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137Julia VinagreCALIDAD DE METODOS ANALITICOS CAPITULO 13

138El proceso analtico se puedeconsiderar dividido en 3 etapas: i)Basndose en las consideraciones deEgan, la eleccin de mtodos debe considerar:CRITERIOS PARA LA ELECCIONDE UN METODOimplicancias nutricionales del nutrien-te, lo cual incluye su rol, su distri- bucin en los alimentos y su importancia relativa en alimentos individuales en el suministro dietario total del nutriente.segundo requisito es comprenderelde El lasalimento y enrango esperado del nutriente.la matriz delnutriente, y el concentracinprocesamiento y la preparacin sobredelefectoelanalizado,serSuele suceder tambin que laslegislaciones de alimentos se basen en un mtodo estandarizado oficial que puede no ser el ms adecuado desde el punto de vista nutricional y, por tal motivo, se deben tomar decisiones individuales en cada caso.fielmente posible el valor nutritivo delalimento. En esta eleccin de un mtodo particular, se debe conocer, en primer lugar la qumica del nutriente, la naturaleza del sustrato alimenticio amsloreflejardebenutrientenutricional, es evidente que el mtodode anlisis seleccionado para unmodernos puede producir valoresmenos confiables que el mtodo tradicional que pretende reemplazar y es preferible desarrollar programas que aseguren la calidad de los datos obtenidos.esalimentosdecomposicinuso de instrumentosunvecesMuchasSi se considera que el principalobjetivo de la base de datos dede sofsticacin delen el gradoinstrumento. mtodo conEn la eleccin de un mtodo se debefocalizar la atencin en los principios analticos involucrados, ms bien queLa seleccin de un mtodo analticodebe ser realizada por el consejero cientfico del programa de base de datos, pero esta responsabilidad debe ser compartida con el analista.instrumentos y; iii) toma y tratamientode datos. La calidad de los resultados depende de la calidad de las diferentes etapas del proceso analtico.deusoelmedianteanalticaLos mtodos analticos que seapliquen para producir datos de composicin qumica de alimentos deben ser apropiados, utilizar tcnicas analticas exactas y ser realizados por analistas entrenados.operaciones previas (muestreo, acon-dicionamiento, disolucin, separacio- nes, reacciones analticas y otras); ii) Medicin y traduccin de la sealINTRODUCCION

139Es la cercana del valor analtico al"valor verdadero" de concentracin del compuesto de inters en el material bajo examen. Es la concor-El objetivo del anlisis es determinarcul de estos atributos es importante y cul puede estar comprometido. Ejemplo: si se desea analizar unExactitudprecisin, sensibilidad y detecta-bilidad), siendo por lo tanto, un concepto compuesto.interferencia de otros componentes enla matriz de la muestra.(aplicabilidad, exactitud,tcnicosanalito, libre dedelpresenciaLa especificidad se refiere a la propiedad del mtodo de producir unaseal medible debida slo a laEs un trmino general cualitativo queexpresa el grado de cumplimiento satisfactorio de un mtodo analtico en trminos de sus variados atributosConfiabilidad(Ejemplo: grasa total, cenizas)un grupodedentrosimilarescaptar compuestosanlisis essustancia que se desea analizar. Sinembargo, en algunas ocasiones se aceptan mtodos con una pobre especificidad cuando el propsito dela laexclusivamenteresponderEs la habilidad de un mtodo paraEntre los atributos a considerar en lacalidad de un mtodo se deben mencionar aquellas caractersticas que son bsicas: confiabilidad, aplicabili- dad, especifidad, exactitud, precisin, detectabilidad y sensibilidad.Especificidad o selectividadse aplican en forma uniforme a variostipos de alimentos sobre aquellos que se aplican a alimentos especficos.Preferir mtodos de anlisis quec)internacionales reconocidas.organizacionesporadoptadosoEn la aplicabilidad de un mtodo sedebe considerar que est libre de interferencias producidas por otros materiales presentes en la muestra alimenticia, asimismo influye el rango en que se va a usar el mtodo.b) Preferir mtodos documentadosAplicabilidadREMCO, 1993)/(ISOlaboratoriosvariosencalidad y confianza se ha establecidoen estudios colabo-rativos, o similarescomponente mayor no se requiere unbajo lmite de deteccin.Dar preferencia a mtodos cuyaa)

140corresponde, aproximadamente, alqueimprecisinlaconsiderarEn trminos reales ms bien se debeprocedimiento ms exacto que elevaluado (por pesada, dilucin enunporuna muestraprepararPrecisinSi bien el valor verdadero de laconcentracin no se conoce sino que slo puede estimarse, es posibleDe todas ellas, sin lugar a dudas, lams utilizada es la recuperacin.confianza. Si el tob resulta mayor queel valor tabulado, el mtodo tiene un error sistemtico, del signo resultante, para ese mbito de confianza.dembitoesepararequeridaSi el tob es menor que el valortabulado el mtodo tiene la exactitudX = valor promedio X

= valor verdaderoRecuperacin:Desviacin:Desviacin relativa:Matemticamente se expresa:En el anlisis de macrocomponentes,en general se requiere que el valor medido no difiera significativamente del aceptado como referencia. Para determinarlo, se utiliza un ensayo t de Student, efectuando varias determi- naciones de la muestra de con- centracin conocida y calculando el t experimental (tob) que se compara con tablas t para n-1 grados de libertad en el nivel de confianza escogido, generalmente p=0,05.En la prctica la cercana a unestndar de algn tipo se toma como medida de exactitud.La exactitud o mejor dicho lainexactitud debe ser tan pequea como sea posible para que el valor medido se aproxime al de referencia, o sea, la recuperacin debe acercarse al 100%.de unel valorentre el valor promedioconjunto de repeticiones y verdadero.peso, etc.) y utilizarla como refe-rencia.dancia entre la mejor estimacin deuna cantidad y su valor real. La inexactitud es la diferencia numrica

