instituto politÉcnico nacional secretarÍa de...

Multidisciplinario Macrophomina 1350 SIP-IPN (INFORME 2011) 1

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

SECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO

INFORME ANUAL 2011 DE ACTIVIDADES DE LA PROPUESTA DE INVESTIGACIÓN MULTIDISCIPLINARIA

‘ANÁLISIS GENÉTICO Y GENÓMICO DEL PATOSISTEMA Macrophomina phaseolina-FRIJOL (REGISTRO 1350)’

COORDINADOR:

DR. NETZAHUALCOYOTL MAYEK PÉREZ (CEBIOGEN)

MÓDULOS DEL PROYECTO:

Director de Módulo Adscripción Módulo

Sanjuana Hernández Delgado CEBIOGEN Análisis patogénico y filogenético de M. phaseolina

Netzahualcoyotl Mayek Pérez CEBIOGEN Bases genéticas de la resistencia a M. phaseolina en frijol

Raymundo Rosas Quijano CEBIOGEN Expresión diferencial de genes de resistencia a M. phaseolina y/o sequía

Jesús G. García Olivares CEBIOGEN Reacción de germoplasma de frijol a M. phaseolina

Víctor R. Moreno Medina CEBIOGEN Respuesta fisiológica de M. phaseolina al déficit hídrico

Juan M. González Prieto CEBIOGEN Identificación de genes involucrados en la patogénesis de M. phaseolina

REYNOSA, TAMAULIPAS FEBRERO DE 2012


RESUMEN

El hongo Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid. causa la enfermedad conocida domo „pudrición carbonosa‟ o „tizón cenizo‟ del tallo en frijol y otros hospedantes de importancia económica. La enfermedad reduce la calidad y la cantidad del rendimiento de grano y progresa particularmente en condiciones de deficiencia hídrica y de altas temperaturas, favorables para el desarrollo del hongo pero desfavorables para el crecimiento y desarrollo del frijol. Alrededor del 75% de las 2 millones de hectáreas que se siembran anualmente con frijol en México se cultivan en ambientes con problemas de sequía y temperaturas extremosas recurrentes. A pesar de los potenciales daños que M. phaseolina puede ocasionar en frijol, poco se sabe de la biología y patología del hongo en frijol y su interacción (patosistema). En esta propuesta pretende ser la base de una línea de investigación básica, sólida y de largo aliento se estudian los mecanismos que generan variabilidad genética y patogénica (virulencia) en M. phaseolina y su posible evolución y filogenia, así como los efectos del estrés osmótico en la fisiología, bioquímica y capacidad parasítica en frijol del hongo. Además, se mide la reacción de germoplasma de frijol a cepas altamente virulentas del hongo y se ha detectado germoplasma con resistencia al mismo, el cual se ha cruzado con germoplasma susceptible y así determinar las bases genéticas de la resistencia a M. phaseolina por una parte. También, dicho germoplasma segregante se avanzó generacionalmente para determinar las bases de la resistencia genética en campo al hongo y a la sequía. Finalmente, el patosistema se analiza bajo condiciones de deficiencia hídrica para caracterizar molecularmente los determinantes de la resistencia a ambos factores adversos vía la detección y posterior análisis de los genes diferencialmente expresados en condiciones controladas y germoplasma con respuesta contrastante al patógeno y la sequía. Para el primer año de actividades de esta propuesta, podemos resumir los avances a continuación. Se estableció un cepario de aislamientos de M. phaseolina originarios de distintas regiones de México así como de otros países tales como EUA, Italia, Australia, Brasil y Japón. Los aislamientos (40) se han purificado a partir de cultivos de un solo microesclerocio y se cuenta con las cepas en aceite mineral. El análisis patogénico y filogenético inicia en este segundo año, mientras que la identificación de los factores de virulencia de aislamientos selectos del hongo está en proceso. Se ha determinado la posible asociación entre estés osmótico y agresividad de M. phaseolina in vitro, y la identificación de osmolitos asociados con dicha respuesta de tolerancia al estrés osmótico variable está en proceso. Ensayos en condiciones de campo y controladas han indicado mayor resistencia en germoplasma de la raza genética Mesoamericana, de la cual se ha seleccionado al genotipo BAT 477 para cruzarlo con la variedad Pinto UI-114 (susceptible a sequía y M. phaseolina) y obtener las generaciones filiales F1 a F8. En dos localidades del estado de Tamaulipas y dos de Veracruz se han evaluado las F8 con testigos y los progenitores para determinar la respuesta del germoplasma en condiciones variables de humedad. Finalmente, se han estandarizado las condiciones para evaluar la respuesta de germoplasma de frijol (BAT 477 y Pinto UI-114) a M. phaseolina y sequía y se han obtenido muestras en condiciones de deficiencia hídrica para así identificar los genes diferencialmente expresados en condiciones de estrés individual y/o combinado.


