en la tomade decisiones sobre la seguridaddurante la producción de alimentos. Enalgunos casos pueden ser inexactos acausa de la falta de conocimiento delas propiedades físicas, químicas omicrobiológicas del alimento, de formaque habrá que realizar igualmentepruebas de laboratorio para validar losPCC. Aun así, aportan informaciónobjetiva que permite realizar un aná-lisis de peligros completo, no limita-do únicamente a valoraciones cuali-tativas basadas en juicios subjetivoso en la experiencia personal de losmicrobiólogos integrantes del equi-po APPCC.

APLICACIÓN DE LAMICROBIOLOGÍAPREDICTIVA: COMBASE

COMBASE (http://www.combase.cc/)es una iniciativa fruto de la colabora-ción entre la Food Standards Agency yel Institute of Food Research en elReino Unido; el USDA AgriculturalResearch Service y su EasternRegional Research Center de losEstados Unidos; y el Australian FoodSafety Centre of Excellence.Su propósito es elaborar herramientaspredictivas sobre las respuestas de losmicroorganismos en los alimentos, delibre uso en software disponible en laweb. La base de datos ComBase(accesible via el ComBase

Browser) consiste en miles de cur-vas de crecimiento e inactivaciónque han sido reunidas a partir deinstituciones de investigación ypublicaciones. Son la base para losnumerosos modelos microbianospresentados en el ComBasePredictor, una herramienta muy útiltanto para la industria (en el desarrollo de nuevas tecnologíasmanteniendo la seguridad de losalimentos) y administración (esta-bleciendo nuevos límites microbio-lógicos), como a nivel académico(tanto en docencia como en investi-gación).

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INTRODUCCIÓN

Antes que nada es necesario precisarla amplitud del término virus en elmarco de la detección de virus en ali-

mentos. ¿A qué virus nos referimos?Pues a aquellos virus que se transmi-ten por ingestión y que, por lo tanto, sepueden adquirir mediante el consumode alimentos contaminados. A este tipode virus se les denomina técnicamente

virus de transmisión fecal-oral, es decirvirus que se adquieren por ingestión yse excretan en las heces, o virus enté-ricos, es decir virus que replican en elaparato digestivo. Existe más de uncentenar de virus distintos que pueden

DETECCIÓN DE VIRUS EN ALIMENTOS: PERSPECTIVAS Y LIMITACIONES

Rosa M. Pintó

Grup Virus Entèrics, Departament Microbiologia, Universitat de BarcelonaAv. Diagonal, 645; 08028 Barcelona

E-mail: [email protected]: (+34) 934034621. Fax: (+34) 934034629

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encontrarse como contaminantes ali-mentarios, como pueden serEnterovirus, Aichivirus, Hepatovirus,Hepevirus, Norovirus, Sapovirus,Rotavirus, Astrovirus y Adenovirus,entre otros. Sin embargo, la gran mayo-ría de brotes de gastroenteritis y hepa-titis víricas de transmisión alimentariase han asociado a Norovirus (NoV) yHepatovirus, comúnmente llamadovirus de la hepatitis A (HAV) (Tabla 1),con lo cual se han convertido en lasprincipales dianas de la virología de ali-mentos. Las infecciones por NoV son muycomunes (Lopman et al 2003; Mead etal 1999) y van a más debido a la cons-tante emergencia de nuevas cepasasociada a la replicación en dinámicade quasiespecies de los virus RNA. Lasituación con el HAV es bastante distin-ta puesto que a pesar de replicar enquasiespecies (Sánchez et al 2003a)posee fuertes restricciones estructura-les en su cápside (Sánchez et al2003b) que impiden la emergencia denuevos serotipos (Aragonès et al2008), con lo cual la vacuna existentees de amplia protección. Sin embargo,dicha vacuna es muy cara y de uso res-tringido en países del Tercer Mundodonde, por otra parte, es muy necesa-ria debido a la deficiente situaciónhigiénico-sanitaria. Además, no hayque olvidar que mientras una gastroen-teritis por Norovirus cursa durante 48-72 horas, una hepatitis A cursa duranteun mínimo de 3-4 semanas. En la actual situación de comercio glo-bal, las infecciones víricas entéricastransmitidas por alimentos están

cobrando mucha importancia (Tabla 1),lo cual hace necesario establecer uncierto control sobre la calidad vírica delos alimentos. Entre los alimentos mássusceptibles de estar contaminados enorigen y responsables de grandes bro-tes cabe destacar, en primer lugar, elmarisco por su capacidad filtradora yconcentradora de los potenciales virusque pueda haber en el entorno marinoy, por otro, las verduras y frutos tipobaya regados con aguas contamina-das. Sin embargo, el control de la cali-dad vírica de este tipo de alimentos sehace muy difícil debido a tres motivos:primero, las dificultades técnicas de ladetección de virus; segundo, el granvolumen de producto que puede llegara la unidad de toneladas; y tercero, elbajo precio de muchos de estos pro-ductos que no permite la gravacióneconómica del valor añadido de laseguridad viral. Llegados a este puntoveamos cómo manejar la situación.

TÉCNICAS DE DETECCIÓNDE VIRUS EN ALIMENTOS

En el diagnóstico clínico de virus sonmuy comunes las pruebas serológicasde detección de anticuerpos específi-cos contra los virus a identificar. Sinembargo las pruebas serológicas notienen sentido en la detección de virusen alimentos puesto que, en este caso,es el antígeno el objeto de interés.Alternativamente, se pueden tambiénusar técnicas de detección de virus quese basan en el aislamiento del virus encultivo celular o su detección por técni-

cas inmunológicas. Sin embargo, estastécnicas son difícilmente aplicables almundo alimentario, por un lado, porquelos virus diana (HAV y NoV) no replicande forma rutinaria en cultivo celular y,por otro, porque las técnicas inmunoló-gicas no ofrecen la sensibilidad nece-saria para detectar las bajas cargasvíricas de los alimentos contaminados.En cuanto a la replicación en cultivocelular solo cabe destacar que, muyrecientemente, se han hecho avancesen cuanto a la posibilidad de replicarcepas salvajes del HAV (Konduru &Kaplan 2006) y de NoV (Straub et al2007) en sistemas celulares, pero quetodavía es muy prematuro afirmar quelos sistemas de cultivo propuestossean aplicables a la detección rutinariade dichos virus. Todo ello deriva en la necesidad derecurrir a sistemas moleculares dedetección y amplificación de ácidosnucleicos víricos y, concretamente en elcaso del HAV y NoV, que como se hadicho son virus de genoma RNA, a latécnica de la RT-PCR.

TÉCNICAS MOLECULARESPARA LA DETECCIÓN DEVIRUS EN ALIMENTOS:PERSPECTIVAS YLIMITACIONES

Aunque se han descrito otras alternati-vas como el NASBA (nucleic acidsequence-based amplification) (Jean etal 2001; Jean et al 2004) para la detec-ción de virus RNA, la RT-PCR

Tabla 1. Ejemplos de brotes alimentarios asociados a NoV y HAV.

