Osnovi ekologije mikroorganizama

Predavanje IIRast i ishrana

Metode u ekologiji mikroorganizama

Prof. dr Tanja Berić

Rast i ishrana

Organizmi mogu da rastu da budu veći i da budu manji. Važi i za bakterije. Sredina je ta koja odlučuje i rezultati rasta mogu osigurati

preživljavanje organizma. Kada su uslovi sredine loši, bakterije nastavljaju da se dele ali

bez povećanja veličine. Rezultat deoba su sve manje i manje ćelije - minijaturizacija.

Odnos površine i zapremine ćelije

Kako ćelija povećava veličinu, odnos P/V se smanjuje. Suprotno tome, kako se ćelija smanjuje, odnos dramatično raste. Smanjenjem ćelije tokom perioda loših sredinskih uslova (obično

manjak hrane) bakterija povećava površinu koja može doći u kontakt sa nutrijentima.

Ekologija ishrane

Sva živa bića moraju pribaviti energiju da bi izvodili osnovne metaboličke funkcije i moraju asimilovati materijal koji je neophodan za sintezu osnovnih gradivnih konstituenata.

Postoji niz izraza koji su indikativni za različite trofizme (načine ishrane): fototrofija, autotrofija, heterotrofija, hemotrofija i litotrofija

Klasifikacija organizama na osnovu izvora energije, donora elektrona i izvora ugljenika

Izvori energije

Supstrati po elekton donorima Izvori ugljenika

Neorganski Organski CO2 Organska jedinjenja

Svetlost FotolitotrofiH2O, H2S, S, H2

Fotoorganotrofisukcinat, acetat

Fotolitoautotrofibiljke, alge, cijanobakterije, neke crvene i zelene bakterije

Fotoorganoheterotrofineke bakterije

Hemikalije HemolitotrofiH2, H2S, NH3, Fe2+, NO2,

HemoorganotrofiRazličiti organski supstratu

Hemolitoautotrofivodonične bakterije, bezbojne sumporne bakterije, nitrifikujuće bakterije, gvožđevite bakterije, metanogeni i metilotrofi

Hemoorganoheterotrofiživotinje, većina bakterija, gljive, mnogi protisti

Redoks potencijali za elektron-donorske i elektron-akceptorske reakcije

Hrana – bilo šta što obezbeđuje energiju. Resurs – bilo koji kvantitet koji može biti redukovan u količini

aktivnošću organizma i uključuju kako hranu, tako i prostor. Odluke: šta jesti, kako to pribaviti i kako optimalno rasporediti „svoje

snage“ Nema organizma koji može da maksimizuje sve procese u svim

sredinama i pod svim uslovima. Prirodna selekcija deluje tako da se postigne kompromis u

ograničenom opsegu mogućnosti.

Postoji dosta mogućih rešenja za pribavljanje energije i hrane, ali svaka solucija je povezana sa odgovarajućom energetskom cenom.

Optimalno rešenje je ono koje najmanje košta i prirodna selekcija favorizuje najbolju ukupnu efikasnost u hvatanju i korišćenju energije.

Obično ima mnogo različitih funkcija i aktivnosti, od kojih neke kompetiraju za istu energiju - ne može se svaka aktivnost maksimizovati.

Optimalno rešenje je najbolji kompromis limitiranog broja opcija koje su na raspolaganju određenom organizmu. u datim uslovima

Teorija optimalnog traženja hrane predviđa strategije koje maksimizuju neto unos energije po jedinici vremena traženja hrane.

Neto energija je razlika unete količine energije i cene koja je plaćena za njeno pribavljanje.

Broj kopija gena u sledećoj generaciji se može koristiti kao mera energetske efikasnosti.

Cena ishrane

Organizmi koji mogu da koriste različite resurse sa donekle sličnom efikasnošću se nazivaju generalistima.

Oni koji su ograničeni na nekoliko resursa nazivaju se specijalistima. Pseudomonas putida može da koristi više od 77 ugljeničnih

jedinjenja kao jedine izvore ugljenika i energije i može se smatrati ekološkim generalistom.