INTRODUCCIÓN

El frijol común (Phaseolus vulgaris L.) es un cultivo importante originario de América. En México, el mejoramiento genético del frijol común inició en 1943 con la colecta de germoplasma nativo y, posteriormente, las primeras variedades genéticamente mejoradas se desarrollaron a partir de variedades criollas sobresalientes. Posteriormente, se realizó recombinación entre el germoplasma nativo y germoplasma exótico. De 1943 al 2000 el Programa de Mejoramiento Genético del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) de México ha desarrollado y liberado más de 120 variedades mejoradas de frijol común para todas las áreas productoras del país. Las variedades desarrolladas son diversas en cuanto a su hábito de crecimiento, ciclo biológico o tipo del grano (Rosales-Serna et al., 2003). La base genética del frijol común se ha ampliado constantemente a través de la utilización de progenitores genéticamente contrastantes en los bloques de cruzamientos de los programas de mejoramiento genético de la especie (Acosta-Gallegos et al., 2000).

La producción de frijol común es afectada por diversos factores bióticos

(enfermedades, plagas insectiles, malezas) y abióticos (salinidad o acidez del suelo, altas o bajas temperaturas, déficit hídrico) que ocasionan estrés en el cultivo. Entre los hongos que infectan frijol y que además ocasionan importantes pérdidas en la producción destaca Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid., enfermedad favorecida por el estrés ambiental producido por la sequía y las altas temperaturas (Mayek-Pérez et al., 1997), condiciones particularmente frecuentes en la producción del frijol común en el Norte y el Altiplano semiárido de México. La pudrición carbonosa infecta al frijol común durante cualquier etapa de crecimiento. El hongo causa lesiones oscuras en epicótilos e hipocótilos de plántulas y, después, la plántula muere debido a la obstrucción de los vasos del xilema y al marchitamiento vascular. En plantas adultas, el patógeno causa decoloración de raíces y tallos y produce micelio oscuro y microesclerocios negros. Los tallos muestran lesiones oscuras longitudinales y la planta se defolia y marchita (Abawi y Pastor-Corrales, 1990). Dos aspectos juegan un papel importante en el desarrollo de la enfermedad en frijol: 1) El hongo M. phaseolina muestra amplia diversidad morfológica (Mayek-Pérez et al., 1999); fisiológica (Manici et al., 1995; Mihail y Taylor, 1995); patogénica (Manici et al. ,1995; Mihail y Taylor, 1995; Mayek-Pérez et al., 2001; Su et al., 2001; Reyes-Franco et al., 2005) y genética (Mihail y Taylor, 1995; Jones et al., 1998; Su et al., 2001; Mayek-Pérez et al., 2001; Reyes-Franco et al., 2005) misma que incrementa la adaptabilidad del patógeno a ambientes diversos; 2) el hongo existe en dos formas dentro de su ciclo de vida asexual, una sub-fase o forma saprofítica (denominada Rhizoctonia bataticola) donde el hongo principalmente produce microesclerocios y otra sub-fase patogénica (M. phaseolina) donde el patógeno principalmente produce picnidios. En la fase patogénica el hongo es un patógeno no específico y ataca a un amplio rango de cultivos económicamente importantes tales como frijol común (P. vulgaris), maíz (Zea mays), sorgo (Sorghum bicolor), soya (Glycine max), ajonjolí (Sesamum indicum), cacahuate (Arachis hypogea), algodonero (Gossypium hirsutum), girasol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius) y cucurbitáceas como sandía (Citrullus lanatus) y melón (Cucumis melo) (Dhingra y Sinclair, 1978). La incidencia y desarrollo de la pudrición carbonosa es favorecida por la presencia de altas temperaturas y condiciones de déficit hídrico o sequía (Abawi y Pastor-Corrales, 1990). Mayek-Pérez et al. (2001) observaron la