141matemticamente por "S" o mscomnmente por RSD o CV.expresaprecisin seLaelaentre ensayos individuales cuandomtodo se aplica repetidamente mltiples alcuotas de una muestrab) El mtodo, evaluando la dispersinde varias preparaciones de la muestra final homognea. La evaluacin corresponde a todo el procedimiento, desde la preparacin de la muestra hastala medicin del analito por paite del instrumento. La imstercision causada por las diluciones es un factor que con frecuencia se olvida.La precisin est relacionada con ladisposicin de las medidas alrededor de su valor medio o central y corresponde al grado de concordanciadispersin de al menos 6inyecciones del estndar, por ejemplo en tcnica HPLCsistema, evaluando laEla)La precisin de un mtodo analiticodebe estudiarse sobre:Para evaluar datos de un amplio rangode concentracin es ms til calcular la desviacin estndar relativa (RSD) o bien el coeficiente de variacin por ciento (CV%).La precisin tiene la desventaja querequiere que los valores se distribuyan normalmente, que enfatiza los valores extremos de una serie de mediciones y que en muchos mtodos aumenta la desviacin estndar cuando aumenta la concentracin.Los estimadores desviacin estndar ydesviacin estndar relativa permiten evaluar la incertidumbre en la estimacin de la medida (error aleatorio, correspondiente a la, dispersin de datos alrededor de la media).trmino dispersin y variabilidadanaltica. La imprecisin se determina haciendo ensayos repetitivos de una misma muestra analtica, o de cada conjunto de muestras analticas y luego se calcula la desviacin estndar, siendo muy importante en este caso la homogeneidad del sustrato.

142sustancia (definida en trmino decantidad absoluta o concentracin)mnima de unaEs la cantidadDetectabilidadanalizando un conjunto de muestrasque han sido analizadas por otro mtodo o por otro laboratorio. El analista debe familiarizarse con un mtodo y asegurarse que ha alcanzadohacersepuedevalidacinLaAn los mtodos bien establecidosnecesitan ser validados por los analistas usando el personal, reactivos y equipos del laboratorio cuyo mtodo se quiere validar.Student tabulado para n medicionescon v=n-l grados de libertad y para varios niveles a de significancia (el ms aplicado es p=0,05 corres- pondiente a un intervalo de confianza del 95%).VALIDACION DE METODOSEn la Grfico 1 se resumen losatributos a considerar en la calidad.Cuando el nmero de muestras espequeo (menos de 30), las medidas independientes y la distribucin normal se calculan de acuerdo a la distribucin t de Student:Es la pendiente de la curva respuesta -concentracin, o el cambio de respuesta por unidad de concentracin. Si la pendiente es empinada el mtodo tiene alta sensibilidad y si la pendiente es poco empinada, el mtodo posee una baja sensibilidad. En estudios de composicin de nutrientes el anlisis de elementos trazas requiere alta sensibilidad, lo que en la prctica se puede lograr mediante amplificacin electrnica o porconcentracin qumica del analito.En muchos casos debe indicarse ellmite o intervalo de confianza de la medida el cual corresponde al rango en el cual puede definirse la probabilidad de capturar el parmetro con la probabilidad indicada.Sensibilidaddiferente da, diferente instrumento).analista,(diferentereproduciblescondicioneseninstrumento) ymedible para un mtodo descrito.(mismomismorepetitivasmismo da,condicionesanalista,La precisin se puede medir enrespuestaunaproporcionaque

143igual con un alimentodiferente sinoexactamenteoperedeterminadosatisfactoriamente con un alimentose ha realizadomtodoemulsif-cantes, pueden constituirseen un problema especial cuando se analiza con un mtodo de anlisis desarrollando para un alimento primario.contienensiespecialmentecomprobarlo. As por ejemplo, ali-mentos procesados y formulados,hastaopuestaposicinlamuy por el contrario, se debe asumirSi un mtodo particular sobre unalimento, o realizado en otro labo- ratorio, ha dado un cumplimiento adecuado est indicando que el m- todo es adecuado, pero esto no signi- fica que se pueda asumir que si elGrfico 1Respuesta en funcin de la concentracin del analito Atributos de los mtodoun conjunto de blanco y muestrasanalticas sintticas o fortificadas.el grado deseado de recuperacin yprecisin despus de haber analizado

