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P ricerca applicata

UUno strumento rivoluzionario per l’analisi

rapida delle proteine che grazie all’utilizzo

della tecnologia iTAGTM permette analisi

più veloci, e risultati più accurati dei metodi

tradizionali. Fra i molteplici e� etti introdotti

dalla globalizzazione, uno dei più controversi è

quello di poter facilmente reperire sui mercati

internazionali ingenti quantitativi di materie

prime e alimenti a prezzi modici, ma la cui

qualità è spesso un punto interrogativo. È

per tale ragione che, sono stati ulteriormente

inaspriti i controlli richiesti alle aziende

alimentari, al � ne di certi� care la sicurezza

e l’integrità dei loro prodotti. Gli ispettori

doganali e le aziende alimentari ricevono

ogni giorno quantitative enormi di grano,

glutine, riso, siero di soia e altri ingredienti di

cui è fondamentale sapere il reale contenuto

di proteine. I laboratori preposti hanno a loro

disposizione metodologie u� ciali, vecchie

di decenni, che richiedono parecchio tempo

per fornire il dato analitico oppure sistemi

rapidi che in pochi minuti sono in grado di

misurare le proteine. Purtroppo, il principio di

funzionamento della maggior parte di questi

strumenti si basa su metodi di misurazione

indiretti, che risalgono al dato analitico

attraverso uno storico oppure tramite calcoli

più o meno complessi.

Come si può facilmente intuire l’uso di additivi,

“camu� ati da proteine”, non può essere

scoperto da strumenti di questo genere, e il

rischio è quello di validare l’immissione sul

mercato di ingredienti alterati o scadenti, a

scapito della salute del consumatore, oltre

che dell’immagine e della credibilità delle

aziende produttrici. La necessità di avere un

metodo a� dabile per la determinazione delle

proteine non è mai stata così fondamentale e

d’attualità come ora.

È di questi tempi, infatti, lo scandalo del

latte in polvere cinese contaminato con la

melamina, i cui danni si sono fatti sentire su

più di 50.000 bambini. Questo fatto gravissimo

fa seguito ad un altro scandalo scoppiato lo

scorso anno negli Stati Uniti, dove centinaia di

cani e gatti sono deceduti a causa di pet food

contaminato da melamina. La melamina è un

composto organico utilizzato nell’industria

plastica, nella produzione di fertilizzanti o

come sostanza ignifuga, la cui ingestione

causa gravi problemi renali. Nella sua forma

in polvere viene aggiunta agli alimenti con

lo scopo di aumentarne fraudolentemente il

contenuto proteico, che risulta così gon� ato.

Tale pratica economicamente vantaggiosa

rispetto all’aggiunta di proteine della soia,

L’analisi delle proteine entra nel XXI secolo

*CEM Italia

Andrea Rota*

Un metodo accurato, rapido e diretto è quello che si va cercando da tempo nella determinazione delle proteine

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del grano o del mais, è ovviamente illegale,

ma quasi impossibile da scoprire con gli

analizzatori di proteine standard che nella

quasi totalità misurano il contenuto totale

d’azoto (quindi anche l’apporto proteico dato

dalla melamina) e non le proteine.

Metodi standard per l’analisi delle proteineGC-MS - La tecnica più accurata per la

misurazione delle proteine coinvolge

tipicamente un’analisi cromatogra� ca seguita

da spettroscopia di massa. Il metodo per

quanto accurato e sicuro è estremamente

costoso, richiede personale quali� cato e un

tempo d’analisi piuttosto lungo.

Kjeldahl/Dumas - L’alternativa più comune

prevede l’impiego di strumenti che attraverso

i metodi Kjeldahl o Dumas determinano

il contenuto totale d’azoto nel campione

e quindi calcolano le proteine in base alla

percentuale d’azoto riscontrata, dando per

assodato che dei 3 costituenti principali di

una matrice alimentare, grassi , carboidrati,

proteine, solo quest’ultime sono una “fonte”

d’azoto. Per diversi anni i chimici hanno

utilizzato queste metodiche, ponendo poca

attenzione al fatto che entrambe non sono in

grado di distinguere se l’azoto misurato è di

origine proteica o non proteica.

A questo si aggiunga il fatto che oltre a

non essere su� cientemente rapide tutte le

strumentazioni basate su queste tecniche

necessitano di sostanze chimiche

aggressive (pericolose), gas

in� ammabili e il loro utilizzo

richiede personale specializzato.

Kjeldahl prevede di scaldare

per diverse ore e a elevate

temperature acido solforico e

un catalizzatore di rame, con

conseguenti procedure di sicurezza

a cui attenersi sia durante l’analisi

che nel successivo smaltimento

dei reattivi utilizzati. Dumas è un

metodo a combustione, quindi

tutto ciò che viene prodotto

dall’incenerimento del campione

deve essere smaltito all’interno dello

strumento stesso. Ciò implica una frequente

manutenzione e pulizia del sistema, che

di� cilmente è in grado di trattare campioni

liquidi o di pesate elevate. NIR - Un’altra opzione

è rappresentata dall’infrarosso, tecnica di

misurazione indiretta che richiede frequenti

calibrazioni. Spesso questi apparecchi, a causa

della loro dipendenza dall’e� etto matrice, sono

impiegati come metodi secondari d’analisi.

