lezione : antibiotici e antibiogramma docente :...
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Corso integrato di Corso integrato di microbiologiamicrobiologia
prof. ord. e coordinatore del corso : prof. ord. e coordinatore del corso : prof. M.A.Tufanoprof. M.A.Tufano
Lezione :Lezione :Antibiotici e antibiogrammaAntibiotici e antibiogramma
Docente : M.R.IoveneDocente : M.R.IoveneIndirizzo Mail: [email protected] Mail: [email protected]
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Struttura batterica
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BATTERIBATTERI
Gram PositiviGram PositiviAerobi Aerobi
Gram NegativiGram Negativi
Gram PositiviGram PositiviAnaerobiAnaerobi
Gram NegativiGram Negativi
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Numerosi ceppi batterici colonizzano differenti distretti corporei66
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BACTERIA COMMONLY FOUND ON THE SURFACES OF THE HUMAN BODY
BACTERIUM Skin Conjunctiva Nose Pharynx Mouth Lower Intestine
Anterior urethra Vagina
Staphylococcus epidermidis (1) ++ + ++ ++ ++ + ++ ++ Staphylococcus aureus* (2) + +/- + + + ++ +/- + Streptococcus mitis + ++ +/- + + Streptococcus salivarius ++ ++ Streptococcus mutans* (3) + ++ Enterococcus faecalis* (4) +/- + ++ + + Streptococcus pneumoniae* (5) +/- +/- + + +/- Streptococcus pyogenes* (6) +/- +/- + + +/- +/- Neisseria sp. (7) + + ++ + + + Neisseria meningitidis* (8) + ++ + + Veillonellae sp. + +/- Enterobacteriaceae* (Escherichia coli) (9) +/- +/- +/- + ++ + +
Proteus sp. +/- + + + + + + Pseudomonas aeruginosa* (10) +/- +/- + +/- Haemophilus influenzae* (11) +/- + + + Bacteroides sp.* ++ + +/- Bifidobacterium bifidum (12) ++ Lactobacillus sp. (13) + ++ ++ ++ Clostridium sp.* (14) +/- ++ Clostridium tetani (15) +/- Corynebacteria (16) ++ + ++ + + + + + Mycobacteria + +/- +/- + + Actinomycetes + + Spirochetes + ++ ++ Mycoplasmas + + + +/- +
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Meccanismi di difesa dell’ospite
L’ integrità delle superfici corporee costituisce insieme ad una “serie di fattori”, una barriera all’iniziale attecchimento e
penetrazione dell’agente patogeno88
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FontiFonti-- da dove provengono i microrganismi?da dove provengono i microrganismi?
Via trasplacentare
Canale del partoAllattamentoMadreMadre
Noi stessiNoi stessi
Altri individuiAltri individui
AnimaliAnimaliAmbiente
SaniPortatoriMalati
Ambiente
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I batteri patogeni possono prendere il sopravvento, quando “l’equilibrio e i meccanismi di difesa dell’ospite”
vengono, per fattori interni o esterni, ad alterarsi.1010
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Il primo a dare un approccio diverso Il primo a dare un approccio diverso alla ricerca sulle malattie infettive fu alla ricerca sulle malattie infettive fu Paul Ehrlich (Paul Ehrlich (18541854--19151915).).
Egli propose che per combattere Egli propose che per combattere queste malattie,si utilizzassero queste malattie,si utilizzassero farmaci precisi, i chemioterapicifarmaci precisi, i chemioterapici((termine coniato dallo stesso scienziatotermine coniato dallo stesso scienziato),), tossicitossiciper il per il microrganismo patogeno microrganismo patogeno
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CHEMIOTERAPIA (definizione)Paul Ehrlich, 1910
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Insieme dottrinale e metodologico volto alla ricerca di sostanze chimiche artificiali e naturali dotate di tossicità selettiva nei confronti di cellule procariotiche od eucariotiche responsabili di infezioni, infestioni, neoplasie o disordini immunologici.
