1

Kandidaatintutkielma

Kipu ja endokannabinoidijärjestelmä

Riikka Huttunen

Oulun yliopisto

Biokemian ja molekyylilääketieteen tiedekunta

2016

2

Sisällysluettelo

Käytetyt lyhenteet

Sisällys

I KIRJALLISUUSTUTKIELMA

Lyhenteet .............................................................................................................................................. 3

1. Kipu .................................................................................................................................................. 4

2. Kannabinoidijärjestelmä .................................................................................................................. 6

3. Toiminta ........................................................................................................................................... 9

3.1 Kannabinoidireseptorien rakenne .............................................................................. 10

3.2 Ligandien rakenne ja toiminta ................................................................................... 14

3.3 Signaalikaskaadi ........................................................................................................ 17

4. Lääkekäyttö .................................................................................................................................... 21

Lähteet ................................................................................................................................................ 25

II liite: TIEDETTÄ POPULARISOIVA ESITYS

Otsikko: Kipu ja endokannabinoidijärjestelmä

Toteutus: Posteri

3

Lyhenteet

AEA N-arakinodyylietanoliamiini, Anandamidi

2-AG 2-arakidonyyliglyseroli

CB1 Kannabinoidireseptori 1

CB2 Kannabinoidireseptori 2

ATP Adenosiinitrifosfaatti

FAAH Rasvahappoamidihydrolaasi

MAGL Monoasyyliglyserolilipaasi

THC Δ9-tetrahydrokannabinoli

GABA Gamma-aminovoihappo

4

1. Kipu

Kipu on subjektiivinen kokemus, joka mielletään epämiellyttävänä tunteeksi, mutta on hengissä

säilymisen kannalta välttämätön aistimus. Kipusignaali muuttuu tuntemukseksi vasta aivoissa, mikä

tarkoittaa, ettei kipuhermojen aktivoitumisesta välttämättä seuraa subjektiivista kiputuntemusta. Kipu

muodostuu muistakin ulottuvuuksista kuin hermojen fysiologisesta stimuloinnista. Kipu voi olla

luonteeltaan akuuttia, jolloin se toimii biologisena varoitussignaalina.

Hermosolujen impulssia pystytään mittamaan, mutta tämä on huono mittari subjektiiviselle

kipukokemukselle. Tyypillisesti kipua kartoittaessa yritetään arvioida kivun tiheyttä ja voimakkuutta

sanallisesti tai numeerisella asteikolla.

Yhdysvalloissa kartoitettiin lähes 9000 yksilöä tutkittaessa kiputilojen yleisyyttä ja voimakkuutta.

Tutkimukseen osallistuneita pyydettiin arvioimaan viimeisen kolmen kuukauden aikana kokemiensa

kiputilojen yleisyyttä ja intensiteettiä. Yli puolet, 55,7 %, raportoi tunteneensa jonkinlaista kipua

viimeisen kolmen kuukauden aikana. Näistä suurin osa, 23,9 %, oli lievää kipua satunnaisina päivinä.

Kroonisesta jokapäiväisestä kivusta kärsi 11,2 % vastaajista, joista 4,6 % luonnehti kipuaan todella

intensiiviseksi. (Nahin 2015) Krooninen kipu heikentää elämänlaatua merkittävästi. Se on yhdistetty

masennukseen, ahdistuneisuuteen sekä heikentyneisiin kognitiivisiin toimintoihin (Bushnell et al.

2015). Pitkäaikaisesta kivusta kärsivillä potilailla on myös vähemmän harmaata ainetta aivoissa

verrattuna terveisiin yksilöihin. Nämä muutokset pystyttiin osoittamaan johtuvan nimenomaan

kivusta, sillä aivojen muutokset korjaantuivat, mikäli kroonisen kivun määrä väheni. (Davis &

Moayedi 2013)

Kipua välittäviä hermoja kutsutaan nosiseptoreiksi. Nosiseptoreita löytyy laajalti ihosta, luista,

lihaksista, useimmista sisäelimistä sekä verisuonista ja sydämestä. Ainoa poikkeus on aivot, joissa

nosiseptoreita ei ole ollenkaan. (Bear et al. 2007)

Kipua ja kosketusta välittävät eri hermot, jotka poikkeavat toisistaan niin rakenteellisesti

läpimitaltaan, terminoitumispisteissään että hermostolliselta reitiltään. Kosketusta välittävissä

hermoissa, pääasiassa Aβ-tyypin, hermopäätteissä on erikoistuneet rakenteet kun taas kipua

välittävissä hermoissa hermopäätteet ovat vapaat. Aα ja Aβ-hermojen läpimitta on myös paksumpi

verrattuna Aδ ja C-hermoihin. Aβ-hermot terminoituvat selkäytimen takajuureen, kun Aδ- ja C-

hermot jatkavat Lissauerin alueen läpi päättyen substantia gelatinosaan. (Bear et al. 2007)

Selkäytimen harmaa aine voidaan jaotella edelleen laminoihin I-X. Aδ-hermot terminoituvat

kerroksiin I, II ja V, ja C-hermot pääasiassa I ja II-kerroksiin, mutta viskeraalisissa C-hermoissa

terminoitumispaikka voi olla myös kerroksissa V ja X (Kandel et al. 2013).

5

Kipusignaali kulkee somatosensoriselle korteksille spinotalamista reittiä pitkin. Huomionarvoista on

myös, että kosketussignaali kulkee kehossa ipsilateraalisesti, samanpuoleisesti, mutta kipusignaalit

kontralateraalisesti. Kipuaistimus siirtyy selkäytimen kautta haaroittumatta välissä talamukselle ja

siitä eteenpäin somatosensoriselle korteksille, jossa signaali tulkitaan kivuksi. (Bear et al. 2007)

Nosiseptisen vasteen aikaansaaminen vaatii muutosta lämpötilassa, paineessa, hapenpuutteessa tai

kemiallisessa ärsytyksessä. Vaikka useat nosiseptorit ovat polymodaalisia kipupäätteitä, jolloin ne

voivat depolarisoitua mistä tahansa edellämainituista ärsykkeistä, osa hermoista on erikoistunut

tietyntyyppisiin ärsykkeisiin selektiivisesti. (Bear et al. 2007)

Selektiivisiin nosiseptoreihin kuuluu lämpö-, kemialliset ja mekaaniset nosiseptorit.

Lämpönosiseptorit ovat erikoistuneet kylmän ja kuuman aistimiseen. Kemialliset nosiseptorit

reagoivat erilaisiin kemiallisiin ärsykkeisiin kuten mastosolujen vapauttamaan histamiiniin ja

mekaaniset nosiseptorit ovat erikoistuneet paineen muutoksiin. Erityisesti C-hermot ovat selektiivisiä

histamiinille. (Bear et al. 2007)

Fyysisen vaurion sattuessa rikkoutuneista hermosoluista vapautuu soluvälitilaan K+-ioneja, ATP:tä

ja proteaaseja. Solun ulkopuolisen kaliumkonsentraation muutos saa aikaan depolarisaation

ympäröivissä hermosoluissa. ATP edesauttaa aktiopotentiaalien syntyä kiinnittymällä ATP-

kytkettyihin ionikanaviin, joka muuttaa hermosolujen membraanipotentiaaleja. Soluista vapautuvat

proteaasit hajottavat soluvälitilassa olevaa kininogeenia bradykiniiniksi, joka herkistää vaurioalueella

olevia nosiseptoreita depolarisoitumaan herkemmin. Nosiseptorien herkkyyteen vaikuttavat myös

solukalvon lipideistä entsymaattisesti hajotetut prostaglandiinit. Hermopäätteiden granuloihin on

varastoitu substance P –peptidiä, joka vapautuu soluvälitilaan mikäli hermosolu saa jatkuvaa

aktiopotentiaalia. Substance P:tä vapautetaan myös nosiseptoreiden vapaista hermopäätteistä siinäkin

tapauksessa että vaurio tapahtuu jossain muualla kuin kohdealueella. Substance P:n vapautuminen

stimuloi verisuonten laajentumista sekä saa mastosolut vapauttamaan histamiinia soluvälitilaan, mikä

aiheuttaa turvotuksen vaurioalueella. (Bear et al. 2007)

Tässä tutkielmassa keskitytään nosiseptisen kivun mekanismeihin.

6

2. Kannabinoidijärjestelmä

Endokannabinoidijärjestelmä on lipidiperusteinen välittäjäainejärjestelmä, jolla on moninaisia

vaikutuksia kipuun (Fine & Rosenfeld 2013), syömiseen ja energia-aineenvaihduntaan (Di Marzo &

Matias 2005), tunnetiloihin ja psykiatrisiin ongelmiin (Ashton & Moore 2011) sekä muistojen

modulointiin (Morena & Campologno 2014) ja jopa uni-valverytmiin (Prospéro-García et al. 2016).

Kannabinoidijärjestelmällä on myös yhteyksiä endorfiinijärjestelmään sekä välittäjäaine GABA:n

(Gamma-aminovoihappo) ja glutamaatin sekä dopamiinin (Oleson & Cheer 2012) vapautumiseen

hermosoluista.

Kannabinoidijärjestelmään kuuluvat kannabinoidireseptorit CB1 ja CB2 ja niiden ligandit

anandamidi ja 2-arakidonyyliglyseroli (2-AG) (Kuva 1), sekä ligandien metaboliasta vastaavat

entsyymit. Kannabinoidiligandit voivat kuitenkin aktivoida myös muita reseptoreja lueteltujen CB1-

ja CB2-reseptoreiden lisäksi. Näihin reseptoreihin kuuluvat TRPV1 ja GPR18 ja GPR55.

Kuva 1. Anandamidin ja 2-AG:n rakennekaavat. Vasemmalla on anandamidi ja oikealla 2-AG.

TRPV1-reseptori (Transient Receptor Potential Vanilloid-1) kuuluu TRP-ionikanavaperheeseen, ja

sen pääligandi on chilien poltteen tuova kapsaisiini. Anandamidi pystyy kiinnittymään TRPV1-

reseptoreihin ja inhiboimaan hermosolujen depolarisaatioherkkyyttä. TRPV1- ja CB1-reseptorin

välillä on todettu myös proteiini-proteiini–interaktioita hiiren sarveiskalvon epiteelisoluissa. (Yang

et al. 2013)

GPR55-reseptori luokiteltiin alunperin orvoksi G-proteiinikytketyksi reseptoriksi, kunnes Ryberg

ryhmineen osoitti että GPR55 kykenee sitomaan anandamidia, Δ9-THC:ta, kannabinolia,

kannabidiolia sekä synteettisiä kannabinodireseptorien agonisteja. Anandamidi ja synteettinen

kannabininoidiagonisti O1602 saivat soluissa aikaan ekspressiosignaalin, mutta samaa vastetta ei

7

saatu toisella yleisesti käytetyllä reseptoriagonistilla WIN55,212-2:lla. Vaikka kannabidiolilla on

alhainen affiniteetti CB1- ja CB2-reseptoreihin, toimii se GPR55-reseptoreissa antagonistina.

