met-uccirt/lma-13 mÉtodo: detecciÓn de alimentos, …

OFICINA DE CENTROS DE DIAGNÓSTICO Y

PRODUCCIÓN

Unidad del Centro de Control de Insumos y

Residuos Tóxicos

MET-UCCIRT/Lma-13

MÉTODO: DETECCIÓN DE Salmonella spp. EN ALIMENTOS, MÉTODO DE PCR EN TIEMPO REAL

Revisión: 00

Página: 1 de 13

Esta versión está vigente, en tanto esté publicada en la Intranet. En caso de imprimir este documento con fines didácticos, una vez utilizado debe destruirlo, bajo responsabilidad.

.

Firma Fecha

Elaborado por: Revisado por: Aprobado por:

Oscar Sánchez Ñahuis Especialista UCCIRT

Orlando Lucas Aguirre Director UCCIRT

César De La Cruz Lezcano

Director OCDP

09/06/2021

09/06/2021 17/06/2021

TABLA DE CONTENIDO

1. Objetivo.

2. Campo de aplicación.

3. Referencias.

4. Definiciones.

5. Metodología.

6. Antecedentes.

7. Anexos.

OFICINA DE CENTROS DE DIAGNOSTICO Y PRODUCCION

Unidad del Centro de Control de Insumos y Residuos

Tóxicos

MET-UCCIRT/Lma-13

MÉTODO: DETECCIÓN DE Salmonella spp. EN ALIMENTOS, MÉTODO DE PCR EN TIEMPO REAL

Revisión:00

Página: 2 de 13

Esta versión está vigente, en tanto esté publicada en la Intranet. En caso de imprimir este documento con fines

didácticos, una vez utilizado debe destruirlo, bajo responsabilidad. .

INTRODUCCIÓN Salmonella spp. es un bacteria patógena para el hombre y animales. Por ello, la presencia de este microorganismo en un alimento indica la contaminación de este por medio de contacto con heces o personas infectadas.

1. OBJETIVO

El presente documento describe el método de operación, para la detección de Salmonella spp. en muestras de alimentos.

2. CAMPO DE APLICACIÓN

Este método es aplicable para la detección de Salmonella spp. por medio de un ensayo molecular, PCR en tiempo real.

3. REFERENCIAS SureTect Salmonella species PCR Assay USER GUIDE. Lysis and real-time PCR

detection of Salmonella species in Food and environmetal samples. AFNOR TNF Validation Thermo Scientific SureTect Salmonella spp. Sure Tect

Certificate No. UNI 03/07-11/13 Alternative analytical methods for agribusiness.

4. DEFINICIONES

4.1 Salmonella spp. : Es un bacilo Gram Negativo, anaerobio facultativo, fermentador de la glucosa, catalasa positiva, oxidasas negativo y suele ser móvil con flagelos perítricos, y que no desarrolla cápsula.

4.2 Alimento agropecuario: Alimento de origen vegetal o animal producidos tradicional o convencionalmente en el campo, excepto los de origen pesquero y acuícola.

4.3 Producción primaria: Las fases de la cadena alimentaria hasta alcanzar, por

ejemplo, la cosecha, el sacrificio, la caza, el ordeño.

4.4 Procesamiento primario: Es la fase de la cadena alimentaria aplicada a la producción primaria de alimentos no sometidos a transformación.

5. METODOLOGÍA

El método es ejecutado por especialista o técnico autorizado en el registro Listado de

Personal Autorizado para Realizar Ensayos REG-UCCIRT/Cal-11.

http://es.wikipedia.org/wiki/Flagelo_bacteriano



Tóxicos

MET-UCCIRT/Lma-13

MÉTODO: DETECCIÓN DE Salmonella spp. EN ALIMENTOS, MÉTODO DE PCR EN

TIEMPO REAL

Revisión: 00

Página: 3 de 13


5.1 Principio El PCR en tiempo Real es una técnica molecular basada en la tecnología de uso de sondas marcadas con colorante que se direccionan a secuencias únicas de ADN específicas de Salmonella spp. y un control interno positivo (ICP). Si el ADN objetivo (target) está presente, es detectado por PCR en tiempo Real. El software de análisis proporciona la interpretación de resultados. Los templados ICP, los primers y las sondas proporcionan un control interno con cada reacción para demostrar que se ha llevado a cabo el proceso de PCR; no es necesario incorporar organismos de control positivo con las pruebas de rutina de las muestras.