144debenpar-validacinsiguientesEn un ensayo deconsiderarse los metros:conocidas, dentro del rango deaceptacin del producto o dentro del rango de aplicacin de la metodologa.de concentracioneshomogneasmbitos estimados de trabajo con unexceso de al menos 50% sobre el lmite superior y un defecto de 50% debajo del lmite inferior. Estas soluciones se inyectan, al menos por duplicado, y se determina la curva de regresin Y = bX+a sobre los puntos individuales sin promedios por el mtodo de los cuadrados mnimos y se grafica para su documentacin.loscomprendiendoestndarunPara su determinacin se prepara unaserie de mnimo cinco diluciones deEn muchos casos un mtodo analticoes desarrollado y validado por un grupo de trabajo y aplicado por otro grupo y para asegurar que este ltimo sea a su vez capaz de entregar resultados confiables, es conveniente realizar una transferencia de vali- dacin. Si se trata, por ejemplo, de un mtodo cromatogrfico consiste en la comparacin de resultados de las pruebas de adecuacin y anlisis en paralelo, al menos dos muestrasAdems, conjuntamente se determinael rango lineal, es decir, el intervalo comprendido entre la concentracin mnima y mxima de analito para el cual el mtodo ha sido probado y dentro del cual se puede efectuar el dosaje por interpolacin en una curva estndar.vez.cadamltiplesestndaresLa selectividad, precisin, exactitud ysensibilidad, fueron descritas con anterioridad y en lo que respecta a la linealidad de un mtodo analtico se refiere a la proporcionalidad entre la concentracin de analito y su respuesta. Este paso de la validacin es necesario si se va a trabajar con un solo estndar en las determinaciones de rutina, aunque pueden aceptarse mtodos no lineales, si se opera conEvidentemente todo nuevo mtodoanaltico debe validarse para demos- trar su idoneidad, pero generalmente existen metodologas antiguas aplicadas durante mucho tiempo y entonces tiene poco sentido validar como si fuera una metodologa desconocida. Se habla entonces de una validacin retrospectiva, donde se pueden combinar los nuevos criterios de validacin con toda la experiencia ya adquirida. En cambio, se conoce como validacin prospectiva a la que se realiza frente a un producto nuevo.selectividadlinealidad precisin exactitud sensibilidad robustezLa validacin consiste, en esencia, enconfirmar y documentar que los resultados emanados de la aplicacin de un mtodo de anlisis son confiables.

145diferentes mtodos. El lmite deconfianza para el estimador de lacorrelacin deevaluar laDe la pendiente (b). Se determinacomo parmetro indicativo de la sensibilidad del mtodo, para-Del coeficiente de regresin lineal(r). Se determina para evaluar el ajuste al modelo lineal propuesto, Y=bX+a.-en un intervalo de confianza dado (porejemplo p=0,05):, La no correspondencia de las rectasindica problemas por efecto de la matriz y est relacionada con la exactitud del mtodo en cuestin. Estos efectos de matriz pueden clasificarse de acuerdo a su naturaleza en aditivos y multiplicativos. Los aditivos se refieren a un despla- zamiento positivo del cero en presencia de la matriz y los multiplicativos a un cambio de la pendiente. Independiente de la apa- riencia de la recta, resulta conveniente evaluar los estimadores de regresinGrfico 2Rectas de regresin del analito y analito ms matriz para HPLCpuro, con la correspondiente a analito+ matriz (en el Grfico 2, se seala para HPLC el efecto de la matriz).En muchos casos es interesantecomparar los resultados de la recta de regresin obtenida sobre el analito

1464. Garfield, F.M. 1991. QualityAssurance Principies for AnalyticalLaboratories. AOAC International.3. Miller, J.C. and Miller, J.N. 1988.Statistic of Analytical Chemistry. John Wiley & Sons.ChemicalforEl mejor indicador del modelo lineal,en reemplazo de r es el clculo del valor tr con n-2 grados de libertad el cual se compara con el valor t tabulado para el nivel de confianza requerido. La hiptesis nula es "no existe correlacin entre X e Y", si el valor observado de tr es mayor que t tabla se rechaza la hiptesis y existe correlacin lineal significativa con la probabilidad calculada.1993.Welac.2. Euchem andAcreditationLaboTatories.1. Quattrocchi, O.A.; Abelaira, S. L.and Laba, R.F. 1992. Introduccin a la HPLC; Aplicacin y prctica. Buenos Aires, Argentina, Artes Grficas FarroBIBLIOGRAFIApendiente (b) se calcula en funcinde su varianza Sb.De la ordenada al origen (a). Sedetermina para evaluar la pro- porcionalidad de la funcin analtica, es decir, que la recta pase por el origen y que cualquier desviacin pueda adjudicarse nicamente a un error aleatorio. El lmite de confianza del estimadorde la ordenada al origen (a) se calcula en funcin de su varianza Sa.-

147Lilia MassonMETODOS ANALITICOS PARA LADETERMINACION DE HUMEDAD, ALCOHOL, ENERGIA, MATERIA GRASA Y COLESTEROL EN ALIMENTOSCAPITULO 14

148producido por solubilizacin de losxidos de azufre y nitrgeno.calorRequiere correcciones por elLas siguientes consideraciones sedeben tener en cuenta:1. Bomba calorimtricaLos mtodos ms usados (3) son:Al expresar el valor de energa de unalimento deber evitarse de usar ms de tres cifras significativas. El mtodo empleado cualquiera que sea debe ser descrito claramente.ENERGIALa expresin kilocaloras se sigueusando, a pesar que se recomienda el sistema internacional de kilojoule. El factor de conversin es 1 kcal = 4,184 kJresumen de los mtodos ms usadospara la determinacin de humedad en alimentos, sealando brevemente sus ventajas, limitaciones y aplicaciones.encuentra unEn el Cuadro N 1 secomponentes.para estosacuerdoanhayesenciales ycomo alcohol, aceitesmateria grasa.En particular para fibra diettica,alcoholes azcares, oligosacridos, noEn general, los ms usados aplican uncierto grado de calor. El alimento sufre cambios que pueden afectar el valor obtenido como humedad. Se pierden compuestos voltiles junto con el agua,La energa metabolizable se calculaaplicando los factores para: protena, materia grasa, cabohidratos dispo- nibles, cidos orgnicos y alcohol.2. Clculo por factoresPor estas razones debe seleccionarsecuidadosamente el mtodo a aplicar para la determinacin de humedad en un alimento, ya que un mismo mtodo no sirve para todos los alimentos.convertir a valores de humedad tipo;expresar en base seca y expresar en base tal como se recibi.Los valores obtenidos son los valoresbrutos de combustin y que deben diferenciarse de los valores de energa metabolizable, que habitualmente se emplean en nutricin.valores;compararpermite:queLa determinacin de humedad es unpaso obligado en el anlisis de alimentos (1,2). Es la base de referenciaLa calibracin se realiza generalmentecon cido benzoico como patrn termoqumico.HUMEDAD