SI DISTINGUONO, IN FUNZIONE DEI DIVERSI BERSAGLI , TRESETTORI DELLA CHEMIOTERAPIA:
1) ANTIMICROBICA (ETIOTROPA)2) ANTIBLASTICA 3) IMMUNOMODULANTE
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•(Paul Erlich 1891-1914)
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Basi razionali della Basi razionali della chemioterapia chemioterapia
TossicitTossicitàà selettivaselettivaRecettore specifico dellRecettore specifico dell’’agente patogenoagente patogenoScreening di prototipi naturali e semisintesi di Screening di prototipi naturali e semisintesi di analoghianaloghiRuolo dei modelli animaliRuolo dei modelli animaliProblema della chemioresistenzaProblema della chemioresistenza
Corpora non agunt nisi fixata (P. Erlich 13 giugno 1914)
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Da un consiglio di Ehrlich Da un consiglio di Ehrlich pubblicato nel 1913pubblicato nel 1913
““Frapper fort et frapper viteFrapper fort et frapper vite””
Colpisci forte e colpisci in frettaColpisci forte e colpisci in fretta
Paul Ehrlich, Lancet 1913
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Tra gli scienziati che parteciparono attivamente alle ricerche sui chemioterapici vi fu anche Alexander Fleming (1881-1955) casualmente, scoprì nel 1928 una sostanza che presentava effetti antibatterici e che arrivò più tardi a chiamare penicillina. Egli, infatti, mentre era intento a pulire nel suo laboratorio, fu incuriosito da una piastra di petri con Stafilococchi che era stata inquinata da una muffa. Le colonie di questa muffa, che egli stabilì essere di Penicillium notatum,avevano causato una zona di inibizione della crescita degli Stafilococchi che stavano nelle vicinanze delle stesse. Fleming ipotizzò che la muffa avesse prodotto una sostanza letale per gli Stafilococchi, che era, appunto, la penicillina
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penicillium notatumpenicillium notatum
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Alone di inibizione formatosi intorno a Alone di inibizione formatosi intorno a penicillum notatum inoculato con stafilococcopenicillum notatum inoculato con stafilococco
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Howard Walter Florey (1898-1968)
Ernst Boris Chain (1906-1979)
Discovery of terapeutic effects of penicillin1945 - Nobel Prize in Physiology or Medicine
“for the discovery of penicillin and its therapeutic effects”
Sir Alexander FlemingSir Ernst Boris Chain
Baron Howard Walter Floreypenicillin culture
at the Sir William Dunn School of Pathology Oxford, England, 1940
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A poster from World War Two
1919
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Sviluppo ed efficacia della chemioterapia antimicrobica(1935 – 1993)
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I capostipitiI capostipiti
1935 PRONTOSIL ROSSO1935 PRONTOSIL ROSSO(Domagk)(Domagk)
1941 PENICILLINA G1941 PENICILLINA G(1929) (Fleming, Chain, Florey)(1929) (Fleming, Chain, Florey)
1944 STREPTOMICINA1944 STREPTOMICINA(Waksman, Shatz, Bugle)(Waksman, Shatz, Bugle)
1945 CEFALOSPORINE P,N,C1945 CEFALOSPORINE P,N,C(Brotzu)(Brotzu)
1947 CLORTETRACICLINA1947 CLORTETRACICLINA(Duggar)(Duggar)
1947 CLORAMFENICOLO1947 CLORAMFENICOLO(Burkholder)(Burkholder)
1952 ISONIAZIDE1952 ISONIAZIDE(Fox)(Fox)
1952 ERITROMICINA1952 ERITROMICINA(Mc Guire)(Mc Guire)
1955 VANCOMICINA1955 VANCOMICINA
1955 AMFOTERICINE A,B1955 AMFOTERICINE A,B(Gold)(Gold)
1959 RIFAMICINE A,B,C,D,E1959 RIFAMICINE A,B,C,D,E(Sensi)(Sensi)
1959 STAFILOMICINA1959 STAFILOMICINA(Vanderhaege)(Vanderhaege)
1962 AC. NALIDIXICO1962 AC. NALIDIXICO(Lesher)(Lesher)
(Mc Cormick)(Mc Cormick)
1987 DuP 7211987 DuP 721
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ANTIBIOTICIDefinizione:
Con il termine antibiotico si intende una molecola naturale, metabolita secondario di Eubatteri, Actinomiceti e Funghi inferiori, prodotta in coincidenza della differenziazione di strutture cellulari specializzate per la sopravvivenza microbica quando il substrato è esaurito, questa molecola è in grado di inibire la crescita di altri microrganismi.
Dal momento che attualmente molte molecole vengono prodotte per via sintetica o semisintetica è più corretto utilizzare il termine CHEMIOANTIBIOTICO.
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Produzione di sostanze antibiotiche indotta dalla carenza di metProduzione di sostanze antibiotiche indotta dalla carenza di metaboliti aboliti azotatiazotati
CRESCITAESPONENZIALE
CRESCITA POST-LOGARITMICA
ESAURIMENTOSUBSTRATO CRESCITA
PRE-SPORULAZIONE
DEPRESSIONE CATABOLICA
LISI
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SPORE
ANTIBIOTICIESOENZIMI
ESOTOSSINEActimomiceti
Funghi inferioriBacillacee
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Classificazione degli Classificazione degli ANTIBIOTICIANTIBIOTICI
Esistono diversi sistemi di Esistono diversi sistemi di classificazione in classificazione in
considerazione del notevole considerazione del notevole numero di molecole utilizzate numero di molecole utilizzate
nella pratica clinicanella pratica clinica..
