keiji nakajima et al- two tropinone reductases with different stereospecificities are short-chain...

8/3/2019 Keiji Nakajima et al- Two tropinone reductases with different stereospecificities are short-chain dehydrogenases evo

1/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USAV o l . 9 0 , p p . 9 5 9 1 - 9 5 9 5 , O c t o b e r 1 9 9 3B i o c h e m i s t r y

Two t r o p i n o n e r e d u c t a s e s w i t h d i f f e r e n t s t e r e o s p e c i f i c i t i e s a r es h o r t - c h a i n d e h y d r o g e n a s e s e v o l v e d f r o m a common a n c e s t o r( s t e r e o s p e c i f i c i t y / p r o t e i n e v o l u t i o n / t r o p a n e a l k a l o i d s )

KEUI N A K A J I M A , T A K A S H I H A S H I M O T O * , AND YASUYUKI Y AMADAD e p a r t m e n t o f A g r i c u l t u r a l C h e m i s t r y , F a c u l t y o f A g r i c u l t u r e , K y o t o U n i v e r s i t y , K y o t o 6 0 6 - 0 1 , J a p a nC o m m u n i c a t e d b y E r i c E . C o n n , J u l y 9 , 1 9 9 3 ( r e c e i v e d f o r r e v i e w Ma y 2 4 , 1 9 9 3 )ABSTRACT I n t h e b i o s y n t h e t i c p a t h w a y o f t r o p a n e a l k a -l o i d s , t r o p i n o n e r e d u c t a s e ( E C 1 . 1 . 1 . 2 3 6 ) ( T R ) - I a n d T R - l l ,r e s p e c t i v e l y , r e d u c e a common s u b s t r a t e , t r o p i n o n e , s t e r e o s p e -c i f f c a l l y t o t h e s t e r e o i s o m e r i c a l k a m i n e s t r o p i n e a n d p s e u d o -t r o p i n e ( a t 6 t r o p i n e ) . cDNA c l o n e s c o d i n g f o r T R - I a n d T R - l l ,a s w e l l a s a s t r u c t u r a l l y r e l a t e d cDNA c l o n e w i t h a n u n k n o w nf u n c t i o n , w e r e i s o l a t e d f r o m t h e s o l a n a c e o u s p l a n t D a t u r as t r a m o n i u m . T h e cDNA c l o n e s f o r T R - I a n d T R - I I e n c o d ep o l y p e p t i d e s c o n t a i n i n g 2 7 3 a n d 2 6 0 a m i n o a c i d s , r e s p e c t i v e l y ,a n d w h e n t h e s e c l o n e s w e r e e x p r e s s e d i n E s c h e r i c h i a c o l i , t h er e c o m b i n a n t T R s s h o w e d t h e s a m e s t r i c t s t e r e o s p e c i f i c i t y a st h a t o b s e r v e d f o r t h e n a t i v e TR s t h a t h a d b e e n i s o l a t e d f r o mp l a n t s . T h e d e d u c e d a m i n o a c i d s e q u e n c e s o f t h e t w o c l o n e ss h o w e d a n o v e r a l l i d e n t i t y o f 64% i n 2 6 0 - a m i n o a c i d r e s i d u e sa n d a l s o s h a r e d s i g n i f i c a n t s i m i l a r i t i e s w i t h e n z y m e s i n t h es h o r t - c h a i n , n o n m e t a l d e h y d r o g e n a s e f a m i l y . G e n o m i c DNA-b l o t a n a l y s i s d e t e c t e d t h e T R - e n c o d i n g g e n e s i n t h r e e t r o p a n ea l k a l o i d - p r o d u c i n g s o l a n a c e o u s s p e c i e s b u t d i d n o t d e t e c t t h e mi n t o b a c c o . We d i s c u s s h o w t h e t w o T R s may h a v e e v o l v e d t oc a t a l y z e t h e o p p o s i t e s t e r e o s p e c i f i c r e d u c t i o n s .Two s t e r e o s p e c i f i c r e d u c t a s e s c o n s t i t u t e a b r a n c h i n g p o i n t i nt h e b i o s y n t h e s i s o f t r o p a n e a l k a l o i d s ( 1 ) ( F i g . 1 ) . T r o p i n o n er e d u c t a s e ( E C 1 . 1 . 1 . 2 3 6 ) I ( T R - I ) c o n v e r t s t h e 3 - k e t o g r o u po f t r o p i n o n e t o t h e 3 a - h y d r o x y l o f t r o p i n e ( 3 a - h y d r o x y t r o -p a n e ) , w h e r e a s t r o p i n o n e r e d u c t a s e I I ( T R - I I ) r e d u c e s t h es a m e k e t o g r o u p t o t h e 3 3 - h y d r o x y l o f p s e u d o t r o p i n e ( 0 -t r o p i n e ) ( 3 f - h y d r o x y t r o p a n e ) . V a r i o u s t r o p a n e e s t e r s , s u c ha s h y o s c y a m i n e a n d s c o p o l a m i n e , a r e d e r i v e d f r o m t r o p i n e .A l t h o u g h t h e m e t a b o l i s m o f 4 - t r o p i n e i s n o t w e l l u n d e r s t o o d ,c a l y s t e g i n s a n d t i g l o i d i n e a r e p o s s i b l e m e t a b o l i t e s o f t h i ss t e r e o i s o m e r . C o c a i n e f o u n d i n E r y t h r o x y l u m i s a w e l l -k n o w n t r o p a n e e s t e r o f t h e q - t r o p i n e t y p e . B o t h T R - I a n dT R - I I a r e p r e s e n t t o g e t h e r i n a n y g i v e n t r o p a n e a l k a l o i d -p r o d u c i n g s p e c i e s a n d a r e a b s e n t a l t o g e t h e r i n n o n p r o d u c i n gs p e c i e s ( 2 ) . T h e r a t i o s o f t h e t w o TR a c t i v i t i e s v a r y c o n s i d -e r a b l y , d e p e n d i n g o n t h e s p e c i e s , a n d ma y d e t e r m i n e t h e f l u xo f m e t a b o l i t e s a t t h e b r a n c h i n g p o i n t b e c a u s e n o i n t e r c o n -v e r s i o n b e t w e e n t r o p i n e a n d / - t r o p i n e h a s b e e n o b s e r v e d i nv i v o ( 3 ) .C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e s e t w o h i g h l y p u r i f i e d TRs f r o m t h ec u l t u r e d r o o t s o f H y o s c y a m u s n i g e r r e v e a l e d t h a t t h e y h a db o t h common a n d d i f f e r e n t p r o p e r t i e s ( 2 ) . B o t h TR s a r ep r o b a b l y h o m o t e t r a m e r s w i t h 2 9 - t o 3 0 - k D a s u b u n i t s , a n db e l o n g t o t h e N A D P H - d e p e n d e n t , c l a s s B o x i d o r e d u c t a s e s ,w h i c h t r a n s f e r t h e p r o - S h y d r o g e n o f NAD(P)H t o t h e i rs u b s t r a t e s . T h e a f f i n i t y f o r N A D P H i s s i m i l a r i n b o t h e n -z y m e s , a n d t h e i n a b i l i t y o f ED T A t o i n h i b i t e i t h e r TRi n d i c a t e d t h a t n e i t h e r c o n t a i n s z i n c . I n c o n t r a s t , t h e r e a r es e v e r a l n o t a b l e d i f f e r e n c e s b e t w e e n T R - I a n d T R - I I w i t hr e g a r d t o t h e r e v e r s i b i l i t y o f t h e i r r e a c t i o n s a n d t h e i r r e a c -T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t "i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .

L - o r n i t h i n e / L - a r g i n i n e

CH 3N


2/5

9 5 9 2 B i o c h e m i s t r y : N a k a j i m a e t a l .R a d ) . B e c a u s e n o sequence was o b t a i n e d f r o m t h e d i r e c ts e q u e n c i n g o f t h e a m i n o t e r m i n i o f t h e s e p u r i f i e d p r o t e i n s ,p r o b a b l y d u e t o t h e a m i n o - t e r m i n a l b l o c k a g e , t h e i n t e r n a la m i n o a c i d sequences were a n a l y z e d . T h e p u r i f i e d p r o t e i n swere d i g e s t e d b y l y s y l e n d o p e p t i d a s e ( E C 3 . 4 . 2 1 . 5 0 ; WakoP u r e C h e m i c a l , O s a k a ) , a n d t h e p e p t i d e f r a g m e n t s weres e p a r a t e d b y r e v e r s e d - p h a s e H P L C u s i n g YMC p a c k e d c o l -umn A P - 3 0 3 S - 5 3 0 0 A o c t a d e c y l s i l y l s i l i c a (YMC, K y o t o ) ,w i t h a l i n e a r 2 0 - 7 0 % g r a d i e n t o f a c e t o n i t r i l e i n 0 . 1 % ( v o l / v o l )t r i f l u o r o a c e t i c a c i d . T h e a m i n o - t e r m i n a l sequences o f s e v e r a lp e p t i d e f r a g m e n t s were d e t e r m i n e d w i t h a 4 7 7 A / 1 2 0 A gas-p h a s e p r o t e i n sequencer ( A p p l i e d B i o s y s t e m s ) .C o n s t r u c t i o n a n d S c r e e n i n g o f t h e cDNA L i b r a r y . M a n i p -u l a t i o n s o f DNA a n d RNA were d o n e as d e s c r i b e d ( 4 ) . T h ecDNA l i b r a r y was c o n s t r u c t e d f r o m p o l y ( A ) + RNA i s o l a t e df r o m t h e h a i r y r o o t s o f D . s t r a m o n i u m b y u s i n g t h e L i b r a r i a nI I cDNA l i b r a r y c o n s t r u c t i o n system ( I n v i t r o g e n ) w i t hp c D N A I I ( I n v i t r o g e n ) as a c l o n i n g v e c t o r .A n o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e o f t h e sequence 5'-AAYTTYG-ARGCIGCITAYCA-3' ( Y , T or C ; R , A or G ) r e p r e s e n t s t h ei n t e r n a l a m i n o a c i d sequence A s n - P h e - G l u - A l a - A l a - T y r - H i sc o m m o n l y f o u n d i n b o t h T R - I a n d T R - I I . T h e p r o b e wase n d - l a b e l e d w i t h [ a - 3 2 P ] A T P b y T 4 p o l y n u c l e o t i d e k i n a s e a n du s e d t o screen 1 . 5 x 1 0 5 c l o n e s o f t h e cDNA l i b r a r y .F o u r t e e n c l o n e s were i s o l a t e d a n d c l a s s i f i e d i n t o t h r e egroups ( g r o u p s I , II , a n d I I I ) , a c c o r d i n g t o t h e n u c l e o t i d esequences o f b o t h e n d s o f t h e cDNA i n s e r t s . T h e c o m p l e t en u c l e o t i d e sequence o f t h e c l o n e t h a t c o n t a i n e d t h e l o n g e s tcDNA i n s e r t o f e a c h group was d e t e r m i n e d on b o t h s t r a n d sb y u s i n g a s e t o f e x o n u c l e a s e I I I - d e l e t e d c l o n e s . T h e c l o n e sf r o m groups I a n d I I e n c o d e d t h e i n t e r n a l a m i n o a c i d s e -quences c o r r e s p o n d i n g t o T R - I a n d T R - I I , r e s p e c t i v e l y , b u tt h e y l a c k e d t h e a m i n o - t e r m i n a l r e g i o n s . T h e group I I I c l o n e sc o n t a i n e d a f u l l open r e a d i n g f r a m e t h a t c o d e d f o r a p r o t e i nh o m o l o g o u s t o T R s . T h e p o l y p e p t i d e e n c o d e d on t h e groupI I I cDNAs i s s u b s e q u e n t l y r e f e r r e d t o as P 2 9 X .A n a d d i t i o n a l 5 x 1 0 4 c l o n e s o f t h e cDNA l i b r a r y weres c r e e n e d w i t h t h e n e w l y s y n t h e s i z e d o l i g o n u c l e o t i d e p r o b ew i t h t h e sequence 5'-AGAGCCACCAGTAACAAGGGC-3',w h i c h c o r r e s p o n d s t o a n u c l e o t i d e sequence f o u n d i n t h e5 ' - r e g i o n o f t h e cDNAs o f b o t h groups I a n d II . C l o n e s t h a tc o m p r i s e d t h e e n t i r e open r e a d i n g f r a m e s were i s o l a t e d . T h el o n g e s t c l o n e s f r o m groups I , I I , a n d I I I were n a m e d p D T R 1 ,p D T R 2 , a n d pDX, r e s p e c t i v e l y . pDTR1 a n d pDTR2 gave t h esame r e s t r i c t i o n map as t h o s e o f t h e p r e v i o u s l y i s o l a t e ds h o r t e r c l o n e s i n e a c h group, a n d t h e n u c l e o t i d e sequencesa l s o m a t c h e d e x c e p t f o r 1 n t i n p D T R 2 . B e c a u s e t h e o t h e rp a r t s o f t h e sequences m a t c h e d c o m p l e t e l y , i t i s b e l i e v e d t h a tt h e m i s m a t c h was i n t r o d u c e d e i t h e r a t t h e reverse t r a n s c r i p -t i o n s t e p or d u r i n g o t h e r p r o c e d u r e s o f t h e cDNA l i b r a r yc o n s t r u c t i o n , a n d t h a t a l l o f t h e group I I cDNAs were d e r i v e df r o m on e gene.E x p r e s s i o n o f t h e C l o n e d cDNAs i n E s c h e r i c h u z c o l i . AcDNA t r u n c a t e d b y s e v e r a l a m i n o a c i d r e s i d u e s a t t h e a m i n ot e r m i n u s was s e l e c t e d f r o m e a c h group, c o n n e c t e d i n f r a m ew i t h t h e / 3 g a l a c t o s i d a s e - c o d i n g r e g i o n o f pcDNAII a n d ex-p r e s s e d as a f u s i o n p r o t e i n i n E . c o l i s t r a i n NM522 u n d e r t h ec o n t r o l o f l a c p r o m o t e r . F u s i o n p r o t e i n s were d e s i g n e d t oh a v e t h e 3 8 - a m i n o - t e r m i n a l r e s i d u e s o f , g a l a c t o s i d a s e a n dt h e p o l y p e p t i d e o f e i t h e r T R - I , T R - I I , or p e p t i d e P29X m i n u s1 6 - , 4 - , or 2 - a m i n o - t e r m i n a l r e s i d u e s , r e s p e c t i v e l y .TR a c t i v i t i e s i n t h e E . c o l i e x t r a c t s were m e a s u r e d b y u s i n gg a s / l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y w i t h a d e s c r i b e d m e t h o d ( 2 ) .G e n o m i c D N A - B l o t A n a l y s i s . G e n o m i c D N A s i s o l a t e d f r o mm a t u r e l e a v e s were d i g e s t e d w i t h e i t h e r BamHI, E c o R I , orK pn I , s e p a r a t e d b y e l e c t r o p h o r e s i s t h r o u g h a 0 . 8 % agaroseg e l , a n d t r a n s f e r r e d t o G e n e S c r e e n P l u s ( D u P o n t ) . T h e f i l t e rwas h y b r i d i z e d w i t h a DNA p r o b e 3 2 P - l a b e l e d b y t h e r a n d o m -p r i m e d DNA l a b e l i n g k i t ( B o e h r i n g e r M a n n h e i m ) i n a h y -b r i d i z a t i o n s o l u t i o n [ 2 x s o d i u m c h l o r i d e / s o d i u m c i t r a t e

