Comunicación intercelular durante el ciclo de desarrollo de

Myxococcus xanthus

Benoit DRIENCOURT Master Microbiología UGR Granada 2011-2012 Asignatura : Transducción de señales a través de la membrana célular de las bacterias

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ÍNDICE • Resumen 3 1. Señales en las bacterias 4 2. Mixobacterias y myxococcus 6 - Las mixobacterias - Historia - Filogenia - Morfología celular y estructuras - Apéndices extracelulares

3. Myxococcus xanthus 9

4. Movilidad por deslizamiento 10 5. Nutrición y metabolismo 13 6. Ciclo de desarrollo 14 - Cuerpos fructificantes - Regulación

• Conclusiones 16 • Bibliografía 17

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RESUMEN Myxococcus xanthus es un bacilo Gram-negativo, tiene apéndices que sirven para su movilidad y sus interacciones sociales. Estas interacciones sociales sirven durante tiempos de ayuno a construir estructuras de reproducción. En las estructuras llamadas ‘cuerpos fructificantes’ se encuentran esporas. Para formar los cuerpos fructificantes, las células de M. xanthus interactúan con señales químicos. También, las células de M. xanthus se mueven con diferentes mecanismos según la fase en el ciclo de desarrollo. Los mecanismos de movilidad y de comunicación son relacionados pero las células puedan moverse solas. Este trabajo presenta de manera sucinta los elementos claves de la vida social de Myxococcus xanthus.

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1. SEÑALES EN LAS BACTERIAS Las bacterias utilizan mecanismos de señal precisamente coordinados para asegurar una transmisión eficaz y precisa de los mensajes químicos dentro de la población. Durante la diferenciación bacteriana, esta señalización fue descrita como autocrina – todas las células emiten y reciben la misma señal. Sin embargo, en un reciente artículo en Genes and Development, Lopez et al. explican que la formación de biofilm por Bacillus subtilis implica una señalización paracrina. Precisamente, cuando la mayor parte de las células de la población produce un péptido prenilado, se encuentra que esta molécula activa la producción de una otra molécula señal – la surfactina – solamente en un pequeño subconjunto de células. Por lo tanto, un subconjunto de células incapaces de producir la surfactina contesta a la surfactina para producir el componente de la matriz extracelular del biofilm. En la señalización autocrina, las mismas células producen y responden a una señal aunque la señalización paracrina controla procesos eucariotas dependientes de la señalización célula-célula como la transmisión neuronal o la coagulación del sangre. La comunicación célula-célula en las bacterias fue pensada autocrina. Por ejemplo, el quorum sensing implica la detección de un umbral de concentración de una molécula señal por las bacterias que producen esta señal (Fig 1a). En el caso del quorum sensing en Vibrio, los auto-inductores AHL están detectados por proteínas citoplasmicas como LuxR, que activa la transcripción de los genes de quorum sensing por ligación de los inductores de las parejas. Aunque estas respuestas pueden producirse sobre largas distancias dentro de las poblaciones bacterianas, una señalización que necesita que las células estén adyacentes puede aparecer. Por ejemplo, durante la formación del cuerpo fructificante de Myxococcus xanthus, una proteína señal esta presentada en superficie y interactúa con el receptor de una célula adyacente para transmitir la señal. Las dos células exprimen la molécula señal y el receptor (Fig1b).

Fig 1

Al contrario de las células eucariotas, las poblaciones bacterianas se consideran en un tipo de células. Sin embargo, hay un numero creciente de pruebas que la bacterias tienen propiedades de organismos pluricelulares, por ejemplo, la estructuras miceliales de los Estreptomicetes o los cuerpos fructificantes de las mixobacterias.

Micelio de Estreptomices

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La comunicación célula-célula es central en varios procesos de desarrollo bacterianos. Esta señalización puede ser entre especies, dentro una especie o entre organismos próximos o viviendo en comunidades en las cuales la célula emisora de la señal estaría lejos de la célula receptora. Investigaciones suplementarias enseñaran sin duda como estos eventos de señalización llevan a alteraciones de la expresión del genoma y dan bacterias idénticas con propiedades fenotípicas y comunales individuales.