(Ryberg et al. 2007)

GPR18-reseptori kuuluu lipidireseptoreihin, jotka sitovat ligandinaan ensisijaisesti N-

arakidonyyliglysiiniä, mutta myös epätyypillistä kannabidiolia ja THC:tä. GPR18-reseptoreja on

lokalisoitunut ainakin sarveiskalvon ja silmän sädekehän epiteelisoluissa hiirillä, ja reseptorien

aktivointi laskee silmän intraokuraalista painetta. Koska N-arakidonyyliglysiini on anandamidin

aineenvaihdunnan tuote ja CB1-reseptoreja on lokalisoitunut samoihin kudoksiin, GPR18-reseptorin

ja kannabinoidijärjestelmän välillä voi olla yhteys. Caldwell kumppaneineen kuitenkin huomautti,

että vaikka anandamidin määrä silmän etuosassa onkin huomattava, anandamidi voidaan metaboloida

entsymaattisesti nopeammin kuin mitä se pystyisi sitoutumaan CB1-reseptoreihin. (Caldwell et al.

2013)

Endokannabinoidijärjestelmä on pitkälti konservoitunut eläinkunnassa. Kirjallisuudessa on useita

esimerkkejä in vivo -kokeista, joissa on käytetty mallieläiminä koiria, reesusapinoita sekä hiiriä.

(Beardsley et al. 1987) Jopa yksinkertaisesta Hydrasta (Cnidaria) on tunnistettu

kannabinoidireseptoreita sekä anandamidia ja anandimidin hajotukseen osallistuvia entsyymejä,

joiden arvellaan vaikuttavan syöntivasteeseen. (De Petrocellis et al. 1999)

CB1-reseptori karakterisoitiin alunperin rotan aivoista selektiivisellä agonistilla CP-55,940. Tällöin

huomattiin myös kannabinoidireseptorin aktivoimisen inhiboivan adenylaattisyklaasia. (Devane et al.

1988) Reseptori kloonattiin ja ekspressoitiin onnistuneesti vuonna 1990 (Matsuda et al. 1990).

Munro kumppaneineen raportoi vuonna 1993 kannabinoidireseptorista, jota ei ekspressoitu aivoissa

vaan haiman makrofageissa. Tämä reseptori kykeni sitomaan anandamidin lisäksi kannabinolia,

vaikka sen transmembraanialue poikkesi CB1-reseptorin vastaavasta 68:lla aminohapolla. Munro

ryhmineen ehdotti tämän perusteella että aivojen kannabinoidireseptorista käytettäisiin nimeä CB1,

jolloin uusi reseptori sai nimen CB2. (Munro et al. 1993)

Ensimmäinen endokannabinoidi eristettiin sian aivoista. Eristetylle arakidonihapon etanoliamiinille

annettiin nimeksi anandamidi sanskriitin ”ananda” –sanaa (”autuus”) mukaillen (Devane et al. 1992).

2-AG:ta ehdotettiin toiseksi endokannabinoidiksi, kun sen huomattiin aktivoivan samoja CB1-

reseptoreja kuin anandamidi. Tutkimuksissa huomattiin myös, että 2-AG:ta tuotetaan ja vapautetaan

hermosolujen synapseissa solunsisäisen kalsiumkonsentraation noustessa, mutta sen synteesireitti

poikkeaa anandamidista ja sen affiniteetti CB1-reseptoriin on heikompi kuin anandamidilla. (Stella

et al. 1997, Sugiura et al. 1995)

8

CB1-reseptorit ovat jakautuneet kehoon laajasti, joskin niiden pääasiallinen sijainti on

keskushermostossa (Herkenham et al. 1991). CB1- reseptoreita esiintyy myös vähäisemmässä määrin

sydämessä, keuhkoissa, luuytimessä, kateenkorvassa, nielurisoissa, lisämunuaisissa sekä naisilla

kohdussa ja munasarjoissa sekä miehillä kiveksissä ja eturauhasessa (Galiegue et al. 1995). CB2-

reseptoreita on pääasiassa immuunipuolustustuksesta vastaavissa kudoksissa haimassa, nielurisoissa

ja kateenkorvassa. Rotilla kannabinoidireseptoreja on löytynyt myös aivokuorelta, käpyrauhasesta,

tyvitumakkeesta, hippokampuksesta ja pikkuaivoista (Harkenheim et al. 1991).

Kannabinoidireseptorien jakautuminen vaikuttaisi ohjaavan reseptoreiden välillä vallitsevaa

hienoista erikoistumista. CB2-reseptoreja esiintyy suuremmissa määrin immuunipuolustuksesta

vastaavissa soluissa. Näiden reseptorien aktivointi onkin yhteydessä tulehdusvasteiden säätelyssä

toisin kuin CB1-reseptorien, jotka vaikuttavat aivoissa fysiologisiin vasteisiin. Endokannabinoidien

eritystä on tutkittu aivojen makrofageilla, mikroglioilla. Mikrogliat ekspressoivat

endokannabinoideja läheisten hermosolujen vaurioiden yhteydessä. Mikrogliat alkoivat myös

jakaantua, mikäli 2-AG:n konsentraatiota nostettiin kasvatusmediassa. (Carrier et al. 2004)

Kannabinoidien ekspressio hermosolujen vaurion yhteydessä viittaa niiden hermosoluja suojelevaan

rooliin. Toisaalta mikrogliojen korkea määrä on tyypillistä Alzheimer- ja Parkinson-potilailla, joten

näitä neurodegeneroivia sairauksia pystytään tulevaisuudessa ymmärtämään paremmin

kannabinoidijärjestelmän tuntemuksen kautta.

Ihmiset ovat käyttäneet Cannabis Sativa –kasvin lehtiä ja kukintoja vuosituhansia kivunlievitykseen,

ruokahalun parantamiseen, sekä myös päihtymiseen. Terapeuttisten ainesosien eristäminen ja

lääkekehitys on olleet vauhdittamassa endokannabinoidijärjestelmän tutkimusta. Tällä hetkellä THC

ja kannabidioli CBD ovat potentiaalisimmat ainesosat lääkekehitystä varten. Vuonna 2012 Saksassa

oli lisensoitu yksi lääke MS-taudin hoitoon, joka sisälsi 1:1–suhteessa THC:tä ja CBD:tä tuotenimellä

Nabiximols. (Grotenhermen et al. 2012) Yhdysvalloissa lääkekannabis on tällä hetkellä laillistettu

28:ssa osavaltiossa.

9

3. Toiminta

Kannabinoidijärjestelmä säätelee elimistön fysiologisia toimintoja laajasti keskushermostossa ja

immuunijärjestelmässä. Tämän kokonaisuuden muodostavat kannabinoidireseptorit, niiden ligandit

ja näiden reseptorien stimuloinnin seurauksena aktivoituvat signalointireitit, jotka määrittävät solun

käyttäytymistä.

Endokannabinoidit stimuloivat CB1- ja CB2-reseptoreita. CB1-reseptorin kiderakenne selvitettiin

vastikään. Vaikka kannabinoidireseptori kuuluukin G-proteiinikytkentäisiin reseptoreihin, sen

rakenne on uniikki jopa valtavan proteiiniperheen keskellä. Rakenteen selvittäminen tarjoaa aivan

uudenlaista tietoa endo- ja eksogeenisten kannabinoidien fyysisestä sitoutumismekanismeista.

Endogeeniset kannabinoidiligandit anandamidi ja 2-AG syntetisoidaan solukalvojen fosfolipideistä

entsyymaattisesti, ja lipofiilisinä molekyyleinä ne diffuntoituvat solukalvon läpi ekstrasellulaariseen

tilaan. Reseptorin aktivoituaan anandamidi kuljetetaan takaisin sytosoliin hajotettavaksi. On vielä

toistaiseksi epäselvää, onko 2-AG:lla samanlaista kuljetusmekanismia.

Kannabinoidijärjestelmän medioima viestinvälitys tapahtuu retrogradisesti, jolloin vapautetut

kannabinoidit kiinnittyvät presynaptisen hermon kannabinoidireseptoreihin ja vaimentavat näin

hermosolujen toimintaa laskemalla neuraalista oskillaatiota ja vähentämällä siten vapautettujen

välittäjäaineiden määriä. Tämä järjestelmä on on hyvin monimutkainen, sillä kannabinoidireseptoreja

on sekä GABAergisissä että glutamaergisissä hermosoluissa, joten kannabinoidien nettovaikutus voi

olla joko toimintaa kiihdyttävä tai vaimentava. Vaikka kannabinoidit vaimentaisivat hermosolujen

toimintaa, ne pystyvät silti aktivoimaan useita solujen jakautumista ja kohtaloa sääteleviä

signalointireittejä.

Kannabinoidit kykenevät indusoimaan hermosoluihin myös pidempiaikaisia muutoksia. Hermosolut

vapauttavat aktiopotentiaalin yhteydessä GABA:a ja glutamaattia, jotka ovat merkittäviä kehon

inhiboivia ja kiihdyttäviä välittäjäaineita. Kun kannabinoidit muuttavat presynaptisen hermon

aktiivisuutta, tämä ilmiö etenee dominomaisesti. Muut hermosolut mukautuvat myös muutoksiin ja

puhutaankin hermosolujen plastisuudesta. Tämä on todettu esimerkiksi kannabinoidireseptoreja

ekspressoivilla hippukampuksen hermosoluilla. (Abush & Akirav 2010)

10

3.1 Kannabinoidireseptorien rakenne

Endokannabinoidijärjestelmään kuuluvat CB1- ja CB2-reseptori. CB1 ja CB2 ovat Gi/0-

proteiinikytkentäisiä reseptoreja, jotka kuuluvat rodopsiinin tapaiseen luokan A/1–

reseptoriperheeseen. Myös kolmannen kannabinoidireseptorien olemassaoloa epäillään, mutta tästä

ei ole vielä tieteellistä konsensusta.

CB1-reseptoria tuottaa CNR1-geeni, ja se koostuu 472:sta aminohaposta ja on molekyylimassaltaan

52,8 kDa. CB2-reseptori on vastaavasti hieman pienempi - 360 aminohappoa ja molekyylimassaltaan

39,6 kDa. Toistaiseksi vain CB1-reseptorin kiderakenne on selvitetty, mutta CB2-reseptorin rakenne

olisi myös tieteellisen ymmärryksen vuoksi tärkeä selvittää. Pelkästään aminohapposekvenssin

perusteella CB1- ja CB2-reseptorit jakavat vain 43 % samankaltaisuuden. (Shire et al. 1996).