diferenciación patogénica y genética entre aislamientos de M. phaseolina con base en el origen y los aislamientos de regiones tropicales fueron más agresivos en frijol; mientras que Su et al. (2001) analizaron aislamientos del hongo de cuatro parcelas que habían sido cultivadas durante al menos 10 años contínuos con algodonero, soya, sorgo y maíz y, con base en los claros patrones de diferenciación patogénica, genética y fisiológica entre aislamientos, sugirieron la especialización de Macrophomina. Por su parte, Almeida et al. (2003) determinaron que la mayor diversidad genética en M. phaseolina ocurre con la rotación de cultivos, mientras que el monocultivo induce la menor diferenciación genética entre aislamientos.

La deficiencia hídrica causa diferentes cambios bioquímicos y fisiológicos en las plantas, tales como la reducción de la tasa de fijación de CO2, la acumulación de osmolitos y de osmoprotectores y la alteración del metabolismo de los carbohidratos (Tabaeizadeh, 1998). También, en frijol reduce el crecimiento debido a que afecta la tasa de alargamiento celular en las diferentes partes vegetativas de la planta (Mayek-Pérez et al., 1997, 2002); afecta significativamente la tasa transpiratoria, el potencial hídrico y el potencial de turgencia, al reducirlos, incrementando por otra parte la resistencia estomática, la temperatura de las hojas y el potencial osmótico (Mayek-Pérez et al., 1997; 2002). Finalmente, las alteraciones en fisiología y bioquímica de la planta de frijol debidas al déficit de humedad se traducen, en mayor o menor grado, en el rendimiento y sus componentes (Singh, 1995; Acosta-Gallegos y White, 1991; Singh et al., 2001; Schneider et al., 1997a). También, los efectos del déficit hídrico se traducen en frijol en su predisposición al ataque de enfermedades tales como las pudriciones de raíz. La predisposición es la tendencia de un tratamiento o condición para actuar antes de la inoculación afectando la susceptibilidad a un parásito (Schoeneweiss, 1986). El déficit hídrico, al ser un factor ambiental que altera el estatus hídrico de las plantas, los procesos bioquímicos y fisiológicos de las mismas, así como el crecimiento, desarrollo y productividad, es un factor importante de predisposición a enfermedades, entre las que destacan las pudriciones de la raíz causadas por Macrophomina (Mayek-Pérez et al., 1997, 2002, 2004, 2005) y, adicionalmente, favorece el crecimiento y la patogenicidad del hongo (Olaya et al., 1996; Cervantes-García et al., 2003; Lira-Méndez y Mayek-Pérez, 2005). El efecto de predisposición de la sequía a enfermedades en plantas se puede deber o bien al favorecer el desarrollo del hongo como a la inhibición o reducción en la velocidad de acción de las defensas del hospedante (Schoeneweiss, 1986).

