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Metodologías basadas en la identificación del ADN: PCR, hibridación, secuenciación y análisis

de secuencias.

Dra. Sonia ArduinoDep. de Clínica EstomatologíaFacultad de Postgrado en Ciencias de la SaludUCA- 2009

Ácidos nucleicos

ADN

ARN

PCR (Polymerase ChainReaction)

Reaccion en cadena dela polimerasa

► Separación de ambas hebras de ADN.

► unión de pequeños fragmentos (primers)

►extensión de estos fragmentos usando de molde el ADN de la muestra.

► ADN-polimerasa obtenida de una bacteria termófilaresistente a altas temperaturas

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MODELOS DE CICLADORES TERMICOS

ADITIVOS UTILIZADOS EN LA PCR

FormamidaSulfato de Amonio

Betaína (Trimetilglicina) DMSO (dimetilsulfóxido)

BSA (seroalbúmina bovina)TMAC (cloruro de tetrametilamonio)

detergentes no iónicos (Tween 20, NP-40)

INHIBIDORES DE LA PCR

Contaminantes orgánicos e inorgánicos incluidos en la muestra de ADN

Atenuan o inhiben completamentela reacción de PCR

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PCR

Molde (ADN o ARN)

dNTPs (A;G;T;C)

Mg2+

ADN polimerasatermoestable

Primer forward Primer reverse

PrimersMoléculas simple cadena que se unen al ADN o ARN molde

ADN polimerasa termoestable

Taq polimerasaVent polimerasa

Pfu polimerasaPfx polimerasa

Diferentes enzimas según su funcionalidad:

relación de error (ideal para clonar)

robustez (ideal para fragmentos largos)

costo (ideal para epidemiología o detección de fragmentos de ADN)

> cantidad de errores

Utilizadas para clonar mediante mutagénesis sitio dirigida

Desnaturalización

Apareamiento

Elongación

Primers complementarios

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Verificación del producto de PCR en gel de agarosa

Fragmentos de PCRMarcador de peso molecular

PCR

Detección

Migración en geles de Agarosa Detección con Bromuro de Etidio

►Diagnóstico (agente etiológico-mutaciones …) ►Biología Molecular- Investigación►Genética Forense► Estudios Evolutivos de ADN ancestros►Sistemática Moderna► Estudios Ecológicos► Proyectos Genoma► Expresión de genes, producción de proteínas

recombinantes en diferentes organismos.

Usos de la PCR

ADN molde

dNTPs

Mg2+

ADN polimerasatermoestable

Primer forward Primer reverse

Se agrega la polimerasa en elpaso de desnaturalización a

95°C NO ANTES!!!Hot Start

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Hot Start

Utilidad Aumenta la cantidad del producto deseado

Ventajas Elimina productos inespecíficos

Mayor cantidad del producto deseado

Tipos de PCR Utilizadas para el Diagnóstico

·AFLP PCR·Colony PCR·In situ PCR·Multiplex PCR·Nested PCR·PCR-ELISA·PCR-RFLP·PCR-SSCP·QC-PCR·RAPD·Real-Time PCR·Rep-PCR

AFLP PCR Combina AFLP y PCR

Zabeau & Vos in 1993

Digestión con enzimasde restricción

Ligación de adaptadores

PCRGenera diferentes

patrones de bandas si hay mutaciones en los sitios de restricción

utilizados

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PCR de Colonia

Utilidad:

Screening para determinar el producto de clonación

Detección rápida de un gen para diagnóstico

Ventaja: Ahorro de tiempo!!!!!!

Sin extracción previa del ADN

Multiplex Se agregamás de un par de primers

Primers forward

1 o más ADNscomo molde

dNTPs

Mg2+

ADN polimerasatermoestable

Primers forward Primers reverse

Primers reversePrimers reversePrimers forward

Primers forward

Primers reverse

Multiplex

Ventajas:•Detección de varios fragmentos de ADN en una misma reacción•Altamente recomendado para diagnósticoDesventajas:•Difícil y larga optimización!!!•No deben darse falsos positivos

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Nested PCR

Un par de primers externos para los primeros ciclos.Un par interno para la amplificación del producto.Utilizado para incrementar la cantidad del producto de amplificación y la especificidad.