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2. MIXOBACTERIAS Y MIXOCOCCUS • LAS MIXOBACTERIAS Las mixobacterias son bacilos Gram-negativos, unicelulares, que se encuentran en suelos y medios ricos en materia orgánica en descomposición. Su distribución es prácticamente universal, en suelos de todo el mundo y bajo condiciones climáticas extremas. Las mixobacterias tienen tres características que las diferencian del resto de las bacterias Gram-negativas :

- Son capaces de hidrolizar una amplia variedad de macromoléculas insolubles como proteínas, almidones, quitina, celulosa, paredes celulares ; no solamente aisladas, sino también cuando forman parte de organismos vivos y muertos.

- Las células vegetativas se mueven por deslizamiento sobre la superficie de sustratos sólidos.

- El ciclo de vida es exclusivo, hay un ciclo de crecimiento vegetativo y otro de desarrollo. Depende de la cantidad de nutrientes, de la concentración en productos tóxicos o de la densidad celular. Esta característica es única entre los procariotas.

• HISTORIA Heinrich Freidrich Link, botánico alemán, fue el primero describiendo los cuerpos fructificantes de algunas mixobacterias, confundiéndolas con hongos en 1809. En 1892, el botánico estadounidense Roland Thaxter reconoció S. aurantiaca como una mixobacteria, y describió el ciclo de vida de las mixobacterias en unas publicaciones. En los 50, Myxococcus xanthus era la especie preferida y se conseguían cultivos puros de estas bacterias. Dworkin fue el primero en conseguir cultivos dispersos con M. xanthus en 1962 ; y con Gibson en 1964, encontraron que las células vegetativas podían convertirse en mixósporas. En los 70, Kaiser desarrolló métodos de análisis genéticos. Muños-Dorado et al. (1991) describió por primera vez una proteína quinasa con capacidad de autofosforilarse en serina y tronina, típica de las quinasas eucariotas.

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• FILOGENIA Clasificación científica :

Dominio : Bacteria Filo : Proteobacteria Clase : Proteobacteria delta Orden : Myxococcales Familia : Myxoccaceae Género : Myxococcus Especie : M. xanthus

• MORFOLOGÍA CÉLULAR Y ESTRUCTURAS Bacilos unicelulares (3-12 µm de longitud y 0,7-1,2 µm de diámetro) que se multiplican por fisión binaria transversal. Las células se encuentran en un mucílago constituyendo una colonia plana característica que recibe el nombre de « enjambre ». La matriz extracelular de M. xanthus está compuesta por un polisacárido neutro, carente de ácidos urónicos, que aparecen normalmente en los exopolisacáridos de otras bacterias, y representa del 5 al 10% del peso seco total de la colonia (Sutherland & Thomson, 1975). A este mucílago se le han atribuido varias funciones : adhesión célula-célula, adhesión a sustratos sólidos, protección frente a toxinas y bacteriófagos, movimiento por deslizamiento. La estructura de las células vegetativas de las mixobacterias es similar a las de otras bacterias Gram-negativas : membrana externa, peptidoglucano y membrana plasmática, que envuelven al protoplasto. Las mixobacterias presentan un tamaño de cromosoma de los más grandes de los existentes en bacterias. En M. xanthus se ha demostrado que el genoma posee un tamaño de 9,5 Mpb, pero sólo una pequeña porción está destinado al proceso de desarrollo – un 0,3-0,6% resulta esencial para estos eventos. El ADN de M. xanthus se metila en sitios específicos durante los procesos de desarrollo y en fases tardías del crecimiento vegetativo. • APÉNDICES EXTRACÉLULARES Las mixobacterias presentan dos tipos de apéndices extracelulares, pili y fibrillas, unidos a su superficie externa. Ambas estructuras están implicadas en interacciones célula-célula.