METODODESECACION POR ESTUFA

130 13 hrs.Destructivo, prdida de voltiles,caramelizacin de azcares, noRpidoSemillas oleaginosas105 1Peso constanteaplicable a alimentos azucarados, grasas o aceites esenciales.Mayora de los alimentos5mg60 a presin reducidaLento, prdida de voltilesMtodo UniversalAlimentos azucarados, materias grasas. Variante de agregar arenaFacilita la determinacin.Alimentos con aceites esenciales.tanto a 105 C como a 60CMayor superficie para la salida Alimentos con contenido grasoy a presin reducida *de la humedad general.importante. Alimentos en general.

HORNO MICROONDACosto del equipoRpidoAlimentos, humedad alta y media

KARL FISHERCosto del equipoRpidoAlimentos de muy baja humedad.Alimentos higroscpicos.NMRCosto del equipo, necesita calibracinRpidoMayora de los alimentos, semillas. LIOFILIZACIONPermanece agua residual, costo del equipoNo altera el productoMayora de los alimentosDETERMINACIONRpido. DeterminaAlimentos con alto contenido deCON ARRASTREslo la humedad.materias voltiles, pimentn, CONXILOLOcebolla, margarina, mantequilla, TOLUENO (MET.manteca.DEANYSTARK)

Temperatura CTiempoLimitacionesVentajasAplicacionesCuadro 1Mtodos mas usados para la determinacin de humedad

Acido lctico 3,62 15Acido mlico 2,39 10Acido qunico 2,39 10

Acido ctrico 2,47 10Acido actico 3,49 15Glicerol 4,31 18Protena 4 17

Materia grasa 9 37Monosacrido 3,75 16Disacrido 3,94 16Almidn y glicgeno 4,13 17Alcohol etlico 7 29Componente kcal/g kJ/g

150Cuadro 2Valores de energa para algunos componentes de los alimentosbomba calorimtrica. Se puede obtenerpor clculo en base a la composicincaloren laEs la energa liberada comocuando el alimento se quemaEnerga bruta--Protenas: 5,4 - 1,25 = 4,15. Seaproxima a 4,0 kcal o 17 kJ/g Carbohidrato: 4,0 kcal o 17 kJ/g Grasa: 9,0 kcal o 38 kJ/g-entresignificativamenteindividuos.varalosnodigestibilidadLad)aparente son constante para todos losalimentos.Los coeficientes de digestibilidadc)Es la energa de los carbohidratos,grasas y protenas menos la cantidad presente en las heces. A efectos de clculo se utilizan los siguientes factores:Energa disponibleaparente dan una indicacin exacta dela energa disponible.Las medidas de digestibilidadb)Grasa: 9,3 kcal o 39 kJ/g---qumica del alimento utilizando lossiguientes factores de conversin:

Protena: 5,4 kcal o 23 kJ/gCarbohidrato: 4,1 kcal o 17 kJ/ga) La energa bruta de diferentesprotenas, materia grasa y carbohidratos es constante para todos los alimentos.

151Ocupa el refractmetro de inmersin.Debe tenerse un muy buen control de la temperatura a 15,56C. A temperaturasPor esta razn las muestras debenneutralizarse antes de la destilacin. La determinacin se efecta por medio de un hidrmetro calibrado y se registra la3. Mtodo refractomtricoNiveles de S02 superiores a 200 mg/1Acidez voltil que exceda 0,10%El control de la temperatura y presinson factores importantes a considerar en la determinacin.elsedestilables. Interfieren el S02 y cido actico a los niveles quesealan a continuacin:Los azcares reductores no sonEl peso especfico se convierte aporcentaje de etanol a 15,56C. Se aplica a destilados entre 25-79 alcohlicos.El contenido de etanol se puede mediren el destilado a partir de un volumen de la muestra exactamente medido.1. HidrometraRequiere de un equipo especial. Mideel peso especfico de la muestra, por el cambio de frecuencia de oscilacin en un tubo en U comparado con dos estndares.Se pueden aplicar varios mtodos (1).A continuacin se resear brevemente la base de ellos.2. Mtodo densitomtricoALCOHOL ETILICOcuidados extremos en todo el procesode neutralizacin, destilacin, medicin y control de temperatura.yexperienciabastanterequieredisponible de grasa y protena en 2-3%con ingestas moderadas y en un 4-6 %con ingestas altasLos hidrmetros para etanol debencalibrarse con soluciones de etanol exactamente preparadas. Este mtodoaparentela energaSe reduceFibra dietticaTambin se puede determinar elporcentaje de etanol en volumen con hidrmetros que miden el peso especfico y consultar posteriormente las tablas pertinentes.especficas.Otras tablas miden los carbohidratosdisponibles, no calculan por diferencia. Calculados como monosacridos usan3,75 kcal o 16 kJ/g.tablasdese obtienevolumentemperatura. El porcentaje de etanol enProblema de los carbohidratos