G-proteiinikytkentäiset reseptorit (GPCR) kuuluvat kehon yleisimpiin reseptorityyppeihin. Niillä

kaikilla on yhteinen rakenne, jossa on seitsemän transmembraanista domeenia, johon ligandia sitova

tasku muodostuu. G-proteiini koostuu 3 alayksiköstä: α, β ja γ. Reseptorin ollessa inaktiivinen α-

alayksikköön on sitoutunut GDP. Ligandin kiinnityttyä reseptoriin α-alayksikkö dissosioituu G-

proteiinikompleksista kun GTP sitoutuu alayksikön GDP:n tilalle. Jäljelle jääneet Gβ ja Gγ aktivoivat

effektorientsyymejä, jotka säätelevät solunsisäisten toisiolähettien konsentraatioita. G-proteiini

palautuu takaisin normaalitilaansa, kun α-alayksikön GTP hydrolysoidaan GDP:ksi, jolloin G-

proteiinitrimeeri voi muodostua uudelleen. Reseptoriin kiinnittyvä ligandi määrää myös sen, mihin

G-proteiiniin reseptori sitoutuu. Esimerkiksi kaikki adenylaattisyklaasin isomuodot on mahdollista

aktivoida Gsα–tyypin G-proteiinilla, mutta sen muiden spesifisten isomuotojen inhibointiin käy vain

Gβγ tai Giα–proteiinit. (Lodish et al. 2000)

CB1-reseptorin kiderakenne saatiin selville kiteyttämällä se rakennetta stabiloivan antagonistin

(AM6538) kanssa (Kuva 2). Kuten tyypilliset GPCR-perheeseen kuuluvat reseptorit, myös CB1-

reseptorista löytyy seitsemän transmembraanista α-helikaalia, joita yhdistää kolme solun ulkopuolista

ja solun sisäpuolista silmukkaa, sekä amfifaattinen alue. Reseptorissa on myös pitkä N-terminaalinen

häntä, josta osa on asettunut ligandia sitovan taskun päälle toimien näin ”tulppana” reseptorille. Tämä

todennäköisesti auttaa välttämään epäspesifistä sitoutumista reseptorin ulkopuolelta. ECL2-domeeni

projektoituu myös ligandia sitovaan taskuun neljän aminohapon verran. (Hua et al. 2016) CB1-

reseptorissa on myös disulfidisidoksia N-terminaalisten Cys98- ja Cys107-aminohappojen välillä

(Fay et al. 2013) sekä Cys257 ja Cys264 välillä. Cys257 ja Cys264 välinen disulfidisidos on CB1-

reseptorin toiminnan kannalta olennainen. (Fay et al. 2005)

11

Kuva 2. Kannabinoidireseptori CB1:n kiderakenne. Vihreällä rakennetta stabiloiva antagonisti AM6538. (Hua et al.

2016)

AM6538 on molekyyli jossa keskellä on pyratsolirengas, johon on kiinnittynyt kolme ”käsivartta”,

joissa on eri funktionaaliset ryhmät (Kuva 3). Käsivarret asettuvat kolmeen suuntaan ligandia

sitovassa taskussa, joita ovat pitkä kanava (Long channel), sivutasku (Side pocket) ja rako (Gap).

Pyratsolirengas keskellä on II ja VII helikaalin välissä ja vuorovaikuttaa Phe170, Phe379 ja Ser383

aminohappojen sekä N-terminaalin kanssa. Ensimmäinen käsi, jossa on diklorofenyylirengas on

asettunut sivutaskuun jonka muodostavat helikaalit II, III, VI ja VII. Se muodostaa π-π-sidoksia sekä

hydrofobisia sidoksia sivutaskun aminohappojen ja N-terminaalin kanssa. Toisessa kädessä on 4-

alifaattinen ketju substituoituna fenyylirenkaaseen. Se asettuu pitkään kanavaan, jonka muodostavat

helikaalit III, V, VI ja ECL2, jossa se muodostaa hydrofobisia ja π-π-sidoksia kanavan

aminohappojen kanssa. Kolmannessa kädessä oleva piperiini-1-ylkarbamoyyli on asettunut

helikaalien I, II ja VII muodostamaan rakoon. Poikkeuksena muihin käsivarsiin verrattuna

kolmannessa kädessä sidokset ovat nonspesifisiä. (Hua et al. 2016)

12

Kuva 3. AM6538:n rakennekaava.

Kolmelle kannabinoidiantagonistille tehtiin docking-malli reseptorin rakenteen perusteella. Malleiksi

valittiin Rimonabant, Otenabant ja Taranabant. Antagonistien ennustettu sitoutuminen noudattaa

samaa kaavaa, sillä ne muistuttavat AM6538:aa rakenteellisesti. Näistä kolmesta Taranabantilla oli

voimakkain affiniteetti reseptoriin. Kolmannessa kädessä olevassa funktionaalisessa ryhmässä oli

antagonisten välillä suurin vaihtelu, mutta sitoutuminen lienee mahdollinen kunhan hydrofobisia

sidoksia muodostuu. (Hua et al. 2016)

Lysiiniä kohdassa 192 on epäilty olevan aktiivinen ligandin sitomisessa ja reseptorin rakenteen

stabiloinnissa. (Chin et al. 1998) Uusimmissa rakennekuvissa yhteyttä AM6538:n ja lysiinin välillä

ei kuitenkaan ole havaittavissa. Sen sijaan se vaikuttaa muodostavan suolasiltoja Asp176 ja Asp184

kanssa. Phe102 ja Asp184 vakauttavat N-terminaalin rakennetta muodostamalla vetysidoksia

toistensa kanssa. (Hua et al. 2016)

Endogeenisille agonisteille tehtiin myös vastaavat docking-mallit ja ennustetut sitoutumispaikat.

Malleina olivat klassiset kannabinoidit THC ja CP55,940, endogeeniset agonistit anandamidi ja 2-

AG, sekä indolijohdannaiset JWH-018 ja WIN 55,212-2. Mallien perusteella agonistit interaktoivat

ECL2-domeenin, N-terminaalisen silmukan sekä III, VI ja VII-helikaalien kanssa, mutta eivät

helikaalien I ja II kanssa. Endokannabinoidien ennustetaan asettuvan N-terminaalisen loopin ja

ECL2-domeenin väliin, jolloin alifaattiset alueet jatkuvat kohti pitkää kanavaa. (Kuva 4) Kaikki

agonistit interaktoivat myös Phe268:n ja Phe379:n kanssa. Synteettisillä ja eksogeenisillä

kannabinoidiagonisteilla oli luonnollisesti enemmän π-π-sidoksia niiden rakenteesta johtuen. (Hua et

al. 2016)

13

JWH-018 ja WIN55,212-2 sitoutuivat kuitenkin matalalle reseptorin pohjaan verrattuna muihin

agonisteihin. Tämä on kiinnostava havainto, sillä JWH-018 synteettisenä kannabinoidiagonistina on

väärinkäytettynä aiheuttanut voimakkaita psyykkisiä ja fyysisiä oireita (Hermann-Clausen et al.

2013). Toistaiseksi yhtään THC:n aiheuttamaa yliannostusta ei tunneta, joten erojen on löydyttävä

siitä kuinka agonistit sitoutuvat reseptoriin ja millaisella affiniteetilla.

Kuva 4. Endokannabinoidien anandamidin ja 2-AG:n kiinnittyminen CB1-reseptoriin. (Hua et al. 2016)

Kuten monet muut G-proteiinikytkentäiset reseptorit, myös kannabinoidireseptorit pystyvät

muodostamaan sekä homodimeerejä (Wager-Miller et al. 2002) että heterodimeerejä (Hojo et al.

2008). Dimeerien muodostumiseen liittyy kuitenkin vielä useita kysymyksiä, kuten miten

dimerisaatio vaikuttaa solusignalointiin ja kuinka ligandien sitoutuminen toimii dimeereissä (Mackie

2005).

Heterodimeerien muodostuminen µ-opioidireseptorien on todistettu käyttäen FRET-kuvantamista

sekä ko-ekspressiokokeita (Wager-Miller et al. 2002). CB1-reseptoreita on lokalisoitunut myös

samoille alueille aivoissa dopamiinireseptoreiden kanssa ja nämä muodostavat heterodimeerejä

(Kearn et al. 2005). Samoin myös TRPV1- ja CB1-reseptoreita on kolokalisoitunut hiiren ja ihmisen

sarveiskalvon epiteelisoluissa, ja immunovärjäys on osoittanut reseptorien interaktoivan keskenään.

CB1-reseptorit näyttävät tässä tapauksessa hillitsevän TRPV1:n eteenpäin medioimia nosiseptisiä

signaaleja (Yang et al. 2013). Tuore tutkimus osoittaa CB1-reseptorien muodostavan heterodimeerejä

myös 5-HT2A –reseptorien kanssa, mikä voisi osaltaan selittää kannabinoidien psykotrooppiset

vaikutukset. (Viñals et al. 2015)

14

3.2 Ligandien rakenne ja toiminta

Endokannabinoidireseptorien tärkeimmät ligandit ovat N-arakidonyylietanoliamiini, toiselta

nimeltään anandamidi (AEA) ja 2-arakidonyyliglyseroli (2-AG). Anandamidi ja 2-AG toimivat

välittäjäaineina ja syntetisoidaan tarvittaessa solukalvojen fosfatidyyli-inositoleista. Anandamidi ja

2-AG vapautetaan välittömästi syntetisoinnin jälkeen synapsirakoon, jossa ne kiinnittyvät

presynaptisiin kannabinoidireseptoreihin. (Huang et al. 2016) Molempien ligandien vapauttaminen

on solunsisäisestä kalsiumkonsentraatiosta riippuvainen tapahtuma.

Anandamidin synteesi tapahtuu kahdessa vaiheessa: N-asetyylitransferaasi (NAT) liittää solukalvon

fosfatidyylietanoliamiiniin N-arakidonyylin, jolloin muodostuu N-

arakidonyylifosfatidyylietanoliamiini (NAPE). NAPE-selektiivinen fosfolipaasi D hydrolysoi

muodostuneen NAPE:n anandamidiksi. (Di Marzo et al. 1994)

2-AG voidaan syntetisoida kehossa kolmea eri kautta: Arakidonihappoa pystytään tekemään

diasyyliglyserolista (DAG), joka on kehon yleisimpiä toisiolähettejä. Diasyyliglyserolilipaasi

(DAGL) hydrolysoi 1,2-diasyyliglyserolin (DAG) 2-monoasyyliglyseroliksi (MAG).