( S S C ) / 0 . 1 % ( w t / v o l ) SDS/10% ( w t / v o l ) d e x t r a n s u l f a t e /5 0 % ( v o l / v o l ) f o r m a m i d e / d e n a t u r e d s a l m o n s p e r m DNA a t1 0 0 , g / m l ] a t 4 2 C a n d w a s h e d i n 0 . 1 x S SC c o n t a i n i n g 0 . 1 %( w t / v o l ) SDS a t 5 5 C . T o r e p r o b e t h e f i l t e r , t h e h y b r i d i z e dp r o b e w a s r e m o v e d b y w a s h i n g t h e f i l t e r i n 0 . 1 x S S C / 0 . 1%( w t / v o l ) SDS a t 1 0 0 C , a n d r e m o v a l o f t h e p r o b e w a sc o n f i r m e d b y a u t o r a d i o g r a p h y .R E S ULT S

I s o l a t i o n o f c D N A s E n c o d i n g T R s . T R - I a n d T R - I I w e r ep u r i f i e d t o h o m o g e n e i t y f r o m c u l t u r e d r o o t s o f D . s t r a m o -n i u m a n d H . n i g e r , r e s p e c t i v e l y , a n d a m i n o a c i d s e q u e n c e so f s e v e r a l i n t e r n a l p e p t i d e f r a g m e n t s w e r e o b t a i n e d f r o m t h ep u r i f i e d e n z y m e s . A n a m i n o a c i d s e q u e n c e o f s e v e n r e s i d u e s ,f o u n d i n p e p t i d e f r a g m e n t s f r o m b o t h T R - I a n d T R - I I , w a sc h o s e n f o r d e s i g n i n g a n o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e , w h i c h w a st h e n u s e d t o s c r e e n 1 . 5 x 1 0 5 c l o n e s f r o m a cDNA l i b r a r yd e r i v e d f r o m t h e c u l t u r e d r o o t s o f D . s t r a m o n i u m . F o u r t e e nh y b r i d i z a t i o n - p o s i t i v e c l o n e s w e r e o b t a i n e d a n d c l a s s i f i e di n t o t h r e e c l o s e l y r e l a t e d b u t d i s t i n c t g r o u p s , o n t h e b a s i s o ft h e i r n u c l e o t i d e s e q u e n c e s . A n o t h e r o l i g o n u c l e o t i d e p r o b ew a s s y n t h e s i z e d a c c o r d i n g t o t h e DNA s e q u e n c e c o m m o n l yf o u n d i n t h e 5 ' e n d s o f t h e c l o n e s o f t h e t w o g r o u p s , a n d t h ecDNA l i b r a r y o f 5 x 1 0 4 c l o n e s w a s s c r e e n e d a g a i n . T h e s et w o r o u n d s o f s c r e e ni n g g a v e p D T R 1 , p D T R 2 , a n d p D X ,w h i c h , r e s p e c t i v e l y , r e p r e s e n t t h e c l o n e s w i t h t h e l o n g e s tcDNA i n s e r t i n g r o u p s I , I I , a n d I I I .P r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n p l a s m i d s pDTR1E, pDTR2E, a n dpDXE w e r e c o n s t r u c t e d s o t h a t t h e p o l y p e p t i d e s e n c o d e d b yp D T R 1 , p D T R 2 , a n d pDX w e r e e x p r e s s e d i n E . c o l i u n d e r t h ec o n t r o l o f l a c p r o m o t e r a s p r o t e i n s f u s e d t o , - g a l a c t o s i d a s e .A f t e r i n d u c t i o n b y 1 mM i s o p r o p y l f 3 - D - t h i o g a l a c t o s i d e a t1 5 C f o r 1 4 h r , s o l u b l e p r o t e i n s w e r e e x t r a c t e d f r o m t h eb a c t e r i a , a n d p r o t e i n s o f t h e e x p e c t e d m o l e c u l a r w e i g h t sw e r e d e t e c t e d b y SDS /PA GE a n a l y s i s . E a c h e x p r e s s i o np l a s m i d p r o d u c e d a s i m i l a r a m o u n t o f t h e f u s i o n p r o t e i n ( d a t an o t s h o w n ) . TR a c t i v i t i e s i n t h e b a c t e r i a l e x t r a c t s w e r em e a s u r e d b y u s i n g g a s / l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( F i g . 2 ) . T h ep r o t e i n e x t r a c t s p r e p a r e d f r o m b a c t e r i a t r a n s f o r m e d w i t hpDTRlE a n d pDTR2E, r e s p e c t i v e l y , c a t a l y z e d NADPH-d e p e n d e n t r e d u c t i o n o f t r o p i n o n e t o t r o p i n e a n d q - t r o p i n e .T h e r e d u c t i o n w a s h i g h l y s p e c i f i c : o n l y o n e o f t h e t w os t e r e o i s o m e r s w a s p r o d u c e d i n e a c h a s s a y . T h e p r o t e i n se x t r a c t e d f r o m b a c t e r i a t r a n s f o r m e d w i t h t h e v e c t o r a l o n e o rw i t h pDXE s h o w e d n o TR a c t i v i t i e s . T h e r e f o r e , pDTR1 a n dpDTR2 e n c o d e d T R - I a n d T R - I I , r e s p e c t i v e l y , w h e r e a s pDXe n c o d e d n e i t h e r .S e q u e n c e A n a l y s i s . p D T R 1 , p D T R 2 , a n d pDX, r e s p e c -t i v e l y , c o n t a i n o p e n r e a d i n g f r a m e s o f 8 2 2 b p , 7 8 3 b p , a n d 8 0 7b p , w h i c h e n c o d e p o l y p e p t i d e s c o m p o s e d o f 2 7 3 - , 2 6 0 - , a n d2 6 8 - a m i n o a c i d r e s i d u e s ( F i g . 3 ) . T h e c a l c u l a t e d m o l e c u l a rw e i g h t s o f t h e s e p o l y p e p t i d e s a r e 2 9 , 6 1 5 , 2 8 , 3 1 0 , a n d 2 8 , 5 8 7 .T h e s u b u n i t s o f b o t h T R - I a n d T R - I I h a v e b e e n d e t e r m i n e dt o b e 2 9 kDa b y SDS/ P AG E a n a l y s i s o f T R - I a n d T R - I Ip u r i f i e d f r o m t h e c u l t u r e d r o o t s o f D . s t r a m o n i u m ( u n p u b -l i s h e d r e s u l t s ) a n d H . n i g e r ( 2 ) , r e s p e c t i v e l y . T h e d e d u c e da m i n o a c i d s e q u e n c e o f T R - I ( e n c o d e d b y p D T R 1 ; F i g . 3 A )c o n t a i n s a l l s e v e n o f t h e p e p t i d e s e q u e n c e s d e t e r m i n e d f o rp u r i f i e d T R - I .pDTR2 h a s t h r e e w e l l - c o n s e r v e d d i r e c t r e p e a t s t h a t e x t e n df r o m t h e c a r b o x y l t e r m i n u s t o t h e 3 ' - n o n c o d i n g r e g i o n ( F i g .3 B ) . T h e s e r e p e t i t i v e s e q u e n c e s w e r e f o u n d i n a l l o f t h ei n d e p e n d e n t c l o n e s o f D . s t r a m o n i u m t h a t e n c o d e d T R - I Ip o l y p e p t i d e . H o w e v e r , t h e s e r e p e a t s a r e a b s e n t i n t h e T R - I IcDNA o f H . n i g e r ( u n p u b l i s h e d r e s u l t s ) a n d a r e t h e r e f o r e n o ta common f e a t u r e o f t h e T R - I I g e n e .T h e d e d u c e d a m i n o a c i d s e q u e n c e s o f T R - I , T R - I I , a n dp e p t i d e P 2 9 X s h o w a h i g h d e g r e e o f h o m o l o g y t o e a c h o t h e r .O f t h e 2 6 0 - a m i n o a c i d r e s i d u e s t h a t o v e r l a p t h e s e q u e n c e s o f