Dos pares de primers

Primer par de primers(externos)

Segundo par de primers(internos)

Touchdown PCR

Favorece la amplificación específica desde el inicio

Se 1°C la T annealingen cada ciclo hasta una

temperatura determinada

Nucleic Acids Res. 1991 Jul 25;19(14):4008.

PCR clásica

Fragmento amplificado

Fragmento amplificado

Secuenciación o Hibridación

PCR inversa

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RT-PCR

Comprobación de la transcripción de un gen (posible cuantificación con marcadores fluorométricos)Evaluación de la actividad de splicing de un intrón

Evitar contaminación con ADN ARN ultrapuro!!!

Amplificación de ADNa partir de ARN

Real time PCR

- Detección y cuantificación de un reporter fluorescente- Cuantificación de la emisión en cada ciclo- A mayor cantidad de ADN, mayor señal- Permite diferenciar alelos por la Tm de sus productosVentajas:

Ahorro de tiempoAdaptable a RT-PCR y Multiplex

monitoreo de la reacción de PCR en la fase exponencial

Higuchi et al. in 1993

Manual Automática

SECUENCIACION

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SECUENCIACION: METODOS

► Frederick Sanger (1970): secuencia completa de la molécula de insulina y demostró que las proteínas tienen una estructura específica, desarrolló un método de secuenciación en 1975 (Premio Nobel en 1980).

► El “método didesoxi” de Sanger emplea nucleótidos modificados (didesoxinucleótidos), que no poseen el hidroxilo (OH) en el extremo 3’.

► El ADN se sintetiza in vitro utilizando un molde de lacadena que se desee secuenciar, un exceso de sustratos nucleótidos desoxi, una pequeña cantidad de didesoxiespecífico (A, T, C o G), un cebador o primer y polimerasa.

didesoxinulétido

desoxinucleótidos

ADN polimerasa

primer

molde

cadenas de distinta longitud.

La incorporación de un nucleótido didesoxi termina el proceso de síntesis (la polimerasa necesita un grupo hidroxilo en la posición 3’para poder agregar el siguiente nucleótido).

Se realiza una corrida en gel sembrando las productos de las reacciones correspondientes al agregado de cada uno de los nucleótidos didesoxi. Se ven distintas bandas correspondientes a tamaños diferentes.

Secuenciación manual

MÉTODO DE SANGER (secuenciación manual)

Molde ADN dNTPs (G;T;A;C)

Sustratos ddNTP (uno por tubo)γ32P dNTP

Enzima T7 DNA polimerasa

ddNTPs carecen del grupo 5´

fosfato

detienen la polimerización

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MÉTODO DE SANGER (secuenciación manual)

SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA

Mayor resoluciónVentajas

Secuenciación de 96 muestras por corrida

SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA

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► Archivos .abi o .spf (cromatograma) acompañado de archivo .txt (secuencia)

► Cromatogramas permite verificar la calidad de secuencias y la corrección de nucleótidos

►Importante: ADN limpio!!!!

SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA

SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA

FISHMicroarrays

Dot BlotSouthern BlotNorthern Blot

Hibridación de colonia

HIBRIDACION

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Radiactivo No Radiactivo

Marcado del oligo con 32P dATP

Marcación con compuestos químicos o

colorimétricos(digoxigenina, biotina)

Marcado de sondas

Extremo 5´con T4 PNK y gP32dATP. Amplificación por PCR con aP32 dCTP

Utiliza enzima Terminal Transferesa y ddUTP

FISH(Hibridación in situ fluorescente)

Esta técnica es útil para identificar anomalías cromosómicasy elaborar mapas génicos y genéticos

Detecta cromosomaso porciones de ellos,

con moléculas fluorescentes

MICROARRAYS

Utilizado para ADN y ARNDeterminación de presencia de genes. Permite

comparaciones inter e intraespecies

Usos:Descubrir nuevos genesDiagnóstico de enfermedadesFarmacogenómica (asociación entre perfil genético y respuesta terapéuticas a drogas)Toxicogenómica (evaluar cambios frente a sustancias tóxicas)Determinación de sistemas de regulación, stress bacteriano, respuesta celular mediante la expresión de los genes

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Microarrays

Dot Blot

Determinación de ausencia o presencia del fragmento de interés

Ventaja: no hace falta hacer migración ni transferencia de ADN

Utiliza muestras con ácidos nuc. sin purificar(ej: sangre, heces o esputos)