NoV 1988 Frambuesas 108 Finlandia Unknown1993 Ostras 190 US Louisiana (US)1996 Ostras 75 US Louisiana (US)

Ostras 153 US Louisiana (US)1997 Frambuesas 200 Canada Unknown

HAV 1979 Mejillones 41 UK Ireland1988 Almejas 300,000 China China

Lechugas 202 US Kentucky (US)1997 Fresas 153 US México / US Processing1998 Cebollas tiernas 43 US México / California (US)1999 Almejas 184 Spain Perú2002 Arándanos 39 New Zealand New Zealand2003 Cebollas tiernas 600 US México2005 Ostras 39 US Mississippi (US)

Virus Año Alimento Casos País Orígen Alimento


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(Retrotranscription-Polymerase ChainReaction) sigue siendo la técnica másutilizada. Una modificación de ésta, laRT-PCR a tiempo real (Real Time RT-PCR), hace uso de la adición de mar-cadores fluorescentes y permite nosolo la amplificación y detección sino,además, la cuantificación del númerode copias genómicas. La ventaja de lacuantificación hace de esta nueva téc-nica una herramienta de gran valorpara determinar la seguridad vírica delos alimentos. Aunque existen diversasquímicas para la incorporación de lafluorescencia la más usada por sureproducibilidad es la tecnologíaTaqMan que hace uso de una sondamarcada.Para el desarrollo de una RT-PCR atiempo real es muy importante: 1) esta-blecer un buen diseño de primers ysonda para obtener resultados fiables,robustos y de amplio espectro; 2) opti-mizar las condiciones del programa deamplificación para tener la máximasensibilidad; y 3) determinar la molécu-la más adecuada para la construcciónde las curvas estándar de cuantifica-ción para asegurar una titulacióncorrecta (Pintó & Bosch 2008).El primer aspecto, el diseño de primersy sonda es de vital importancia, sobretodo en el mundo de los virus RNA,para garantizar la detección de todaslas posibles variantes víricas por unlado y la robustez de la cuantificaciónde todas estas variantes. Para ello, hayque llevar a cabo análisis de alinea-miento de secuencias con todos losgenomas existentes para un determi-nado virus, a fin de poder determinarlas mejores regiones en cuanto a nivelde conservación de nucleótidos. Estasregiones altamente conservadas sue-len coincidir con regiones altamenteestructuradas del RNA, es decir aque-llas regiones del RNA donde la propiaestructura secundaria tiene un papelfuncional dando señales para la inter-acción con proteínas víricas y celularesinvolucradas en la replicación y expre-sión genómica. Concretamente, en elcaso del HAV, al tratarse de un picorna-virus, posee un extremo 5’no codifican-te (5’NCR) en su RNA que se halla alta-mente estructurado y que contiene elsitio de entrada del ribosoma (InternalRibosome Entry Site IRES). Estaregión imprescindible para llevar a

cabo la traducción cap-no dependientees una excelente candidata para eldiseño de primers y sonda. En el casode NoV, existe una región de solapa-miento entre el ORF1 y ORF2 que tam-bién posee estructuras secundariasdestinadas en este caso a señalizardónde el ribosoma debe llevar a caboun cambio de pauta de lectura median-te la vuelta atrás de dos nucleótidos.El segundo aspecto hace referencia a laoptimización de los pasos críticos de lasreacciones moleculares de la RT-PCR atiempo real, como adecuar temperaturay tiempo de la RT, temperatura y tiempode la desnaturalización, temperatura ytiempo de la hibridación de primers ysonda y temperatura y tiempo de laextensión.Finalmente, es imprescindible determi-nar cuál es la mejor molécula para serusada como patrón en la curva están-dar de cuantificación. Existen tres posi-bilidades: el propio genoma vírico, unssRNA idéntico a la diana a detectar yun dsDNA idéntico al amplímero. La pri-mera alternativa no es, en la práctica,adecuada puesto que exige trabajarcon grandes cantidades de virus pató-genos. Entre la segunda y la tercera, losdatos empíricos demuestran que mejorla segunda, probablemente por proble-mas de sobreestimación de la concen-tración de ssRNA después de llevar acabo una transcripción in vitro.Hechas estas consideraciones, esta-mos ya a punto de cuantificar los virusdiana en alimentos. Sin embargo,cuando los títulos de genomas víricos/gobtenidos por estas técnicas molecula-res de cuantificación se relacionan conlos datos reales de niveles de ataqueasociados al consumo de estos alimen-tos, todas las previsiones de riesgo deinfección fallan. Concretamente, en unbrote de hepatitis A asociado al consu-mo de marisco contaminado (Sánchezet al 2002) se determinaron dosis de0.0025 virus infecciosos/g, después delproceso de cocción al que se sometióel marisco (100 copias genómicas/gantes del procesado), asociadas aniveles de ataque reales del 50%. Esdecir suponiendo un consumo de 60 gde marisco, que contendrían tan solo0.15 virus infecciosos, la probabilidadde infección sería del 50%. Es eviden-te que debe de haber algún eslabónperdido.

ESTANDARIZACIÓN DELOS PROTOCOLOS DEDETECCIÓN DE VIRUS ENALIMENTOS

El eslabón perdido corresponde a lafalta de medidas correctoras de aque-llos pasos críticos del proceso. Ello sepuede resolver mediante la adopciónde medidas de control de calidad. Lospuntos más críticos de todo el procesode determinación del título de genomasvíricos en un alimento son la extracciónde virus y ácidos nucleicos y la reac-ción de RT-PCR, principalmente elpaso de RT. Con el fin de controlarambos pasos, lo más idóneo es añadirconcentraciones conocidas de virus yssRNAs previamente a la ejecución delos citados procesos. Lo más difícil esescoger correctamente estos controlesa añadir. En cuanto al control de la extracción, lomás idóneo es utilizar un virus animal,un bacteriófago o un armored RNA. Sinembargo, tanto los bacteriófagos comolos armored RNA, que son cápsides delfago MS2 con un RNA diana en su inte-rior, presentan el problema de poseeruna cápside que, a pesar de tener unaestructura parecida a la de los virusentéricos, químicamente es muy distin-ta y por lo tanto no modelizarían correc-tamente el comportamiento de éstos.Por lo tanto, lo más aconsejable esusar virus estructural y químicamentesimilares como el picornavirus Mengo(Costafreda et al 2006) o los calicivi-rus murino y felino (Cannon et al2006). Cualquiera de estos virus sepuede cuantificar y añadir a concen-traciones conocidas a la muestra, afin de determinar la eficiencia de losprocesos de extracción de virus y áci-dos nucleicos.En cuanto a los controles de las reac-ciones de RT-PCR, lo ideal es dispo-ner de moléculas de ssRNA amplifica-bles con los mismos primers y de lon-gitud similar. Lo más práctico es modi-ficar los amplímeros mediante la intro-ducción de nuevas dianas de restric-ción, su clonaje en un vector de trans-cripción y la obtención de los corres-pondientes tránscritos (ssRNA). Estasmoléculas se cuantificarán y se añadi-rán a concentraciones conocidas paradeterminar la eficiencia de la RT-PCR.