- Pili de tipo IV (T4P = type four pili) : de 3 a 10 µm de longitud y unos 10 nm de diámetro. Forman un penacho de dos a ocho filamentos en uno de los polos. Papel importante en la adhesión de las células en la comunidad, así como en el movimiento social. - Fibrillas : de más de 50 µm de longitud por 15-30 nm de diámetro. Distribuidas alrededor de la célula – disposición peritrica. Estas fibrillas conectan unas células con otras y representan las fuerzas cohesivas que mantienen a las células unidas en el enjambre. Papel critico en la agregación y la formación de cuerpos fructificantes.

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Fibrillas de M. xanthus

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3. MYXOCOCCUS XANTHUS

La vida social de M. xanthus depende del movimiento activo de las células. Las células de M. xanthus se mueven por deslizamiento, es el movimiento de los bacilos en el sentido de la longitud sobre una superficie y sin flagelo. Sobre una superficie solida y en alta densidad celular, las células de M. xanthus se auto-organizan en tres estructuras distintas : colonias en expansión, cretas y cuerpos fructificantes. La estructura dominante depende del estatus nutricional de las células. En presencia de nutrimentos, la células forman colonias en expansión. En ausencia de nutrimentos, las células inician un desarrollo que se acaba con la producción de cuerpos fructificantes llenos de esporas.

El ciclo de desarrollo de M. xanthus

La formación del cuerpo fructificante se desarrolla en fases morfológicas distintas,

separadas en el tiempo y en el espacio. Después de 4 a 6 horas de ayuno aparecen los primeros signos de la formación de un cuerpo fructificante. Las células agregan, los centros crecen y forman cúpulas. A 24 horas, el proceso de agregación está acabado y cada cuerpo fructificante naciente contiene aproximadamente 105 células. En cada cuerpo fructificante las células pasan por una diferenciación morfológica y fisiológica en mixosporas esféricas, los cuerpos fructificantes son maduros. Sólo 10% de las células de la población se diferencian en esporas, las que están en los cuerpos fructificantes. Hasta 30% de las células se quedan fuera y se diferencian en bacilos esféricos. Las otras células mueren por lisis.

Bajo condiciones de ayuno menos drásticas o con presencia de presas, las células de M. xanthus se arreglan en una tercera estructura llamada ondas. Durante la ondulación, las células agregan en crestas espaciadas por valles menos densas en células. Las estructuras en crestas se mueven por deslizamiento de manera coordinada y síncrona en ondas sobre la superficie. La ondulación se inicia típicamente antes la agregación, las crestas desaparecen con la génesis de los cuerpos fructificantes.

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4. MOVILIDAD POR DESLIZAMIENTO

Placa de Mycococcus xanthus

La movilidad de las células es esencial para la mayoría – sino todas – las actividades

sociales de M. xanthus. Las células se mueven por deslizamiento utilizando dos sistemas llamados sistema de movilidad A (aventurero) y sistema de movilidad S (social). Los dos sistemas son independientes para generar una fuerza motriz en la misma dirección y demostrar una ventaja selectivo sobre diferentes superficies ; por lo tanto, las actividades son coordinadas. La movilidad S es generalmente operativa sólo cuando las células están juntas, mientras que la movilidad A es operativa en las células solas o en grupos. De vez en cuando, las células cambian de trayectoria, el antiguo polo líder se vuelve el nuevo polo posterior.

Movimiento de M. xanthus en 3 horas

• SISTEMA S La máquina molecular del T4P da la fuerza para la movilidad S. Los T4P son estructuras localizadas en los polos y solo presentes en el polo anterior de las células. La generación de fuerza por los T4P implica 3 etapas : extensión del T4P desde el polo anterior de la célula, fijación sobre la superficie, retracción. La fuerza permite a la célula avanzar.

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Máquina del T4P

Además del T4P, la movilidad S depeende del lipopolisacarido O-antigenio y matriz

extracelular (ECM). Ignoramos como el lipopolisacarido afecta la movilidad del T4P. La relación entre la ECM y la movilidad dependiente de los T4P fue establecida con la observación que los polisacaridos de la ECM activa la retracción de los T4P. Este explica le dependencia con el contacto célula-célula.