Monoasyyliglyserolilipaasi (MAGL) hydrolysoi MAG:in, jolloin saadaan arakidonihappo. (Farooqui

et al. 1989) Toinen reitti kulkee fosfatidyyli-inositolin (PI) kautta. Fosfolipaasi C katkaisee

solukalvosta irrotetun fosfatidyyli-inositolin fosfaattiosan, jolloin muodostuu diasyyliglyseroli.

Diasyyliglyserolilipaasi (DAGL) poistaa hydrolysoimalla molekyylistä rasvahapon, jolloin

muodostuu 2-AG. (Kuva 5) (Kano et al. 2009; Stella et al. 1997) Fosfatidyyli-inositolista voidaan

saada 2-AG:tä myös vaihtoehtoisesti hydrolysoimalla PI lysofosfatidyyli-inositoliksi (LysoPI)

spesifisellä fosfolupaasi A1 –entsyymillä (PLA). LysoPI voidaan edelleen hydrolysoida 2-AG:ksi

LysoIP-spesifisellä fosfolipaasi C:llä. (Kuva 5) (Sugiura et al. 1995)

Kuva 5. 2-AG:n kaksi vaihtoehtoista synteesitapaa.

15

Kun kannabinoidit irtoavat reseptoreistaan, ne kuljetetaan takaisin solun sisälle hajotettavaksi.

Anandamidin kataboliasta vastaa rasvahappoamidihydrolaasi (FAAH). Se on integraalinen

kalvoproteiini, joka on lokalisoitunut endoplasmiseen retikulumiin. FAAH:in toinen substraatti on

rasvahappoamidi oleamidi, joka on endokannabinoidien sukulaismolekyyli, jolla arvellaan olevan

yhteys uni-valverytmiin (Prospéro-García et al. 2016). Endokannabinoidit ovat lipofiilisiä, ja ne

diffuntoituvat solukalvon läpi synteesin jälkeen. Kuinka kannabinoidit pääsevät takaisin sytosolin

puolelle hajotettavaksi on ollut mysteeri. Anandamidin tapauksessa ehdotettiin endosytoosia, mutta

myöhempi tutkimus osoittaa että kuljetusmekanismi on olemassa. Rasvahappoja sitovan proteiinin

(FABP) on osoitettu kuljettavan anandamidia takaisin solun sisälle, jolloin FAAH pystyy

hydrolysoimaan sen arakidonihapoksi ja etanolamiiniksi. (Kuva 6) Tämä on osoitettu COS7- ja

N18TG2-soluissa käyttämällä FABP-inhiittoria ja oleamidihappoa, joka on FABP:n luonnollinen

ligandi. AEA:n lokalisoituminen solun sisään hidastui puolella inhibiittoria ja agonistia käytettäessä.

(Kaczocha et al. 2009)

Kuva 6. Endokannabinoidien metaboliaa. 2-arakidonyyliglyseroli hajoaa arakidonihapoksi ja glyseroliksi, kun vastaavasti anandamidi

hajoaa arakidonihapoksi ja etanolamiinikisi.

2-AG myös lipofiilisenä molekyylinä kohtaa yhtälaisen kuljetushaasteen päästäkseen

monoasyyliglyserolilipaasin (MAGL) hajotettavaksi sytosoliin. Vaikka anandamidin

transportaatiosta on tehty useita tutkimuksia, 2-AG:n kuljetusmekanismit ovat edelleen harmaata

aluetta. Tutkimuksia aiheesta on vähän, ja tulokset ovat tulkinnanvaraisia. On mahdollista että 2-

AG:lle on oma kuljetusproteiininsa ja anandamidille omansa, tai AEA:ta ja 2-AG:tä kuljettaa yksi

kotransportteri. (Hermann et al. 2006) 2-AG:n hajotukseen kuitenkin tiedetään pystyvän kaikkiaan 7

entsyymiä, joista MAGL, ABHD12 ja ABHD6 medioivat suurimman osan. MAGL on

seriinihydrolaasi-proteiiniperheeseen kuuluva kalvoproteiini, joka on lokalisoitunut sytosoliin ja

16

tumaan. Se hydrolysoi 2-AG:n arakidonihapoksi ja glyseroliksi (Kuva 6). MAGL:in osuus 2-AG:n

hajotuksesta on merkittävä noin 85 % osuudellaan aivoissa. ABHD12 ja ABHD6 osallistuvat myös

2-AG:n hajotukseen 9 % ja 4 % osuuksillaan. Nämä proteiinit ovat kuitenkin lokalisoituneet

solukalvolle ja ekstrasellulaariseen tilaan ja onkin kiinnostavaa, miksi useita 2-AG:n hajotukseen

osallistuvia entsyymejä on lokalisoitunut eri paikkoihin. (Blankman et al. 2007)

2-AG:n sitoutuu CB1-reseptoriin samoin kuin anandamidi, mutta matalammalla affiniteetilla. Myös

ligandien konsentraatioissa on eroja: 2-AG:ta esiintyy rotalla aivojen lipidiekstraktissa 1000-

kertainen määrä verrattuna anandamidiin. (Buczynski & Parsons 2010) Sillä on kuitenkin matalampi

affiniteetti kuin AEA:lla, jonka lisäksi se toimii täysagonistina toisin kuin anandamidi, joka toimii

osittaisagonistina. (Hillard 2000, Sugiura et al. 1996). Ligandin kiinnittyminen näyttäisi kuitenkin

olevan solujen erikoistumisesta riippuvainen. CB2-reseptoria ekspressoivilla HL-60 soluilla saatiin

aikaan kalsiumvirtaus kun soluja stimuloitiin 2-AG:llä. Tämä vaikutus pystyttiin estämään CB2-

antagonisteilla. Sama ei kuitenkaan onnistunut CB1-antagonistilla. Sugiura et al (1996) ovat

kuitenkin osoittaneet että 2-AG kiinnittyy CB1-reseptoreihin NG108-15 neuroblastooma x

glioomahybridisoluissa.

McPartland kumppaneineen kokosivat 211 tutkimuksesta meta-analyysin, jossa koitettiin selvittää

kannabinoidiligandien affiniteettiä CB1- ja CB2-reseptoreihin. Anandamidin Ki-arvo ihmisen CB1-

reseptorille on 239,2 +/- 61,77 nM ja CB2-reseptorille 439,5 +/- 95,89 nM. 2-AG:n vastaavat arvot

ovat CB1-reseptorille 3423,6 +/- 3288,24 nM ja CB2-reseptorille 1193,8 +/- 327,71 nM. On

huomattavaa, että THC:n vastaavat arvot olivat CB1-reseptoriin 25,1 +/- 5,54 ja CB2-reseptoriin 35,2

+/- 5.86 nM. Endogeenisistä ligandeista anandamidi sitoutuu helpommin ja sillä on yhtä suuri

preferenssi molempiin reseptoreihin. 2-AG:n affiniteetit olivat anandamidin vastaavia huomattavasti

suuremmat, mutta 2-AG:llä vaikuttaisi myös olevan selvä preferenssi CB2-reseptoriin. THC:llä sen

sijaan ei ole preferenssiä reseptoreiden välillä lainkaan, mutta sen Ki –arvo on todella pieni suhteessa

anandamidiin. Meta-analyysissä havaittiin myös lajikohtaisia eroja rotan ja ihmisen

kannabinoidireseptorien välillä. Anandamidin Ki –arvo rotalla oli 87,8 +/- 11,32 nM CB1-

reseptoreissa, kun ihmisen vastaava oli 239,2 +/- 61,77 nM. (McPartland et al. 2007)

Kannabinoidireseptoreille on kehitetty lukuisia selektiivisiä agonisteja ja antagonisteja sekä

tutkimus- että lääkekäyttöön. CB1-selektiivisistä agonisteista mainittakoon R-(+)-metanandamidi,

arakidonyyli-2’-kloroetyyliamidi (ACEA), arakidonyyli-syklopropyyliamidi (ACPA) ja O-1812.

(Pertwee R.G 2006) CB1-reseptorille selektiivisiä antagonisteja ovat SR141716A, AM251, AM281

ja LY320135. (Pertwee R.G 2005)

17

3.3 Signaalikaskaadi

Yksi endokannabinoidien mielenkiintoisimpia signalointireittejä on anandamidin ja 2-AG:n

retrogradinen signalointi. Tyypillisessä hermosolujen signaloinnissa viesti siirtyy yksisuuntaisesti

presynaptiselta hermolta postsynaptiselle. Retrogradisessa signaloinnissa tämä asetelma kääntyy

ympäri. Anandamidi syntetisoidaan hermosolun postsynaptisessa terminaalissa solukalvon

fosfolipideistä, jonka jälkeen se siirtyy synapsirakoon ja kiinnittyy presynaptisen hermosolun

kannabinoidireseptoreihin vaimentaen solun välittäjäaineiden vapautumista ja

depolarisaatioherkkyyttä. Endokannabinoidit ovatkin tunnetuin välittäjäaineryhmä, jonka

pääasiallinen signalointi tapahtuu tällä erikoisella tavalla.

Retrogradisen signaloinnin ilmiö huomattiin 90-luvulla tutkittaessa Purkinjen solujen GABA-

herkkyyttä. GABA (Gamma-aminovoihappo) on aivojen merkittävin hermosoluja inhiboiva

välittäjäaine. Presynaptinen inhibitio toteutui, kun postsynaptisen hermosolun kalsiumkonsentraatio

nousi. Tutkimuksessa spekuloitiin myös mahdollista kalsiumriippuvaisen lähetin olemassaoloa.

(Llano et al. 1991) Todisteita endokannabinoidien roolista kalsiumriippuvaisina lähetteinä saatiin

vuosia myöhemmin. Endokannabinoidit sopivat lähetin viitekehykseen niiden nopean synteesin ja

lipofiilisen luonteen vuoksi, joka mahdollistaisi nopean diffuusion sytosolista synapsirakoon. CB1-

reseptoreita on lokalisoitunut hippokampuksen GABAergisiin neuroneihin. (Tsou et al. 1999) Kun

reseptoreita stimuloitiin synteettisellä CB1-agonistilla, GABA:n vapauttaminen presynaptisesta

hermosolusta laskee samoin kuin niiden neuraalinen oskillaatio. (Wilson & Nicoll 2001)

Hermoimpulssin vaimentaminen toimii GABAergisissä hermosoluissa, mutta kannabinoidit pystyvät

säätelemään myös eksitatoristen hermosolujen aktiopotentiaaleja. Tämä on todettu Purkinjen soluilla,

joita stimuloimalla saatiin presynaptisissa neuroneissa aikaan kymmeniä sekunteja kestävä inhibitio

ja välittäjäaineiden supressio. (Kreitzer & Reger 2001) Endokannabinoidit pystyvät moduloimaan

hermosolujen depolarisaatiota näinollen sekä inhibitorisissa että eksitatorisissa hermosoluissa. Tämä

yhdistettynä käänteiseen signalointiin tekee endokannabinoideista erikoisimpia välittäjäaineita mitä

eläinkunnasta löytyy.