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CLASSIFICAZIONECLASSIFICAZIONE1. 1. Classificazione in FAMIGLIEClassificazione in FAMIGLIE2. Secondo l' ORIGINE2. Secondo l' ORIGINE3. Secondo lo SPETTRO D'AZIONE3. Secondo lo SPETTRO D'AZIONE4. Secondo il TIPO D'AZIONE4. Secondo il TIPO D'AZIONE5. 5. In base al In base al MECCANISMO D'AZIONEMECCANISMO D'AZIONE
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1.Classificazione in FAMIGLIE
Vengono classificati in "famiglie" molecole che presentano
caratteristiche simili (es. penicilline, cefalosporine,aminoglucosidi, tetracicline etc.)
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Classificazione degli Classificazione degli ANTIBIOTICIANTIBIOTICI
2. Secondo l' ORIGINEEstrattiva: da batteri e funghi (Penicillium,Cephalosporium, Streptomyces)
Semisintetica: partendo da una struttura base, ottenuta per estrazione (fermentazione) e aggiungendo catene di sintesi
Sintesi chimica: molti composti si ottengono per sintesi chimica (chinoloni, monobattami, cloramfenicolo etc)
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Classificazione degli ANTIBIOTICI
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3. Secondo lo SPETTRO D'AZIONESi intende per spettro d'azione, il ventaglio delle specie batteriche nei riguardi delle quali l'antibiotico mostra attività.Ampio: (Gram positivi e negativi)
Medio: (Gram + ed alcuni Gram -)
Ristretto: (solo Gram - o solo Gram +)
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Classificazione degli ANTIBIOTICI
4. Secondo il TIPO D'AZIONEbatteriostatica: blocca la riproduzione dei batteri
battericida: (determina la morte dei batteri)
Si definisce battericida un antibiotico il quale dopo 24 h di contatto "in vitro“ determina una
sopravvivenza dei germi uguale o inferiore allo 0,01% .
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Classificazione degli ANTIBIOTICI
5. In base al MECCANISMO D'AZIONE1. Antibiotici che inibiscono la sintesi della parete cellulare,
tale inibizione si può verificare:nella prima fase di sintesi (inibizione della fosfoenolpiruvatotransferasi) : Fosfomicina oppure (mancata utilizzazione della alanina): Cicloserina.nella seconda fase (trasferimento e polimerizzazione del mucopeptide parietale) Vancomicina. a livello terminale (fase di transpeptidizzazione) Penicilline, Cefalosporine.
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Classificazione degli ANTIBIOTICI5. In base al MECCANISMO D'AZIONE2. Antibiotici che inibiscono la sintesi proteica, tale
inibizione può avvenire:• a livello della subunità 30S dei ribosomi
(aminoglicosidi,tetracicline)• a livello della subunità 50S dei ribosomi
(cloramfenicolo,macrolidi)
3. Antibiotici che inibiscono il meccanismo di replicazione e di trascrizione degli acidi nucleici:• inibizione della RNA-polimerasi (rifamicine)• inibizione della DNA-girasi o topoisomerasi (chinoloni)
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Classificazione degli ANTIBIOTICI
5. In base al MECCANISMO D'AZIONE
4. Antibiotici che alterano la membrana citoplasmatica batterica o micotica (polimixine, polieni)
5. Antibiotici che agiscono come antimetaboliti (sulfamidici, trimetropim)
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MECCANISMI DI AZIONE DELLE MECCANISMI DI AZIONE DELLE PRINCIPALI CLASSI di ANTIBIOTICIPRINCIPALI CLASSI di ANTIBIOTICI Inibizione della sintesi proteica
(macrolidi, tetracicline,aminoglicosidi, oxazolidinoni)
Inibizione della sintesi della parete cellulare
(penicilline, cefalosporine, glicopeptidi)
Inibizione della replicazione del DNA
(fluorochinoloni)
Trasformazioni metaboliche nel citoplasma
(sulfonamidi, trimetoprim)
Interferenza con la membrana citoplasmatica
(polimixina)3333
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ANTIBIOTICO RESISTENZAANTIBIOTICO RESISTENZA
E’ la capacità dei batteri di essere o di diventare resistenti nei confronti degli antibiotici.
Principale problema dell’antibiotico-terapia di grande attualità e di profondo impatto pratico.
Condiziona la scelta, l’impiego, il futuro della chemioterapia
Iniziato con la nascita della chemioterapia, ne segue costantemente il decorso
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MECCANISMI DELLMECCANISMI DELL’’ANTIBIOTICO ANTIBIOTICO RESISTENZARESISTENZA
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I meccanismi attraverso i quali può I meccanismi attraverso i quali può instaurarsi una resistenza instaurarsi una resistenza
antibiotica sono:antibiotica sono:
ridotta permeabilitridotta permeabilitàà cellularecellulareaumentato efflussoaumentato efflussoalterazione del bersaglioalterazione del bersaglioproduzione di enzimi inattivantiproduzione di enzimi inattivanti
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MECCANISMI DELLMECCANISMI DELL’’ANTIBIOTICO ANTIBIOTICO RESISTENZARESISTENZA
1. 1. Ridotta permeabilitRidotta permeabilitàà cellulare:cellulare:la penetrazione di un antibiotico può essere la penetrazione di un antibiotico può essere ridotta da cambiamenti strutturali negli ridotta da cambiamenti strutturali negli involucri superficiali della cellula. involucri superficiali della cellula.