Movilidad de tipo S en M. xanthus

• SISTEMA A Se ignora actualmente como el sistema de movilidad A genera una fuerza mecánica. Sin embargo, dos modelos existen. Las células de M. xanthus se mueven con el sistema de movilidad A y dejan una huella de mucus. La movilidad A dependería de las secreciones y la hidratación de un gel polielectrólito de las estructuras en tobera de la membrana externa. En M. xanthus, estas estructuras se encuentran a los dos polos ; pero pensamos que la secreción aparece sólo al polo posterior de la célula. Un descubrimiento soporta este modelo enseñando los varios genes necesarios a la movilidad A codeando proteínas de la síntesis y la exportación de polímeros. Además, la proteína reguladora de respuesta RomR, necesaria para la movilidad A se encuentra en una estructura bipolar y asimétrica en el polo posterior. Su función en la movilidad A es ignorada ahora ; sin embargo, la localización de RomR sugiere que la máquina de la movilidad A es en el polo posterior de la célula.

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Huellas de mucus de M. xanthus

En el segundo modelo para la movilidad A, la producción de fuerza depende de los complejos de adherencia multifocal distribuidos en la longitud de la célula. Estos complejos son definidos por la proteína AglZ necesaria para la movilidad A. Asociando una AglZ con una proteína amarilla fluorescente (YFP), se observa que AglZ-YFP forma puntos en la longitud de la célula. Esos puntos se quedan fijos sobre el sustrato durante el movimiento de la célula. Se necesitaría una estructura citoesqueleto para sostener el complejo. Una otra investigación sugiere AglZ fuera la máquina y mas como un regulador negativo del sistema quemo-sensor Frz que regula la frecuencia de inversión celular.

La máquina de la movilidad A en M. xanthus

A lo largo de los años, un gran nombre de mutantes para la movilidad A fue aislado.

Sólo un pequeño nombre fue analizado a la escala molecular y celular. Futuras análisis en combinación con la identificación de los genes codeando las proteínas en las estructuras en tobera y en los complejos de adhesión focal ayudaron para resolver los mecanismos de la movilidad A.

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5. NUTRICION Y METABOLISMO Las mixobacterias son saprofitos y depredadores de otros microrganismos. ¿Cómo cazan las mixobacterias? Varias prácticas en laboratorio enseñan colonias de M. xanthus pueden atraer células de E. coli con un mecanismo desconocido y después, lisar esta células. Al contrario, el carbono de las células viviente de E. coli en el suelo seria recuperado por bacterias rastreras ; sugiriendo que las mixobacterias utilizan también la movilidad celular para cazar sus presas. Una vez atrapada, la presa esta matada y los polímeros degradados. No sabemos mucho a propósito de estos procesos ; sin embargo, pensamos que la célula esta matada con enzimas hidroliticas secretadas y de metabolitos segundarios con actividad antimicrobiana, mientras que la degradación de los polímeros dependería sólo de enzimas hidroliticas secretadas. Además, la función y la importancia de la variedad de enzimas secretadas por la depredación son desconocidas. Pensamos que la degradación de polímeros es un proceso cooperativo. Así, si la caseína es la sola fuente de carbono, las células de M. xanthus no enseñan un crecimiento significativo que desde una cierta densidad celular y el índice de crecimiento aumenta con la densidad celular. Además, el crecimiento cooperativo está relacionado con los aumentos de la actividad de la proteasa extracelular y con la concentración en caseína hidrolisada en el medio, sugiriendo una hidrolisis cooperativa de la caseína. También, si la caseína esta sustituida por caseína hidrolisada, el crecimiento de M. xanthus es independiente de la densidad celular.