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 9 0 ( 1 9 9 3 )


3/5

B i o c h e m i s t r y : N a k a j i m a e t a l . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 9 0 ( 1 9 9 3 ) 9 5 9 3p l a s m i d ( s t a n d a r d ) p D T R 1 E pDTR2E pDXE p c D N A I I

C D0C Q

e l u t i o n 01,0p a t t e r n Co f GLC0

retention ~ ~ 7 ~ 3OO0 LO0 ' LO O LOO ' L O O Dt i m e ( m i n ) r C ~ c 6 c ,6c6- > c 6 c o , r r . c o a i c 6 P - : c 6 c 6p r o t e i n i na s s a y 2 . 0 2 0 1 0 0 1 0 0m i x t u r e ( , u g ) I_I

F I G . 2 . TR a c t i v i t i e s i n E . c o l i t h a t h a v e b e e n t r a n s f o r m e d w i t h e x p r e s s i o n p l a s m i d s . A n e l u t i o n p a t t e r n o f a u t h e n t i c a l k a l o i d s o n g a s / l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( G L C ) i s s h o w n a t l e f t . p c D N A I I i s a v e c t o r w i t h n o cDNA i n s e r t . N o t e t h a t d i f f e r e n t amounts o f p r o t e i n were u s e d f o r e n z y m ea s s a y s .T R - I a n d T R - I I , 1 6 7 r e s i d u e s ( 6 4 % ) a r e i d e n t i c a l , w h e r e a sp a i r - w i s e c o m p a r i s o n s o f P 2 9 X / T R - I a n d P 2 9 X / T R - I I showt h e s o m e w h a t r e d u c e d i d e n t i t i e s o f 61% ( 1 6 4 / 2 6 8 ) a n d 58%( 1 5 2 / 2 6 0 ) , r e s p e c t i v e l y . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e s et h r e e p r o t e i n s h a v e e v o l v e d f r o m a common a n c e s t o r . T h ea m i n o a c i d h o m o l o g y b e t w e e n T R - I a n d T R - I I wa s p l o t t e dw i t h G e n e W o r k s s o f t w a r e ( I n t e l l i G e n e t i c s ) ( d a t a n o t s h o w n ) .T h e p l 6 t i n d i c a t e d t h a t t h e a m i n o - t e r m i n a l h a l v e s o f T R - I a n dT R - I I s h a r e a h i g h e r h o m o l o g y ( 7 2 % , 9 1 / 1 2 6 ) t h a n t h ec a r b o x y l - t e r m i n a l h a l v e s ( 5 7 % , 7 6 / 1 3 4 ) .T h e p r o t e i n d a t a b a s e ( N a t i o n a l B i o m e d i c a l R e s e a r c hF o u n d a t i o n ) w a s s e a r c h e d f o r p r o t e i n s h o m o l o g o u s t o T R - I .A c o n s i d e r a b l e d e g r e e o f h o m o l o gi e s ( 2 9 - 3 3 % ) was f o u n d i ns e v e r a l s h o r t - c h a i n d e h y d r o g e n a s e s ( S D H s ) , i n c l u d i n g g l u -c o s e d e h y d r o g e n a s e o f B a c i l l u s m e g a t e r i u m ( 5 ) , 2 0 l 3 -

h y d r o x y s t e r o i d d e h y d r o g e n a s e o f S t r e p t o m y c e s h y d r o g e n -a n s ( 6 ) , a n d 1 5 - h y d r o x y p r o s t a g l a n d i n d e h y d r o g e n a s e i n h u -m a n s ( 7 ) . T h e m e m b e r s o f t h i s d e h y d r o g e n a s e f a m i l y u s eNAD(H) o r NADP(H) a s c o f a c t o r s , h a v e s u b u n i t s o f o - 2 5 0 -a m i n o a c i d r e s i d u e s , a n d d o n o t r e q u i r e z i n c f o r c a t a l y s i s ( s e er e f . 8 f o r a r e v i e w ) .S i x a m i n o a c i d r e s i d u e s o f p o s s i b l e f u n c t i o n a l i m p o r t a n c e

a r e s t r i c t l y c o n s e r v e d i n a l l 2 0 o f t h e SDH s c h a r a c t e r i z e d s of a r ( 8 ) . T h e s e r e s i d u e s a r e a l s o c o n s e r v e d i n T R - I , T R - I I , a n dp e p t i d e P 2 9 X , e x c e p t f o r p o s i t i o n 1 4 7 i n P29X ( A l a - 1 4 7 ) ,w h e r e g l y c i n e i s f o u n d i n a l l o t h e r SDHs ( F i g . 4 ) : G l y - 2 8 a n dG l y - 3 4 ( i n t h e n u m b e r i n g o f T R - I ) f o r m a t i g h t t u r n a t t h en u c l e o t i d e - b i n d i n g r e g i o n ( 1 1 ) , A s p - 7 8 h a s b e e n s u g g e s t e d t op a r t i c i p a t e i n h y d r o g e n b o n d i n g t o t h e c o e n z y m e ( 8 ) , a n d t h eh y d r o x y g r o u p o f T y r - 1 7 1 may p a r t i c i p a t e i n t h e h y d r i d e -A

A TGC GA GTTGTGGA C C AC A A A G A A A A C C TTA A TA A A TTTC 4 0TAACTTTTGGGGCTTTTCCATCCCATCTCAAAATAATTGCAAGAAAAA 88ATGGA AGA ATC AA A AGTGTCC ATGATGA ATTGC AACAATGA AGGA AGA 13 6M E E S K V S M M N C N N E G R 1 6T G G AG TCTCAAAG G CACCACAG CCCTT G TT ACTG G T G G CTCTAAAG G C 1 8 4I S L K C 7 7 A v 7 G C s H G 3 2ATT G G G T AT G CAAT AG T G G AAG AATT G G CAG G TCTT G G AG CAAG AG T A 232I G Y A I V E E L A G L G A R V 48TATACATGTTCACGTAATGAAAAAGAACTGGACGAATGCCTTGAAATT 280Y T C S R N E K E L D E C L E I 6 4T G G AG AG AAAAAG G ACTT AAT G TT G AAG G TTCT G TTT G T G ACTT ATT A 3 2 8W R E K G L N V E G S V C D L L 80TCACG T ACT G AACG T G AT AAG CTT AT G CAG ACT G TT G CACAT G T ATTT 37 6S R T E R D K L M Q T V A H V F 96GATGGAAAGCTCAATATTTTGGTGAATAATGCCGGGGTGGTGATACAT 42 4D G K L N I L V N N A G V V I H 11 2AAGGAAGCTAAAGATTTCACAGAAAAACATTACAACATAATTATGGGA 47 2K E A K D F T E X D Y N TI M G 12 8ACTAATTTTGAAGCAGCTTATCATTTATCTCAAATTGCTTATCCATTA 52 0T N r rA A v H - 1 . s 0 7 A Y P L 14 4TTGAAGGCTTCTCAAAATGGGAATGTTATTTTTCTCTCTTCTATTGCT 56 8L K A s 0 N C N Y T F L s s I A 16 0GGATTTTCACCACTGCCTTCTGTTTCTCTTTACTCAGCTTCCAAAGGT 61 6G F S A L P S V S L Y S A S K G 17 6GCAATAAATCAAATCACAAAGAGTTTGGCTTGTGAATGGGCTAAAGAC 66 4A T N O_ M T K S L A C E I A K D 19 2AACATTCGGGTCAATTCAGTTGCTCCGGGAGTCATTTTAACCCCACTG 71 2N T R V N S V A P G V T 1 . P 1 20 8G T T G A A A C T G C A A T T A A G A A A A A T C C T C A T C A A A A A G A A G A A A T A G A C 7 6 0v ..T a T . K N P H Q K v T n 22 4A A T T T T A T T G T C A A C A C T C C T A T G G G C C G G G C C G G A A A G C C C C A A G A A 80 8N r T V X T P M G R A G K P Q E 24 0GTTTCTGCACTAATAGCTTTTCTTTGCTTCCCTGCTGCTTCATATATT 85 6V S A L I A F L C F P A A S Y I 25 6ACG G G CCAG ATCAT AT G G G CT G ACG G T G G ATTCACAG CT AAT G G T G G G 90 4T G Q I I W A D G G F T A N G G 27 2TTTTA A 91 0F s to p 27 3A C A TTA TTTTTGTTA TTTGTAC TTTGGA C C TGTA A C C C GGC C C ATA A T 9 5 8GCTTTGAACACTTCCCATGTCCATGGGCTTGTTGGCCTCCAGGTTTCC 1006ATTTTCATGGGCATGTTGCTTTGGGCCTGTATAATTCTTATGTCAGCT 1054A C C TGC TA TA TGTTC C A A GTTGTTA TC A TC AC A A TA A A A G A GTA A A A T 1102G A T T A A A A A T C A T A A G G T T C C G A T T T T ( A ) n 1129