Methylococcus koristi jedino metan kao izvor ugljenika i energije i smatra se ekološkim specijalistom.

Metabolizam se razvio u odsustvu kiseonika. Prva je, najverovatnije, bila hemolitotrofija. Tokom evolucije razvili su se i mehanizma za dobijanje energije

posredstvom svetlosti (fotolitotrofija i fotoorganotrofija) kao i fermentacija (hemoorganotrofija).

Pet glavnih evolutivnih linija fotosintetičkih bakterija: cijanobakterije, purpurne bakterije, zelene sumporne bakterije, heliobakterije i zelene filamentozne bakterije.

Samo cijanobakterije su aerobne, koriste hlorofil a i imaju dva fotosistema zahvaljujući kojima mogu da oksiduju vodu i proizvode kiseonik.

Strategije ishrane mikroorganizama

Sve ostale fototrofne bakterije su anaerobne, ne mogu da koriste vodu kao izvor elektrona, ne koriste hlorofil a i imaju samo jedan fotosistem.

Žive u okviru relativno uskih opsega sredinskih faktora. Ograničenja predstavljaju raspoloživost akceptora i donora

elektrona i svetlost. Zbog upotrebe različitih hlorofila anaerobni fototrofi mogu da

iskoriste gotovo čitav spektar vidljive svetlosti i da žive u sredinama koje ne mogu da naseljavaju biljke.

Strategija povećanja količine pigmenata u ćeliji. Vertikalna migracija u stubu tečnosti na dnevnoj bazi.

Strategije ishrane mikroorganizama

Optimalna ishrana i mikroorganizmi

Koliko je koncept optimalne ishrane primenljiv na mikroorganizme? Da li mikroorganizmi biraju i „rukuju“ svojom hranom? Dva načina pribavljanja hrane: „sedi i čekaj“ i aktivno traži Akvatične bakterije koje su pričvršćene za površinu (biofilm) su, u biti,

predatori tipa „sedi i čekaj“. Deo cene koju mikroorganizmi u biofilmu moraju da plate da bi došli do

hrane jeste proizvodnja egzopolisaharidnog matriksa i egzoenzima. Početne faze razgradnje ili mineralizacije različitih jedinjenja ponekad

podrazumeva značajnu modifikaciju jedinjenja gde je utrošak energije mnogo veći od dobiti.

Varanje kao strategija preživljavanja.

Optimalna ishrana i mikroorganizmi

Šta je sa slobodnoživećim mikroorganizmima koji se ne kreću aktivno? Oni nemaju luksuz mehanizma hvatanja hrane u EPM. Međutim, ostaci ćelija i detritus koji se sležu ka dnu basena kroz stub

vode su kvazi-biofilmovi koji mogu olakšati pribavljanje hrane pelagijskim mikroorganizmima.

Mogućnost uzimanja i razlaganja specifičnih jedinjenja zavisi od koncentracije supstrata i membranskih enzima ili transportnih molekula.

Pod takvim uslovima možemo očekivati da mikroorganizmi preferencijalno uzimaju jedinjenja manje molekulske mase.

Eksperimentalne potvrde ovakvog ponašanja je teško dobiti iz prirode ali, laboratorijski rezultati podržavaju ovu pretpostavku.

U eksperimentu gde je praćeno usvajanje različitih šećera (glukoze, fruktoze, saharoze i sorbitola) od strane kvasca Saccharomyces fragilis gajenog u zatvorenoj kulturi i u hemostatu utrvđena je sekvencijalna upotreba šećera.

Optimalna ishrana i mikroorganizmi

Aktivno traženje hrane – pokretne bakterije. Usmereno kretanje.

Lanci ishrane Trofički odnosi viših organizama se obično prikazuju u obliku

lanaca ishrane, mreža ishrane, piramida brojnosti ili biomase i piramida energije.

Lanac ishrane prikazuje povezanost energije i ugljenika od primarnih producenata do nekog vrhunskog predatora.