152acetaldehido formado y luegoelatrapandoalcalino,medioEl etanol presente en vinos, cervezas,jugos se puede separar de otros componentes por GLC. Para mejorarLa reaccin se desplaza a la derecha en6. Anlisis de etanol porcromatografa gas-lquido (GLC)Actualmente se dispone de mezclaspreparadas. Debe tenerse precaucin en la medicin cuantitativa de volmenes muy pequeos de reactivo y muestra.Debe tenerse especial precaucin con elmaterial de vidrio, exactitud de las mediciones, calibracin de pipetas, etc. Debe realizarse un blanco.espectrofotomtricamente a 334, 340 o360 nm.determinaseproducidoNADHEl exceso de K2Cr207 se determina con solucin de sulfato ferroso y amonioestandarizado. Los tiempos y tem- peratura de incubacin para oxidar el etanol a cido actico son crticos.acetaldehido por el NAD en presenciade la enzima alcohol dehidrogenasa (ADH) para producir NADH. Es una reaccin esteoquiomtrica en condi- ciones experimentales adecuadas. ElaoxidarpuedeseetanolEl7. Mtodo enzimticoEl etanol obtenido por destilacin seoxida cuantitativamente a cido actico por un exceso de dicromato de potasio estandarizado.5. Determinacin de etanol por elmtodo de dicromato de potasioSe recomienda determinar el porcentajede etanol en volumen por un mtodo oficial para efectos de control.empacadas de acero inoxidable o vidriode 2 m rellenas con Porapack QS, Carbowax 0,2 % 1500 sobre Carbopack C 80 -100 mesh, Chromosorb 103.columnasemplearpuedenSeSe utiliza el mtodo del picnmetro. Sedebe tener la precaucin de un buen control de peso del picnmetro y bien calibrado, y un muy buen control de temperatura4. Determinacin del etanol en pesoLa relacin de rea de ambos picos secompara con la de una solucin patrn de etanol y 2-propanol.los aspectos cuantitativos se usa 2-propanol como estndar interno.diferentes se aplican factores decorreccin.

pigmentos carotenoidesextraccin con ter de petrleo, ter etlico153materia grasa total-evaporacin del solventepesada del residuo--Entre las determinaciones ms frecuen-tes se pueden sealar:saponificacinlavado---Generalmente se aplica mtodoAOAC- AOCS o Comunidad Europea(1,6). Se tienen las siguientes etapas:Desde el punto de vista de una base dedatos de composicin de alimentos, el anlisis y determinacin de los dife- rentes componentes lipidcos de un alimento encierra una serie de desafos y problemas.MtodosLIPIDOSEs un dato que normalmente sedetermina cuando se van a cuantificar esteroles u otros componentes que se encuentran en la materia insapo- nificable.2. Materia insaponificableEl mtodo es muy sensible, debetenerse especial cuidado con el agua empleada que debe estar libre de etanol. Igualmente se recomienda tapar las cubetas en el momento de la lectura. El etanol es muy voltil. Debe trabajarse en atmsfera libre de etanol. Para controlar el mtodo se recomienda emplear una solucin patrn de etanol.En el Cuadro 3 aparece un resumen delos mtodos ms empleados en la extraccin de materia grasa total. Se ha sealado brevemente sus limitaciones, ventajas y aplicaciones.En general en alimentos lquidos serecomienda clarificar y filtrar.1. Materia grasa totalcontinuacin. Los dos ltimos serntratados en otra seccin.aexpondrn brevementeseDependiendo de la longitud de ondaque se elija, se debe tener la precaucin de que la concentracin de etanol sea de 0,01 a 0,12g/l (365 nm) o de 0,005 a0,06g/l(340o334nm).Para cada uno de estos temas sedispone de diversas metodologas quevitaminas liposolubles A, D, E, K-.--oxidndolo a cido actico en presencia de aldehido dehidrogenasa.materia insaponificable

esteroles cidos grasos-

154Comunidad Europea (1,6).AOCS,AOAC,oficialmtodopuede realizar porinsaponificable sematerialadeobtencinLaSeparacin de la fraccin de esterolesdel insaponificable extrado mediante cromatografa en placa de slica gel bsica.b) Mtodo generalExtraccin de la materia insapo-nificable con ter etlico.Saponificacin de la materia grasa conKOH alcohlico, a la cual se adiciona alfa colestanol como patrn interno.Para la determinacin cuantitativa secalculan las reas de los picos del colestanol y de los esteroles dadas por el integrador y se aplica la frmula para expresar en mg/kg de materia grasa.El mtodo se basa en:a) Mtodode la ComunidadEuropea (6)El tiempo de retencin del betasitosterol se ajusta a 205 minutos.3. Esteroles por GLClaapor pesada, que correspondemateria insaponificable.Para la identificacin de los diferentespicos se usan los tiempos de retencin y la comparacin con mezclas de TMSE de los esteroles analizados en las mismas condiciones.Proceder a una cuidadosa evaporacindel solvente y control del residuo finalRealizar un lavado exhaustivo pararetirar jabones.Evitar los problemas de separacin defases, formacin de emulsiones.Anlisis por columna capilar GLC deslica fundida o vidrio 20-30 m de largo de 0,25 a 0,32 mm dimetro interno, recubierta con fase lquida Se52, Se54 o equivalente, grosor de pelcula entre0,1 y 0,3 Tm y temperatura de la columna 260C 5o.extraccin con los solventes.cuidadosaunarealizarseDebetildisilazano: trimetilclorosilano 9:3:1,a razn de 50 T1 por mg de esteroles.hexame-piridina:mezclaconDebe asegurarse una completa sapo-nificacin, para lo cual la preparacin del KOH alcohlico es importante.derivatizan a trimetilsililteres (TMSE)serecuperadosesterolesLosLimitaciones o inconvenientes

Otros mtodos

Dispersin de la luz. Milkotester.Rpido. Leche crudaEquipo especial de alto costo. NMREquipo especial de alto costo.