B A A T T A A G A T A 1 0AGATATAGAAAGGGGTTTCTATAAAAACAACTCGGAGGACCACTTCAT 58CG AAACAACATT AG AACCCATTTCCAG TTCTTCAAT AATTT G AG AG TT 10 6ATGGCTGGAAGCTGGAATCTTGAAGGCTGCACTGCCCTTGTTACTGGT 1 5 4M A G R W N L E G C T A L V T G 16G G C T C T C G A G G C A T A G G G T A T G G G A T C G T A G A G G A A C T A G C C A A G T C T T 20 2G S R G I G Y G I V E E L A S L 3 2GGTGCATCAGTGTATACATGTTCACGTAATCAAAAGGAGCTTAATGAC 25 0G A S V Y T C S R N Q K E L N D 4 8TGCTTGACTCAATGGAGAACTAAGGGGTTCAAAGTTGAAGCCTCTGTT 29 8C L T Q W R S K G F K V E A S V 6 4T G T G ACTT ATCATCAAG ATCT G AACG ACAAG AG CTT AT G AACACT G T A 34 6C D L S S R S E R Q E L M N T V 80GCTAATCATTTCCATGGAAAACTCAATATCTTGGTAAATAATGCTGGT 3 9 4A N H F H G K L N I L V N N A G 9 6ATT G TCAT ATACAAG G AAG CT AAAG ATT ACACT G T GG AAG ATT ACTCT 44 2I V I Y K E A K D Y T V E D Y S 11 2TT AATT AT G AG CATCAACTTTG AG G CT G CTT ACCACTT ATCT G T ACTT 49 0L I M S I N F E A A Y H L S V L 12 8GCACACCCTTTTTTAAACGCATCAGAAAGGGGAAATGTTGTCTTTATT 53 8A H P F L K A S E R C N V V F I 14 4TCTTCTG TTTCCG G G G CTTT AG CAG T G CCAT AT G AG G CT G TTT AT G G A 58 6S S V S C A L A V P Y E A V Y G 16 0GCAACCAAAGGACCAATGGATCAACTCACAAGATGCTTGGCGTTTGAG 6 3 4A T K G A M D Q L T R C L A F E 17 6TGGGCAAAGGACAACATTCGTGTCAATGGTGTTGGACCAGGGGTTATT 68 2W A K D N I R V N G V G P C V I 19 2GCAACTTCTCTGGTCGAAATGACTATTCAAGATCCGGAGCAAAAAGAA 73 0A T S L V E M T I Q D P E Q K E 20 8AATCTGAATAAGCTGATTGATAGATGTGCTCTCCGTCGAATGGGAGAG 77 8N L N K L I D R C A L R R M G E 22 4CCTAAAGAACTTGCAGCAATGGTTGCATTCCTCTGTTTCCCTGCTCCT 82 6P K E L A A M V A F L C F P A A 24 0T C A T A T G T C A C T G G C C A A A T T A T A T A T G T T C A A T G G T C G A C T T X G C 87 4S Y V T G Q I I Y V D G C L M A 25 6AATTGTGGTTTTTAA 88 9N C G F s t op 260TCATCTTTTAATTTGTTTTCTAAGTTAATCAACTAATTATTCAGAGCA 9 3 7A A T A T G C T T TA T A G T G G T G A A A A 7 T A T G G C C A A T G G T GA G T T T TA A T C A 98 5TCCTTTAATTTGTTTATGCTTTTGTAAGTTCATCAAACAATTATTCAG 1033A G C A A T A T G C T T T A T A G T G A T G A A A r I T A T G G G T A A T G C T G G T T T T G A A 1081TCATCCTTTAATTTTTCTCTGCTTTTCTAAGTTAATCAAGTAATTATT 1129TAGAGC(A)n 1135

C CGATCTCTTATTATAGAAGCAAATACGTACTATAGCA 3 7TTAGGCTTAAAACGAAGAATTTACAGAGCTACAAAGATAATCAATCAT 85ATGGCAGGAAGAGAAATTGGTGGTGGAGATAGAAGATGGTCTCTCAGA 13 3M A G R E I G G G D R R W S L R 16GGCATGACTGCACTTGTTACTGGCGGTACTCGTGGTATCGGTTATGCT 18 1G M T A L V T G G T R G I G Y A 3 2ATAGTAGA AGAGCTGGCGAATTTTGGAGC AGAGGTGTATAC ATGTTC A 22 9I V E E L A N F C A E V Y T C S 48CGTAGCCAAAATGATTTGGATGAATGCTTAGAGAAATGGAGGAGAAAG 27 7R S Q N D L D E C L E K W R R K 6 4GGCTTCAAAGTGTCTGGACCTGTATGCGATGTGTCATCGATATCTCAG 325G F K V S G P V C D V S S I S Q 8 0CGACAAACGCTTATGGAATCACTCACTAGTAGTTTCAACGGGAAGCTT 37 3R Q T L M E S V T S S F N G K L 96AATATACTTATAAACAATGCAGGCACAACAATACCAAAAGAAGCCACA 42 1N I L I N N A G T T I P K E A T 11 2AATTTTACTGCAGAAGACTATTCAATCATAATGGGTACTAATTTCGAG 46 9N F T A E D Y S I I M G T N F E 128GCGTCGTACAACCTGTGTCAACTTGCTCATCCCTTATTAAAGGCTTCT 51 7A S Y N L C Q L A H P L L K A S 14 4GGAAATGCAAGTATAGTCTTTAATTCTTCGGCTGCTGGAGTGATTGCA 56 5G N A S I V F N S S A A G V I A 16 0GTCCCCCTCTCATCCATCTATGCCGCATCTAAAGGTGCAATCAACCAA 61 3V P L S S I Y A A S K C A I N Q 17 6GTGACAAAGAGCTTGGCCTGTGAGTGGGCAAAGGACACCATTCGCGTT 66 1V T K S L A C E W A K D S I R V 19 2AATGCAGTTGCGCCATGGATCATCAATACTCCCATCATTGAAGCAGCA 70 9N A V A P I I I N T P I I E A A 20 8TGTCAAGTCCCTAGTCAAAAGAAAAATATAGAAAGCTTAATTGGTCGG 75 7C Q V P S Q K K N I E S L I G R 22 4GCACCTATGAAGCGAGCAGGAGAGCCGAGTGAAGTTTCGTCGCTGGTG 80 5A P M K R A C E P S E V S S L V 24 0ACGTATCTATGCCTTCCCACTGCTTCTTATATCACTGGCCAAATTATT 85 3T Y L C L P T A S Y I T G Q I I 25 6TGTGTAGACGGTGGATACACAGTCAATGGTTTCATCTAA 89 2C V D G G Y T V N G F I s to p 26 8TTGTAATGCTCTGTAACAACAAACATACTTTTIATCTTCTTTATTTAA 94 0TTTGGAGCACATTTTTAAATATATTGCGATTGGCATTTCATACGTATG 98 8GCAAACGTTACTTGATGCCACCTATCTTGTTTCTTAAAAGATGAGATG 1036ATCAATTCAAG ACCACTT ATTT ATT AG CTT ( A) n 1066