Osnov piramide su primarni producenti koji su i najbrojniji a vrh piramide su vršni predatori (malobrojni).

Invertovana piramida brojnosti u planktonu.

Mreže ishrane

Mreže ishrane pokušavaju da prikažu trofičku povezanost svih organizama u okviru nekog staništa ili ekosistema.

Saprovorna mreža ishrane

U većini diskusija mreža ishrane upadljivo odsutna ili slabo naglašena je uloga i mesto mikroorganizama.

Neki autori uključuju mikroorganizme kao deo paralelne saprovorne mreže, koja uključuje i neke invertebrate.

Saprovorni sistem je ograničen na tri veze zato što su neki procesi grupisani zajedno u jednoj saprovornoj karici lanca.

U suštini, pretpostavlja se da svi razgrađivači rade istu stvar!

Disimilativna mreža ishrane

Trofičke veze u saprovornoj crnoj kutiji mogu se kolektivno nazvati disimilativna mreža ishrane

Trofičke veze u ovakvoj mreži mogu biti mnogobrojne i različite i zasnovane su na početnom supstratu za razgradnju.

U mnogim disimilativnim mrežama, uloge različitih mikroorganizama su nepoznate.

Ponekad, uloge su poznate i ne učestvuju svi mikroorganizmi iz konzorcijuma u depolimerizaciji molekula.

Neki mikroorganizmi obezbeđuju faktore rasta za one mikroorganizme koji su direktno uključeni u primarni „napad“ na supstrat ili mogu da uklanjaju inhibitorne produkte.

Primer mikrobijalne degradacije organskih materija u metanogenom ekosistemu

„Mikrobijalna logika“ za nekompletnu oksidaciju različitih organskih jedinjenja.

Višestepeni proces u kojem sledeća grupa bakterija u nizu koristi produkte prethodne grupe bakterija u lancu.

Acetogene bakterije proizvode H2 i acetat. Acetogena oksidacija supstrata kao što su

propionat, butirat i benzoat daje više energije nego njihova kompletna oksidacija do H2 i CO2.

Višestepeni proces sa više grupa bakterija je sposobniji da bolje iskoristi energiju iz jedinjenja nego jedan organizam koji bi kompletno razgradio neki supstrat.

Sintrofija.

Kompletna mineralizacija Tri nivoa:1. Inicijacija procesa bakterijama sa površine i iz zemljišta i sedimenta. - ekskrecija proteaza i drugih ekstraćelijskih hidrolitičkih enzima- metabolizam je često neefikasan (fermentacija) i bakterije često zahtevaju

jedan ili više faktora rasta u sveže raspadajućem biljnom materijalu

2. Fermentacioni produkti i materijal koji nije iskorišćen od strane inicijalnih razgrađivača postaje fokus napada.- ova faza je obično aerobna zato što većina fermentacionih produkata ne

može da se razgradi anaerobno- većina ugljenika se respiriše u vidu CO2

3. Poslednja faza mineralizacije je okarakterisana sporim otuštanjem CO2 anaerobno razgradnjom najupornijih preostalih jedinjenja. - učestvuju bakterije koje oksiduju jedinjenja sa jednim ugljenikovim atomom

i drugi specijalisti

Disimilativna mreža ishrane Broj potencijalnih specijalista povećava se sa

trofičkim nivoom dok broj organizama u klasičnim lancima ishrane opada sa povećanjem trofičkog nivoa.

Mnogo je manji broj mikroorganizama koji su sposobni za inicijalni napad na neki kompleksan molekul

Može postojati samo jedan tip koji može započeti mineralizaciju

Kako depolimerizacija napreduje formiraju se sve manji molekuli i sve više različitih mikroorganizama može da ih koristi

Diverzitet vrsta tercijernih i viših veza u disimilativnim mrežama se povećava i može biti prilično veliki.

Diverzitet vrsta različitih trofičkih nivoa u disimilativnom i klasičnom lancu ishrane.