5.2 Aparatos

Termociclador Tiempo Real.

Autoclave horizontal o vertical (material limpio).

Incubadora de 37 ºC ± 1°C.

Mechero Bunsen.

Balanza digital; medición hasta 1000 g, sensibilidad de ± 0,1 g.

Refrigeradora de 2 a 8 °C.

Tijeras de acero inoxidable.

Frascos de vidrio de 500 mililitros.

Asa de siembra.

Mezclador Vórtex.

Bolsas para Stomacher.

Blender.

Jarras para blender estériles.

pH metro.

Pipetas y Micropipetas: de 1 a 10 mL; de 10 a 100 uL.

5.3 Medios de cultivo y reactivos

Agua Peptonada Buferada (ISO).

Novobiocina.

Kit PCR tiempo real Salmonella species - Reactivo de lisis 1 tubos. - Proteínasa K. - Tubos de reacción PCR.

Agar cromogénico Brilliance Salmonella.

Suplemento selectivo Salmonella.

Caldo Rappaport Vassiliadis Peptona Soya.

Test Látex Salmonella.



Tóxicos

MET-UCCIRT/Lma-13


TIEMPO REAL

Revisión: 00

Página: 4 de 13


5.4 Procedimiento

5.4.1 Preparación y pre-enriquecimiento Pre- enriquecimiento: Agregar 25 gramos de la muestra a 225 mililitros en Agua Peptonada Bufferada + 12mg/L Novobiocina y homogenizar por 1 minutos. Incubar por 37.0 ± 1 °C por 20-24 horas. Este caldo puede ser almacenado a 2-8 °C por máximo de 72 horas.

5.4.2 Lisis

a. Retirar la muestra enriquecida de la incubadora, mezclar brevemente, transferir un alícuota a un tubo nuevo estéril.

b. Mantener los reactivos a temperatura ambiente. c. Tomar la cantidad de Tubos de reactivo de Lisis 1 necesarios de acuerdo al

número de muestras. d. Permitir que los tubos permanezcan 10 minutos a temperatura ambiente antes

de destaparlos. e. Remover la tapa plástica de cada Tubo de Reactivo de Lisis 1. f. Agregar 10uL de Proteinasa K a los tubos de Reactivo de Lisis 1; estos se

denominarán “Tubos de Lisis”. g. Transferir 10uL de la muestra enriquecida a los tubos de lisis. h. Para el control negativo transferir medio de enriquecimiento estéril al tubo de

lisis. i. Asegurarse que el tip alcance el fondo del Tubo de Lisis, para facilitar

completamente la homogenización de la muestra con los reactivos de lisis. j. Sellar los tubos con los tapas de tubos de lisis usando la herramienta de sellado. k. Incubar los tubos en bloques térmicos de temperaturas apropiadas siguiendo

estos pasos:

1. 37 ± 2°C por 10 minutos. 2. 95 ± 2°C por 5 minutos. 3. Temperatura ambiente por 2 minutos.

Las muestras pueden ser almacenadas de 2 – 8 °C hasta por 24 horas.

5.4.3 PCR en Tiempo Real

Encender el termociclador por lo menos media hora antes de iniciar el ensayo.

a. Mantener los tubos de PCR, que contienen los reactivos de PCR aproximadamente por 5 minutos para que alcancen la temperatura ambiente, luego abrir los tubos.

b. Los pellets de PCR son amarillo pálido, si el pellet no es amarillo pálido, no usar el tubo. Si el pellet no se encuentra en el fondo del tubo, suavemente moverlo hacia el fondo del tubo con un tip vacío estéril, no usar un tip que contenga el lisado.

c. Abrir los tubos de lisado empleando la herramienta de sellado. d. Transferir 20 uL del lisado al tubo de PCR para rehidratar el pellet. Remover el

lisado desde la parte media superior del lisado para asegurar que no se



Tóxicos

MET-UCCIRT/Lma-13


TIEMPO REAL

Revisión: 00

Página: 5 de 13


transfieran partículas de lisis desde los tubos de lisis a los tubos de PCR. No tocar el pellet cuando se agrega el lisado.

e. Sellar los tubos con las tapas planas empleando la herramienta de sellado. f. Mezclar por 10 a 15 segundos para asegurarse que los pellets estén totalmente

rehidratados. g. La corrida de PCR se debe dar un máximo de 30 minutos después de haber

agregado el lisado los tubos de PCR. h. Configurar el equipo para la lectura:

1. Buscar y abrir en el escritorio el programa RapidFinder Express 2. Seleccionar Create/Edit a Run File y hacer doble click, para crear el documento

de corrida.