F I G . 3 . N u c l e o t i d e a n d d e d u c e d a m i n o a c i d s e q u e n c e s o f T R - I ( A ) , T R - I I ( B ) , a n d P 2 9 X ( C ) cDNAs o f D . s t r a m o n i u m . A m i n o a c i d s e q u e n c e sa r e s h o w n b e l o w t h e n u c l e o t i d e s e q u e n c e s i n o n e - l e t t e r c o d e s . T h e u n d e r l i n e d a m i n o a c i d s e q u e n c e s ( A ) were f o u n d i n p r o t e o l y t i c p e p t i d ef r a g m e n t s o f T R - I t h a t h a d b e e n p u r i f i e d f r o m t h e c u l t u r e d r o o t s o f D . s t r a m o n i u m . A r r o w s a b o v e t h e T R - I I n u c l e o t i d e s e q u e n c e a n d c l o s e da r r o w h e a d s b e l o w t h e s e q u e n c e ( B ) i n d i c a t e t h r e e w e l l - c o n s e r v e d d i r e c t r e p e a t s a n d a l t e r n a t i v e p o l y ( A ) s t a r t s i t e s , r e s p e c t i v e l y .


4/5

9 5 9 4 B i o c h e m i s t r y : N a k a j i m a e t a l .AT R- ITR- I IP 2 9 XDADHG L C O HRDH20SDHP GD HBTH -IT R - I IP 2 9 XDADHGLCDHRD H20 DHPGDH

21917771465

15 013 814 613 113 813 913 113 0

v vG T T A LV T G G S K G I G Y A I V E E L A GL G A RV YGCT A LV T G G S R G T G Y G I V E E L A S L G A S V YGMTALVTICGTRGIGYAIVEELANFGAEVYKNVIFVAG-LGGIGLDTSKELLKRDLKNLGKVVVITGSSTGLGKSMAIRFATEKAKVVG K V A A I T G A A S G I G L ECARTLLG A G A KVVGKTVI I T G G A RG L G A E A A RQ AV A A G A RVVGKVALVTGAAQGIGRAFAEALLLKCAKVA

493 7453 435423 43 3

NG NV I F L S S I A G F S AL P SV - S I ' Y S A S K G A 1 7 7RG NVVF I S SV S G AL AV P Y E - AV Y G A T K G A 16 5NASIVFNSSAAGVIAVPLS-SI S Y A A I S K GA 1 73GGI I CN I G SV T G F N A I Y QV - P V Y S G T K A A 158KGTVINMSSVHEWKIPWPLFVHYAA:SKGG 1 66SGDI I F T AV I A G VV P V IW E - P V YT A S K F A 16 6GG SIVNISSAASGLMGLALT- S S Y G A S K W G 15 8G G I I INMSSLAGSLMPVAQQ -PVYCA SKH G 15 7F I G . 4 . C o m p a r i s o n o f t h e p r o t e i n s e q u e n c e s o f t h e t w o T R s ,p e p t i d e P 2 9 X , a n d r e p r e s e n t a t i v e e n z y m e s o f t h e S DH f a m i l y a t t h ea m i n o - t e r m i n a l c o f a c t o r b i n d i n g f o l d ( A ) a n d a t t h e m i d - c h a i n r e g i o ns u r r o u n d i n g t h e c o n s e r v e d t y r o s i n e r e s i d u e ( B ) . A m i n o a c i d s a r es h o w n i n o n e - l e t t e r c o d e s . R e s i d u e s c o n s e r v e d i n m o r e t h a n s i xp r o t e i n s a r e h a t c h e d . A r r o w h e a d s i n d i c a t e 5 o f t h e 6 - a m i n o a c i dr e s i d u e s r e p o r t e d t o b e s t r i c t l y c o n s e r v e d a m o n g t h e 2 0 SDHsc h a r a c t e r i z e d s o f a r ( 8 ) . DADH, a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e o f D r o s o p h -i l a m e l a n o g a s t e r ( 9 ) ; GLCDH, g l u c o s e d e h y d r o g e n a s e o f B . m e g a -t e r i u m ( 5 ) ; RDH, r i b i t o l d e h y d r o g e n a s e o f E n t e r o b a c t e r a e r o g e n e s( 1 0 ) ; 2 0 , / D H , 2 0 , B - h y d r o x y s t e r o i d d e h y d r o g e n a s e o f S . h y d r o g e n a n s( 6 ) ; PGDH, 1 5 - h y d r o x y p r o s t a g l a n d i n d e h y d r o g e n a s e i n h u m a n s ( 7 ) .

t r a n s f e r p r o c e s s ( 1 2 ) . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e TRs a n dp e p t i d e P 2 9 X a r e m e m b e r s o f t h e S DH f a m i l y a n d , t o o u rk n o w l e d g e , SDHs f r o m p l a n t s h a v e n o t b e f o r e b e e n r e p o r t e d .DN A G e l - B l o t A n a l y s i s . T h r e e t r o p a n e a l k a l o i d - p r o d u c i n gs o l a n a c e o u s s p e c i e s , D . s t r a m o n i u m , H . n i g e r , a n d A . b e l -l a d o n n a , a n d a n o n p r o d u c i n g S o l a n a c e a e , N . t a b a c u m , w e r ea n a l y z e d f o r t h e p r e s e n c e o f t h e g e n e s f o r T R - I , T R - I I , a n dP29X b y g e n o m i c S o u t h e r n h y b r i d i z a t i o n . DNA f r a g m e n t sc o r r e s p o n d i n g t o t h e c a r b o x y l - t e r m i n a l h a l f r e g i o n o f e a c hcDNA w e r e u s e d a s h y b r i d i z a t i o n p r o b e s t o a v o i d c r o s s -h y b r i d i z a t i o n among t h e t h r e e g e n e s ( f o r t h e p r e c i s e cDNAr e g i o n s u s e d f o r t h e p r o b e s , s e e t h e l e g e n d f o r F i g . 5 ) . B o t hT R - I a n d T R - I I g e n e s w e r e d e t e c t e d i n t h e t h r e e t r o p a n ea l k a l o i d - p r o d u c i n g s p e c i e s b u t w e r e n o t f o u n d i n t o b a c c o ,w h e r e a s t h e P 2 9 X - e n c o d i n g g e n e w a s d e t e c t e d o n l y i n D .s t r a m o n i u m a n d A . b e l l a d o n n a ( F i g . 5 ) .

DISCUSSIONT h e d e d u c e d p r i m a r y s t r u c t u r e s o f T R - I a n d T R - I I s h o w t h a tb o t h e n z y m e s b e l o n g t o t h e S DH f a m i l y . T h e n u c l e o t i d e -b i n d i n g r e g i o n i n S DH i s l o c a l i z e d a t t h e a m i n o t e r m i n u s ,