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Evidentemente, no hay que olvidar que,además, el control de calidad exigesiempre incorporar controles negativosde extracción, RT y PCR.Aplicando este tipo de controles, lacuantificación es mucho más aproxima-da a la realidad y adoptando estascorrecciones se obtienen valores deestimación del riesgo de infección trasel consumo de alimentos contaminadosmucho más acordes con el nivel de ata-que real. En el ejemplo expuesto ante-riormente, los títulos corregidos del HAVen el marisco, una vez cocinado ,seríande 2.5 virus infecciosos/g, y esta dosispresenta unos niveles de riesgo estima-dos del 41% mucho más cercanos a losreales que fueron del 50%.

RETOS ACTUALES EN LADETECCIÓN DE VIRUS ENALIMENTOS

De todo lo dicho hay que concluir que,en la actualidad, se dispone de lasherramientas para el control de la pre-sencia/cuantificación de virus en ali-mentos. Sin embargo, todavía hay todauna serie de cuestiones que resolver:1) Científicamente sigue estando pordeterminar el significado de una copiagenomica, desde la perspectiva de lainfectividad. 2) Desde una perspectivade salud pública hay que decidir si seamplían los virus diana. 3)Estadísticamente sigue sin resolverseel tema del muestreo significativo, asícomo todos los temas de incertidumbrede la cuantificación. 4) Legalmente se

requiere establecer normas. 5) Económicamente hay que decidircuando se analizan los alimentos,siempre o cuando existen indicios decontaminación, análisis prospectivo oretrospectivo. 6) Y, finalmente, hay quedecidir quién lleva a cabo estos análisislos productores, los distribuidores o laadministración.Responder estas cuestiones es de vitalimportancia para la futura implementa-ción del control de virus en alimentos y,evidentemente, requiere de más deuna reflexión por parte de científicos,gestores e industriales.

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During the past decades, dueto the emergence of diffe-rent crisis incriminating

Food, the consideration of problemsrelated to Food Safety has taken an

increasing importance all aroundthe world. In order to answer to con-sumers’ fears, a lot of initiativeshave been taken; as it appearednecessary to evaluate the risks for

the consumers, Food SafetyAgencies have been created at anational then at the European level;the risk’s monitoring has led to thesetting up of new regulations.

IMPACT OF THE DEVELOPMENT OFMICROBIOLOGICAL RAPID METHODS ON FOOD

SAFETY IMPLEMENTATION IN THE EUROPEAN UNIONCécile Lahellec (F)

Honorary Research Director, French Food Safety Agency (AFSSA)[email protected]


VI WORKSHOP MRAMA

Of course, all measures which arerecommended must be implemented;different aspects have to be conside-red: among them, the impact of rapidmethods in Food microbiology.In order to get a comprehensiveunderstanding of that impact, I wouldlike to share with you a few data: atfirst, they will concern the evolutionof the place of Food Safety inEurope, then we shall have a look atthe development of rapid methodsduring the past decades; then we’lltry to answer to the question: Whichis the impact of the development ofrapid methods on Food Safety imple-mentation in the European Union?

EVOLUTION OF THEPLACE OF FOOD SAFETYIN EUROPE DURING THEPAST DECADES

In fact, the concept of Food Qualityfrom the point of view of consumershas somewhat changed according tothe periods. In a book publishedabout ten years ago, Pierre Feilletindicated different periods:- 1945-1955: efforts to improve the

shelf life of food products.- 1965-1985: development of the

concept of Food Science. - 1975-1995: the years of biotechno-

logies.- 1990-1995 and later: priority is

given to Food Hygiene. Then, during a long time, the rela-tionship between Food and the con-sumer’s health has been somewhatunderestimated; then, around thenineties, it may have been overesti-mated, due to the BSE crisis, to theincrease of the knowledge on listerio-sis as being mostly a foodborne dise-ase and, generally speaking, to thedevelopment of molecular tools allo-wing to trace the contaminants (a lotof examples may be taken).Whichever the reasons, Food Safetyhas become a very important topicand, in different countries, people incharge of the consumer’s health hadto reorganize the expertise which, infact, did exist, but necessitated areorganization. As an example, inFrance, different groups of people

were in charge of Food Safety but thecoordination between those groupswas far to be perfect; the creation ofthe French Food Safety Agencyincluding the existing groups andorganisms in charge of consumers’protection has been considered in ashort time as a noticeable progress.An important date has now to bementioned: on January 12th 2000,David Byrne, nominated to theEuropean Commission in 1999 andserving as a Commissioner with res-ponsibility to Health and ConsumerProtection, presented what has beencalled the “White Paper”. It originatedfrom the “Green Paper” published in1997; its purpose was to reach thehighest level of Food Safety inEurope. In order to do so, it was con-sidered as necessary to set up animportant program of new regulationstaking the “New Approach”, fromfarm to fork into account in order toharmonise the expertise of theEuropean scientific community. Aswe shall examine later, the impact ofthose recommendations would be farmore important it was possible toimagine at first, especially in the fieldof rapid methods whose develop-ment has been spectacular duringthe past decades.

DEVELOPMENT OFRAPID METHODS INFOOD MICROBIOLOGYFROM THE END OF THESIXTIES TILL NOW

From many decades, in the field ofFood Microbiology, industrials and,consequently research laboratorieshave been seeking for methodswhich may be used as alternatives ofreference methods, in order to detectand/enumerate microorganisms; infact, reference methods are usuallysomewhat expensive and many daysare necessary to obtain a result;alternative methods should give aquicker result, allow to examine a lotof samples simultaneously, win of theplace.During a long period, that looked likea dream; now, the situation haschanged for different reasons.

In fact, along the past years, thequestion of Food Safety has taken anincreased importance in the consu-mers’mind, in all countries worldwi-de. Different measures have beentaken at different stages from food’sproduction till distribution to the con-sumers in order to improve FoodSafety whose responsibility nowbelongs to industrials; in that context,implementation of the HACCPmethod (Hazard Analysis CriticalControl Point) is mostly importantwhen it is applied to raw materialsand foods examined at different sta-ges “from farm to fork”. The results ofthose controls must be available,accepted by all concerned groups,including, of course, official controls.That means the validation of twosteps: sampling as the sample mustbe representative of the population tobe examined; the conditions of sam-pling must be perfectly defined andbe founded on statistic considera-tions; the nature of samples must bedefined and known; then, the methodused for the analysis must be thegood one and practiced in a compe-tent laboratory; if those two condi-tions are not respected, the resultscan’t be taken under consideration.The advantages of alternativemethods have often been described. The laps of time necessary for imple-menting the whole method must besignificantly less than which is usedfor traditional methods (including thetime for sample preparation andeventually for preenrichment), becheap.Their use in epidemiological studieswhich necessitates the examinationof a high number of samples appearsnecessary if one wants to examine asufficient number of samples.Presently, as we shall see in a fewminutes, the introduction of principlesof Risk Analysis seem to have madethe use of alternative methods una-voidable. During a very long period, traditionalmethods have been the only onesregistered in regulations in all coun-tries worldwide; however, differentimprovements have been observedalong the years:for example, official methods concer-ning milk and dairy products have

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VI WORKSHOP MRAMA

been revised regularly during theannual meetings of NationalReference Laboratories organized bythe Community ReferenceLaboratory. In priority, methods stan-dardized by CEN, ISO or IDF havebeen taken under considerationwhich, most of them, are consideredas reference methods. However,frommany years, at a European level,alternative methods have been allo-wed to be used, subject to a valida-tion (presently according to therecommendations of the standardEN/ISO 16140 which defines theconditions of validation and certifica-tion).- One of the resolutions taken at

Parma (It), on April 23rd 2004during a joined meeting ofISO/TC34/SC9 andCEN/TC275/WG6 has to be men-tioned; it indicates that, each time areference method is being revised,the possibility of using new techno-logies, including PCR, must beexamined by comparing resultswith those obtained when using theconventional method (based on theuse of culture media).