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6. CICLO DE DESAROLLO

Cuerpos fructificantes de M. xanthus

La formación de cuerpos fructificantes depende mucho de la comunicación celular

entre las células de M. xanthus. 5 señales intercelulares fueron definidos genéticamente. Sin embargo sólo dos de estas señales, las señales A y C fueron caracterizadas bioquímicamente y funcionalmente. Estas dos señales tienen funciones diferentes. El sistema de señalización A asegura que la formación del cuerpo fructificante no se inicia antes que un número suficiente de células están en ayuno. El sistema de señalización C asegura un orden temporal correcto por el deslizamiento, la aglomeración y la esporulación. La señal C informa las células a propósito de la posición y permite un buen acoplamiento espacial de las células en la agregación en cuerpos fructificantes y en la esporulación de las células acumuladas en los cuerpos fructificantes.

Maduración de mixósporas

La señal A vuelve importante en el desarrollo después de dos horas de ayuno. La señal A consiste en 2 partes : una parte estable con el calor y una parte inestable con el calor. La parte estable es una mezcla de aminoácidos y de péptidos. La parte inestable consiste al menos en dos proteasas. Según el modelo actual para el mecanismo de la señal A, las células secretan una mezcla de proteasas durante las primeras fases del ayuno, las proteasas digieren las proteínas de superficie, causando la liberación de péptidos y aminoácidos con una actividad señal A. Si un umbral de concentración en señal A está alcanzado, la señal A se nota y la expresión de los genes dependientes del sistema A empieza, resultando una progresión en el programa de desarrollo. El sistema de señalización A no es un análogo funcional de los sistemas de quorum sensing con homoserina lactone de las bacterias Gramo negativo, porque a bajas concentraciones, la señal A apoya el desarrollo y a altas concentraciones el crecimiento celular. Seis mutantes (asgA a asgE y sigD) que no producen la señal A fueron aislados. Pensamos que las proteínas correspondientes son los compuestos de vías de señalización importantes en síntesis de la señal A. Notablemente, ningún de los seis genes codean

A B CA B C

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proteasas, las proteasas de la señal A quedan desconocidas. Varias mutaciones fueron identificadas, causando un desvío del encargo en señal A por los genes cuyos la expresión depende de la señal A. Sin embargo, queda a identificar un receptor para esta señal. Recientes datos sugieren también una conexión entre los genes asg – pero no la señal A – y la depredación, es decir que varios mutantes asg tienen una eficacia de depredación reducidos, y en presencia de presas, la señal A esta facultativa en la formación del cuerpo fructificante, pero no en la esporulación. La señal C vuelve importante en la formación del cuerpo fructificante después de seis horas de ayuno y es totalmente requerida para la ondulación, la agregación y la esporulación. La señal C actúa de una manera umbral-dependiente para inducir estos mecanismos, es decir que la ondulación es inducida a bajo umbral, la agregación a medio umbral y la esporulación a alto umbral. La señal C es una proteína de 17 kDa y su síntesis depende del gen csgA. csgA codea una proteína de 25 kDa que se cliva de manera proteolitica para dar p17. Durante el clivaje proteolítico de p25, 8 kDa son quitados de la extremidad N-ter y p17 corresponde al C-ter de p25. LA localización sub-celular de p25 y p17 es controvertida. Células salvajes marcadas con anticuerpos contra un péptido correspondiente a p17, seguido por un anticuerpo con una cola dorada son analizados por microscopia electrónica enseña partículas de oro asociadas con la ECM y el citoplasma, mientras que los p17 y p25 fueron detectados en la membrana externa de un mutante deficiente en biosíntesis de ECM. Al final, estas observaciones sugieren que p17 y p25 son ancladas en la membrana externa.

