kelompok 4 - strategi kloning apoptin dengan plasmid puc19 pada e.coli bl21(de3).pptx
TRANSCRIPT
Kloning Apoptin dari Chicken Anemia Virus
Kelompok 4
Anissa Permatadietha A.
Fransiska Milaniati P.
Khairu Nuzula
Yunita Florensia
Laksita Utami
Pendahuluan
• Kloning merupakan upaya menganak pinakan suatu organisme mirip dengan induknya.
• Dalam bioteknologi, kloning merujuk pada berbagai usaha yang dilakukan untuk menghasilkan salinan berkas DNA atau gen, sel, atau organisme.
• Rangkaian proses kloning :1. Isolasi fragmen DNA dari genom organisme
2. Penentuan sekuens atau fragmen DNA
3. Pembentukan molekul DNA rekombinan
4. Ekspresi gen target dalam sel inang.
• Kloning merupakan terobosan baru untuk mendapatkan sebuah gen yang dibutuhkan keberadaannya bagi kehidupan manusia.
Penelitian dilakukan bertujuan untuk mengkloning gen apoptin dengan menambahkan 10 histidin pada N-Terminal dan 8 Arginin pada C-Terminal
Overview Metode Kloning
Vektor
Gene Apopti
n
DNA Rekombina
nOrganisme
Transformasi
Apoptin• Apoptin adalah protein yang mampu
menginduksi kematian sel spesifik pada sel tumor.
• Apoptin merupakan jenis protein VP3 yang dikodekan oleh Chicken Anemia Virus (CAV)
Persiapan Gen Apoptin
Mengisolasi DNA virus
Mengamplifikasi DNA
Memodifikasi DNA Virus
Isolasi Virus CAV
• CAV adalah virus yang memiliki materi genetik single-stranded DNA
• Virus CAV diambil dari jaringan hati ayam broiler yang terinfeksi
Isolasi DNA Virus
Sampel dipanaskan pada suhu 650C selama 20 menit
Tambahkan Buffer phenol dengan perbandingan 1 : 1
Sentrifugasi selama 5 menit pada 14000 RPM
Didinginkan selama 30 menit pada suhu -200C
Isolasi DNA Virus
Penambahan NaAc 3M sebanyak 1/10 sampel dan etanol 100% sebanyak 2 kali volum sampel.
Sentrifugasi selama 5 menit pada 14000 RPM
Mengamplifikasi DNA
Genom CAV
VP1
VP2
VP3
Ampifikasi dan modifikasi DNA CAV
Untuk mempermudah saat harvesting kita akan menempelkan histidin pada N-terminal apoptin
Metode yang akan digunakan adalah PCR karena mudah dimodifikasi pada primer sehingga penempelan histidin mudah dilakukan
Penempelan histidin pada protein rekombinan dikenal dengan metode histidin-tagging
His-Tag
Desain Primer
• Karena asam amino pada DNA dibaca dari ujung 5’ ke ujung 3’ maka untuk menambahkan histidin pada N-Terminal dilakukan dengan menyisipkan gen pengkode histidin di ujung ke 5’ Primer setelah kodon start
Memasukan ddNTP, DNA Primer, Polimerase dan template DNA ke dalam satu tabung
PCR
Memanaskan pada suhu 940 selama 35 x 1 menit. Untuk mendenaturasi DNA
Memanaskan pada suhu 940C pada suhu 1 menit untuk annealing
Pemanasan pada suhu 720 C untuk
pemanjangan
Penambahan Arginin
Arginin adalah polipeptida yang dapat membantu saat penetrasi DNA kedalam vektor
DNA Hasil amplifikasi direaksikan dengan arginin dan enzim ligase khusus dan direaksikan pada suhu 400C
Hasil reaksi adalah DNA yang mengandung gen apoptin yang mengandung histidin di ujung N-Terminal dan Arginin di C-Terminal
Arginin akan menempel pada ujung 3’ karena pada ujung 5’ cenderung lebih stabil karena adanya gugus fosfat
Isolasi Vektor
Definisi Vektor
Vector adalah molekul DNA yang berfungsi sebagai wahana atau
kendaraan yang akan membawa suatu fragmen DNA masuk ke dalam sel inang dan memungkinkan terjadinya replikasi
dan ekspresi fragmen DNA asing tersebut
Definisi Vektor
• Mempunyai ukuran relative kecil dibandingkan dengan pori dinding sel inang sehingga dapat dengan mudah melintasinya
• Mempunyai sekurang kurangnya dua gen marker yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid ke dalam sel inang
• Mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang kurangnya didalam salah satu marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA, dan
• Memiliki titik awal replikasi (ori) sehingga dapat melakukan replikasi didalam sel inangnya
Syarat Utama VektorSyarat Utama Vektor
Ukuran yang cocok
Ada penanda untuk insersi
DNA
Kemampuan tinggi untuk mengcopy
Syarat Tambahan VektorSyarat Utama Vektor
• Origin of replication : sekuen DNA yang mana replikasi dapat diinsiasi
• Promoter : untuk mengontrol ekspresi gen
• Adaptor
• Multiple clone site : insersi DNA kedalam vector
Bagian Penting VektorKomponen Penting Vektor
Kenapa Vektor pUC 19 ?