Mtodos volumtricos

Carbonizacin selectiva con H2S04 concentradoEquipo especialRpido. Se us mucho para leche y derivados lcteos.

Extraccin con mezcla de solventes

Hidrlisis acida previa a la extraccin con solventes: EterNo se recomienda ocupar el extracto lipdico en el

emplean. No recomendable en alimentos ricos enalimentos. Trabaja sobre muestra fresca. Debe aplicarse a todo etlico, ter de petrleo.tratamiento trmico.Mtodo de Folch, Bligh y Dyer Cloroformo-MetanolAlternativa: usar embudos de decantacin.Mtodo de eleccin para leche y productos lcteos.

Cierto costo en solventes. Re-extraccin paraExtraccin en frio, aplicable prcticamente a todo alimento. El

Debe conocerse el % de humedad del delesteroles, etc. Son mtodos rpidos.

Extraccin con un solventeSolventes inflamablesSemillas oleaginosas, cubos de caldo saborizantes. baja humedad, menos de 8%.Discontinuo (SOXHLET)Algunos tipos de derivados crneos, frutas yusarse para estudio de cidos grasos. No se puedeAutomtico (FOSS-LETaplicar a alimentos sometidos a algn tratamientoDerivados crneos

Tetracloroetileno

MtodoLimitacionesVentajas y aplicacionesRequiere calibracin.Semillas oleaginosas. Mtodo muy rpido.Requiere calibracinNear Infrared Reflectance (NIR)Cereales. Leche.Equipo especialalimento para ajustarla al 80%.extracto se puede usar para determinacin de cidos grasos,purificacin, debe conocerse el % de humedadEquipo especial con tubos y centrifuga adecuada.Hidrlisis alcalina previa a la extraccin con solventes: Eterazcares, productos lcteos.alimento sometido a algun tipo de procesamiento 0etlico, ter de petrleoestudio de cidos grasos aunque algunos autores loMtodo rpido, de amplia aplicacin en diversos tipos deFAT ANALYZER) solventetrmico ni a leche y derivados lcteos.verduras, algunos productos azucarados.Eter etlico, ter de petroleo, alcoholesExtraccin incompleta, usa alta temperatura, no puedeAlgunas sopas deshidratadas.Debe trabajarse sobre muestra seca 0 de muyContinuo (BUTT)Cuadro 3Mtodos para determinar materia grasa total

156al Lutidina (el color se mideespectrofotmetro a 405 nm).extraos que pueden confundirse concidos grasos.compuestosdeFormacinc) formaldehdo + acetilacetona +amoniocolesterol + 02 + colesterol oxidasa +H202 + catalasa + metanoloriginal de los cidos grasos durantela esterifcacin que puede originar formacin de ismeros posicionales y/o geomtricos.Cambios en la composicinb)lpidos de la muestra a steresmetlicos de cidos grasos.formndose finalmente una lutidinacuyo color se mide al espectrofotmetro a 405 nm. Las reacciones involucradas se sealan a continuacin:Conversin incompleta de losa)metanol,yoxigenada, catalasaaguadeen presenciaoxidasacolesterolcolesterol se oxida conAl preparar los steres metlicos hayque considerar los siguientes aspectos que pueden afectar el resultado:Otro mtodo para determinar colesteroles el mtodo enzimtico (7). Elc) Mtodo enzimticoSe abordar a continuacin losprincipales mtodos de derivatizacin:El estndar interno puede ser 5 alfacolestano, o 5 alfa colestanol.El primer punto ya fue tratado enmtodos de extraccin.lquido.Anlisis por cromatografa gas-c)El mtodo es por cromatografa gas-lquida (GLC) en columnas de vidrio con fase OV 17, Se30, de 2 m, tambin se emplean columnas de slica rundida de 12; 20; 30 m Se52, Se54 o equivalente.b) Derivatizacin de los cidosgrasos.mtodo de extraccin en fro conmezcla de solventes.Obtencin de la materia grasa pora)derivatizacin.alternativas sinTLC antes de laTambin se describen derivatizar.El mtodo de la Comunidad Europeapurifica el residuo insaponificable porEl anlisis de los cidos grasos decualquier alimento requiere de las siguientes etapas:4. Acidos grasosLa derivatizacin puede realizarse parapreparar acetatos, trimetilsililteres, o butiratos.

diazometano157saponificacin lo cual resulta enconjugada, etc.produceaguadepresenciainsaturacinciclopropeno,epoxi,Debe trabajarse en medio anhidro. LaNo es til para aceites de semilla quecontienen cidos grasos inusuales comointerferentes.oajenoscompuestosFormaNo convierte los cidos grasos libres asteres metlicos. Por lo tanto no sirve para muestras de materias grasas con elevada acidez.DesventajasDesventajasNo produce isomerizacin de doblesenlaces. No libera el aldehido del plasmalgeno. No transesterifca ni esfingolpidos ni colesterol.El mtodo de la AOAC saponifica conNAOH en metanol y luego esterifica con BF3 en metanol. Es un mtodo rpido.procedimiento aceptado por AOCS.primerelusarpormetanolRpido, puede efectuarse a temperaturaambiente. Convierte los triglicerdos o acilgliceroles directamente a steres metlicos (transesterificacin).VentajasTodos estos mtodos convierten losacilgliceroles o triglicridos y cidos grasos libres en steres metlicos. El ms popular tal vez es el BF3 20% enMetxido de sodio en metanol anhidroVentajasa) Catlisis bsicaotros mtodos de esterificacinHC1 en metanol 5% P/V H2S04en metanol 1 a 2% V/V Cloruro deacetilo en metanol KOH en metanol y BF3 en metanolb) Catlisis cido bsicacatlisis bsica

catlisis cida, bsica-

---Los mtodos de derivatizacin sepueden dividir en cuatro categoras (8):Alta concentracin de lcali y altatemperatura puede llevar a la formacin de cidos grasos conjugados.prdida de cidos grasos. El usoprolongado puede alterar la compo- sicin en cidos grasos.d) Contaminacin y dao de lacolumna GLC proveniente de muestras contaminadas o de restos de los reactivos de derivatizacin.