- For a given microorganism, inorder to complete the existingmethod, the development of stan-dardized methods based on newtechnologies can be proposedwhen the purpose to be obtained(for example the pathogenicitylevel makes it necessary).

- When new technologies, includingPCR are used as alternativemethods, they must be validatedagainst the reference method.Those two examples show animportant progress in the accep-tance of alternative methods.Finally, in the EC new regulation,alternative methods are nowaccepted as we can read in the ECregulation (2073/15 December2005):“Test results are dependent onthe analytical method used, andtherefore a given referencemethod should be associatedwith each microbiological crite-rion. However, food businessoperators should have the pos-sibility to use analyticalmethods other than the referen-

ce methods in particular morerapid methods, as long as theuse of these alternative methodsprovide equivalent results.Moreover, a sampling plan needsto be defined for each criterion inorder to ensure harmonized imple-mentation. It is neverthelessnecessary to allow the use of othersampling and testing schemesincluding the use of alternativeindicator organisms on conditionthat these schemes provide equi-valent guarantees of food safety”.The dream becomes a reality.

IMPACT OF THEDEVELOPMENT OFRAPID METHODS ONFOOD SAFETYIMPLEMENTATION INTHE EUROPEAN UNION

As we have said previously, from along time the necessity of implemen-ting the HACCP method has led a lotof industrials and research laborato-ries to be conscious of the necessityof rapid methods to be used in Foodmicrobiology; the eldest of us havebeen able to follow the progress ofthe first kits presented of the market,many of them concerning Salmonella(I remember some of them “forgot” toinclude the time of pre-enrichment,and sometimes enrichment in thetime necessary to get a result!); later,the request of trying to reach the hig-hest level of Food Safety in Europehas led to a package of new regula-tions called the “Hygiene Package”including general rules for all types offoods, specific regulations for foodsof animal origin; in addition, specificregulations for animal feeds; otherregulations have been set up whichconcern official controls and inspec-tions.It seems easy to understand that theimplementation of regulations repre-sents a huge work in terms of labora-tory work.In order to make the situation morecomplicated, a lot of problems of har-monization did exist, especially formicrobiological criteria; in the newcontext, as a consequence of those

regulations and in order to evaluatethe acceptability of the process aswell as the safety of food products, ithas been necessary to set up micro-biological criteria; the result of thatimportant work was published(Regulation EC n° 20073/2005 of theCommission). It must be mentionedthat harmonisation is a verydifficulttopic to be implemented.Criteria include the sampling plan,the number of samples to be tested,the microbiological limits and, ofcourse, the microbiological methodsHarmonisation of microbiologicalmethods is prepared by workinggroups of ISO (TC34 /SC9) and CEN(TC275/WG6). From many years(many decades for ISO), an impor-tant work of methods harmonizationhas been undertaken; recently, EChas given a mandate to CEN andfinance collaborative studies to fullyvalidate reference methods.Moreover alternative methods arenow allowed to be used, on approvalof validation according to the stan-dard EN/ISO 16140.What to say as a conclusion?Many people do not know the idea ofminiaturized and rapid methods havegerminated about 40 years ago in thebrain of a very young and enthusias-tic microbiologist, American Chinese,who is present in the room and willteach you the whole week (I don’tknow if you can imagine how muchyou, we are lucky).So, the idea has been the beginningof a long story: rapid methods havebeen developed; in the beginnings,they were not always well accepted;there were a lot of obstacles; now,the situation has changed; FoodSafety has become a priority; in orderto be able to examine samples repre-sentative of the populations, theneed of rapid methods has becomemore and more obvious; the improve-ments in the field of standardizationhave made the use of rapid methodsat a large scale possible and realis-tic. What was only a concept at thebeginnings has become a veryimportant reality and I am sure that,during the week, you will appreciatethe efforts realized, enjoy yourselvesand go back home with a lot of ideasto develop.


VI WORKSHOP MRAMA

EL EMPLEO DIRECTO DELA GENÉTICA EN LAAGROLIMENTACIÓN:MEJORA GENÉTICA DELOS ALIMENTOS

La comunidad científica entiende porbiotecnología el uso de un organismovivo con un propósito industrial.Biotecnología de alimentos no es másque el uso de seres vivos en la pro-ducción de alimentos, lo que incluyetoda la alimentación, porque todocuanto comemos son, o han sido,seres vivos, ya sean animales, vege-tales, o alimentos o bebidas fermenta-das por un microorganismo. Pero elconsumidor, sobre todo el europeo,tiene una percepción distinta de loque es y entiende que este términohace referencia a la aplicación de lagenética en la alimentación. En otraspalabras, los consumidores europeosentienden por biotecnología de ali-mentos “poner genes en su sopa”. Hay que recordar a los consumidoresque la genética se ha aplicado en laalimentación desde que comenzó laagricultura y la ganadería. Desdeentonces, el hombre ha mejoradoempíricamente el genoma de lasvariedades vegetales comestibles, lasrazas animales y los fermentos. Estamejora se ha fundamentado en laaparición de mutantes espontáneos,la variabilidad natural y la aplicacióndel cruce sexual o hibridación. Deesta forma se han obtenido varieda-des de trigo con espigas incapaces dedispersar sus semillas en la naturale-za, pero capaces de generar unasharinas panaderas con inmejorableaptitud tecnológica, o patatas comes-tibles al contener niveles mínimos dealcaloides tóxicos. Desde hace treintaaños, los científicos aíslan en el labo-ratorio fragmentos concretos que por-tan genes determinados. Esos genesse pueden variar en el tubo de ensa-

yo y se pueden reintroducir en elorganismo natural o en uno distintogenerando un transgénico. Al globalde estas técnicas las llamamos inge-niería genética y cuando se aplica enel diseño de un alimento surgen losllamados alimentos transgénicos.Hoy se comercializan muchos alimen-tos transgénicos en todo el mundo,sobre todo en Estados Unidos,Australia, Canadá y China. Los másconocidos son la soja resistente alherbicida glifosato y el maíz Bt, aun-que existen muchos más. Son degran importancia los que hacen refe-rencia a la mejora nutricional de losalimentos. Desde algunas organiza-ciones ecologistas se acusa a los ali-mentos transgénicos de ser un vene-no para la salud y el medioambiente.No es cierto. Desde hace más dequince años, FAO, OCDE y OMS hanestablecido grupos de trabajo paraevaluar la seguridad para el consumi-dor de los alimentos transgénicos. Seha llevado a cabo una evaluación deriesgos sanitarios de todos los ali-mentos transgénicos comercializadosatendiendo al contenido nutricional, laposible presencia de alérgenos y elnivel de toxicidad. Son los alimentosmás evaluados de la historia de la ali-mentación y no disponemos de undato científico que indique que repre-senten un riesgo para la salud delconsumidor superior al que implica laingestión del alimento convencionalcorrespondiente. Este hecho ha sidopuesto de manifiesto por la OMS ensu página de internet. Es interesantedestacar que, tras la publicación deesta decisión, dichos grupos hanvariado su estrategia y apenas hablande los riesgos sanitarios de los trans-génicos pero si de los riesgosambientales. Ahí las cosas sonmenos claras porque hay una falta demetodologías para analizar este tipode riesgos que afectan tanto a lasplantas transgénicas como a las con-vencionales. Aun así, debemos afir-