Es importante identificar los genes relevantes al patosistema y caracterizar su

regulación y respuesta a la pudrición carbonosa, la sequía o ambos factores estresantes (Schneider et al., 1997; Mayek-Pérez et al., 2002) dado que la combinación de la resistencia de diferentes fuentes de resistencia (piramidación genética) proveerá de resistencia estable y durable. En la variedad resistente a sequía Pinto Villa se han identificado genes de respuesta a sequía asociados con la protección celular, metabolismo de azúcares y la síntesis de proteínas. Además, se han analizado genes de transcripción de proteínas abundantes en embriogénesis tardía (LEA) como el gen PvLEA3 así como ADN complementarios asociados con la síntesis de acuaporinas restringidas en el tejido del floema del frijol (Barrera-Figueroa et al., 2007; Montalvo-Hernández et al., 2008; Montero-Tavera et al., 2008). No obstante éstos avances, sigue sabiéndose poco sobre las diferencias fundamentales y las vías de ‘comunicación cruzada’ entre las rutas de señalización de la respuesta a sequía, M. phaseolina y/o ambas (Mayek-Pérez et al., 2004).


La variación continua de los fenotipos observados para muchas características importantes en la agricultura son causados por la segregación de poligenes independientes con efectos menores (Paterson et al., 1990). Los poligenes pueden detectarse y mapearse en intervalos de 10 a 20 cM como caracteres de loci cuantitativos (QTLs), particularmente en el caso de marcadores moleculares de ADN. Tal localización es suficiente para ciertos estudios de su estudio y manipulación. Sin embargo, las estimaciones altamente precisas de la localización en el mapa de un QTL particular, dentro de un rango de1 a 2 cM es necesario para una selección asistida por marcadores moleculares realmente efectiva (Prabhu et al., 1999); la disección de genes dentro de un loci complejo (Chase et al., 1997) y el mapeo físico de genes asociados con QTLs (Meksem et al., 1998). El mapeo fino de QTLs no puede alcanzarse utilizando poblaciones F2 o líneas endogámicas recombinantes (Darvasi y Soller, 1995). Lo anterior debido a que pueden ocurrir errores en la determinación de fenotipos y a los efectos de loci que alteran las características independientemente de los QTLs de los cuales el mapa se genera (Kearsey y Farquhar, 1998). El mapeo fino descansa en el análisis de sub-poblaciones derivadas en las cuales los QTLs pueden posteriormente localizarse. Tales métodos incluyen: mapeo por sustitución en líneas F1BC2 (Paterson et al., 1990); mapeo de líneas entrecruzadas avanzadas (Darvasi y Soller, 1995); mapeo en líneas endogámicas recombinantes de retrocruza (Eshed y Zamir, 1995); y mapeo en sub-líneas de poblaciones endogámicas recombinantes (Haley et al., 1994). Cada uno de los métodos anteriores implica el aislamiento de los QTLs en una región de 30 a 40 cM utilizando marcadores moleculares, seguido del análisis de los eventos de recombinación dentro de dicha región en una población alternativa. Un ciclo individual de análisis de recombinación puede localizar a los QTLs dentro de intervalos menores a 1 cM (Meksem et al., 1999). Ciclos subsecuentes generados por eventos de recombinación recientemente verificados reducirán el tamaño del intervalo que permanezca pendiente de analizar proporcionando una densidad de marcadores y de tamaño de población suficientes. El grado de localización necesario para los QTLs individuales varía dependiendo de la característica y el locus estudiado. Tanto la selección asistida por marcadores como la separación de un QTL benéfico de un QTL deletéreo estrechamente ligado serán frecuentemente efectivas con la localización de un intervalo de 1 cM. Sin embargo, para el aislamiento de genes en intervalos cada vez menores se podrá requerir debido a que las regiones del genoma de las plantas varían ampliamente en sus frecuencias e recombinación por Mbp de ADN (Funke et al., 1993). El frijol común tiene un genoma de 2N = 2X = 22 y se ha estimado en 637 Mbp o 0.66 pg/IC (Arumuganathan y Earle, 1991). De ahí que el grado de saturación con marcadores y la cantidad del mapeo fino requerido para cada QTL pueda variar dependiendo del grupo de ligamiento y del número de QTLs implicados. La heredabilidad de características asociadas con QTLs puede variar ampliamente (Kearsey y Farquhar, 1998). Sin embargo, los métodos para el mapeo fino y la disección genética de QTLs pueden aplicarse a datos de características registrados en campo donde la heredabilidad cercana a la unidad es raramente alcanzada (Njiti et al., 1998).