Nei GramNei Gram-- la resistenza può essere dovuta ad la resistenza può essere dovuta ad alterazione delle porine (proteine di alterazione delle porine (proteine di membrana attraverso le quali penetrano molti membrana attraverso le quali penetrano molti antibiotici)antibiotici)
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MECCANISMI DELLMECCANISMI DELL’’ANTIBIOTICO ANTIBIOTICO RESISTENZARESISTENZA
2. 2. Aumentato efflusso:Aumentato efflusso:LL’’antibiotico penetrato nella cellula antibiotico penetrato nella cellula
batterica batterica èè allontanato da sistemi di allontanato da sistemi di efflusso.efflusso.
Nei GramNei Gram-- le pompe di efflusso operano le pompe di efflusso operano accoppiate a accoppiate a ”” proteine canaleproteine canale”” che che provocano lprovocano l’’espulsione diretta del farmacoespulsione diretta del farmaco
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MECCANISMI DELLMECCANISMI DELL’’ANTIBIOTICO ANTIBIOTICO RESISTENZARESISTENZA
33. . Alterazione del bersaglio:Alterazione del bersaglio:il bersaglio dellil bersaglio dell’’antibiotico antibiotico èè alterato e non alterato e non èè
pipiùù riconosciuto dallriconosciuto dall’’antibiotico.antibiotico.
4.4. Produzione di enzimi inattivantiProduzione di enzimi inattivanti::ll’’antibiotico perde la sua attivitantibiotico perde la sua attivitàà biologica, biologica, poichpoichéé viene inattivato da enzimi specifici. viene inattivato da enzimi specifici. ((betabeta--lattamasilattamasi, acetiltransferasi, , acetiltransferasi, fosfotransferasi, adeniltransferasi)fosfotransferasi, adeniltransferasi)
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MECCANISMI MECCANISMI DELLDELL’’ANTIBIOTICO ANTIBIOTICO RESISTENZARESISTENZA
Produzione di enzimi inattivantiProduzione di enzimi inattivanti
1)1) nello spazio periplasmico per i nello spazio periplasmico per i Gram negativi (a,b,c)Gram negativi (a,b,c)
2)2) extra cellulari per i Gram extra cellulari per i Gram positivi (d)positivi (d)
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RESISTENZA NATURALE (origine naturaleRESISTENZA NATURALE (origine naturale))
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Insensibilità costituzionale di un microrganismo verso un determinato antibiotico
Immutabile nel tempo, geneticamente determinataSi manifesta in tutti i ceppi di una stessa specie
Dipende:caratteristiche dell’antibioticostrutture del microrganismomancata penetrazione del farmaco attraverso le
struttureesterne del microrganismo
Es. insensibilità degli Enterobatteri per la penicillina o dei batteri Gram negativi per i glicopeptidi
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RESISTENZA ACQUISITARESISTENZA ACQUISITA(variazione informazionale(variazione informazionale))
Comparsa di ceppi che, nellComparsa di ceppi che, nell’’ambito ambito di una specie microbica di una specie microbica
originariamente sensibile ad un originariamente sensibile ad un chemioterapico, hanno perduto la chemioterapico, hanno perduto la sensibilitsensibilitàà verso concentrazioni verso concentrazioni del farmaco terapeuticamente del farmaco terapeuticamente
raggiungibili in vivo.raggiungibili in vivo.4141
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EE’’ favorita dallfavorita dall’’elevata velocitelevata velocitààcon cui i batteri si moltiplicanocon cui i batteri si moltiplicano
Distinguiamo :Distinguiamo :cromosomica o endogenacromosomica o endogenaextracromosomica o esogenaextracromosomica o esogena
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RESISTENZA CROMOSOMICARESISTENZA CROMOSOMICA
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Costituisce solo il 10Costituisce solo il 10--15% di tutte le resistenze acquisite 15% di tutte le resistenze acquisite (bassa frequenza di insorgenza)(bassa frequenza di insorgenza)
Si realizza tramite unSi realizza tramite un’’alterazione mutazionale spontaneaalterazione mutazionale spontaneadelldell’’informazione genetica cromosomicainformazione genetica cromosomica
LL’’antibiotico esercita unantibiotico esercita un’’azione selettiva (seleziona i mutanti azione selettiva (seleziona i mutanti resistenti inibendo le cellule sensibili)resistenti inibendo le cellule sensibili)
Tale resistenza interessa solo lTale resistenza interessa solo l’’antibiotico verso il quale sonoantibiotico verso il quale sonostati isolati i mutanti resistentistati isolati i mutanti resistenti
Gli stessi mutanti possono essere resistenti anche ad altrGli stessi mutanti possono essere resistenti anche ad altriiantibiotici con caratteristiche simili (resistenza antibiotici con caratteristiche simili (resistenza crociata o cross crociata o cross --resistenza)resistenza)