CB1-reseptorin aktivointi inhiboi adenylaattisyklaasia, joka syntetisoi syklistä

adenosiinimonofosfaattia (cAMP) ATP:stä. G-proteiinit irtoavat alayksiköikseen aktivoinnin

seurauksena, jolloin alatyyppi Gi inhiboi adenylaattisyklaasia, mikä johtaa solunsisäisen cAMP-

konsentraation laskuun. Tämä sulkee solun kalsiumkanavat, joka vaikuttaa välittäjäaineiden

vapautumiseen presynaptisesta hermopäätteestä synapsirakoon. Kannabinoidit säätelevät lisäksi

presynaptisen hermon generoimia aktiopotentiaaleja sulkemalla jänniteherkkiä kalium- ja

natriumkanavia.

18

Endokannabinoidit sekä kannabinoidiagonistit pystyvät hillitsemään presenaptisen hermon

vapauttamia välittäjäaineita kalsiumkanavien avulla. Kun CB1-reseptoreita stimuloidaan agonistilla,

presynaptisen hermon kalsiumkanavat sulkeutuvat jolloin hermosolun sisäinen kalsiumkonsentraatio

laskee inhiboiden hermosolun depolarisaatioherkkyyttä ja täten välittäjäaineiden vapautumista. Tämä

on havaittu GABAergisillä kolekystokiinia ja CB1-reseptoreita ekspressoivilla pyramidaalisoluilla,

joita stimuloitiin kalsiumkanavan salpaajilla samalla mitaten postsynaptisia amplitudin muutoksia.

Kalsiumin virtaus vaikuttaa tapahtuvan N-tyypin jänniteherkkien kalsiumkanavien kautta, joita CB1-

reseptorit salpaavat. Solunsisäinen kalsiumkonsentraatio on myös suoraan verrannollinen

vapautettuun GABA:n määrään. (Szabó et al. 2014)

Hermosolussa on lepotilassa negatiivinen jännite suhteessa solun ulkopuoliseen tilaan, jossa on

positiivinen jännite. Tällöin solun sisäpuolella on runsaasti kaliumioneita, mutta vähän natriumioneja.

Solun ulkopuolisessa tilassa asetelma on päinvastoin: natriumia on ylimäärin, mutta kaliumia ei.

Tämä synnyttää potentiaalieron solun sisä- ja ulkopintojen välille. Aktiopotentiaali syntyy, kun solun

pinnassa olevat jänniteherkät natrium-kanavat aukeavat, jolloin solun ulkopuolinen natrium virtaa

solun sisälle, nostaen sen jännitteen positiiviseksi. Jänniteherkät kalium-kanavat aukeavat

seuraavaksi, jolloin solunsisäinen kalium virtaa solusta ulos – tämä laskee jännitettä ja palauttaa solun

lopulta lepotilan negatiiviseen jännitteeseen. (Lodish et al. 2000)

Kannabinoidien kaliumkanavien säätelyä on testattu dendriittisoluilla, jotka ekspressoivat CB1-

reseptoria. Stimulointi anandamidilla sekä anandamidianalogilla johti ulospäin virtaavaan kaliumin

määrän laskemiseen, joka vaikuttaa suoraan aktiopotentiaalin syntyyn. Kaliumin virtauksessa

syntyneet muutokset pystyttiin estämään käyttämällä CB1-reseptorin antagonisteja. (Wacnik et al.

2008) Kaliumkanavien hallinnoin lisäksi endokannabinoidit inhiboivat myös solun natriumkanavia.

Eristetyissä synaptosomeissa ja synaptoneurosomeilla tehdyt kokeet osoittavat anandamidin ja

synteettisten anandamidianalogien vähentävän hermosolujen depolarisaatiota sekä nostavan

jatkuvasti signaaleja generoivien hermosolujen latenssia mikromolaarimäärillä. (Nicholson et al.

2003)

Vaikka kannabinoidien toiminta vaikuttaisi olevan yksinomaan hermosolujen toiminnan

vaimentamista, tämä ei pidä täysin paikkansa. CB1-reseptoreiden stimulointi aktivoi samalla

MAPK/ERK-signalointireittiä, joka on merkittävä solun jakautumisen, apoptoosin ja erikoistumisen

kannalta. (Turu & Hunyady 2010) Tämä on osoitettu astrosytoomasoluilla, joissa CB1-reseptorin

stimulointi HU-210 agonistilla sai ERK-vasteen aikaan, sekä että vaste oli nimenomaan CB1-

reseptorista johtuva koska se oli estettävissä CB1-antagonistilla. Reseptorien aktivointi auttoi myös

estämään keramidilla indusoidun apoptoosin. Reseptoreiden signalointi on linkittynyt myös

19

PI3K/PKB-reittiin, joka osallistuu solun kohtalon säätelyyn yhdessä ERK-reitin kanssa. (Galve-

Roperh et al. 2002)

Kannabinoidijärjestelmän signalointi ei rajoitu pelkästään MAPK/ERK-reittiin. Yhteyksiä β-

arrestiiniin (Nguyen et al. 2012) sekä Wnt-signalointiin (Laezza et al. 2012) on myös löydetty.

β-arrestiini on proteiini, joka estää G-proteiinikytkentäisten reseptorien yhdistämisen G-

proteiineihin. β-arrestiini2 nimenomaisesti pystyy säätelemään CB1-reseptoreiden turtumista

eksogeenisten kannabinoidien jatkuvan annostelun seurauksena. Nguyen ryhmineen testasi β-

arrestiinin osuutta THC:llä βarr2-KO–hiirillä. THC:n annostelun jälkeen βarr2-KO–hiirillä oli

selvästi kohonnut G-proteiiniaktivaatio, antinosiseptio ja hypotermia verrattuna villityypin hiiriin.

Molemmilla hiirillä kehittyi toleranssia kivunlievitykseen THC:n jatkuvan annostelun seurauksena,

mutta βarr2-KO–hiirillä tämä muutos oli hitaampi. Sama ilmiö toistui annosteltaessa hiirille

opiaatteja vahvistaen β-arrestiinin roolia reseptoriherkkyyden säätelyssä. Kokeissa havaittiin myös

että THC:n aiheuttama lihasjäykkyys oli heikentynyt βarr2-KO–hiirillä. (Nguyen et al. 2012) β-

arrestiinin osuus solusignaloinnissa pystytään suoraan kytkemään endokannabinoidijärjestelmään ja

soveltamaan lääkesuunnittelussa.

Wnt-signalointi ohjaa monia solun toimintoja liittyen proliferaatioon, liikkumiseen, polaarisuuteen

sekä organogeneesiin. Syöpäsoluissa signalointi on tyypillisesti häiriintynyttä johtaen aggressiiviseen

jakautumiseen. MDA MB 231 rintasyöpäsolujen kasvua pystyttiin hidastamaan käyttämällä

synteettistä anandamidin analogia 2-metyyli-2’-F-anandamidia (Met-F-AEA). Syöpäsoluissa β-

kateniini translokatoituu tumaan, jossa se aktivoi solun jakautumista edistäviä transkriptiotekijöitä.

Analogilla käsitellyissä soluissa β-kateniinia ei ollut lokalisoitunut sytosoliin tai tumaan, viitaten että

se on hajotettu preteosomeissa. Sen lisäksi reseptorin aktivointi rajoitti syöpäsolujen kykyä tehdä

etäpesäkkeitä inhiboimalla epiteeli-mesenkymaalitransitiota sekä vaimentamalla

mesenkymaalimarkkereita. MCF7-soluissa adriamysiini-indusoitu epiteeli-mesenkymaalitransitio

pystyttiin estämään kokonaan käsittelemällä solut Met-F-AEA:lla. (Komiya & Habas 2008)

Parasetamolia käytetään yleisesti kipu- ja kuumelääkkeenä. Parasetamolin ja endokannabinoidien

kipua lievittävät ominaisuudet ovat linkittyneet toisiinsa yhteisten metaboliareittien kautta. Tätä

yhteyttä on tutkittu mittaamalla rottien kivunsietokykyä lämpölaattakokeella. Kokeissa käytettiin

CB1-reseptorille selektiivistä agonistia HU 210, parasetamolia sekä kahta CB1-reseptorille

selektiivistä antagonistia (SR141716 ja AM281). Tutkimusryhmä huomasi että antagonistit hävittivät

täysin sekä parasetamolin että HU 210:n aikaansamaan kivunlievityksen rotilla. Tällöin

parasetamolin kivunlievityksellä ja kannabinoidireseptoreilla on oltava yhteys. (Ottani et al. 2006)

20

Aiemmin on tiedetty N-(4-hydroksifenyyli)arakidonyyliamidin (AM404) lisäävän anandamidin

konsentraatiota rottien aivoissa, sillä se inhiboi anadamidille selektiivisiä kuljettajaentsyymejä

(Beltramo et al. 1997). AM404 on parasetamolin pääasiallinen metaboliitti, jolloin parasetamolin

kivunlievitys perustuu osittain myös endokannabinoidijärjestelmän hyödyntämiseen.

Endokannabinoidien kivunlievitys perustuu presynaptisen hermosolun vaimentamiseen säätelemällä

ionikanavia sekä G-proteiineja ja täten solun depolarisaatioherkkyyttä ja välittäjäaineiden

vapautumista. Järjestelmällä on yhteyksiä myös signalointireitteihin, jotka vaikuttavat solun

jakaantumiseen ja elossapysymiseen. CB1-reseptorit ovat tässä avainasemassa, sillä ne ovat

lokalisoituneet keskushermostoon ja aivoihin.

21

4. Lääkekäyttö

Kannabinoidijärjestelmän toimintaa voidaan muokata joko annostelemalla eksogeenisiä

kannabinoideja, jotka ovat tyypillisesti reseptoreidensa agonisteja, tai nostamalla

endokannabinoidien konsentraatiota keskushermostossa inhiboimalla niiden aineenvaihduntaan

vaikuttavia entsyymejä. Tutkimus on vasta alussa, vaikka monia lupaavia terapeuttisia sovelluksia on

jo olemassa. Arakidonihapon yhteydet prostaglandiinien synteesiin ja sitä kautta suoraan

immuunijärjestelmän toimintaan tarjoaa myös maaperän uusille lääkkeille, joilla voisi säädellä kehon

immuunivasteita.