Hibridación de Colonia

Ventaja: Permite determinar frecuencia de eventos, aislar clones o determinar positivos de clonación

Ideal para screening de bibiotecas genómicas

Detecta un fragmento de ADN en una colonia bacteriana

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Southern Blot

1er Paso Digestión del ADN 2do Paso Migración en Agarosa3er Paso Transferencia a una membrana

(nitrocelulosa o nylon)4to Paso Hibridación5to Paso Detección

Utilidad:Evaluación de la presencia de genes de interésLocalización del contexto

Hibridación de ADN

Southern Blot

Southern blot para detectar presencia de un gen transformado en una población mezcla de células.

Gel de agarosa con muestras digeridas con una enzima de restriccion (EcoRI). El ADN tranferido a nitrocelulosa y luego se realizo Southern blot con una sonda de DNA (fragmento del gen transformado) marcado con radioactividad.

Film de rayos X revela cuales celoulascontienen el targetADN (gen)

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Northern Blot

Igual principio que para Southern Blot

Permite evaluar la transcripción de un ARNm

Permite cuantificar la expresión del ARNm comparando con un gen constitutivo

Hibridación de ARN

Gel agarosa/formaldehído

Autorradiograma

Northern Blot

WESTERN BLOTELISA mide anticuerpos contra un virus total, dando “positivo o negativo“.Western blotting es mas especifico.Permite visualizar Acs contra proteínas virales (test confirmatorio para un ELISA de HIV).En HIV Western blotting, se hace electroforesis de proteínas en un gel Las proteínas migran, y se separan en función de cargas y pesos moleculares Las mas pequeñas migran mas rápido.

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Western Blot

Igual principio que para Southern y Nothern Blot

Se utilizan geles de poliacrilamida

Se pueden separar en Fndel tamaño y carga, o sólo en Fn del tamaño (agregado de SDS)

Detección con anticuerpos

Detección de proteínas

HERRAMIENTAS DE BIOINFORMATICA

Primers para PCRSondas para hibridación con ADNSondas para hibridación con ARN

Sondas para hibridación con proteínasPrimers para generar ADN copias

DIAGRAMA DE OLIGOS (Primers)

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DIAGRAMA DE OLIGOS (manual)

Criterios a tener en cuenta

Tamaño: 18-25nt (según su uso)% G+C: 55%

1er y últimos nt : G o CExtremo 3´ libre de interacciones (evitar 2-3nt G

o C)Diferencia de Tm entre primers 0-3°C

Tm: entre 55 y 65°C

DIAGRAMA DE OLIGOS (Programas)

► Acceder a secuencia nucleotídica en GenBank u otra base de datos(GenBank: www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/index.html)

► Introducir la secuencia en el programa

► Seleccionar primer forward y primer reverse con igual criterio que diseño manual

► Podemos evaluar mejor:Formación de duplexes (apareamiento entre primers)Formación de hairpins

Buscar ΔG más positivo!!!!!!!

DIAGRAMA DE OLIGOS

Confirmar en BLAST la especificidad ytamaño de producto de los primersdiseñados

Si no son específicos… comenzar de nuevo!!!!!

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ANALISIS DE SECUENCIAS

► Producto de amplificación por PCR purificado y cuantificado

► Secuenciación automática (Sequencer ABI 373 o equivalente)

► Análisis con programas:Sequencher V4.2(demo) www.genecodes.com/sequencherBLAST V2.0 (Basic Local Alignment Search Tool)www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST

- BioEdit V7.0www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html

BLAST

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BLAST

BLAST V2.0

► Blastn comparación nucleótido-nucleótido

► Blastx secuencia traducida-secuencia peptídica

► Blastp secuencia peptídica-secuencia peptídica

► Tblastn secuencia peptídica-secuencia traducida

► Tblastx secuencia traducida-secuencia traducida

► Bl2seq alineción de dos secuencias

BLAST V2.0

Secuencia conocida o número de acceso del GenBank

Seleccionar organismo (bacteria, virus, etc.)

Analizar el score

Blastn más utilizado

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BLAST

Copiar Secuencia con formato .txt

Seleccionarorganismo

BLAST

Selección del tipo de búsqueda

BLAST

Contexto

Secuencia