Si trasmette verticalmente tramite la discendenza (da cellSi trasmette verticalmente tramite la discendenza (da cellula madre ula madre a cellula figlia)a cellula figlia)
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RESISTENZA CROMOSOMICARESISTENZA CROMOSOMICA
Può essere:Può essere:multimulti--stepstep: : sono necessarie pisono necessarie piùù mutazioni mutazioni
perchperchéé possa instaurarsi (es. betapossa instaurarsi (es. beta--lattamine, lattamine, macrolidi, cloramfenicolo)macrolidi, cloramfenicolo)
oneone--stepstep: : èè sufficiente una sola mutazione per sufficiente una sola mutazione per determinare la comparsa di ceppi totalmente determinare la comparsa di ceppi totalmente resistenti (es. rifamicine, chinoloniresistenti (es. rifamicine, chinoloni))
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RESISTENZA EXTRACROMOSOMICARESISTENZA EXTRACROMOSOMICA
Costituisce il 90% di tutte le resistenze Costituisce il 90% di tutte le resistenze (alta frequenza di insorgenza)(alta frequenza di insorgenza)
Si origina per acquisizione di nuova informazione genetica cheSi origina per acquisizione di nuova informazione genetica che deriva da deriva da altri microrganismi e che penetra nella cellula mediante i meccaaltri microrganismi e che penetra nella cellula mediante i meccanismi di nismi di coniugazione, trasformazione e trasduzioneconiugazione, trasformazione e trasduzione
Riguarda piRiguarda piùù antibiotici contemporaneamente (antibiotici contemporaneamente (resistenza multiplaresistenza multipla))
EE’’ a trasmissione orizzontale (a trasmissione orizzontale (tramite lo scambio geneticotramite lo scambio genetico))
Può essere trasferita anche a microrganismi appartenente a spePuò essere trasferita anche a microrganismi appartenente a specie cie differenti differenti (resistenza contagiosa(resistenza contagiosa))
EE’’ dovuta a geni presenti su plasmidi o trasposoni (dovuta a geni presenti su plasmidi o trasposoni (elementi genici mobilielementi genici mobili))
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TrasduzioneTrasduzione ::
UnUn batteriofagobatteriofago funge da vettore e funge da vettore e trasferisce il DNA contenente un trasferisce il DNA contenente un gene di resistenza da una cellula gene di resistenza da una cellula
batterica ad un'altra.batterica ad un'altra.
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Principali meccanismi di resistenza Principali meccanismi di resistenza antibattericaantibatterica
Deflusso(macrolidi,chinoloni)
Ridotta permeabilità(co-trimossazolo)
Modifica della sede bersaglio(intra o extracellulare; β-lattamici, macrolidi, chinoloni, glicopeptidi)
Degradazioneenzimatica
(intra o extracellulare; β-lattamici, aminoglucosidi)
XX
Bypass(co-trimossazolo)
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Classi di AntibioticiClassi di Antibiotici
TetraciclineTetraciclineCloramfenicoloCloramfenicoloPolipeptidiciPolipeptidici
PolimixinePolimixineStreptogramineStreptogramineAltriAltri
VariVariFosfomicinaFosfomicinaAcido fusidicoAcido fusidicoSpectinomicinaSpectinomicinaNovobiocina
BetalattamiciBetalattamiciAminoglucosidiAminoglucosidiChinoloniChinoloniGlicopeptidiGlicopeptidiOxazolidinoniOxazolidinoniMacrolidiMacrolidiKetolidiKetolidiLincosamidiLincosamidiRifamicineRifamicine Novobiocina
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MECCANISMI DI AZIONE DELLE MECCANISMI DI AZIONE DELLE PRINCIPALI CLASSI di ANTIBIOTICIPRINCIPALI CLASSI di ANTIBIOTICI Inibizione della sintesi proteica
(macrolidi, tetracicline,aminoglicosidi, oxazolidinoni)
Inibizione della sintesi della parete cellulare
(penicilline, cefalosporine, glicopeptidi)
Inibizione della replicazione del DNA
(fluorochinoloni)
Trasformazioni metaboliche nel citoplasma
(sulfonamidi, trimetoprim)
Interferenza con la membrana citoplasmatica
(polimixina)5050
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Che cosa si intende per antibiogramma ?
L’antibiogramma è un metodo di valutazione in vitro dell’interazione
tra il microrganismo isolato e gli antibiotici più appropiati per il
trattamento in vivo.
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Isolare l’agente eziologico in coltura pura, identificarlo con i test biochimici per
permettere la classificazione in genere e specie
L’identificazione dei germi isolatidai campioni biologici, riveste importanza clinica ed epidemiologica ed è una tappa
fondamentale per allestire i test di sensibilità agli antibiotici
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La scelta degli antibiotici da saggiare in vitro viene fatta per via generale in base
alle linee guida di NCCLS(National Committee for Clinical Laboratory Standard).