Dapat membuat
pustaka DNA dengan
panjang gen < 2000bp
menggunakan host E coli
mudah ditransfeksikan kedalam E coli dengan
metode yang sederhana dan relatif
murah seperti heat shock
cepat bereplikasi
amat mudah diseleksi dengan
metode white/ blue color selection
Alasan memilih Vektor
• vector yang memiki circular double stranded DNA• mempunyai 2686 pasang basa• puC 19 paling banyak digunakan sebagai
rekombinan atau pengenalan DNA asing• puC 19 hampir mirip dengan puC 18 namun
wilayah MCS nya dibalik• dapat dengan mudah dibedakan dari non
rekombinannya berdasarkan perbedaan warna koloni pada media pertumbuhan
Karakteristik Vektor pUC 19
Karakteristik Vektor pUC 19
Perbedaan warna koloni
Karakteristik Vektor pUC 19
Karakteristik Vektor pUC 19 Karakteristik Vektor pUC 19
Komponen Vektor pUC 19
1. Terdapat ori V
2. gen bla yang terdapat ampicilin resistance dan memiliki fragmen DNA special dengan beberapa
perbedaan recognition sites untuk restriksi endonuklease
3. Sekuen Multiple cloning site berada pada bagian 5’
dari lacZ gene
4. N-terminal fragment of β-galactosidase (lac Z) gene of E.
coli.
Komponen Vektor pUC 19
Perbanyakan bakteri
Lisis Sel
Pemisahan Protein dan DNA Kromosom
Pengambilan plasmid
Isolasi pUC 19 Isolasi Vektor pUC 19
Isolasi pUC 19 – Perbanyakan BAKTERI
Bakteri inang ditumbuhkan dalam medium dengan suhu 37o C dan dikocok dengan kecepatan 150 –
250 r/menit
sel E.coli akan membelah sekali setiap 20 menit sampai kultur mencapai
densitas maksimum kira kira 2 sampai 3 x 10^9 sel/ml
dipanen, diambil 3 ml dan disentrifuse pada kecepatan 5700 x g selama 5
menit
Perbanyakan Bakteri
Isolasi DNA plasmid
dilakukan dengan cara isolasi DNA
plasmid pUC 19 yang
terdapat dalam E.coli JM 109.
denaturasi
dengan
alkali
metode
sentrifuge
isopiknat
Lisis Sel
Pilihan metode Isolasi Vektor
LISIS SEL
Buffer P1 + enzim
RNAse A +SDS
+indicator LyseBlue
Bufffer P2
Lisis sel
bakteri
LISIS
Kombinasi RNAse dan SDS inilah yang dapat
merusak dinding dan lisis sel.
rentang pH 12 -12,5 ikatan hydrogen dari DNA
kromosom non supercoiled akan terdenaturasi, heliks ganda terurai dan kedua
rantai polipeptida memisah.
Penambahan P2 untuk memastikan apakah
denaturasi telah terjadi.