Kannabinoideja on käytetty muun muassa krooniseen neuropaattiseen kipuun (Cohen 2008),

migreeniin, päänsärkyyn ja klusteripäänsärkyihin (Russo 1998), syöpään liittyviin kiputiloihin

(Farguhar-Smith 2009), epilepsiaan (Rosenberg et al. 2015), multippeliskleroosin kivunhoitoon ja

spastisuuteen (Zajicek & Apostu 2011), ahdistukseen (Tambaro & Bortolato 2012) ja post-

traumaattiseen stressioireyhtymään (Mizrachi Zer-Aviv et al. 2016), ruokahalun parantamiseen

(Mattes et al. 1994) ja Alzheimerin (Aso & Ferrer 2014) sekä autoimmuunisairauksien hoitoon

(Katchan et al. 2016).

Endokannabinoidien AEA:n ja 2-AG:n käyttäminen lääkkeenä on ongelmallista niiden synteesireitin

ja epävakauden vuoksi. Kannabinoidien konsentraatiota aivoissa on kuitenkin pystytty nostamaan

epäsuorasti inhiboimalla anandamidin ja 2-AG:n hajotukseen osallistuvia FAAH- ja MAGL-

entsyymejä. Myös suoria CB1-reseptorin antagonisteja on kokeiltu ruokahalun hillitsemiseen ja

liikalihavuuden hoitoon. Näistä ensimmäinen oli Rimonabant, joka tuli myyntiin Euroopassa 2006

mutta sen valmistus ja myynti lopetettiin kahta vuotta myöhemmin vakavien psykiatristen

sivuvaikutusten vuoksi (Moreira & Crippa 2009). Rimonabant toimi CB1-reseptortin käänteisenä

antagonistina, ja on hyvin todennäköistä että ainakin osa sivuvaikutuksista johtui tästä. Neutraaleista

antagonisteista mainittakoon Surinabant, jota on kokeiltu tupakoinnin lopettamisen apuna. Surinabant

ei auttanut plaseboa paremmin tupakoinnin lopettamiseen, mutta se vähensi hieman tupakoinnin

lopettamisen jälkeistä painonnousua kontrolliryhmään verrattuna. (Tonstad & Aubin 2012)

Useita potentiaalisia FAAH-inhibiittoreita on testattu kliinisissä ensimmäisen ja toisen vaiheen

kokeissa. Aiemmissa kokeissa testatut lääkeaineet oli todettu ihmiselle turvalliseksi, mutta

odottamattomat haittavaikutukset saattavat silti yllättää tutkijat. Neuropaattisen kivun hoitoon

ensisijaisesti kehitetty FAAH-inhibiittori BIA 10-2747 sai negatiivista julkisuutta vuoden 2016

alkupuolella, kun kuudentena testipäivänä yksi koehenkilöistä kuoli ja viidellä muulla koehenkilöllä

ilmeni magneettikuvauksissa pysyviä aivovaurioita. Ensimmäisen vaiheen lääketutkimukset

22

keskeytettiin välittömästi tapahtuman jälkeen. On toistaiseksi selvityksen alla miksi koe päättyi näin

traagisesti, mutta syitä voi olla lääkeaineen epäspesifinen sitoutuminen muihin entsyymeihin, liian

suuret annoskoot tai lääkeaineen metaboliittien kasautuminen. Osalle koehenkilöistä annosteltiin

inhibiittoria päivittäin ja tämä on voinut osaltaa vaikuttaa odottamattomiin tuloksiin. Toistaiseksi

markkinoilla ei ole yhtään kaupallistettua FAAH-inhibiittoria, mutta tutkimukset jatkuvat. (Kaur et

al. 2016)

2-AG:n hajotukseen osallistuvan monoasyyliglyserolilipaasin (MAGL) inhibointi on ollut myös

suosittu tutkimuskohde. Ignatowska-Jankowska ryhmineen raportoivat testanneensa KML29-nimistä

MAGL-inhibiittoria kivunlievitykseen hiirillä. Kipumalleina käytettiin karrageenilla indusoitua

takakäpälän turvotusta, lonkkahermon liimauksesta seurannutta allodynesiaa sekä tulehduskipulääke

Diklofenaakilla indusoitu mahalaukun verenvuotoa. Inhibiittorin annostelemisen jälkeen 2-AG:n

määrä hiirten aivoissa nousi 2-4 tunnin aikana, jolloin eläimillä havainnoitiin myös suurin

kivunlievitys. Kokeiden perusteella karrageenin aiheuttamaan kipuun tarvitaan sekä CB1 että CB2-

reseptoreiden aktivointi, kun lonkkahermon allodyniaa saatiin lievitettyä aktivoimalla pelkästään

CB1-reseptoria 2-AG:llä. Inhibiittori ehkäisi myös diklofenaakin indusoiman mahanlaukun

verenvuodon. Inhibiittori ei vaikuttanut anandamidin konsentraatioon aivoissa millään tavalla.

Tutkijat pitivät myös erityisen innostavana, ettei hiirillä ilmennyt kannabinoideille olennaista

päihtymystä lääkeannoksen antamisen jälkeen siitä huolimatta, että 2-AG aktivoi CB1-reseptoria.

(Ignatowska-Jankowska et al. 2014) Pasquarellin ryhmä on myös saanut samakaltaisia tuloksia

omista KML29-kokeistaan. He lähestyivät tutkimusongelmaa prostaglandiinien synteesin kautta, ja

kuinka endokannabinoidijärjestelmä voisi kytkeytyä tähän. Prostaglandiineja voidaan syntetisoida

solunsisäisestä diasyyliglyserolista tai solukalvojen fosfolipideistä. Nomura kumppaneineen olivat

aiemmin osoittaneet, että 2-AG:n hydrolyysissä syntyvä arakidonihappo toimii prostaglandiinien

prekursorina ja näin ollen tarjoaa vaihtoehtoisen synteesireitin (Nomura et al. 2011). Pasquarellin

ryhmä varmisti nämä tulokset, ja osoitti syntetisoidun prostaglandiinin määrän alentuneen aivoissa,

lihaksissa, maksassa ja haimassa inhibiittorin annostelun jälkeen. (Pasquarelli et al. 2015)

Eksogeenisillä kannabinoideilla vaikuttaisi olevan myös rooli antioksidantteina sekä hermosolujen

suojelemisessa. Kun aivokuoren kortikaalisia hermosoluja altistettiin glutamaatille tai tert-

butyylihydroperoksidille, sekä THC että CBD pystyivät suojelemaan hermosoluja glutamaatin ja

hydroperoksidin aiheuttamilta oksidatiivisilta vaurioilta. Tämä vaikutus säilyi käytettäessä

kannabinoidireseptorien antagonistia SR-141716A, osoittaen ettei efekti ole kannabinoidireseptorista

riippuvainen. Mielenkiintoisena havaintona endogeeninen kannabinoidi anandamidi ei hapettunut

23

eikä siten pysty medioimaan suojaavaa vaikutusta eksogeenisten kannabinoidien tapaan. (Hampson

et al. 1998)

Lynch ja Campbell kokosivat yhteen satunnaistettua 18 kliinistä koetta vuosilta 2003-2010, joissa oli

tutkittu kannabinoidien vaikutusta krooniseen, ei-syöpäperäiseen kipuun 776:lla potilaalla. Kokeissa

testattiin poltettua kannabista, suun kautta annosteltavaa suihketta, sekä synteettistä kannabinoideja

Nabilonea, Drobinolia sekä ajuleemihappoa (THC-11-oic acid). Kaikkiaan 15 kokeessa havainnoitiin

merkittävä kivunlievennys, ja joissain tapauksissa myös parantunut unenlaatu. Yleisimmiksi

haittavaikutuksiksi raportoitiin suun kuivuminen, huimaus, rauhoittuminen, pahoinvointi ja

keskittymisen häiriöt. Vakavammat sivuvaikutukset käsittivät päänsärkyä, paranoiaa, koordinaation

heikkenemistä, kiihtymystä ja dissosiaatiota. Haittavaikutukset olivat kuitenkin kuvailtu lieviksi ja

hyvin siedetyiksi. Kivunlievityksen kannalta kannabinoidit vaikuttavat toimivan kohtalaisesti, mutta

toisaalta kahdessa kokeessa (Abrams et al. 2007; Ellis et al. 2009) havaittiin poltetun kannabiksen

lievittävän HIV:iin liittyviä vaikeita neuropaattisia kiputiloja. Kokeiden keskimääräinen kesto oli 2,8

viikkoa, mikä on tarkasteluajanjaksona melko lyhyt. Pidemmät seurantajaksot sekä laajempi kartoitus

toimintakyvyn palautumisesta olisivat tarpeen selvitettäessä kannabinoidien lääkekäytön

pitkäaikaisvaikutuksia. Kannabinoidit vaikuttaisivat turvalliselta vaihtoehdoilta kroonisiin kipuun,

mutta niiden kivunlievitys ei välttämättä ole yksinään riittävä erittäin vaikeisiin kiputiloihin. (Lynch

& Campbell 2011)

Kiehtova tuore tutkimus valottaa taustoja tetrahydrokannabinolin, päihtymyksen ja kivunlievityksen

välille. Viñals kumppaneineen osoittivat että CB1-reseptorit pystyvät muodostamaan heteromeerejä

5-HT2A–reseptoreiden kanssa, jotka kuuluvat G-proteiinikytkentäisiin serotoniin-

reseptoriperheeseen. 5-HT2A on myös LSD:n, psilosybiinisienten ja meskaliini-kaktusten

psykoaktiivisten agonistien vastinreseptori. Eläinkokeissa villityypin hiirillä havaittiin

muistihäiriöitä, sedaatiota ja kohonnutta sosiaalisuutta THC:n annostelun jälkeen, mutta 5-HT2A –

KO-hiirillä nämä käyttäytymismallit joko lievenivät tai hävisivät kokonaan. Erittäin

mielenkiintoisena havaintona THC:n tuoma kivunlievitys säilyi ennallaan molemmilla hiirillä

lämpölaatta- ja hännäheilautuskokeissa. CB1-5-HT2A–dimeeri pystyttiin erottamaan toisistaan

käyttämällä solukalvon läpäiseviä peptidejä, jolloin villityypin hiirten muistihäiriöt hävisivät, mutta

kivunlievitys säilyi ennallaan THC:n annostelun jälkeen. Tämän yhteyden löytyminen auttaa

ymmärtämään ja suunnittelemaan tulevaisuudessa uudenlaisia lääkkeitä, jotka pystyvät medioimaan

eksogeenisten kannabinoidien hyödyt ja minimoimaan haitat. Endokannabinoidijärjestelmän

yhteydet muihin kehon välittäjäainejärjestelmiin, kuten endorfiini- ja dopamiinijärjestelmään tulisi

näinollen ottaa huomioon lääkesuunnittelussa. (Viñals et al. 2015)

24

Kannabinoidien lääkekäytön yhteydessä on otettava huomioon sivuvaikutukset. Vaikka

kannabinoidireseptoreja on keskushermostossa, ne eivät ole lokalisoituneet aivorungossa sydämen ja

keuhkojen toimintaa sääteleville alueille kuten opioidireseptorit. Tästä johtuen opiaattien

yliannostuksessa ilmenevä hermostolama on mahdoton saavuttaa pelkästään kannabinoideilla.