In particolare, però, ogni laboratorio ha il dovere di aggiornarsi e/o partecipare
attivamente agli studi epidemiologici recenti o in corso, che studiano per ogni patologia la
frequenza di isolamento degli agenti patogeni da cui possiamo estrapolare
le resistenze batteriche locali.
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Metodi di antibiogrammaMetodi di antibiogramma
PER DILUIZIONEPER DILUIZIONE--in terreno liquidoin terreno liquido--in terreno solidoin terreno solido
PER DIFFUSIONEPER DIFFUSIONE--in terreno solidoin terreno solido
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In ogni caso,i risultati ottenuti devono In ogni caso,i risultati ottenuti devono essere tradotti in categorie di essere tradotti in categorie di
sensibilitsensibilitàà o di resistenza.o di resistenza.
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Definizione di MIC e MCB
Per valutare se un antibiotico è batteriostatico o battericida si determinano le M.I.C e le M.B.C.
o- M.I.C. o minima concentrazione inibente è la minima concentrazione di antibiotico in grado di
impedire lo sviluppo dei microrganismi
5555
o- M.B.C. o minima concentrazione battericida è la minima concentrazione di antibiotico in grado di portare a morte le
cellule batteriche.scaricato da www.sunhope.it
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Si prelevano con una ansa sterile tre o Si prelevano con una ansa sterile tre o quattro colonie isolatequattro colonie isolate
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Quindi si stemperano in un brodo sterile (inoculo)Quindi si stemperano in un brodo sterile (inoculo)
5959
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Viene misurata con un turbidimetro la torbiditViene misurata con un turbidimetro la torbiditàà delldell’’inoculo che secondo i metodi inoculo che secondo i metodi standard non deve superare 0.5 Mac Farlandstandard non deve superare 0.5 Mac Farland((101088 CFU/mlCFU/ml ), l), l’’inoculo utilizzato inoculo utilizzato dovrebbe condurre a crescita semidovrebbe condurre a crescita semi--confluente delle colonie dopo una incubazione confluente delle colonie dopo una incubazione notturna. Un inoculo non corretto (colonie a crescita confluentenotturna. Un inoculo non corretto (colonie a crescita confluente o separate) può o separate) può essere rapidamente riconosciuto e le prove con inoculo non idoneessere rapidamente riconosciuto e le prove con inoculo non idoneo dovrebbero o dovrebbero essere ripetute. essere ripetute.
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Metodo per Metodo per diluizione in diluizione in
terreno liquidoterreno liquido
6161
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Metodo per diluizioneMetodo per diluizione(determinazione della MIC)(determinazione della MIC)
16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12
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Metodo per diluizioneMetodo per diluizione(determinazione della MIC)(determinazione della MIC)
16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12
MIC 6363
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Determinazione della MIC (micrometodo)Determinazione della MIC (micrometodo)
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Determinazione della MIC (micrometodo)Determinazione della MIC (micrometodo)
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Determinazione della MIC (micrometodo)Determinazione della MIC (micrometodo)
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Metodica di Antibiogramma su micropiastra per la determinazione Metodica di Antibiogramma su micropiastra per la determinazione della MICdella MIC
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Metodo per diffusione Metodo per diffusione in terreno solidoin terreno solido
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l'antibiogramma per diffusionel'antibiogramma per diffusioneDensitDensitàà dell'inoculo : 0,5 McFarland = 10dell'inoculo : 0,5 McFarland = 1088 CFU/ml CFU/ml Terreno di coltura:Terreno di coltura:
—— composizione (Mullercomposizione (Muller--Hinton agar)Hinton agar)—— spessore: 4 mm spessore: 4 mm
(25 ml per piastre da 9 cm, 60 ml per piastre da 15 cm)(25 ml per piastre da 9 cm, 60 ml per piastre da 15 cm)
—— pH: 7,2 pH: 7,2 -- 7,47,4-- Uso di dischetti in carta bibula Uso di dischetti in carta bibula (diametro 6,35 mm)(diametro 6,35 mm) imbevuti imbevuti
da Concentrazione standard degli antibiotici da da Concentrazione standard degli antibiotici da saggiare saggiare
Temperatura d'incubazione 35Temperatura d'incubazione 35°°-- 3737°°CCTempo d'incubazione 15Tempo d'incubazione 15--18h18h
7070
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Esecuzione dellEsecuzione dell’’antibiogramma col metodo antibiogramma col metodo per diffusioneper diffusione