mar con contundencia que existentres posibles riesgos: la transferenciade los genes exógenos desde lavariedad transgénica a variedades sil-vestres, la pérdida de biodiversidad ylos efectos dañinos que ciertas plan-tas transgénicas resistentes a insec-tos pueden tener sobre poblacionesde insectos distintos de aquellos con-tra los que protegen. Todos estos ries-gos ya existen con las variedadesconvencionales. Por ello, la cuestiónclave es conocer si el empleo detransgénicos acelerará la aparición deestos riesgos. Parece que no, siem-pre que se mantengan y mejoren lasnormas de evaluación que emplea-mos actualmente con las plantastransgénicas. Finalmente, debemosconsiderar los riesgos económicos. El90% de los agricultores que utilizaronsemillas transgénicas en el 2006 eranagricultores pobres de países en des-arrollo. Una realidad muy lejana delestereotipo que hace de lo transgéni-co un negocio en manos de pocascompañías multinacionales.Pero conviene debatir acerca de laopinión del consumidor sobre lostransgénicos. En general, y destacan-do la falta de formación e informaciónen biotecnología de nuestra sociedad,así como la constante presencia delos grupos en contra en los medios decomunicación, los perciben como algopeligroso. Por ello resulta importantela divulgación de los datos reales quedesde la Ciencia tenemos de estosproductos.

LAS NUEVASAPLICACIONES DE LAGENÉTICA EN LAAGROALIMENTACIÓN:NUTRIGENÉTICA YNUTRIGENÓMICA

En el año 2003 se hizo pública lasecuencia que conforma nuestro

TRANSGÉNICOS, NUTRIGENÉTICA YNUTRIGENÓMICA EN ALIMENTACIÓN

Daniel Ramón Vidal1,2

1Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos, Consejo Superior de Investigaciones Científicas2Biópolis S.L.

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VI WORKSHOP MRAMA

genoma, el genoma humano. Somospoco más de 23.000 genes interaccio-nando con el ambiente. Pero lo quesomos no depende de nuestro colorde piel, ni de nuestro credo político oreligioso; está escrito en ese alfabetomolecular y se traduce en función denuestro ambiente físico o cultural. Esevidente el impacto de la genómicaen nuestra vida cotidiana y ello hadado lugar a la aparición de dos nue-vas disciplinas científicas: la nutrige-nética y la nutrigenómica. Por nutrige-nética entendemos la disciplina cientí-fica que estudia el efecto de las varia-ciones genéticas entre individuos enla interacción dieta y enfermedad. Pornutrigenómica, aquella que estudia elefecto de los nutrientes de los alimen-tos sobre la expresión de nuestrosgenes. Con su empleo empezamos aentender como se va a definir en elfuturo una alimentación a la carta enfunción de lo que podríamos llamar“pasaporte genético”. Puede que amuchos les aterre, pero quizás no lovean tan grave si piensan en la venta-ja que para un recién nacido puedesuponer que sus padres sean infor-mados sobre una posible mutación ensu genoma que le predisponga a desarrollar una enfermedad cardio-vascular si su alimentación no es ade-cuada. Es claro el enorme potencial que elconocimiento del genoma humanopuede tener en las pautas de alimen-tación, pero no será menor el quetenga la secuenciación de los geno-mas de otros organismos vivos deinterés agroalimentario. Hasta ahora,se han secuenciado totalmente másde quinientos genomas distintos y haymás de setecientos proyectos desecuenciación en marcha. Algunos deellos se refieren a animales, plantas omicroorganismos de relevancia ali-mentaria, como por ejemplo el arroz,la levadura panadera, la bacteriaBifidobacterium bifidum (usada enmuchos productos probióticos) opatógenos responsables de toxiinfec-ciones alimentarias como Escherichiacoli. El conocimiento de los genes quecomponen el genoma de estos orga-nismos permite conocer sus genesclave para así definir estrategias demejora por genética clásica (la llama-da mejora asistida por marcadores) o

por ingeniería genética, desarrollarmecanismos de defensa frente a supatogenicidad, o descubrir nuevasfunciones fisiológicas con impactonutricional.La secuenciación de genomas hasido hasta ahora una técnica costosaen tiempo y dinero. Hace apenas unaño, se describió una nueva técnicade secuenciación basada en elempleo de nanomateriales. Dicha téc-nica se denomina pirosecuenciación ypermite secuenciar genomas deforma masiva en mucho menos tiem-po y a un menor costo. Por ejemplo, latecnología clásica de secuenciaciónaplicada en un laboratorio convencio-nal tardaba en secuenciar el genomade una bacteria láctica un tiempovariable entre uno y tres años. Con latecnología de pirosecunciación esposible hacerlo en tan solo ochohoras y por un precio en costo demateriales diez veces menor al de latecnología convencional. Sin duda, lapirosecuenciación va a revolucionar lasecuenciación de genomas y tambiénde los llamados metagenomas. Coneste último sustantivo se hace refe-rencia a la secuenciación de DNAextraído de un ecosistema, de formaque, a partir de los datos de secuen-cia, es posible inferir los organismospresentes en dicho nicho ecológico.Su aplicación en alimentación y nutri-ción es más próxima de lo quemuchos imaginan. Por ejemplo,recientemente se han llevado a caboproyectos de secuenciación masivaen voluntarios humanos, determinán-dose que más de trece mil cepas bac-terianas distintas pueblan nuestrotracto digestivo. También mediante elempleo de metagenómica se handetectado diferencias en la composi-ción de la flora microbiana del tractodigestivo de individuos obesos. Sonlos primeros resultados de una tecno-logía potente que permitirá conoceraspectos nuevos de nuestra fisiologíay su relación con la alimentación.Podemos concluir, por todo loexpuesto, que el futuro de la genéticaen la alimentación es importante. Laépoca en que los tecnólogos de ali-mentos eran expertos en el manejode las tuberías de las instalacionesindustriales ha quedado lejos. Lanueva tecnología de alimentos preci-

sa de nuevos profesionales queentiendan la importancia de la biotec-nología y la genética y también pue-dan discutir sobre conocimientos deotros campos del saber como la far-macología, la nutrición, el controlautomático de sistemas o las nano-tecnologías.