p25 se acumula en las células vegetativas ; sin embargo, es solamente clivado para generar p17 durante el ayuno. En los 2000, el mecanismo de regulación del clivaje de p25 durante el ayuno fue descubierto. Como p25 y p17 están ancladas en la membrana externa y como la proteólisis esta bloqueada por los inhibidores de proteasa a serina, emitimos la hipótesis que la proteasa responsable del clivaje es una proteasa a serina secretada. Una análisis enseña la protease subtilisin-like PopC como la proteasa que cliva directamente p25. El mecanismo subyacente la proteólisis regulada de p25 es basada sobre la secreción regulada de PopC. PopC acumula en el citoplasma de las células vegetativas y es solamente secretada durante el ayuno de las células. Además, a pesar de que PopC y p25 acumulan en las células vegetativas, sólo están presentes en el mismo compartimento en las células jóvenes, así restringiendo el clivaje de p25 en las células jóvenes. Una vez secretada, PopC es rápidamente degradada y acta sólo en cis. La degradación rápida, combinada con la lenta secreción de PopC, asegura la lenta acumulación de p17 en la superficie de las células, necesaria para un bien funcionamiento de la señal C como minutero de desarrollo y de morfogénesis. Ninguna de PopC o p25 no tiene péptido señal y no se sabe como son secretadas.

p17 es anclada en la membrana externa y por consiguiente no es difusible. Además, la transmisión de la señal C necesita una movilidad activa y un buen alineamiento de las células. Desde estas observaciones, se sugiere que la transmisión de la señal C depende de las interacciones entre p17 y el receptor a p17 de una célula adyacente. Este receptor queda desconocido. La transmisión de la señal C se añade a la lista de las actividades de M. xanthus que son dependientes del contacto célula-célula.

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CONCLUSIONES Mixococcus xanthus encarna el modelo de la bacteria social. Con un ciclo de desarrollo único, M. xanthus es a la vanguardia de la tecnología bacteriana. Enseñar una vida multicelular bacteriana antes de las eucariotas pruebe que hoy, estos organismos están lejos en la evolución delante de nosotros.

Comportamientos multicelulares de M. xanthus

Además, su vida social enseña como se construyen las grandes estructuras orgánicas, estas estructuras multicelulares que hoy permiten al ser humano conquistar el espacio. Sabemos que las estructuras multicelulares son una ventaja frente a la vida. Y este se ve cuando vemos M. xanthus dar mixosporas en gran cantidad, que pueden sobrevivir a catástrofes mayores. Además, M. xanthus enseña una evolución cuando caza otros micro-organismos, sus apéndices son sus armas.

A : M. xanthus salvaje ;B : M. xanthus mutante frz

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BIBLIOGRAFÍA From individual cell motility to collective behaviors: insights from a prokaryote, Myxococcusxanthus. Zhang Y, Ducret A, Shaevitz J, Mignot T FEMS Microbiol Rev. 2012 Jan;36(1):149-64. doi: 10.1111/j.1574-6976.2011.00307.x. Epub 2011 Oct 3. CorE from Myxococcus xanthus is a copper-dependent RNA polymerase sigma factor. Gómez-Santos N, Pérez J, Sánchez-Sutil MC, Moraleda-Muñoz A, Muñoz-Dorado J. PLoS Genet. 2011 Jun;7(6):e1002106. Epub 2011 Jun 2. Microbial interactions: bacteria talk to (some of) their neighbors. Shah IM, Dworkin J. Curr Biol. 2009 Aug 25;19(16):R689-91. Sociobiology of the myxobacteria. Velicer GJ, Vos M. Annu Rev Microbiol. 2009;63:599-623. Extracellular biology of Myxococcus xanthus. Konovalova A, Petters T, Søgaard-Andersen L. FEMS Microbiol Rev. 2010 Mar;34(2):89-106. Epub 2009 Oct 20. Eukaryotic-like protein kinases in the prokaryotes and the myxobacterial kinome. Pérez J, Castañeda-García A, Jenke-Kodama H, Müller R, Muñoz-Dorado J. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Oct 14;105(41):15950-5. Epub 2008 Oct 3. Myxococcus-from single-cell polarity to complex multicellular patterns. Kaiser D. Annu Rev Genet. 2008;42:109-30. Social interactions in myxobacterial swarming. Wu Y, Jiang Y, Kaiser D, Alber M. PLoS Comput Biol. 2007 Dec;3(12):e253. Epub 2007 Nov 13.