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Esecuzione dellEsecuzione dell’’antibiogramma col metodo antibiogramma col metodo per diffusioneper diffusione
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Esecuzione dellEsecuzione dell’’antibiogramma col metodo antibiogramma col metodo per diffusioneper diffusione
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Antibiogramma per diffusione secondo KirbyAntibiogramma per diffusione secondo Kirby--Bauer : aloni di inibizioneBauer : aloni di inibizione
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Misura degli aloni di inibizioneMisura degli aloni di inibizione
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Misura degli aloni di inibizioneMisura degli aloni di inibizione
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Antibiogramma Antibiogramma per diffusione su per diffusione su Escherichia coliEscherichia coli
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Antibiogramma Antibiogramma per diffusione per diffusione
su su Pseudomonas Pseudomonas
aeruginosaaeruginosa
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Antibiogramma Antibiogramma per diffusione per diffusione
su su Pseudomonas Pseudomonas
aeruginosaaeruginosa
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VANTAGGI E SVANTAGGI DEI METODI VANTAGGI E SVANTAGGI DEI METODI TRADIZIONALITRADIZIONALI
Metodo per diluizione in terreno liquidoMetodo per diluizione in terreno liquidoPro:Pro: risultati quantitativi (MIC)risultati quantitativi (MIC)Contro:Contro: lentezza e complessitlentezza e complessitàà di esecuzione di esecuzione (se non automatizzato)(se non automatizzato)
••Metodo per diffusione in terreno solidoMetodo per diffusione in terreno solidoPro:Pro: rapiditrapiditàà e facilite facilitàà di esecuzionedi esecuzioneContro:Contro: risultati qualitativi (sensibile risultati qualitativi (sensibile -- intermedio intermedio --resistente)resistente)
8080
EtestEtestPro: rapiditPro: rapiditàà e facilite facilitàà di esecuzionedi esecuzionePro: risultati quantitativi (MIC)Pro: risultati quantitativi (MIC)
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Caratteristiche di EtestCaratteristiche di Etest
8181
La tecnica di semina La tecnica di semina èè analoga a quella analoga a quella delldell’’antibiogramma per diffusione secondo Kirbyantibiogramma per diffusione secondo Kirby--Bauer.Bauer.La lettura della MIC si effettua dove la crescita La lettura della MIC si effettua dove la crescita batterica interseca la striscia.batterica interseca la striscia.
Etest Etest èè costituito da strisce di plastica costituito da strisce di plastica di 5 x 50 mm contenenti un gradiente di 5 x 50 mm contenenti un gradiente corrispondente a 15 concentrazioni a corrispondente a 15 concentrazioni a raddoppio di antibiotico (in mg/ml).raddoppio di antibiotico (in mg/ml).
Queste sono variabili secondo i diversi Queste sono variabili secondo i diversi antibiotici:antibiotici:0.00025 0.00025 -- 440.002 0.002 -- 32320.016 0.016 -- 2562560.032 0.032 -- 5125120.064 0.064 -- 1024.1024.
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Applicazione della strisciaApplicazione della striscia
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Applicazione della strisciaApplicazione della striscia
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5 o 6 5 o 6 strisce strisce sulle sulle piastre piastre da 15 da 15 cm...cm...
8585
...2 strisce sulle ...2 strisce sulle piastre da 9 cmpiastre da 9 cm
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E test : metodica per diffusione , lettura in MICE test : metodica per diffusione , lettura in MIC
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Gli antibiotici battericidi formano un’ellissi
molto netta
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8888
Gli antibiotici Gli antibiotici batteriostatibatteriostatici possono ci possono formare formare unun’’ellissi ellissi sfumatasfumata
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Sottopopolazione Sottopopolazione resistente di resistente di pneumococcopneumococco
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9090
Sottopopolazione Sottopopolazione resistente ad resistente ad
elevata frequenza elevata frequenza di mutazionedi mutazione
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E testE test
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METODI AUTOMATIZZATIMETODI AUTOMATIZZATINuovo tipo di apparecchiatura chiusa, e computerizzata che ci daNuovo tipo di apparecchiatura chiusa, e computerizzata che ci da la possibilitla possibilitàà di di identificare con certezza un agente patogeno e di eseguire lidentificare con certezza un agente patogeno e di eseguire l’’antibiogramma o MIC antibiogramma o MIC
in automaticoin automatico
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ANTIMICOGRAMMA