En frijol común la resistencia a M. phaseolina y sequía es variable y va desde

reducida a moderada y depende del ambiente, nivel del estrés hídrico, fenología de la planta, genotipo u origen genético del germoplasma implicado. Además, los QTLs ubicados para cada uno de los factores estresantes incluidos en este trabajo varían en cuanto al grupo de ligamiento donde se han ubicado y a su heredablidad y grado


de explicación (Schneider et al., 1997b; Miklas et al., 1998; Schneider et al., 2001). La resistencia genética a M. phaseolina es una opción de manejo integrado durable, barata y práctica en el cultivo del frijol. Se ha detectado germoplasma de frijol con resistencia genética a M. phaseolina (Pastor-Corrales and Abawi, 1988; Mayek-Pérez et al., 2001a, 2002) y sequía (Singh, 1995; Acosta-Gallegos y White, 1991; Singh et al., 2001; Schneider et al., 1997a; Terán y Singh, 2002; Frahm et al., 2004) en México y otros países. La combinación de la resistencia a factores adversos de fuentes de resistencia diferentes proveerá de resistencia durable a dichos factores. Olaya et al. (1996) y Mayek-Pérez et al. (2001b) determinaron que la resistencia a M. phaseolina en BAT 477 está condicionada por el efecto de dos genes dominantes con efectos complementarios y denominados Mp-1 and Mp-2; mientras que Hernández-Delgado et al. (2009) identificaron un QTL asociado con la resistencia a la pudrición carbonosa en BAT 477. No obstante lo anterior, no se ha demostrado la relación directa entre la resistencia a Macrophomina y sequía en frijol y mucho menos, se han identificado los genes que, en conjunto, codifican su expresión. El análisis de la heredabilidad de la resistencia a dichos factores adversos así como la identificación de QTLs asociados a ellas y su ubicación en mapas de ligamiento de la especie permitirán determinar su dichas resistencias se heredan conjuntamente como un conglomerado de genes y, de tal forma, se podrán maximizar las estrategias de mejoramiento genético del frijol asistido por marcadores moleculares de ADN. Actualmente, existe un hueco aparente entre la generación rápida de marcadores moleculares de ADN tales como RAPDs (ADN polimórfico amplificado al azar); AFLPs (Polimorfismos en la Longitud de los Fragmentos Amplificados) o SSRs (Secuencias Simples Repetidas) y su confiabilidad en la selección asistida por marcadores moleculares (SAM), particularmente en México.

Para escapar a este problema y mejorar la SAM y particularmente

desarrollarla en México como una estrategia que actualmente no se utiliza y se hace indispensable en el mejoramiento genético eficiente y rápido de cultivos, se deben desarrollar marcadores moleculares específicos a partir de las secuencias amplificadas e identificadas como ligadas o estrechamente asociadas con caracteres fenotípicos de interés (Paran y Michelmore, 1993). A partir de dichos iniciadores se podrán generar SCARs (Regiones amplificadas con secuencia conocida) que podrán ser útiles en el monitoreo de la herencia de la región marcada en el genoma de la especie de interés. Tales marcadores moleculares ya han sido desarrollados para frijol en el caso de diversas enfermedades, pero no para Macrophomina o sequía (Miklas, 2005). Lo más que se tiene a la fecha son aproximaciones en cuanto a la identificación de marcadores moleculares tipo RAPD asociados con la resistencia a M. phaseolina (Olaya et al., 1996; Miklas et al., 1998; Miklas et al., 2000) o sequía (Schneider et al., 1997). La conversión de aquellos marcadores moleculares ligados a las características de interés en SCARs mejorará la reproducibilidad y la confiabilidad de las pruebas con PCR y, adicionalmente, impactará positivamente en los menores costos y reducción del tiempo en la identificación de genes útiles y el proceso de mejoramiento genético del frijol común contra dichos factores adversos.