158La transesterificacin se efecta en unaetapa, no se requiere etapa deEl exceso de reactivo se elimina porevaporacin bajo N2.Esterifica los cidos grasos libres en presencia de metanol.Se produce la transesterificacin de losacilglicexoles o triglicridos a steres metlicos de cidos grasos por pirlisis en la columna GLC.Es un mtodo rpido casi instantneo atemperatura ambiente.VentajasVentajashidrxido de trimetilamonio(TMAH)-c) Diazometanohidrxido de trimetilfenilamo(TMPAH)-No esterifica los cidos grasos libresDesventajahidrxido de m-trifluorome-tilfeniltrimetilamonio(TFMPTAH)-transesterifcar los colesteril esteres, noproduce compuestos extraos.paraBF3-metanolalComparableSe han usado sales cuaternarias deamonio fuertemente bsicas como:1. Utilizacin de sales cuaternarias deamoniaPresenta buenos resultados con leche yaceites vegetales sin extraccin previa de los lpidos.VentajasCloruro de acetilo en metanolSe han buscado nuevos reactivos con elobjeto de obtener mas rpidamente los steres metlicos de los cidos grasos.d) Otros mtodos de esterificacindeo concentrado produce prdidascidos grasos poliinsaturados.El reactivo es caro e inestable. Deberefrigerarse. El empleo de BF3 antiguoReacciona con colesterol formandocolesterolmetilster y colestadieno.Reactivo muy txico. Se puede usarslo si es estrictamente necesario. Es explosivo. Forma compuestos extraos reaccionando con dobles enlaces o grupos carbonilos.DesventajaReacciona conplasmalgenosformandoaldehido.

159El reactivo no es caro, no produceisomerizacin de dobles enlaces. Es unSe ha aplicado a tejidos, plasma,alimentos, leche, grasa de leche, etc. Se ha mostrado ms eficiente comparadosatisfactoriamente con el mtodo Ce 2-66 con 20% BF3 en metanol de laAOCS.comparadohasemtodoEsteLa muestra se coloca en un solvente, seagrega cloruro de acetilo en metanol y se obtiene los steres metlicos de los cidos grasos. Se han investigado diferentes solventes.Los cidos grasos forman la salguanidinacarboxilato que en presencia de exceso de metanol forma los steres metlicos.La extraccin y aislacin del lpido seefecta en una sola etapa.VentajasCloruro de acetilo en metanolSe produce una completa metanlisis delos aceites y se convierte los acilgliceroles o triglicridos y cidos grasos libres en steres metlicos.2. Transesterificacin directaVentajasGuanidina y sus derivados alquiladosen metanolcidosinterferir con el anlisis degrasos de cadena mediana.conjugados. Algunos productos deruptura de estos reactivos puedengrasoscidosdandoSe obtuvieron valores ms bajos que losobtenidos por mtodos convencionales.para la metilacin pirolticaisomerizacin de doblescolumnaproduce enlacesDesventajaLa muestra debe ser neutralizada antesdel anlisis por GLC. La alta alcalinidad y alta temperatura de laDesventajasSe aplic a hojas y los steres metlicosde los cidos grasos se extrajeron con solvente.Ventaja3. Metanol caliente en HCLSe podra determinar separadamente lacomposicin en cidos grasos de los triglicridos, de los cidos grasos libres y del total.con el mtodo tradicional de extraccinde Folch.extraccin. De especial importancia encidos grasos de cadenas cortas.

160a) Columna empacada de vidrio oacero inoxidable 1 a 3 metros deLa Comunidad Europea (9) seala lossiguientes mtodos para la preparacin de los steres metlicos.Seala las siguientes alternativas:Preparacin de steres metlicosestosDa mejores recuperaciones decidos grasos de cadena corta.Cromatografa gas-lquido de lossteres metlicos.Mtodo de la Comunidad Europea(9)VentajaSe usa BF3 al 12,5 % en butanolRecomendacin: no se tomar encuenta la materia insaponificable cuando no supere el 3%. En caso contrario, los steres metlicos se prepararn a partir de los cidos grasos.Se prefiere para el anlisis de cidosgrasos de cadena corta presentes en grasa de leche.5. Preparacin de steres butlicosmezcla de metanol, hexano y cidosulfrico se emplear para pequeas cantidades de materias grasas, por separacin mediante cromatografa en capa fina.laenfra. Se agrega el hexano paraextraccin de los steres metlicos.El procedimiento que emplead)ismeros trans, slo se usarn losprocedimientos con metilato de > sodio o con sulfato dimetlico.En el caso de determinacin dec)La metilacin se efecta con metilatode sodio, calentando a reflujo 10 minu- os. Se enfra y luego se agrega la solu- cin metanlica de H2S04 hasta pH cido, viraje de la fenolftalena, luego se calienta a reflujo por 20 minutos, se4. Metilacin con metanol catlisisbsica y cidab) Cuando se trata de materias grasascon acidez superior al 3%, slo podrn usarse los procedimientos con mezcla de metanol y cido clorhdrico o con sulfato dime-tlico.El exceso de reactivo debe ser extradoantes que la muestra se inyecte en la columna GLC.procedimientos en tubo cerrado o consulfato de dimetilo.DesventajalosusarsepodrnsloC12,contengan cidos grasos inferiores aEn caso de materias grasas quea)enminutosmtodo rpido, bastan 2bao de agua hirviendo.