T R - IBa m H I E c o R I K p n

DHANDHANDHANk b p2 3 . 19 . 4 -6 . 6 -4 . 4 -

2.3-2 . 0 -

w h i c h i s m o r e c o n s e r v e d t h a n t h e c a r b o x y l t e r m i n u s i n b o t hT R s . T h e f a c t t h a t t h e t w o TRs s h o w s i m i l a r a f f i n i t i e s f o rN A D P H a n d t r a n s f e r t h e p r o - S h y d r o g e n o f NADPH ( 2 ) a l s os u p p o r t s t h e i d e a t h a t b o t h e n z y m e s b i n d NADPH s i m i l a r l ya t t h e a m i n o - t e r m i n a l r e g i o n . T h e c a r b o x y l - t e r m i n a l r e g i o na p p e a r s t o c o n t r i b u t e m o s t b i n d i n g s i t e s f o r t r o p i n o n e , w h i c hd i f f e r c o n s i d e r a b l y i n t h e t w o e n z y m e s . T h e m o s t p l a u s i b l em o d e l f o r t h e s u b s t r a t e b i n d i n g i n TRs i s t h a t w h e n t r o p i n o n ei s b o u n d a t t h e a c t i v e s i t e o f T R- I, t h e p r o - S h y d r o g e n o fN A D P H i s l o c a t e d i n t h e s i f a c e ( t h e s a m e s i d e a s t h e t r o p a n en i t r o g e n a t o m ) o f t h e 3 - k e t o g r o u p , w h e r e a s t r o p i n o n e i sb o u n d i n t h e u p s i d e - d o w n o r i e n t a t i o n a t t h e a c t i v e s i t e o fT R - I I , s o t h a t t h e p r o - S h y d r o g e n i s t r a n s f e r r e d f r o m t h e r ef a c e o f t h e 3 - k e t o g r o u p .When t h e DNA s e q u e n c e s o f T R - I a n d T R - I I a r e a l i g n e d ,h o m o l o g y e x t e n d s t h r o u g h o u t t h e cDNA s e q u e n c e s ( d a t a n o ts h o w n ) . O u r p r e v i o u s s t u d y s h o w e d t h a t t h e s o l a n a c e o u ss p e c i e s t h a t p r o d u c e t r o p a n e a l k a l o i d s h a v e b o t h e n z y m ea c t i v i t i e s a n d t h a t t h e s e a c t i v i t i e s o c c u r i n v a r i o u s r a t i o s ( 2 ) .O n e p o s s i b l e s c e n a r i o f o r t h e e v o l u t i o n o f TRs i s t h a t ap r o t o t y p e o f t h e TR g e n e e v o l v e d f r o m a n S DH g e n e d u r i n gt h e e a r l y s t a g e o f d i v e r s i f i c a t i o n o f t h e S o l a n a c e a e . T h i sp r o t o t y p e TR p r o t e i n d i d n o t n e c e s s a r i l y h a v e d i s t i n c t s t e -r e o s p e c i f i c i t y f o r t h e r e d u c t i o n o f t r o p i n o n e . S o o n a f t e re v o l u t i o n o f t h e p r o t o t y p e TR g e n e , g e n e d u p l i c a t i o n o c -c u r r e d , f o l l o w e d b y a c c u m u l a t i n g m u t a t i o n s i n t h e c o d i n gr e g i o n s ( e s p e c i a l l y i n t h e t r o p i n o n e - b i n d i n g r e g i o n ) o f e a c hd u p l i c a t e d g e n e , t o t h e p o i n t t h a t e a c h TR e n z y m e a c q u i r e dv e r y s t r i c t s t e r e o s p e c i f i c i t y . A b s e n c e o f TR g e n e s i n t o b a c c om e a n s e i t h e r t h a t t h e p r o t o t y p e TR g e n e e v o l v e d a f t e r t h eD a t u r e a e t r i b e a n d t h e S o l a n e a e t r i b e ( t o w h i c h H y o s c y a m u sa n d A t r o p a b e l o n g ) d i v e r g e d f r o m t h e C e s t r e a e t r i b e ( t ow h i c h t o b a c c o b e l o n g s ) o r t h a t t h e C e s t r e a e t r i b e , i n w h i c ht r o p a n e a l k a l o i d s h a v e n o t b e e n f o u n d , l o s t t h e p r o t o t y p e TRg e n e , t o g e t h e r w i t h t h e a b i l i t y t o s y n t h e s i z e t r o p a n e a l k a -l o i d s , v e r y e a r l y d u r i n g f o r m a t i o n o f t h e t r i b e .T h e e n z y m a t i c r e a c t i o n c a t a l y z e d b y p e p t i d e P 2 9 X h a s n o tb e e n i d e n t i f i e d . J u d g i n g f r o m t h e h i g h h o m o l o g y t o t h e t w oT R s , P 2 9 X a p p e a r s t o b e a n S DH t h a t h a s d i v e r g e d f r o m t h ep u t a t i v e p r o t o t y p e T R . P 2 9 X m i g h t c a t a l y z e t h e r e d u c t i o n o fk e t o n e s i n t h e b i o s y n t h e t i c p a t h w a y o f t r o p a n e a l k a l o i d s w i t hc h e m i c a l s t r u c t u r e s r e l a t e d t o t r o p i n o n e . T h e r e f o r e , we e x -a m i n e d w h e t h e r t h e r e c o m b i n a n t P 2 9 X f u s i o n p r o t e i n ( F i g . 2 )c a n r e d u c e h y g r i n e , a p r o p o s e d p r e c u r s o r o f t r o p i n o n e ( 1 3 )a n d 2 - c a r b o m e t h o x y - 3 - t r o p i n o n e , a p u t a t i v e i n t e r m e d i a t e i nt h e b i o s y n t h e s i s o f c o c a i n e ( 1 3 ) , i n t h e p r e s e n c e o f e i t h e rN A D P H o r NADH a s a c o f a c t o r . H o w e v e r , we c o u l d n o td e t e c t e n z y m e a c t i v i t y t o w a r d t h e s e s u b s t r a t e s ( o u r u n p u b -l i s h e d r e s u l t s ) . T h e P 2 9 X g e n e i s p r e s e n t i n D a t u r a a n d

T R - I IBa m H I E c o R l K p n

DHANDHANDHAN

P 2 9 XBa m H I E c o R I K p n

, .DHANDHANDHAN*4W

F I G . 5 . D e t ec t i o n o f TR a n d P 2 9 X g e n e s i n s o l a n a c e o u s p l a n t s b y g e n o m i c D N A - b l o t a n a l y s i s . DNAs ( 2 0 p g ) f r o m D . s t r a m o n i u m ( l a n e sD ) , H . n i g e r ( l a n e s H ) , A . b e l l a d o n n a ( l a n e s A ) , a n d N . t a b a c u m ( l a n e s N ) w e r e d i g e s t e d w i t h t h e e n z y m e s s h o w n a n d l o a d e d o n e a c h l a n e .T h e f i l t e r w a s s u c c e s s i v e l y h y b r i d i z e d w i t h t h r e e cDNA p r o b e s : T R - I , 3 0 7 - b p E a r I - N d e I f r a g m e n t o f pDTR1 ( n t 5 6 3 - 8 6 9 ) ; T R - I I , 2 6 1 - b p Nd eI f r a g m e n t o f pDTR2 ( n t 5 6 9 - 8 2 9 ) ; o r P 2 9 X , 4 2 5 - b p P s t I - A c c I f r a g m e n t o f pDX ( n t 4 3 4 - 8 5 8 ) . P o s i t i o n s o f s i z e m a r k e r s a r e s h o w n a t l e f t .