Imagen 1

3. Seleccionar Create New Run File y hacer doble click en next:

Imagen 2



Tóxicos

MET-UCCIRT/Lma-13


TIEMPO REAL

Revisión: 00

Página: 6 de 13


4. Llenar los datos de corrida: Run ID: fecha de corrida; Setup Operator: Nombre

del analista; y agregar comentarios si es necesario. Hacer click en next:

Imagen 3

5. Seleccionar el método: Salmonella spp. Sure Tect, el número de muestras,

replicas que debe ser 1, control negativo 1 y control positivo 1 (cuando corresponda 1 vez al mes) y hacer click en next

6. Colocar el código de muestra en los casilleros Sample Name y hacer click en next.

7. Aparece la distribución de los tubos en la placa: azules son los tubos de muestra, verde el control negativo y los transparentes son los tubos de contrapeso los cuales son tubos vacíos.

8. Colocar los tubos en la bandeja del termociclador de acuerdo a la distribución señalada y presionar para cerrar la bandeja.

Imagen 4



Tóxicos

MET-UCCIRT/Lma-13


TIEMPO REAL

Revisión: 00

Página: 7 de 13


9. Luego ir a Start Instrument Run, seleccionar y hacer click en next:

Imagen 5

10. Colocar el nombre el analista en Run Operator, se elige el Run file creado anteriormente.

11. Aparece la siguiente pantalla, hacer click en start se mostrará el tiempo estimada de la corrida (Estimated Time Remaining) y el porcentaje en el cuadro de abajo del avance de la corrida. Una vez transcurrido el tiempo estimado se completará el 100% de la corrida, aparece un mensaje de corrida completa, hacer click en Close.

Imagen 6



Tóxicos

MET-UCCIRT/Lma-13


TIEMPO REAL

Revisión: 00

Página: 8 de 13


5.4.4 Lectura de resultados:

1. Una vez concluida la corrida abrir View Results para visualizar los

resultados de la corrida. 2. Seleccionar en Run file según la fecha los resultados obtenidos y

aparecerán los resultados de la corrida:

Imagen 7

Donde:



Tóxicos

MET-UCCIRT/Lma-13


TIEMPO REAL

Revisión: 00

Página: 9 de 13


3. En el caso de resultados de advertencia es necesario revisar las posibles causas de contaminación o problemas en la corrida, una vez analizado el problema repetir la corrida para subsanar los errores.

4. Obtener el reporte de los resultados en una hoja donde se indica el número de muestra y los resultados, dar click en la pestaña reporte:

Imagen 8

5. Guardar los resultados en la carpeta PCR, seleccionar la carpeta Salmonella spp. y colocar como nombre la fecha de la corrida.

6. Si el resultado fue negativo, el ensayo termina y se reporta en la Hoja de trabajo de Ensayos Microbiológicos Moleculares REG-UCCIRT/Lma-14 como Ausencia/25g.

7. Los resultados positivos son presuntivamente positivos y deben ser confirmados.

5.4.5 Confirmación

a. De las muestras enriquecidas estriar en Agar Brilliance Salmonella,

incubar de 22 a 26 horas a 37±1°C. b. En este medio las colonias características para Salmonella son púrpuras. c. Si las placas presentan alta carga microbiana que no permita la

diferenciación de las colonias, inocular en 10ml Rappaport Vassilidis (RV) 0.1 ml el caldo de enriquecimiento por 41.5±1 °C por 22 a 26 horas.

d. Sembrar desde el caldo RV una nueva placa de agar Brilliance Salmonella e incubar 22 a 26 horas a 37±1°C.

e. Confirmar las colonias positivas empleando el Tex de Látex Salmonella:

Látex Salmonella

Realizar los siguientes controles cada vez que se emplea el kit:



Tóxicos

MET-UCCIRT/Lma-13


TIEMPO REAL

Revisión: 00

Página: 10 de 13


Reactivo control: Añadir una gota del reactivo látex para Listeria de Oxoid a una gota se suero fisiológico en el mismo círculo de la tarjeta reactiva; mezclar y observar la posible aglutinación durante dos minutos. No debería producirse aglutinación. Si este control muestra aglutinación, el reactivo látex o bien el suero fisiológico probablemente se encuentra contaminado y debe desecharse.