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82 � Alimentaria Marzo 08

VI WORKSHOP MRAMA

Se ha celebrado la VI edición delya clásico seminario del Dr.Fung en la UAB, todo un hito en

nuestro país en lo que se refiere aMicrobiología Alimentaria. Se trata deun foro excelente donde se ofrece atodos los asistentes la posibilidad deentrar en contacto con las más recien-tes técnicas disponibles, valorar lasdiferentes opciones, realizar prácticascon las mismas y poder tratar aspectosparticulares en lo que a análisis micro-biológicos de alimentos se refiere. Loscada vez más estrictos requerimientosde la sociedad y del mercado, en rela-ción a la Seguridad Alimentaria, ponende relieve la vigencia y plena actuali-dad de los métodos rápidos y de esteseminario en particular.Nada más indicado que la definición demétodo rápido para incidir en su justifi-cación en el contexto de exigencias deseguridad y competitividad que el mer-cado y la sociedad demandan, pero¿cómo se define un método rápido?Son aquellos métodos capaces deaportar eficiencia y consistencia a lasprácticas analíticas habituales. Estoconlleva el empleo de métodos valida-dos, fáciles de usar, resultados repro-ducibles y en menor tiempo, calidaddel resultado igual o superior al méto-do convencional y capacidad para lagestión de la documentación y losdatos.Disponer consistentemente de losresultados completos de los análisismicrobiológicos en el menor tiempoposible es objetivo crucial de la indus-tria alimentaria. El abanico de técnicasrápidas disponibles permite llegar aeste nivel de respuesta en 24 h para lamayoría de los conceptos de indicado-res, contaminación y patógenos querequiere la legislación y el mercado.No hay quien pague la confianza ysatisfacción generada, tanto propiacomo de los clientes, por disponer deresultados microbiológicos de manerarápida y consistente y, además, ¿cuán-

to cuesta mantener el inventario mien-tras no se autorizan los lotes al merca-do? ¿Qué beneficio supone aumentaren dos días la vida útil del producto?Siendo el anterior concepto de la rapi-dez de la máxima importancia, no con-viene olvidar otro beneficio trascen-dental proveniente de los recursos quequedan liberados como consecuenciade la adopción de los métodos rápidosque no es otro que el incremento de laeficiencia y productividad de la funcióntécnica y de calidad en las empresas.Así, se podrán atender demandas cre-cientes de mayor número de análisis,implicación en programas de mejora,asistencia a la gestión del APPCC eimplantación interna del autocontrol,auténtica garantía de calidad, consis-tencia y competitividad.¿Resultan más caros los métodos rápi-dos? Justamente todo lo contrario,ahorran tiempo e inventario. Más aún,

los valiosos recursos liberados seemplean para aumentar la competitivi-dad de las empresas.“El ahorro de tiempo que suponen losmétodos rápidos, no supone reducciónde plantilla, antes al contrario, losrecursos liberados incrementan losniveles de calidad, conocimiento delproceso, cualificación del personal ycompromiso de la organización técnicacon los objetivos de la empresa”, ase-guró el Dr. Fung.

PRESENTACIÓN DELVI WORKSHOP MRAMA

Jesús Prado

Dpto. de Microbiología3M España, S.A.

www.3M.com/microbiology

82-87 Ponencias MRAMA.qxp 13/3/08 16:12 Página 82

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VI WORKSHOP MRAMA

Para Salmonella, Listeriamonocytogenes, Reversetranscriptasa Listeria genus 8

horas, Escherichia coli O157:H7 MP,Enterobacter sakazakii,Campylobacter coli / jejuni/lari,Levaduras y Hongos,Staphylococcus aureus.

DESCRIPCIÓN

El sistema de detección BAX es unmétodo PCR rápido y exacto dedetección de patógenos y otros micro-organismos en alimentos y muestrasmedioambientales. El proceso del Sistema BAX constade la preparación de muestras enri-quecidas, seguida de amplificación ydetección automatizadas. Estas eta-pas usan técnicas de biología mole-cular simplificadas y no requierendestrezas especializadas adicionales.Las muestras se enriquecen median-te protocolos estándar para el tipo dealimento. Posteriormente, alicuotasde los medios de enriquecimiento secalientan en una solución de proteasapara lisar las bacterias, que liberan elADN. El procedimiento no require nin-gún paso de centrifugación, minimi-zando así la manipulación de lasmuestras.Seguidamente, se monta la reacciónde PCR. Este paso del protocolo de

trabajo no requiere la preparacióndel cóctel de reacción, ya que cadatubo de reacción PCR contiene uncomprimido, que incluye todos losreactivos necesarios, incluyendo elcontrol interno para la amplificación.Las pastillas se hidratan con lamuestra de ADN y se procesan en elciclador/detector. En unas pocashoras, la reacción en cadena de lapolimerasa (PCR) amplifica el frag-mento de ADN que es específico dela diana.Con un único programa para la mayo-ría de las bacterias, el Sistema BAXpermite analizar múltiples dianas enuna única operación, hasta 96 mues-tras por lote. Las indicaciones queaparecen en pantalla, de fácil com-prensión, guían al usuario a través detodo el proceso, reduciendo la necesi-dad de técnicos muy especializados yde una formación costosa. El Sistema BAX Q7 permite realizaranálisis en tiempo real y a la conclu-sión. Ofrece análisis en tiempo realpara la detección, diferenciación ycuantificación de especies deCampylobacter (C. jejuni, C. coli y C.lari,) en la misma muestra; la detec-ción y la cuantificación umbral deStaphylococus aureus; y resultadosclaros a la conclusión de otros impor-

tantes patógenos que se transmitenpor los alimentos.El sistema Bax ha lanzado un nuevoensayo que usa la PCR para amplifi-car RNA ribosómico por transcripciónreversa. Este nuevo ensayo permitedetectar de forma rápida y precisaListeria spp en 8 horas. El gran núme-ro de fragmentos de ARN presentes alinicio de la reacción de PCR implicauna espectacular mejora de la sensi-bilidad frente a otros métodos dedetección.El Sistema BAX es el método adopta-do por los laboratorios USDA-FSISpara el análisis de Salmonella,Listeria monocytogenes y E.coliO157:H7. Asimismo, ha obtenido lavalidación o certificación AFNOR,AOAC y de otros organismos interna-cionales para analizar una ampliavariedad de productos alimentarios,entre otros, productos lácteos, cárni-cos, mariscos, chocolate, fruta yzumos de fruta, hortalizas, ensaladasy piensos para animales1. Oxoid Ltd distribuye el Sistema BAXpara toda Europa, Australia, NuevaZelanda y Canadá. 1 Todos los particulares sobre las vali-

daciones, autorizaciones y certifi-caciones pueden obtenerse deOxoid.

©2001 - 2007 Oxoid Limited, Todos losderechos reservados.