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 9 0 ( 1 9 9 3 )

"W

.. . :; , -: * .. .. . . . . ;


5/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 9 0 ( 1 9 9 3 ) 9 5 9 5A t r o p a , b u t i s n o t p r e s e n t i n H y o s c y a m u s a n d t o b a c c o .F u r t h e r m o r e , t h i s g e n e i s e x p r e s s e d r e l a t i v e l y s t r o n g l y i n t h er o o t a n d t h e s t e m o f D . s t r a m o n i u m b u t i s e x p r e s s e d v e r yl i t t l e i n t h e p l a n t o f A . b e l l a d o n n a ( o u r u n p u b l i s h e d r e s u l t s ) .T h e r e f o r e , t h e n a t u r a l c a t a l y t i c p r o d u c t s o f P 2 9 X m i g h t b es e c o n d a r y m e t a b o l i t e s t h a t a r e p r e s e n t i n D a t u r a ( a n d p o s -s i b l y i n A t r o p a a t l o w l e v e l s ) b u t a r e a b s e n t i n H y o s c y a m u sa n d t o b a c c o , a l t h o u g h we c a n n o t s u g g e s t s u i t a b l e c a n d i d a t em e t a b o l i t e s o n t h e b a s i s o f t h e c u r r e n t p h y t o c h e m i c a l i n f o r -m a t i o n a v a i l a b l e r e g a r d i n g t h e s e s p e c i e s .I n v i e w o f t h e r e l a t i v e l y r e c e n t e v o l u t i o n o f f l o w e r i n gp l a n t s d u r i n g t h e l a s t 1 5 0 t o 2 0 0 m i l l i o n y e a r s , t h e c h e m i c a ld i v e r s i t y o f s e c o n d a r y m e t a b o l i t e s i s t h e c o n s e q u e n c e o fc o n t i n u i n g e v o l u t i o n o f v a r i o u s e n z y m e s w i t h d i s t i n c t i v es p e c i f i c i t i e s . S t u d i e s o f e n z y m e s f r o m v a r i o u s s o u r c e s s u g -g e s t t h a t o n l y r e l a t i v e l y s m a l l c h a n g e s i n a m i n o a c i d s e -q u e n c e s a r e n e e d e d t o a l t e r s u b s t r a t e o r p o s i t i o n a l s p e c i f i c -i t i e s o f s o m e e n z y m e s . F o r e x a m p l e , o n l y 1 - a m i n o a c i ds u b s t i t u t i o n i n l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e o f B a c i l l u s s t e a r o t h e r -m o p h i l u s i s s u f f i c i e n t t o c o n v e r t t h e e n z y m e t o m a l a t ed e h y d r o g e n a s e ( 1 4 ) . T h e p o s i t i o n a l s p e c i f i c i t y o f o x y g e n -a t i o n i n m a m m a l i a n l i p o x y g e n a s e s i s d e t e r m i n e d b y a s m a l ln u m b e r o f a m i n o a c i d r e s i d u e s t h a t p o s i t i o n t h e s u b s t r a t e i nt h e a c t i v e s i t e ( 1 5 ) . S i m i l a r p r i m a r y s t r u c t u r e s o f t w o p l a n tf l a v o n o l s u l f o t r a n s f e r a s e s s u g g e s t t h a t a new p o s i t i o n a l s p e c -i f i c i t y f o r s u l f a t i o n ma y h a v e e v o l v e d i n F l a v e r i a a n d r e l a t e ds p e c i e s ( 1 6 ) . O u r p r e s e n t s t u d y s u g g e s t s t h a t s t e r e o s p e c i f i c i t yo f e n z y m e s ma y a l s o b e a l t e r e d d u r i n g d i v e r s i f i c a t i o n o fs p e c i e s . I t s h o u l d b e n o t e d , h o w e v e r , t h a t c a t a l y t i c a l l yr e l a t e d e n z y m e s w i t h d i f f e r e n t s t e r e o s p e c i f i c i t i e s d o n o ta l w a y s e v o l v e f r o m common a n c e s t o r s . D - L a c t a t e d e h y d r o -g e n a s e o f L a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m , f o r e x a m p l e , b e l o n g s t ot h e D - i s o m e r - s p e c i f i c d e h y d r o g e n a s e f a m i l y a n d s h o w s n os i g n i f i c a n t h o m o l o g y t o L - l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e o f t h e s a m es p e c i e s ( 1 7 ) . M o l e c u l a r c h a r a c t e r i z a t i o n o f m a n y o t h e r e n -

z y m e s i n v o l v e d i n s e c o n d a r y m e t a b o l i s m i s e x p e c t e d t op r o v i d e f u r t h e r e x a m p l e s o f t h e f a s c i n a t i n g p r o c e s s o f e n -z y m e e v o l u t i o n .1 . D r a g e r , B . , H a s h i m o t o , T . & Y a m a d a , Y . ( 1 9 8 8 ) A g r i c . B i o l .C h e m . 5 2 , 2 6 6 3 - 2 6 6 7 .2 . H a s h i m o t o , T . , N a k a j i m a , K . , O n g e n a , G . & Y a m a d a , Y .( 1 9 9 2 ) P l a n t P h y s i o l . 1 0 0 , 8 3 6 - 8 4 5 .3 . Y a m a d a , Y . , H a s h i m o t o , T . , E n d o , T . , Y u k i m u n e , Y . , K o h n o ,J . , H a m a g u c h i , N . & D r a g e r , B . ( 1 9 9 0 ) i n S e c o n d a r y P r o d u c t sf r o m P l a n t T i s s u e C u l t u r e , e d s . C h a r l w o o d , B . V . & R h o d e s ,M . J . C . ( C l a r e n d o n , O x f o r d ) , p p . 2 2 7 - 2 4 2 .4 . S a m b r o o k , J . , F r i t s c h , E . F . & M a n i a t i s , T . ( 1 9 8 9 ) M o l e c u l a rC l o n i n g : A L a b o r a t o r y M a n u a l ( C o l d S p r i n g H a r b o r L a b .P r e s s , P l a i n v i e w , N Y ) , 2 n d E d .5 . J a n y , K . - D . , U l m e r , W . , F r o s c h l e , M. & P f l e i d e r e r , G . ( 1 9 8 4 )FEBS L e t t . 1 6 5 , 6 - 1 0 .6 . M a r e k o v , L . , K r o o k , M . & J o r n v a l l , H . ( 1 9 9 0 ) FEBS L e t t . 2 6 6 ,5 1 - 5 4 .7 . K r o o k , M . , M a r e k o v , L . & J o r n v a l l , H . ( 1 9 9 0 ) B i o c h e m i s t r y 2 9 ,7 3 8 - 7 4 3 .8 . P e r s s o n , B . , K r o o k , M . & J o r n v a l l , H . ( 1 9 9 1 ) E u r . J . B i o c h e m .2 0 0 , 5 3 7 - 5 4 3 .9 . T h a t c h e r , D . R . ( 1 9 8 0 ) B i o c h e m . J . 1 8 7 , 8 7 5 - 8 8 3 .1 0 . I r i e , S . , D o i , S . , Y o r i f u j i , T . , T a k a g i , M . & Y a n o , K . ( 1 9 8 7 ) J .B a c t e r i o l . 1 6 9 , 5 1 7 4 - 5 1 7 9 .1 1 . G h o s h , D . , W e e k s , C . M . , G r o c h u l s k i , P . , D u a x , W. L . , E r -

m a n , M . , R i m s a y , R . L . & O r r , J . C . ( 1 9 9 1 ) P r o c . N a t l . A c a d .S c i . U S A 8 8 , 1 0 0 6 4 - 1 0 0 6 8 .1 2 . A l b a l a t , R . , G o n z A l e z - D u a r t e , R . & A t r i a n , S . ( 1 9 9 2 ) FEBSL e t t . 3 0 8 , 2 3 5 - 2 3 9 .1 3 . L e e t e , E . ( 1 9 9 0 ) P l a n t a M e d . 5 6 , 3 3 9 - 3 5 2 .1 4 . C l a r k e , A . R . , A t k i n s o n , T . & H o l b r o o k , J . J . ( 1 9 8 9 ) T r e n d sB i o c h e m . S c i . 1 4 , 1 4 5 - 1 4 8 .1 5 . S l o a n e , D . L . , L e u n g , R . , C r a i k , C . S . & S i g a l , E . ( 1 9 9 1 )N a t u r e ( L o n d o n ) 3 5 4 , 1 4 9 - 1 5 2 .1 6 . V a r i n , L . , D e L u c a , V . , I b r a h i m , R . K . & B r i s s o n , N . ( 1 9 9 2 )P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 9 , 1 2 8 6 - 1 2 9 0 .1 7 . T a g u c h i , H . & O h t a , T . ( 1 9 9 1 ) J . B i o l . C h e m . 2 6 6 , 1 2 5 8 8 - 1 2 5 9 4 .

B i o c h e m i s t r y : N a k a j i m a e t a l .

keiji nakajima et al- two tropinone reductases with different stereospecificities are short-chain...

Documents