Jikalau denaturasi telah terjadi, maka suspense pellet sel akan berwarna biru karena adanya reaksi dengan indicator Lyse Blue
penambahan buffer N3 yang mengandung asam
asetat
DNA bakteri yang sebelumnya terdenaturasi
mengelompok dalam massa DNA linier yang
kusut.
Sentrifugasi selanjutnya pada kecepatan 13000
selama 10 menit
mengendapkan massa DNA ini didasar tabung
sentrifugasi dan meninggalkan plasmid
murni dalam supernatant.
Pemisahan protein dan kromosom
RENATURASI
Penambahan RNAse A (ribonuklease) dan SDS di buffer pertama (P1) menyebabkan sebagian besar protein dan RNA menjadi tidak larut dan dapat dihilangkan pada
tahap sentrifugasi (ikut mengendap bersama massa DNA, dinding serta debris
sel lainnya).
Isolasi pUC 19
Keuntungan metode Sentrifugasi
Karena metode ini menggunakan metode denaturasi alkali maka keuntungannya ialah tidak diperlukan presipitasi menggunakan fenol atau pelarut organic seperti kloroform untuk menghilangkan sisa protein.
Supernatan plasmid murni dicuci 2x
dengan buffer PB dan PE
supernatant plasmid kemudian
dipindahkan ke tabung
mikrosentrifuge baru
sebanyak 2 kali dengan buffer EB (Elution Buffer)
pada 13000 rpm selama satu menit
Hasil elusi inilah DNA plasmid pUC
19 yang telah berhasil
diisolasikan dari E.coli JM109
Isolasi pUC 19 – Pengambilan Plasmid
Buffer PB mengandung
isopropanol dan buffer
PE yang mengandung
96 – 100% ethanol
PENYISIPAN INSERT KE
VEKTOR DENGAN METODE
LIGASI
MEKANISME
Penambahan alkalin
fosfatase pada larutan
vektor
penambahan insert
penambahan buffer
penambahan air (pelarut)
penambahan DNA ligase
inkubasi campuran
larutan
Penambahan alkalin fosfatase
pada larutan vektor dilakukan
sebelum pencampuran dengan insert
Meminimalisasi terjadinya
kemungkinan vektor
menyambung pada vektor itu
sendiri atau vektor
menyambung dengan vektor
lain
Menghilangkan gugus P pada 5’P sehingga menjadi 5’OH (defosforilasi)
Penambahan Alkalin Fosfatase pada Larutan
Vektor
Ligasi
untuk mempertahankan pH pada nilai tertentu agar DNA tidak terdegradasi
digunakan buffer yang mengandung ATP
Buffer biasanya diberikan atau disiapkan sebagai konsentrat 10X yang, setelah pengenceran, konsentrasi ATP menghasilkan sekitar 0,25-1 mM
Penambahan Buffer
Penambahan Air (Pelarut)
ddH2O (double-distilled water)
untuk pemurnian dan proses
vakum
keuntungan: tidak
mengandung EDTA
Kekurangan: peluang
untuk berubahnya
pH
enzim yang mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara ujung 5’-fosfat dan 3’-hidroksil pada DNA yang mengalami nick
DNA Ligase enzim ligase yang
dihasilkan oleh bakteri E. coli yang telah terinfeksi virus T4
T4 DNA
Ligase
Penambahan DNA Ligase
Mekanisme T4 DNA Ligase
hidrolisis kofaktor
menghasilkan kompleks
enzim-adenylate AMP yang berikatan kovalen
dengan grup α-amino residu lysin pada sisi aktif dengan melepaskan pyrofosfat
inorganik (PPi)
sebagian AMP akan berpindah dari sisi
aktif lysin ke ujung bebas
5’-fosfat
ikatan fosfodiester
akan terbentuk antara ujung 3’-OH yang berada di ujung nick dengan 5’-
fosfat & melepaskan