(Abrams et al. 2011)

Vaikka eksogeenisiä kannabinoideja on käytetty lääkkeeksi, tutkimus pysähtyi vuosikymmeniksi kun

kannabis luokiteltiin vuonna 1970 Yhdysvalloissa Luokan I huumausaineeksi, jossa se nykyäänkin

on. Luokka I sisältää vaatimuksen siitä, että aineella on korkea riippuvuutta aiheuttava potentiaali, ei

hyväksyttyä lääketieteellistä käyttöä sekä ettei aine ole turvallinen käyttää edes lääkärin valvonnassa.

Useita esityksiä luokittelun muuttamiseksi on tehty tieteellisen ymmärryksen lisääntyessä

kannabinoidijärjestelmästä sekä kannabinoidien farmakologisesta potentiaalista, mutta toistaiseksi

kannabis säilyy laittomana. (Baron 2015)

Kannabinoidien täyden lääketieteellisen potentiaalin kartoittaminen on arvokasta työtä. CB1-

reseptorin rakenteen selvittämisen ja heterodimerisaation löytyminen auttavat suunnittelemaan yhä

spesifisempiä lääkkeitä. Tällä hetkellä markkinoilla olevat lääkkeet tarjoavat ensimmäisen polven

ratkaisuja tehokkaampaan ja turvallisempaan kivunlievitykseen. Kannabinoideja käytetään tällä

hetkellä MS-taudin, syövän sekä akuutin ja krooniseen kivun hoitoon. Nykytietämyksen valossa

kannabinoideilla on mahdollista saavuttaa kohtalainen kivunlievennys melko miedoilla

sivuvaikutuksilla.

25

Lähteet

Abrams, D. I., Jay, C. A., Shade, S. B., Vizoso, H., Reda, H. et al. Petersen, K. L. (2007). Cannabis

in painful HIV-associated sensory neuropathy: A randomized placebo-controlled

trial. Neurology, 68(7), 515-521.

Abush, H. & Akirav, I. (2010). Cannabinoids modulate hippocampal memory and

plasticity. Hippocampus, 20(10), 1126-1138.

Ashton, C. H. & Moore, P. B. (2011). Endocannabinoid system dysfunction in mood and related

disorders. Acta Psychiatrica Scandinavica, 124(4), 250-261.

Aso, E. & Ferrer, I. (2014). Cannabinoids for treatment of Alzheimer’s disease: Moving toward

the clinic. Frontiers in Pharmacology, 5, 10.3389/fphar.2014.00037.

Baron, E. P. (2015). Comprehensive review of medicinal marijuana, cannabinoids, and therapeutic

implications in medicine and headache: What a long strange trip it's been ... Headache, 55(6), 885-

916.

Bear, M. F., Connors, B. W., & Paradiso, M. A. (2007). Neuroscience: Exploring the brain.

Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins

Beardsley, P. M., Scimeca, J. A. & Martin, B. R. (1987). Studies on the agonistic activity of delta 9-

11-tetrahydrocannabinol in mice, dogs and rhesus monkeys and its interactions with delta 9-

tetrahydrocannabinol. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 241(2), 521-

526.

Beltramo, M., Stella, N., Calignano, A., Lin, S. Y., Makriyannis, A. & Piomelli, D. (1997).

Functional role of high-affinity anandamide transport, as revealed by selective inhibition. Science

(New York, N.Y.), 277(5329), 1094-1097.

Blankman, J. L., Simon, G. M. & Cravatt, B. F. (2007). A comprehensive profile of brain enzymes

that hydrolyze the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol. Chemistry & Biology, 14(12), 1347-

1356.

Buczynski, M. W. & Parsons, L. H. (2010). Quantification of brain endocannabinoid levels:

Methods, interpretations and pitfalls. British Journal of Pharmacology, 160(3), 423-442.

Bushnell, M., Case, L., Ceko, M., Cotton, V., Gracely, J. et al. Villemure, C. (2015). Effect of

environment on the long-term consequences of chronic pain. Pain, 156(0 1), S42-9.

26

Caldwell, M. D., Hu, S. S., Viswanathan, S., Bradshaw, H., Kelly, M. E. & Straiker, A. (2013). A

GPR18-based signalling system regulates IOP in murine eye. British Journal of

Pharmacology, 169(4), 834-843.

Carrier, E. J., Kearn, C. S., Barkmeier, A. J., Breese, N. M., Yang, W. et al. Hillard, C. J. (2004).

Cultured rat microglial cells synthesize the endocannabinoid 2-arachidonylglycerol, which increases

proliferation via a CB2 receptor-dependent mechanism. Molecular Pharmacology, 65(4), 999-1007.

Chin, C. N., Lucas-Lenard, J., Abadji, V. & Kendall, D. A. (1998). Ligand binding and modulation

of cyclic AMP levels depend on the chemical nature of residue 192 of the human cannabinoid

receptor 1. Journal of Neurochemistry, 70(1), 366-373.

Davis, K. D. & Moayedi, M. (2013). Central mechanisms of pain revealed through functional and

structural MRI. Journal of Neuroimmune Pharmacology : The Official Journal of the Society on

NeuroImmune Pharmacology, 8(3), 518-534.

De Petrocellis, L., Melck, D., Bisogno, T., Milone, A. & Di Marzo, V. (1999). Finding of the

endocannabinoid signalling system in hydra, a very primitive organism: Possible role in the feeding

response. Neuroscience, 92(1), 377-387.

Devane, W. A., Dysarz, F. A., Johnson, M. R., Melvin, L. S. & Howlett, A. C. (1988).

Determination and characterization of a cannabinoid receptor in rat brain. Mol Pharmacol, 34(5),

605.

Devane, W. A., Hanus, L., Breuer, A., Pertwee, R. G., Stevenson, L. A. et al. Mechoulam, R.

(1992). Isolation and structure of a brain constituent that binds to the cannabinoid receptor. Science

(New York, N.Y.), 258(5090), 1946-1949.

Di Marzo, V. & Matias, I. (2005). Endocannabinoid control of food intake and energy

balance. Nature Neuroscience, 8(5), 585-589.

Ellis, R. J., Toperoff, W., Vaida, F., van den Brande, G., Gonzales, J. et al. Atkinson, J. H. (2009).

Smoked medicinal cannabis for neuropathic pain in HIV: A randomized, crossover clinical

trial. Neuropsychopharmacology : Official Publication of the American College of

Neuropsychopharmacology, 34(3), 672-680.

Farooqui, A. A., Rammohan, K. W. & Horrocks, L. A. (1989). Isolation, characterization, and

regulation of diacylglycerol lipases from the bovine brain. Annals of the New York Academy of

Sciences, 559, 25-36.

27

Fay, J. F., Dunham, T. D. & Farrens, D. L. (2005). Cysteine residues in the human cannabinoid

receptor: Only C257 and C264 are required for a functional receptor, and steric bulk at C386

impairs antagonist SR141716A binding. Biochemistry, 44(24), 8757-8769.

Fay, J. F. & Farrens, D. L. (2013). The membrane proximal region of the cannabinoid receptor

CB(1) N-terminus can allosterically modulate ligand affinity. Biochemistry, 52(46), 8286-8294.

Fine, P. G. & Rosenfeld, M. J. (2013). The endocannabinoid system, cannabinoids, and

pain. Rambam Maimonides Medical Journal, 4(4), e0022. doi:10.5041/RMMJ.10129.

Galiegue, S., Mary, S., Marchand, J., Dussossoy, D., Carriere, D. et al. Casellas, P. (1995).

Expression of central and peripheral cannabinoid receptors in human immune tissues and leukocyte

subpopulations. European Journal of Biochemistry / FEBS, 232(1), 54-61.

Galve-Roperh, I., Rueda, D., Gomez del Pulgar, T., Velasco, G. & Guzman, M. (2002). Mechanism

of extracellular signal-regulated kinase activation by the CB(1) cannabinoid receptor. Molecular

Pharmacology, 62(6), 1385-1392.

Herkenham, M., Lynn, A. B., Johnson, M. R., Melvin, L. S., de Costa, B. R. & Rice, K. C. (1991).

Characterization and localization of cannabinoid receptors in rat brain: A quantitative in vitro

autoradiographic study. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for

Neuroscience, 11(2), 563-583.

Hermann, A., Kaczocha, M. & Deutsch, D. G. (2006). 2-arachidonoylglycerol (2-AG) membrane

transport: History and outlook. The AAPS Journal, 8(2), E409-12.

Hermanns-Clausen, M., Kneisel, S., Szabo, B. & Auwarter, V. (2013). Acute toxicity due to the

confirmed consumption of synthetic cannabinoids: Clinical and laboratory findings. Addiction

(Abingdon, England), 108(3), 534-544.

Hillard, C. J. (2000). Biochemistry and pharmacology of the endocannabinoids

arachidonylethanolamide and 2-arachidonylglycerol. Prostaglandins & Other Lipid

Mediators, 61(1-2), 3-18.

Hojo, M., Sudo, Y., Ando, Y., Minami, K., Takada, M. et al. Uezono, Y. (2008). Mu-opioid

receptor forms a functional heterodimer with cannabinoid CB1 receptor: Electrophysiological and

FRET assay analysis. Journal of Pharmacological Sciences, 108(3), 308-319.

Hua, T., Vemuri, K., Pu, M., Qu, L., Han, G. et al. Liu, Z.Crystal structure of the human

cannabinoid receptor CB1. Cell, 167(3), 750-762.e14.

28

Huang, W. J., Chen, W. W. & Zhang, X. (2016). Endocannabinoid system: Role in depression,

reward and pain control (review). Molecular Medicine Reports, 14(4), 2899-2903.

Ignatowska-Jankowska, B. M., Ghosh, S., Crowe, M. S., Kinsey, S. G., Niphakis, M. J. et al.

Lichtman, A. H. (2014). In vivo characterization of the highly selective monoacylglycerol lipase

inhibitor KML29: Antinociceptive activity without cannabimimetic side effects. British Journal of

Pharmacology, 171(6), 1392-1407.

Kaczocha, M., Glaser, S. T. & Deutsch, D. G. (2009). Identification of intracellular carriers for the

endocannabinoid anandamide. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United

States of America, 106(15), 6375-6380.