SISTEMA BAX® Q7 DE DU PONT QUALICONItziar Olea

Product Manager. Departamento de Marketing. Thermo Fisher Scientific



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EL CONTROLMICROBIOLÓGICO EN LAINDUSTRIAAGROALIMENTARIA

Una de las mayores preocupacionesen la industria agroalimentaria es elcontrol microbiológico de sus produc-tos. La legislación actual recopila unaserie de normas microbiológicas aseguir, que indican los microorganis-mos a analizar dependiendo de los ali-mentos que se produzcan o procesen.La mayor parte de estos análisismicrobiológicos en la industria alimen-taria, un 80 - 85%, se realizan paracontrolar los microorganismos dedesecho e indicadores y solo el 15 -20% se realizan para analizar patóge-nos. El número de ensayos microbio-lógicos crece año tras año y diversosfactores hacen que los industrialesdejen de mirar hacia la microbiologíaclásica y busquen métodos rápidos yautomatizados que les permitan lan-zar los productos al mercado conmayor rapidez y seguridad. Los méto-dos tradicionales requieren demasia-do tiempo para muchos fabricantes,ya que requieren la preparación de lasmuestras, una incubación larga y elcontaje y la subsiguiente interpreta-ción de los resultados. Además debe-mos tener en cuenta que los resulta-dos siempre están sujetos a la subjeti-vidad humana y que nos interesareducir al máximo al riesgo de error dela informatización de los resultados. Con las nuevas técnicas y equipos

automatizados se solucionan lamayor parte de estos inconvenientes,pero las necesidades de este tipo deindustria son muy amplias y en lamayor parte de los casos no se limitana un simple control de algún microor-ganismo en una matriz en concreto.El control microbiológico va muchomás allá dependiendo del cliente enconcreto y su problemática específi-ca.

NECESIDADESESPECÍFICAS

Aunque la legislación actual no obligaa testar los microorganismos dedesecho, la industria alimentaria dedi-ca muchos esfuerzos al análisis deéstos, ya que representan una medidade calidad del producto. Este grupo decontrol es muy amplio. Incluye determi-naciones generalizadas a la mayoríade las empresas del sector, como elanálisis de aerobios mesófilos, entero-bacterias, coliformes, o mohos y leva-duras. Pero también incluye determi-naciones tan específicas como ladeterminación de bacterias del ácidoláctico, que causa problemas en ali-ños; alicyclobacillus, que produce unsabor metálico a los zumos de frutas olas levaduras osmofílicas que, en pro-ductos con elevadas concentracionesde azúcares, producen gases. En las industrias de bebidas, es nece-sario trabajar con un gran volumen demuestra y uno de los hándicaps de lossistemas automatizados actuales es laimposibilidad de trabajar con estos

volúmenes. Es necesario disponer deun sistema que nos permita automati-zar este tipo de muestras.El mercado actual requiere una altaversatilidad en estos nuevos equipos,ya que uno de los requisitos microbio-lógicos incluye analizar no solo el pro-ducto en sí, o las materias primas, sinotambién las superficies de trabajo y lospuntos de control críticos. Por lo tanto,necesitamos poder analizar tambiénlos parámetros de control en escobillo-nes o esponjas.

SISTEMA SOLERIS

Desde hace 7 años, con una tecnolo-gía sencilla e innovadora y con másde 600 equipos en funcionamiento,Neogen Corporation ofrece la posibili-dad de solucionar todos estos requeri-mientos con un único equipo comercia-lizado con el nombre de Soleris. El sistema se diseñó basado en lasnecesidades del departamento decontrol de calidad de la industria ali-mentaria, cosmética y nutraceuticapara la determinación de todos losmicroorganismos de desecho e indica-dores. Su diseño permite la automati-zación de los análisis, con la mínimamanipulación por parte del usuario, lamayor especificidad posible y laobtención de resultados en horas enlugar de días. Por lo tanto, reduce sen-siblemente los tiempos de liberaciónde los lotes y de aceptación de lasmaterias primas.

MICROBIOLOGÍA A LA VELOCIDAD DE LA LUZNatàlia Reig

Especialista de producto, Vitaltech Ibérica S.L.

Equipo Soleris con incubador de capacidad para 128 muestras o de 32 muestras.


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VI WORKSHOP MRAMA

La PCR (Reacción en Cadenade la Polimerasa) es una técni-ca de biología molecular que

consiste en la obtención de replica-dos de DNA a partir de un DNAmolde, utilizando una enzima DNA-Polimerasa. Esta polimerasa comien-za a copiar sólo si existe un fragmen-to de DNA específico, el cebador oprimer. Los cebadores son fragmen-tos de DNA diseñados de forma com-plementaria a los extremos del DNAmolde para poderlo replicar.Actualmente, el proceso de la PCRestá totalmente automatizadomediante un aparato llamado termo-ciclador.La PCR a tiempo real, que permiteobtener millones de copias de unfragmento de DNA en pocas horas,se utiliza en laboratorios de microbio-logía para la identificación de patóge-nos, como Salmonella, Listeria oLegionella. Para la detección de bac-terias patógenas se utiliza un frag-mento del DNA bacteriano específicoy perfectamente definido.El gran número de copias de DNAque se obtiene tras la reacción dePCR a tiempo real puede detectarsemediante fluorescencia. La deteccióndel DNA se hace con fluoróforos, queson moléculas que emiten fluores-

cencia cuando vuelven a su estadonormal desde un estado excitado.Los fluoróforos pueden ser inespecífi-cos, si detectan todo el DNA produci-do durante la reacción, o específicos,si distinguen entre la secuencia deinterés y los dímeros de primers o lasamplificaciones inespecíficas.Las etapas de la técnica PCR puedenresumirse en los siguientes pasos:1. Desnaturalización. Las dos cade-

nas de ADN molde se separan(normalmente mediante calenta-miento).

2. Apareamiento (hibridación). Loscebadores se unen a la parte com-plementaria del ADN molde.

3. Extensión. La ADN polimerasa(termoestable) copia el ADNmolde.

4. Repetición cíclica de los trespasos: 20-30 veces.

La PCR supone muchas ventajasinmediatas respecto a los sistemas decultivo tradicionales. Una de ellas esla rapidez de la técnica, que permiteefectuar la determinación en tan solo4-5 horas (a diferencia de las casi 70horas que se necesitan en los méto-dos clásicos). Otro punto positivo dela PCR es la elevada especificidad sise eligen los genes diana adecuada-mente. Además, también hay que

tener en cuenta los excelentes nivelesde sensibilidad y reproducibilidad delmétodo. Todo estas ventajas haránque incremente la capacidad de aná-lisis y que mejore la optimización delos recursos humanos, materiales ytemporales del laboratorio que utilicela PCR.La técnica PCR se encuentra enestos momentos en pleno auge. Asílo demuestran la gran cantidad deartículos científicos sobre PCR queestán siendo publicados en revistasespecializadas durante los últimosaños. Además, la venta de equiposde PCR va creciendo también deforma exponencial año tras año, conel consiguiente abaratamiento de losequipos. Muchas empresas noshemos dado cuenta del tremendopotencial que tiene la técnica PCR decara al futuro, por lo que hemospuesto a la venta kits especialmentediseñados para la detección de pató-genos concretos.