AMP dan enzim
adenylate
suhu 4 °C semalaman, atau pada suhu ruang selama 30 menit - beberapa jam hingga terjadi
transformasi
Inkubasi Campuran Larutan
STRATEGI PEMASUKAN
GEN APOPTIN REKOMBINAN
KE DALAM E.coli BL12(DE3)
Laju pertumbuhan yang
cenderung cepat
Dapat dikultivasi pada
medium kultur biasa
Mengekspresikan dengan
baik berbagai gen asing
yang mengkode protein
target
Pemilihan bakteri Escherichia Coli sebagai Sel Inang dalam Proses Kloning Gen Apoptin
I n c l u s i o n b o d yAkumulasi protein rekombinan, yang
membentuk agregat kompak bersifat inaktif tidak larut
Kelemahan Escherichia coli sebagai Host Cell
Kelemahan Escherichia coli sebagai Host Cell
Strain Escherichia coli
Tingkat efisiensi transformasi yang cenderung
lebih tinggi
Memiliki gen DE3 pengkode T7 RNA polimerase
Memiliki mutasi Ion dan OmpT protease yang
meminimalisir degradasi protein rekombinan
E.coli BL21 (DE3) sebagai Host cell dalam teknik
kloning Gen Apoptin
E.coli BL21 (DE3) sebagai Host cell dalam teknik
kloning Gen Apoptin
Pembuatan bakteri
kompeten
Tahap transforma
si
Identifikasi klon yang diinginkan
Strategi Pemasukan Gen Apoptin Rekombinan ke dalam
E.coli BL21(DE3)
CaCl2
Memperlemah dinding sel
Membantu mengubah sifat permeabilitas sel
MgCl2
Mengganggu kestabilan membran E.coli BL21
Pembuatan E.coli BL21(DE3) kompeten
Tahapan Transformasi
Pembengkakan sel-sel E.coli BL21(DE3)
sehingga dinding menjadi bocor (lisis)
Gen Apoptin membentuk kompleks
resisten Dnase dengan ion-ion Ca2+
yang terikat pada permukaan sel
Pemberian kejutan panas (heat shock)
Recovery E.coli BL21(DE3) melalui
proses pendinginan dan penumbuhan
pada medium kaya nutrien.
Tahapan Transformasi
Elektroforasi (Metode lain dalam tahapan
transformasi)
Elektroforasi (Metode lain dalam tahapan
transformasi)
host tidak dimasuki
DNA apapun
host dimasuki
vektor religasi
host dimasuki
rekombinan dengan /tanpa
fragmen target
Identifikasi Klon Apoptin yang diingingkan
Bagaimana memastikan transformasi berhasil??
Diperlukan cara untuk menseleksi/menapis agar sel
inang yang mengandung DNA yang dituju dapat
diperoleh di antara sel-sel inang lain yang tidak
mengandung DNA yang dituju
Seleksi menggunakan kondisi yang memungkinkan
pertumbuhan sel/faga yang membawa vektor yang
mengandung DNA yang dituju
Screening
Proses yang melibatkan penelusuran sel rekombinan
atau fag yang diperoleh dari transformasi atau
transduksi untuk menemukan klon yang diinginkan
𝑁=ln (1−𝑃)
𝑙𝑛(1− 1𝑛 )
Persamaan matematis untuk menentukan jumlah rekombinan yang perlu di-screening
Screening
Kelompok kami melakukan proses kloning gen apoptin
yang diisolasi dari chicken anemia virus, menggunakan
plasmid sebagai vektornya. Ukuran genom apoptin adalah
1,4 x 103 kb dan ukuran rata-rata fragmen perpustkaan
adalah 2,32 kb. Perpustakaan genomik dibuat dalam
vektor-vektor yang ditransformasi ke dalam sel-sel bakteri
E. coli BL21(DE3). Dengan propabilitas 95%, berapa
banyak koloni bakteri rekombinan yang harus discreening
untuk menemukan fragmen gen apoptin tersebut?