161Deber tener un dispositivo altamentesensible para controlar la temperatura,El hornoEl Dr. Robert Ackman ha propuestoque las fases de tipo Carbowax 20M sean utilizadas como patrones de referencia para columnas capilares de slica fundida en ensayos interlabora- torios. Tambin ha trabajado bastante con Silar CP, una fase que es ligeramente ms polar que Carbowax20M. FFAP, Supelcowax-10 y SP 1000 son muy similares al Carbowax 20M en columnas de slica fundida.Otras consideraciones en relacin a lacromatografa gas-lquido de steres metlicos de cidos grasosLos gases deben pasarse a travs detrampas de oxgeno y humedad antes de la columnas para dar mayor estabilidad a la lnea base cuando se trabaja a altas sensibilidades y para prolongar la vida de la columna. Para columnas empacadas, nitrgeno con menos de 5 ppm de oxgeno es adecuado. El argn es ms caro que el nitrgeno y contiene menos oxgeno.Anlisis cuantitativo, se puedeaplicar: normalizacin interna, patrn interno, factores de correccin.d)El hidrgeno tiene ventajas como gasportador para las columnas capilares de tubo abierto en trminos de eficiencia. Problema: detectar prdidas o escapes permanentemente por seguridad. El helio es ms seguro pero ms costoso en diversos pases.Anlisis cualitativoComo referencia: Se toma el pico del estearato de metilo.c)Gas portadorColumna capilar de vidrio o slicafundida, Di. 0,2 y 0,8 mm, longitud 25 metros. Fase lquida tipo polietilenglicol 20.000, polisteres, polisiloxano polar (cianosiliconas).Espesor de film entre 0,1 y 0,2 Tmb)En el caso de columnas empacadas, trescolumnas que contienen 15% EGSS-Y, EGSS-X y Silar 10C sobre soporte silanizado 100-120 mesh, lavado al cido abren un amplio rango de polaridad para el anlisis de la mayora de los cidos grasos poliinsaturados.Fases estacionaria con enlace cruzado yunidas (bonded) se han mostrado satisfactorias en la resolucin de ciertos pares crticos.largo, 2 a 4 mm dimetro interno(Di.) Soporte inerte: tierra de diatomeas lavada al cido y silanizada. Fase lquida polis- teres o cianosilicona entre 5 y20%.

162Normalizacin. 1988. NCh 484deNacionalInstituto2. Chile.1. AOAC. 1990. Official Methods ofAnalysis. 15 ed. USA.Los valores para cidos grasosindividuales, generalmente se expresan como porcentaje de cidos grasos en relacin al total, ya que esta es la forma ms comn de presentacin analtica.BIBILIOGRAFIAValores para cidos grasoscomprobada con estndares primariosde cidos grasos de cadena corta, larga y poliinsaturados.La exactitud del mtodo debe serd)Como algunos lpidos de origen animaly marino contienen mezclas complejas de cidos grasos, se recomienda usar algunas materias grasas de composicin conocida como: aceite de hgado de bacalao, materia grasa de testculos de bovino y porcino, lpidos de hgado de rata, etc.transesterificacin debe ser cuidadosoen cuanto a su efecto sobre la columna.dereactivodelextraccinEl empleo de reactivos nuevos sinc)establecidas.especificacioneslasaacuerdob) Los mtodos deben seguirse depreparacin de los steres metlicoses el adecuado para el tipo de muestra.Para identificacin se usan los tiemposde retencin corregidos o relativos de los patrones en relacin a los componentes de la muestra, corridos en la misma columna y bajo idnticas condiciones. La comparacin se debe hacer en dos columnas con fases lquidas de polaridad diferente. El largo de cadena equivalente es otra posibilidad de identificacin.Asegurarse que el mtodo dea)Conclusiones generalesExisten en el mercado mezclas patronesconteniendo cantidades conocidas de steres metlicos de cidos grasos saturados, monoenoicos y polienoicos. Sirven para efectos de identificacin y cuantificacin.Uso de patrones para identificacinA nivel de base de datos se necesita lainformacin por 100 g de alimento. Por lo tanto, se han publicado factores de conversin derivados de la proporcin de los cidos grasos presentes en el lpido total para convertir porcentajes de cidos grasos a cidos grasos por100 g de alimento (3).de modo que sea uniforme en todas lasregiones.

163gaseosa. (UNE55 037-3).cromatografaporgrasoscidosforG.H.S. 1957. A simple methodthe isolation and purification of9. Materias grasas. Determinacin de5. Folch, J.; Lees, M. and Stanley,Scotland, The Oily Press. AIR.Lipids.ChromatographyGas1989.andW.W.8. Christie,4. Bligh,E.G. and Dyer,W.J. 1959.A rapid method of total lipid extraction and purification. (Can. J. Biochem. and Physiol. 37: 911-917).1989.and Food Analysis.Germany, Boehringer Mannheim.7. Methods of Biochemical Analysis3. Greenfield, H. and Southgate,D.A.T. 1992. Food Composition Data. Production, Management and Use. London, Elsevier Applied Science.6. Determinacin de la composiciny del contenido de esteroles mediante cromatografa de gases con columna capilar. 1991. (Diario Oficial de las Comunidades Europeas L248/15).total lipids from animal tissues. (J.Biol. Chem. 226: 497-509).CR 88; Determinacin de lahumedad y materias voltiles en granos o semillas oleaginosas. Santiago.