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Nei primi anni 90 i derivati azolici erano considerati Nei primi anni 90 i derivati azolici erano considerati la soluzione alle infezioni fungine.la soluzione alle infezioni fungine.Attualmente, specie prima infrequenti di Attualmente, specie prima infrequenti di Candida Candida (Candida krusei)(Candida krusei) risultano intrinsecamente risultano intrinsecamente resistenti al fluconazolo, mentre le altre specie resistenti al fluconazolo, mentre le altre specie possono acquisire resistenza secondaria.possono acquisire resistenza secondaria.I ceppi di I ceppi di CandidaCandida con resistenza secondaria al con resistenza secondaria al fluconazolo sono probabilmente resistenti anche fluconazolo sono probabilmente resistenti anche allall’’ itraconazoloitraconazoloVerso la flucitosina cVerso la flucitosina c’è’è un rapido sviluppo di un rapido sviluppo di resistenza da parte dei ceppi di resistenza da parte dei ceppi di CandidaCandidaAmfotericina B Amfotericina B èè il farmaco a piil farmaco a piùù ampio spettro di ampio spettro di azione. Risultano resistenti azione. Risultano resistenti Zygomiceti, Zygomiceti, Trichosporon, Fusarium e Candida lusitaniaeTrichosporon, Fusarium e Candida lusitaniae
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METODO DELLE DILUIZIONI IN BRODO SECONDO METODO DELLE DILUIZIONI IN BRODO SECONDO NCCLS NCCLS (M27(M27--A)A) PER LA VALUTAZIONE DELLA PER LA VALUTAZIONE DELLA
SENSIBILITASENSIBILITA’’ DEI LIEVITI VERSO GLI DEI LIEVITI VERSO GLI ANTIMICOTICIANTIMICOTICI
9595
Inoculo standardizzato Inoculo standardizzato ⇒⇒ 0.5 Mc Farland0.5 Mc FarlandTerreno Terreno ⇒⇒ RPMI 1640, a pH 7RPMI 1640, a pH 7Metodica in piastra Metodica in piastra ⇒⇒ MicrodiluizioneMicrodiluizioneTemperaturaTemperatura ⇒⇒ 3535°°CCDurata dellDurata dell’’incubazione incubazione ⇒⇒ 48h 48h ((Candida spp) Candida spp)
72h (72h (C.neoformans)C.neoformans)Gli antimicotici saggiati sono : Amfotericina B, Gli antimicotici saggiati sono : Amfotericina B, Fluorocitosina, Ketoconazolo, Fluconazolo e Fluorocitosina, Ketoconazolo, Fluconazolo e ItraconazoloItraconazoloA diluizioni seriate di antimicotico viene aggiunto lA diluizioni seriate di antimicotico viene aggiunto l’’inoculo inoculo del lievito, la lettura del lievito, la lettura èè spettrofotometrica.spettrofotometrica.
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ATB FUNGUS (bioMATB FUNGUS (bioMéérieux)rieux)
La lettura della galleria può essere manuale o La lettura della galleria può essere manuale o automatica (automatica (lettore ATB bioMlettore ATB bioMéérieuxrieux))
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SENSITRE YeastOneSENSITRE YeastOneControlloControllo
Amfotericina BAmfotericina BFluconazoloFluconazoloItraconazoloItraconazoloKetonazoloKetonazolo
55--FlucitosinaFlucitosina
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METODICHE ALTERNATIVE ALLA MIC IN METODICHE ALTERNATIVE ALLA MIC IN BRODO BRODO
E TESTE TEST (AB Biodisk, Solna, Sweden)(AB Biodisk, Solna, Sweden)
Determinazione di MIC in piastraDeterminazione di MIC in piastraCorrelata con i test di riferimentoCorrelata con i test di riferimentoUna crescita non uniforme del micete, e la Una crescita non uniforme del micete, e la frequente presenza di ricrescita frequente presenza di ricrescita allall’’interno dellinterno dell’’alone di inibizione, possono alone di inibizione, possono provocare difficoltprovocare difficoltàà nella lettura del punto nella lettura del punto di inibizione della crescita.di inibizione della crescita.LL’’uso delluso dell’’E test presuppone molta E test presuppone molta esperienzaesperienza
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E test E test (AB Biodisk.Sweden)(AB Biodisk.Sweden) Metodo di MIC in piastraMetodo di MIC in piastra
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100100
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METODO DELLE DILUIZIONI IN BRODO PROTOCOLLO METODO DELLE DILUIZIONI IN BRODO PROTOCOLLO NCCLS M38NCCLS M38--PP,, PER LA VALUTAZIONE DELLA SENSIBILITAPER LA VALUTAZIONE DELLA SENSIBILITA’’
DELLEDELLE MUFFE MUFFE NEI CONFRONTI DEGLI ANTIMICOTICINEI CONFRONTI DEGLI ANTIMICOTICI
InoculoInoculo ⇒⇒ 0.4x10 0.4x10 -- 5x10 cfu/ml 5x10 cfu/ml (Conidium (Conidium ––and sporeand spore--forming fungi)forming fungi)
Inoculo standardizzatoInoculo standardizzato ⇒⇒ Metodo Metodo spettrofotometrico spettrofotometrico (varia col genere di fungo)(varia col genere di fungo)
Terreno Terreno ⇒⇒ RPMI 1640 a pH7RPMI 1640 a pH7MetodoMetodo ⇒⇒ MicrodiluizioneMicrodiluizioneTemperatura Temperatura ⇒⇒ 3535°°CCDurata dellDurata dell’’incubazione incubazione ⇒⇒ Variabile Variabile (dipende dalla (dipende dalla
Muffa in esame) Muffa in esame)
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grazie per l’attenzione
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