Kandel Eric R., Schwartz James H., Jessell Thomas M., Siegelbaum Steven A., Hudspeth A.J (2013)

Principles of Neural Science, McGraw-Hill, ISBN: 978-0-07-181001-2

Kano, M., Ohno-Shosaku, T., Hashimotodani, Y., Uchigashima, M. & Watanabe, M. (2009).

Endocannabinoid-mediated control of synaptic transmission. Physiological Reviews, 89(1), 309-

380.

Katchan, V., David, P. & Shoenfeld, Y. (2016). Cannabinoids and autoimmune diseases: A

systematic review. Autoimmunity Reviews, 15(6), 513-528. doi:10.1016/j.autrev.2016.02.008 [doi]

Kaur, R., Sidhu, P. & Singh, S. (2016). What failed BIA 10–2474 phase I clinical trial? global

speculations and recommendations for future phase I trials. Journal of Pharmacology &

Pharmacotherapeutics, 7(3), 120-126.

Kearn, C. S., Blake-Palmer, K., Daniel, E., Mackie, K. & Glass, M. (2005). Concurrent stimulation

of cannabinoid CB1 and dopamine D2 receptors enhances heterodimer formation: A mechanism for

receptor cross-talk? Molecular Pharmacology, 67(5), 1697-1704.

Komiya, Y. & Habas, R. (2008). Wnt signal transduction pathways. Organogenesis, 4(2), 68-75.

Kreitler, S. & Beltrutti, D. (2007). The handbook of chronic pain Nova Biomedical Books.

Kreitzer, A. C. & Regehr, W. G. (2001). Retrograde inhibition of presynaptic calcium influx by

endogenous cannabinoids at excitatory synapses onto purkinje cells. Neuron, 29(3), 717-727.

Laezza, C., D'Alessandro, A., Paladino, S., Maria Malfitano, A., Chiara Proto, M. et al.

Endocannabinoid Research Group (2012). Anandamide inhibits the Wnt/beta-catenin signalling

pathway in human breast cancer MDA MB 231 cells. European Journal of Cancer (Oxford,

England : 1990), 48(16), 3112-3122.

29

Llano, I., Leresche, N. & Marty, A. (1991). Calcium entry increases the sensitivity of cerebellar

purkinje cells to applied GABA and decreases inhibitory synaptic currents. Neuron, 6(4), 565-574.

Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al. Molecular Cell Biology. 4th edition. New York: W. H.

Freeman; 2000. Section 20.3, G Protein –Coupled Receptors and Their Effectors.

Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al. Molecular Cell Biology. 4th edition. New York: W. H.

Freeman; 2000. Section 21.2, The Action Potential and Conduction of Electric Impulses.

Mackie, K. (2005). Cannabinoid receptor homo- and heterodimerization. Life Sciences, 77(14),

1667-1673.

Matsuda, L. A., Lolait, S. J., Brownstein, M. J., Young, A. C. & Bonner, T. I. (1990). Structure of a

cannabinoid receptor and functional expression of the cloned cDNA. Nature, 346(6284), 561-564.

Mattes, R. D., Engelman, K., Shaw, L. M. & Elsohly, M. A. (1994). Cannabinoids and appetite

stimulation. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior, 49(1), 187-195.

McPartland, J. M., Glass, M. & Pertwee, R. G. (2007). Meta-analysis of cannabinoid ligand binding

affinity and receptor distribution: Interspecies differences. British Journal of

Pharmacology, 152(5), 583-593.

Mizrachi Zer-Aviv, T., Segev, A. & Akirav, I. (2016). Cannabinoids and post-traumatic stress

disorder: Clinical and preclinical evidence for treatment and prevention. Behavioural

Pharmacology, 27(7), 561-569.

Moreira, F. A. & Crippa, J. A. (2009). The psychiatric side-effects of rimonabant. Revista

Brasileira De Psiquiatria (Sao Paulo, Brazil : 1999), 31(2), 145-153.

Morena, M. & Campolongo, P. (2014). The endocannabinoid system: An emotional buffer in the

modulation of memory function. Neurobiology of Learning and Memory, 112, 30-43.

Nahin, R. L. (2015). Estimates of pain prevalence and severity in adults: United states, 2012. The

Journal of Pain : Official Journal of the American Pain Society, 16(8), 769-780.

Nguyen, P. T., Schmid, C. L., Raehal, K. M., Selley, D. E., Bohn, L. M. & Sim-Selley, L. J. (2012).

Beta-arrestin-2 regulates cannabinoid CB(1) receptor signaling and adaptation in a CNS region-

dependent manner. Biological Psychiatry, 71(8), 714-724.

Nicholson, R. A., Liao, C., Zheng, J., David, L. S., Coyne, L. et al. Lees, G. (2003). Sodium

channel inhibition by anandamide and synthetic cannabimimetics in brain. Brain Research, 978(1-

2), 194-204.

30

Nomura, D. K., Morrison, B. E., Blankman, J. L., Long, J. Z., Kinsey, S. G. et al. Cravatt, B. F.

(2011). Endocannabinoid hydrolysis generates brain prostaglandins that promote

neuroinflammation. Science (New York, N.Y.), 334(6057), 809-813.

Oleson, E. B. & Cheer, J. F. (2012). A brain on cannabinoids: The role of dopamine release in

reward seeking. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine, 2(8), 10.1101/cshperspect.a012229.

Ottani, A., Leone, S., Sandrini, M., Ferrari, A. & Bertolini, A. (2006). The analgesic activity of

paracetamol is prevented by the blockade of cannabinoid CB1 receptors. European Journal of

Pharmacology, 531(1-3), 280-281.

Pertwee, R. G. (2006). The pharmacology of cannabinoid receptors and their ligands: An

overview. International Journal of Obesity, 30, S13-S18.

Pertwee, R. G. (2005). Inverse agonism and neutral antagonism at cannabinoid CB1 receptors. Life

Sciences, 76(12), 1307-1324.

Prospero-Garcia, O., Amancio-Belmont, O., Becerril Melendez, A. L., Ruiz-Contreras, A. E. &

Mendez-Diaz, M. (2016). Endocannabinoids and sleep. Neuroscience and Biobehavioral

Reviews, 71, 671-679.

Rosenberg, E. C., Tsien, R. W., Whalley, B. J. & Devinsky, O. (2015). Cannabinoids and

epilepsy. Neurotherapeutics : The Journal of the American Society for Experimental

NeuroTherapeutics, 12(4), 747-768.

Russo, E. (1998). Cannabis for migraine treatment: The once and future prescription? an historical

and scientific review. Pain, 76(1-2), 3-8.

Ryberg, E., Larsson, N., Sjogren, S., Hjorth, S., Hermansson, N. O. et al. Greasley, P. J. (2007). The

orphan receptor GPR55 is a novel cannabinoid receptor. British Journal of Pharmacology, 152(7),

1092-1101.

Shire, D., Calandra, B., Delpech, M., Dumont, X., Kaghad, M. et al. Ferrara, P. (1996). Structural

features of the central cannabinoid CB1 receptor involved in the binding of the specific CB1

antagonist SR 141716A. The Journal of Biological Chemistry, 271(12), 6941-6946.

Stella, N., Schweitzer, P. & Piomelli, D. (1997). A second endogenous cannabinoid that modulates

long-term potentiation. Nature, 388(6644), 773-778.

Sugiura, T., Kodaka, T., Kondo, S., Tonegawa, T., Nakane, S. et al. Waku, K. (1996). 2-

arachidonoylglycerol, a putative endogenous cannabinoid receptor ligand, induces rapid, transient

31

elevation of intracellular free Ca2+ in neuroblastoma x glioma hybrid NG108-15 cells. Biochemical

and Biophysical Research Communications, 229(1), 58-64.

Sugiura, T., Kondo, S., Sukagawa, A., Nakane, S., Shinoda, A. et al. Waku, K. (1995). 2-

arachidonoylglycerol: A possible endogenous cannabinoid receptor ligand in brain. Biochemical

and Biophysical Research Communications, 215(1), 89-97.

Szabó, G. G., Lenkey, N., Holderith, N., Andrási, T., Nusser, Z. & Hájos, N. (2014).

Presynaptic calcium channel inhibition underlies CB1 cannabinoid receptor-mediated suppression of

GABA release. The Journal of Neuroscience, 34(23), 7958.

Tambaro, S. & Bortolato, M. (2012). Cannabinoid-related agents in the treatment of anxiety

disorders: Current knowledge and future perspectives. Recent Patents on CNS Drug

Discovery, 7(1), 25-40.

Tonstad, S. & Aubin, H. J. (2012). Efficacy of a dose range of surinabant, a cannabinoid receptor

blocker, for smoking cessation: A randomized controlled clinical trial. Journal of

Psychopharmacology (Oxford, England), 26(7), 1003-1009.

Tsou, K., Mackie, K., Sanudo-Pena, M. C. & Walker, J. M. (1999). Cannabinoid CB1 receptors are

localized primarily on cholecystokinin-containing GABAergic interneurons in the rat hippocampal

formation. Neuroscience, 93(3), 969-975.

Turu, G. & Hunyady, L. (2010). Signal transduction of the CB1 cannabinoid receptor. Journal of

Molecular Endocrinology, 44(2), 75-85.

Viñals, X., Moreno, E., Lanfumey, L., CordomÃ, A., Pastor, A. et al. Robledo, P. (2015).

Cognitive impairment induced by Delta9-tetrahydrocannabinol occurs through heteromers between

cannabinoid CB(1) and serotonin 5-HT(2A) receptors. PLoS Biology, 13(7), e1002194.

doi:10.1371/journal.pbio.1002194.

Wacnik, P. W., Luhr, K. M., Hill, R. H., Ljunggren, H. G., Kristensson, K. & Svensson, M. (2008).

Cannabinoids affect dendritic cell (DC) potassium channel function and modulate DC T cell

stimulatory capacity. Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950), 181(5), 3057-3066.

Wager-Miller, J., Westenbroek, R. & Mackie, K. (2002). Dimerization of G protein-coupled

receptors: CB1 cannabinoid receptors as an example. Chemistry and Physics of Lipids, 121(1-2),

83-89.

Wilson, R. I. & Nicoll, R. A. (2001). Endogenous cannabinoids mediate retrograde signalling at

hippocampal synapses. Nature, 410(6828), 588-592.

32

Yang, Y., Yang, H., Wang, Z., Varadaraj, K., Kumari, S. S. et al. Reinach, P. S. (2013).

Cannabinoid receptor 1 suppresses transient receptor potential vanilloid 1-induced inflammatory

responses to corneal injury. Cellular Signalling, 25(2), 501-511.

Zajicek, J. P. & Apostu, V. I. (2011). Role of cannabinoids in multiple sclerosis. CNS Drugs, 25(3),

187-201.

33