Metode u ekologiji mikroorganizama

• Metode za određivanje diverziteta i aktivnosti mikroorganizama• U cilju proučavanja biodiverziteta potrebno je identifikovati i kvantifikovati prokariote u njihovim staništima• Znati kako da se to postigne može biti korisno za izolovanje organizama od interesa, što je takođe jedan od ciljeva mikrobijalne ekologije• Merenje aktivnosti mikroorganizama se svodi na merenje njihovih metaboličkih procesa u odgovarajućem staništu• Metodologija mikrobioloških analiza predstavlja poseban problem u ekološkim proučavanjima mikroorganizama• Tek razvojem adekvatnih metoda i njihovim kombinovanjem omogućena su kompleksna saznanja o ulozi koju mikroorganizmi imaju u prirodi i razumevanje funkcionisanja ekosistema u celini

Obogaćivanje i izolovanje

• Izolovanje podrazumeva izdvajanje mikroorganizma iz zajednice u kojoj se nalazi, uglavnom kroz proces obogaćivanja, i dobijanje organizma u vidu čiste kulture• Obezbeđivanje uslova (medijum, uslovi inkubiranja...) koji su selektivni za željeni mikroorganizam i kontraselektivni za neželjene mikroorganizme• Ceo proces započinje uzorkovanjem iz odgovarajuće sredine (inokulum)• Klasične i "high-tech" metode• Konceptualni tvorac metode obogaćivanja Martinus Beijerinck• Prvi izolovao azotofiksirajuće bakterije Azotobacter ovom metodom

Izolovanje bakterija Azotobacter sp.

Kolona Vinogradskog

• Veštački mikrobijalni ekosistem• Dugoročni izvor bakterija za izolovanje i/ili testiranje mogućnosti razgradnje različitih supstrata

Pristrasnost metode obogaćivanja

• Vrlo izražena kod obogaćivanja u tečnom medijumu• Izrašće mikroorganizmi koji najbrže rastu pod datim uslovima, u laboratoriji•Realno, takvi organizmi u prirodnim uslovima su najčešće samo minorne komponente ekosistema•Veliki problem u mikrobijalnoj ekologiji• Donekle se prevazilazi razblaživanjem inokuluma pre obogaćivanja

Čista kultura

• Išarana ploča

• Razređenje u agaru

• MPN (najverovatniji broj)

Provera čiste kulture:- mikroskopija- karakteristike kolonija na/u agaru- rast u drugim medijumima

Izolovanje čiste kulture optičkom pincetom

brojanje i ispitivanje ćelija citometar ispituje odabrane parametre (veličina,

oblik, fluorescencija...), kvantifikuje ćelije koje zadovoljavaju i može i da ih sortira na osnovu istih parametara

sortirane ćelije mogu se zasejavati na nizmedijuma koji se međusobno razlikuju

Izolovanje čiste kulture protočnom citometrijom (Flow Cytometry)

Analize sastava zajednica bez izolovanja čiste kulture

Bojenja:

Bojenje fluorescentnim bojama (DAPI (slika a), akridin narandžasto, SYBR Green I; boje koje se vezuju za DNK)

Vijabilno bojenje (zelena boja koja ulazi u sve ćelije, i žive i mrtve; crvena boja koja ulazi samo u ćelije sa narušenom membranom) (slika b)

Fluorescentna antitela (specifično bojenje) (slika c)• najveće ograničenje mikroskopskih metoda: ne otkrivaju filogenetski diverzitet

a b c

Analize sastava zajednica bez gajenja

Filogenetsko bojenje upotrebom FISH (Fluorescentna In Situ Hibridizacija)• fluorescirajuće nukleinske probe – moćno oruđe za

identifikaciju i kvantifikaciju mikroorganizama

• fluorescentni oligonukleotidi koji odgovaraju delu sekvence za 16S rRNK (npr.)