Una nuova via Un metodo accurato, rapido e diretto è

quello che si va cercando da tempo nella

determinazione delle proteine. Qualcosa

che sia abbastanza semplice, da poter essere

utilizzato da chiunque, ma nel contempo

accurato e in grado di assicurare l’integrità del

prodotto analizzato. SPRINT™ Rapid Protein

Analyzer o� re tutto ciò — veloce, accurato,

estremamente facile da usare, operativo sia

nei reparto di produzione che in laboratorio

e che utilizza metodi approvati sia AOAC che

AACC. L’accuratezza di SPRINT è identica e a

volte per� no migliore del metodo Kjeldahl

con un tempo medio d’analisi di soli 2 minuti.

Il segreto di tutto ciò sta nel fatto che SPRINT

utilizza la tecnica conosciuta come “protein

La melamina è un composto organico utilizzato nell’industria plastica, nella produzione di fertilizzanti o come sostanza ignifuga, la cui ingestione causa gravi problemi renali.

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tagging”, già utilizzata da diversi anni nel campo

bio-scienti� co. È un metodo diretto che ignora

l’azoto non proteico, e rileva solamente le

proteine del campione.

Cos’è il Protein TaggingLe proteine sono delle catene peptidiche

costituite da sequenze di aminoacidi. Nelle

matrici alimentari, possiamo trovare � no a 20

di� erenti aminoacidi combinati in determinate

sequenze che danno origine a proteine con

funzioni speci� che. Per esempio l’α-Caseina

è una proteina composta da 201 amino acidi,

di cui 15 Arginine, 4 Histidine e 7 Lysine. La

particolarità di questi 3 amino sta nel fatto

che sono gli unici caratterizzati da un elevato

pKa, quindi facilmente isolabili in ambiente

fortemente acido. Questa caratteristica viene

sfruttata dal nuovo sistema CEM SPRINT

che grazie all’impiego di iTAG™, una miscela

acquosa con un gruppo acido, è in grado di

complessare i gruppi basici degli amino acidi.

La medesima soluzione ha un’altra preziosa

caratteristica: un esteso gruppo aromatico

in grado di assorbire la luce a un lunghezza

d’onda di 483 nm. La combinazione di queste

due strutture fa di iTAG™ un agente che si lega

stechiometricamente agli amino acidi basici

ed è facilmente rilevabile utilizzando con un

spettroscopio d’assorbimento. Essenzialmente,

un quantitativo noto di iTAG viene aggiunto

al campione di cui si vuole determinare le

proteine. Legandosi solo con gli amino acidi

basici, iTAG ignora di fatto le eventuali sorgenti

di azoto non proteico. Questa azione chimica

porta a una precipitazione della componente

proteica stessa. A questo punto la soluzione

iTAG debitamente � ltrata viene letta da un

detector e il risultato appare sul display della

macchina, e stampato (con la stampante

integrata nel sistema). Tutto ciò in soli 2-3

minuti.

Risultato indipendente dagli agenti adulteranti Kjeldahl e Dumas sono i metodi maggiormente

utilizzati dalle aziende alimentari. Entrambe le

tecniche come abbiamo visto misurano l’azoto

totale che viene poi convertito, tramite una

formula matematica, nel contenuto teorico

di proteine. Questo signi� ca che qualsiasi

sorgente di azoto, quindi anche gli adulteranti,

viene classi� cata come proteina.

Contaminare un alimento con agenti ricchi

di azoto o “proteine apparenti” (come la

Melamina) è abbastanza semplice, ma con

SPRINT è oggi possibile smascherarlo. La

soluzione iTAG grazie alla sua selettività

attaccherà solo Arginine, Histidine e Lysine,

mentre ignorerà eventuali agenti adulteranti.

Come funzionaIn un’apposito bicchiere viene aggiunto e

pesato circa 1 grammo di campione. Bicchiere

e � ltro vengono, quindi, inseriti nell’apposito

alloggiamento dello strumento. SPRINT

provvederà ad aggiungere la soluzione iTAG

nel bicchiere e a omogeneizzare il campione.

Le proteine combinate con iTAG formano

un complesso indissolubile. Un’aliquota di

soluzione iTAG viene aspirata attraverso il � ltro

in un colorimetro e analizzata. Il risultato viene

poi visualizzato sul display dello strumento.

Tutte le parti che vengono in contatto con

il campione sono usa e getta o in grado di

autopulirsi. La soluzione iTAG è completamente

atossica ed essendo costituita per il 98% da

acqua può essere facilmente smaltita.

Sample ID Kjeldahl Sprint

NFDM Powder 35.33 35.58

NIST Infant Formula 11.17 11.14

Milk, Chocolate 3.27 3.27

Milk 3.27 3.27

Sour Cream Regular 2.85 2.83

Sour Cream Light 5.71 5.7

Ice Cream, Vanilla 3.11 3.13

Ice Cream, Chocolate 3.46 3.41

Plain Yogurt 3.46 3.46

Cheese, Natural Cheddar 23.57 23.64

Cheese, Processed 10.53 10.59

Soy Milk 3.07 3.075

Soy Milk, Chocolate 2.08 2.12

High Fiber Beverage 9.91 9.92

Egg with Butter 10.52 10.57

Whole Egg 10.77 10.74

Franks, Turkey/Pork 9.13 9.2

Franks, Turkey 11.5 11.6

Bologna Chicken/Pork 11.33 11.39

Beer Malt 7.94 7.84

Pet Food, Canned, Moist 10.29 10.30

Kjeldahl Sprint

Glutine di grano

75 75

Glutine di grano con 5% di melamina

87 75