DETECCIÓN DE BACTERIAS PATÓGENASMEDIANTE LA TÉCNICA PCR A TIEMPO REAL PARA

LABORATORIOS DE MICROBIOLOGÍA

Richard Fielder

La tecnología usada se basa en la capa-cidad de los microorganismos de conver-tir los azúcares en ácidos durante la fer-mentación. La muestra a analizar seintroduce en los viales específicos yéstos se introducen en el incubador.Estos viales contienen medio de cultivoespecífico con un indicador de pH. En losviales hay dos zonas bien diferenciadas,una de crecimiento y una de detección.El crecimiento microbiano en los vialesproduce un cambio de pH y, por lo

tanto, un cambio de color en el medio,que es detectado a tiempo real por elincubador. Las ventajas de esta meto-dología son la simplicidad de uso, larapidez en la obtención de los resulta-dos y la monitorización de éstos.Además, nos permite trabajar con ungran número de microorganismos, conniveles de sensibilidad de hasta 1organismo por vial, con un rango dedetección de hasta 107-108 y congran versatilidad de muestras (materia

prima, membranas de filtración paragrandes volúmenes, escobillones parasuperficies, producto acabado,…).Finalmente, un software fácil de usarbasado en windows, que realiza la lec-tura y el almacenaje de los análisisautomáticamente, con aplicacionesHACCP, capacidad de trabajo con códi-go de barras y vista remota de losdatos, convierte a este equipo en elcompañero ideal en el laboratorio ali-mentario.

International Marketing Manager de Biosere-mail:[email protected]



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La presencia de microorganis-mos patógenos en alimentos esuno de los problemas esencia-

les en la salud pública. Salmonellaspp, Listeria monocytogenes, E. coli0157:H7 y Campylobacter spp. pue-den considerarse las principales cau-sas de enfermedad y/o mortalidadasociadas a patógenos de origen ali-mentario. La industria alimentaria debe asegu-rarse que cada uno de sus productoscumpla la normativa establecida paracada patógeno y alimento, para evitarasí posibles toxicoinfecciones de losconsumidores.Tradicionalmente, el proceso dedetección de microorganismos en laindustria se basa en técnicas demicrobiología clásica. Estas técnicasde identificación suelen ser largas ytediosas y, en la mayoría de los casos,no pueden aplicarse a alimentos oproductos perecederos con una vidacorta.El desarrollo de las técnicas de biolo-gía molecular y el estudio del genomade especies de interés han permitidodesarrollar métodos de control de cali-dad basados en el estudio del ADN.Estos métodos son más precisos, sen-

sibles, fiables y rápidos que los con-vencionales.En Applus-Roche hemos desarrolladouna técnica de detección de patóge-nos basada en la PCR a tiempo Realque permite un análisis en 24-48horas. La PCR a tiempo real es unmétodo específico que permite ampli-ficar un segmento concreto y conocidodel ADN de modo exponencial. LaDNA polimerasa es la enzima encar-gada de amplificar esta secuencia,junto al par de cebadores o primers,que delimitan la zona a amplificar, y eluso de un tercer primer especificopara cada patógeno capaz de captar yemitir fluorescencia, conocido comosonda. La fluorescencia emitida por lasonda es captada por el equipoLightCycler® 480 ROCHE, y nos per-mite visualizar los resultados simultá-neamente a la amplificación.Habitualmente, esta detección depatógenos mediante PCR a tiemporeal, se realiza en reacciones en uni-plex, es decir, una PCR para cada unode los patógenos, donde cada sistemaes exclusivo y específico para un pató-geno en concreto. En Applus, hemosdesarrollado un sistema en multiplex,donde se amplifican simultáneamente

distintas secuencias de ADN en unamisma reacción. Cada patógeno adetectar va marcado con un fluorocro-mo diferente y con el LightCycler® 480ROCHE se leen las distintas emisionesy se interpretan los resultados. De estemodo, se pueden detectar varios pató-genos en una misma PCR. Esta técni-ca conserva la elevada especificidadpara cada patógeno y nos permite unahorro importante de tiempo y costes.Las matrices alimentarias pueden lle-gar a ser muy complejas, y puedencontener sustancias que inhiban laPCR, pudiendo ocasionar resultadosfalsos negativos, por este motivo, esimportante utilizar un control de inhibi-ción que permita asegurar que la PCRno está inhibida y los resultados sonfiables.Tras la recepción de la muestra esnecesaria la homogenización median-te el stomacher o homogenizador y elposterior cultivo overnight con unmedio de cultivo apropiado según laespecie a detectar. A continuación, serealiza la extracción del ADN con pro-tocolos adaptados a cada matriz ali-mentaria, PCR a tiempo real y, final-mente, la interpretación de los resulta-dos.

PCR A TIEMPO REAL. ANÁLISIS DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS

Mireia Robles

Laboratorio de Genética. Applus

B ioMérieux es una empresade biotecnología quedesarrolla, produce y comer-

cializa reactivos y equipos automati-zados destinados a análisis clínicos

y a controles microbiológicos indus-triales.A través del diagnóstico biológico,queremos contribuir a mejorar laSalud Pública en el mundo.

Actualmente, bioMèrieux es líderdestacado en la automatización dedetección de patógenos alimentarioscon los equipos Vidas y miniVidas,con mas de 240 equipos instalados

SISTEMAS AUTOMÁTICOS VALIDADOS DERECUENTO BACTERIANO EN LA INDUSTRIA

ALIMENTARIAFrancisco García Bejarano

Especialista en Microbiología IndustrialbioMèrieux España S.A.


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VI WORKSHOP MRAMA

en Industrias, en laboratorios exter-nos públicos y privados y acredita-dos por la ISO 17025, y realizandomás de 600.000 determinaciones depatógenos durante 2007. Conmedios de cultivo de reconocidoprestigio internacional, cumpliendocon los criterios de calidad más exi-gentes en su producción, como porejemplo la norma de fabricación ycontrol de medios de cultivo, ISO11133, en todos los medios que loprecisan.

¿QUÉ ES TEMPO?

Tempo es la primera solución auto-mática multiparamétrica pararecuento de Indicadores deCalidad en cualquier matriz de ali-mentos, con un único protocolo,basada en microbiología tradicional:método NMP miniaturizado.

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mentos.- Lecturas 24h (40hTVC).

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Flexibilidad en el laboratorio:- Inicio y lectura de los análisis en

cualquier momento del día.- Permite afrontar picos de trabajo. - Formación del técnico es simple. - Permite cambio de turno de ope-

rarios.- Dedicar recursos a tareas extra

(gestión, calidad…).

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- Resultados reproducibles: elimi-nar errores de asignación, mues-tras, transcripción, cálculo dediluciones, cambio de reactivos,interpretación resultados…1 muestra = 10 operarios =

10 resultados distintos1 muestra = 1 tempo =

1 resultado reproducible• Gestión de datos integral en el

laboratorio: conexión LIMS.• Datos históricos de producto-pro-

ceso.• Análisis de tendencias, ARPCC.• Auditorías más sencillas.Validación AFNOR (según ISO16140) en todos los alimentos enlos siguienes parámetros disponi-bles:

- TEMPO EC (E. Coli).- TEMPO TVC (Aerobios

Mesófilos).- TEMPO TC (Coliformes totales).- TEMPO EB (Enterobacterias).

Estación de trabajo al completo.

Estación de trabajo al completo.Filling rack.

Incubation / Reading Rack


metodos de recuento

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