• target molekul je rRNK u ribozomima

• ulaze u ćelije ne izazivajući lizu, hibridizuju sa targetom i daju fluorescenciju kad se uzorci posmatraju na fluorescentnom mikroskopu

• vrlo specifične ili nespecifične probe

• kombinacijom FISH i DAPI bojenja može se odrediti zastupljenost neke filogenetske grupe u uzorku

FISH analiza mulja iz kanalizacije

•FISH u kombinaciji sa konfokalnim mikroskopom – za ispitivanje mikrobijalnih populacija „u dubinu“ (biofilm, npr.)

Flurescentna In Situ Hibridizacija

Lokalizacija najzastupljenijih vrsta u subgingivalnom biofilmu

• Određivanje ekspresije gena (target molekul mRNK):- CARD-FISH (catalyzed reporter deposition-FISH)- amplifikacija signala

Flurescentna In Situ Hibridizacija

CARD-FISH princip

• specifični geni kao mera biodiverziteta

• filotip

• tehnike u upotrebi:

- analiza DNK fragmenata elektroforezom (DGGE, T-RFLP, ARISA)

- molekularno kloniranje

- sekvenciranje DNK i analiza

DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

• u agarozni gel se dodaje gradijent denaturišućeg agensa

• razdvaja uzorke iste veličine a različite sekvence

• zavisno od primarne sekvence, fragmenti DNK će denaturisati (i zaustavljati se) u gelu na različitim pozicijama

• razdvojeni fragmenti se mogu sekvencirati

Metode analiza zajednica bazirane na PCR

• jedan gen vs svi geni• analiza totalnih DNK sekvenci u zajednici• opisuje i funkcionalni kapacitet zajednice• zavisi od uspona tehnologije sekvenciranja• metatranskriptomika – analiza totalnih RNK

u zajednici• daje informacije o ekspresiji gena• metaproteomika – mera diverziteta i

zastupljenosti različitih proteina u zajednici

Metagenomika

• DNK microarray (phylochip)

- materijal – fragmentisana genomska DNK- za vrstu specifične oligonukleotidne probe dizajnirane za specifične regione različitih ciljnih gena- visoko specifična, skupa

Filočipovi

DNK čipovi

Merenje mikrobiološke aktivnosti u prirodi

Merenja aktivnosti u prirodnom uzorcima pružaju opštu procenu fizioloških reakcija koje su zastupljene u celokupnoj mikrobiološkoj zajednici.

Koji su tipovi glavnih metaboličkih aktivnosti mikroorganizama na njihovom prirodnom staništu i koja je stopa njihove zastupljenosti, kakvi su uslovi potrebni za kultivisanje određenih mikroorganizama, kakva je struktura i funkcija mikrobiološkog ekosistema?

Hemijski testovi, radioizotopske metode i mikroelektrode

Radioizotopi u kombinaciji sa FISH: FISH-MAR

Mikroautoradiografija (MAR) je mikroskopska tehnika koja se koristi za merenje mikrobijalne aktivnosti.

Ćelije iz zajednice se izlažu radioaktivnom izotopu (14CO2, npr.) i inkubiraju.

Nakon toga, ćelije se fiksiraju na pločicu koja se uranja u fotografsku emulziju.

FISH-MAR kombinuje identifikaciju sa merenjem aktivnosti.

Koji organizmi iz prirodnog uzorka metabolišu odgovarajući, obeleženi supstrat - otkriva i filogenetske i fiziološke informacije o organizmu.

SIMS tehnologija

Sekundarna jonska masena spektrometrija (SIMS) je zasnovana na detekciji jona oslobođenih iz uzoraka stavljenih pod fokus visokoenergetskog primarnog jonskog zraka

Generiše podatke o elementarnom i izotopskom sastavu analiziranog materijala.

Nano SIMS instrumenti su opremljeni mikrosondama, koje se mogu usmeravati na oblasti veličine manje od mikrometra, i one mere distribucije različitih izotopa i elemenata unutar pojedinačnih ćelija.

Genomika pojedinačnih ćelija

Metoda mnogostruke izmeštajuće amplifikacije (Multiple Displacement Amplification) umnožava hromozomsku DNK iz jedne ćelije izolovane iz životne sredine korišćenjem protočne citometrije.