Screening
Langkah 1 : Hitung nilai n (rasio ukuran organisme relatif terhadap fragmen rata-rata dalam perpustakaan gen)
𝑛=1,4×103𝑘𝑏
2,32𝑘𝑏=6,034×102
Langkah 2 : Hitung nilai N (jumlah sel rekombinan yang discreening)
𝑁=ln (1−0,95 )
ln(1− 1
6,034×102 )=1806
Screening
lacZ
Enzim berfungsi
X-gal produk
lacZ insert
enzim tak berfungsi
X-gal produk
Penggunaan metode blue-white screening dalam proses identifikasi klon gen apoptin
dalam E.coli BL21(DE3)
Jika memiliki DNA probe
Suatu bagian dari gen
yang dituju
Gen sejenis dari spesies
lain (orthologue)
Oligonukleotida sintetik
yang disintesis
berdasarkan sekuen
DNA dari gen di atas
Penggunaan metode hibridisasi dalam proses identifikasi klon gen apoptin dalam
E.coli BL21(DE3)
cont’d
Master Plate
Ditumbuhkan pada membran
nitroselulosa yang diletakkan di atas
media pertumbuhan
membran nitroselulosa dilepaskan
Penggunaan metode hibridisasi dalam proses identifikasi klon gen apoptin dalam E.coli BL21(DE3)
Sel bakteri dilisiskan menggunakan NaOHpH dinetralkanProteinaseDicuci
Total DNA [chromosom, plasmid
(vektor + ‘klon’)] menempel pada
membran nitroselulosa
cont’dPenggunaan metode hibridisasi dalam proses identifikasi klon gen apoptin dalam E.coli BL21(DE3)
Film fotografi diproses,Titik gelap menandakan
adanya P radioisotop
Koloni bakteri yang memiliki DNA yang
dituju
Lembar film fotografi dipaparkan kepada
membran nitroselulosa (Autoradiography)
cont’dPenggunaan metode hibridisasi dalam proses identifikasi klon gen apoptin dalam E.coli BL21(DE3)
Strategi Panen (Harvest) dan Pemurnian Gen Apoptin Hasil Kloning
Sentrifugasi hasil blue-white screening
Pemurnian Apoptin dengan teknik IMAC
His-Tag ini memfafilitasi proses pemurnian protein
berdasarkan afinitas selektif protein dengan
polihistinin tersebut terhadap adsorben yang
dilengkapi pengkelat metal seperti Ni2+ atau Co2+.
Terjadi interaksi antara residu histidin dengan ion
logam dan elusi protein dengan imidazole
Strategi Panen (Harvest) dan Pemurnian Gen Apoptin Hasil Kloning
Kelebihan dan Kekurangan
1. Metode Isolasi (metode Phenol – Chloroform):
Metode Kelebihan Kekurangan
Phenol – Chloroform
DNA yang didapatkan lebih murni
Waktu yang dibutuhkan lebih lama
Kolom Adsorpsi Waktu yang dibutuhkan lebih cepat
Memiliki kemungkinan hasil isolasi DNA masih terkontaminasi (polisakarida, protein)
2. Metode Sekuensing DNA (metode Sanger) :
Metode Kelebihan Kekurangan
Metode Sanger Mudah dilakukan Hanya efektif diterapkan pada DNA rantai tunggal
Tidak menggunakan bahan yang mudah merusak sampel
Metode Maxim – Gilbert
Dapat diterapkan pada DNA rantai tunggal maupun rantai ganda
Menggunakan reagen kimia dalam menentukan pembelahan spesifik DNA
3. Metode Isolasi Plasmid (metode denaturasi alkali) :
Dengan menggunakan metode denaturasi alkali, bakteri akan melisis sehingga dapat diambil plasmidnya, dan tidak diperlukannya pemurnian lanjutan.
4. Transformasi Unit (metode heat – shock) :
Dengan melakukan teknik ‘heat-shock‘ — mendinginkan, memanaskan dan mendinginkan kembali– bakteri, maka DNA dapat masuk ke dalam sel. Melakukan metode dikejutpanaskan (heat shock) pada suhu 42°C selama 45 detik akan membuat membran sel akan tertutup kembali karena terjadi perubahan suhu yang mendadak dari suhu rendah ke suhu tinggi. Dengan metode ini, kesterilan kerja dan kontaminasi sel akan terminimalisir.
5. Seleksi Klon Rekombinan (metode Blue – white screening) :
– Kelebihan yang ditawarkan oleh teknik ini adalah metodenya mudah dilakukan dan cepat.
– digunakan metode blue – white screening karena plasmid pUC 19 yang memiliki gen lacZ.