Control Positivo: Depositar una gota de la suspensión de antígeno control positivo sobre una tarjeta reactiva. Colocar una gota de reactivo látex en el mismo círculo, al lado de la gota de suspensión de control positivo. EL CUENTA GOTAS NO DEBE ENTRAR EN CONTACTO CON EL CONTROL POSITIVO. Mezclando el reactivo látex y el control positivo con un palillo de mezclado limpio, extendiendo la suspensión sobre toda la superficie del círculo. Agitar con suavidad y evaluar la posible aglutinación en uh intervalo de no más de dos minutos. Una aglutinación fácilmente visible con el reactivo látex indica un funcionamiento normal del reactivo.

Prueba de autoaglutinación: Colocar la tarjeta de reacción en la mesa de trabajo, agregar una gota de suero fisiológico en el interior del círculo de la tarjeta, mediante el uso de un asa de inoculación emulsificar la colonia a estudiar en una gota de suero fisiológico, para producir una suspensión espesa y uniforme. Las suspensiones debe preparase a partir de colonias con morfología semejante a Listeria spp. Examinar la suspensión con el fin de identificar posibles aglutinaciones o agregaciones, que serían indicativas de autoglutinación. Si no hubiese autoglutinación pasar al siguiente paso.

Prueba: Mezclar suavemente el reactivo de látex para Listeria de Oxoid por inversión y añadir una gota de reactivo en el mismo pocillo adyacente a la suspensión. EL CUENTA GOTAS NO DEBERA ENTRAR EN CONTACTO CON LA SUSPENSION DEL ORGANISMO. Mezclar el reactivo látex y la suspensión del organismo con un asa de siembra estéril, extendiendo la mezcla sobre toda la superficie del pocillo, agitando la tarjeta reactiva con suavidad. Examinar la posible aparición de aglutinación en un plazo máximo de 2 minutos. Una vez terminada la lectura, desechar las tarjetas reactivas usadas en un medio desinfectante adecuado.

Interpretación: La aparición de la aglutinación en un plazo de dos minutos constituye una resultado positivo e indica la presencia de Salmonella spp. en la muestra. La ausencia de aglutinación indica que la muestra de prueba carece de Salmonella spp.

Si las pruebas realizadas confirman la presencia de Salmonella spp. en la muestra esta se reporta como PRESENCIA/25g.



Tóxicos

MET-UCCIRT/Lma-13


TIEMPO REAL

Revisión: 00

Página: 11 de 13


5.4.6 Control de Calidad

5.4.7 Llenado de Hoja e información y resultados: La información del cumplimiento de los pasos del método y los resultados obtenidos se registra en la Hoja de trabajo en el SIGCED o en el registro REG-UCCIRT/Lma-14: REGISTRO DE ENSAYOS MICROBIOLOGICOS MOLECULARES.

6. ATECEDENTES

No aplica 7. REGISTRO REG/UCCIRT-Lma- 14

Parámetro de calidad interno

Frecuencia Criterio de aceptación

Acción inmediata

Blanco Cada lote analítico No se detecta u observa crecimiento de colonias de bacterias características para Salmonella spp.

Repetir el ensayo, empleado otro kit o lote de preparación de medio de cultivo

Control positivo Cada lote analítico Se detecta u observan colonias características para Salmonella spp.

Repetir el ensayo, empleado otro kit o lote de preparación de medio de cultivo



Tóxicos

MET-UCCIRT/Lma-13


TIEMPO REAL

Revisión: 00

Página: 12 de 13




Tóxicos

MET-UCCIRT/Lma-13


TIEMPO REAL

Revisión: 00

Página: 13 de 13


met-uccirt/lma-13 mÉtodo: detecciÓn de alimentos, …

Documents