OBJETIVOS Y METAS CUMPLIDAS POR MÓDULO 1) Determinar la filogenia y las relaciones genéticas de aislamientos de M.

phaseolina de diferentes países y la posible asociación entre el genotipo y la patogenicidad.

2) Identificar los genes implicados en el proceso de patogénesis de M. phaseolina en frijol.

3) Evaluar la respuesta fisiológica (crecimiento y desarrollo, patogenicidad, síntesis de osmolitos activos) de M. phaseolina y su respuesta al estrés osmótico in vitro.

4) Evaluar la reacción individual y combinada de líneas y genotipos de frijol a M. phaseolina y sequía terminal en campo e invernadero y detectar germoplasma con resistencia combinada a ambos factores adversos.

5) Caracterizar la base genética de la herencia de la resistencia a M. phaseolina en líneas avanzadas de frijol en condiciones de campo y de humedad variables.

6) Analizar los niveles de expresión de etiquetas génicas de frijol obtenidas a través de ensayos de infección por M. phaseolina en condiciones de estrés hídrico.

Los objetivos y metas de esta propuesta se han cumplido parcialmente, salvo el objetivo y meta 4 que si está cumplido al 100 % en este primer año de desarrollo del proyecto. Globalmente, el proyecto también tiene los objetivos y metas científicas y de formación de recursos humanos de:

1) Mejorar el conocimiento de la biología y virulencia del hongo M. phaseolina, las

bases genéticas de la resistencia al patógeno en frijol y las bases genómicas de la interacción planta-patógeno y así poder diseñar estrategias de mejoramiento genético molecular asistido por biotecnología en frijol en el mediano y largo plazos.

2) Establecer y desarrollar una línea de investigación básica, sólida y de largo aliento que sea reconocida a nivel nacional e internacional sobre el estudio y análisis del patosistema M. phaseolina-frijol desde un enfoque multidisciplinario.

3) Difundir los resultados de la presente investigación en la forma de participaciones en congresos nacionales y/o internacionales; publicaciones en revistas científicas indizadas en el padrón CONACYT, ISI y/o JCR; reportes anuales internacionales de investigación en frijol (Annual Report of the Bean Improvement Cooperative, EUA) y el desarrollo de recursos humanos de los niveles medio superior, superior, maestría y doctorado de alto nivel académico.

Metas de formación de recursos humanos Con el desarrollo del presente proyecto de investigación se formarán los recursos humanos de alto nivel que a continuación se enlistan:


Recurso Humano Niveles

Medio Superior

Superior Posgrado

Maestría Doctorado Total

Tesis 3 3 4 10 Prácticas profesionales 2 1 3 Alumnos PIFI 7 7 Prestatarios de Servicio Social

1 1 2

Otros (estancias de investigación)

1

1

Total 4 5 10 4 23

Productividad científica del proyecto a febrero de 2012: Artículos publicados en revistas internacionales indizadas en JCR

1. García-Olivares, J. G., López-Salinas, E., Cumpian-Gutiérrez, J., Cantú-Almaguer, M. A., Zavala-García, F., Mayek-Pérez, N. 2012. Grain yield and charcoal rot resistance stability in common beans under terminal drought conditions. Journal of Phytopathology 160: 98-105 (FI = 0.937, 2010).

Artículos enviados para publicación

1. Méndez-Aguilar, R., M. H. Reyes-Valdés, N. Mayek-Pérez. 2011. Mapeo genético

de la resistencia a las pudriciones de la raíz en frijol común. Phyton, International Journal of Experimental Botany (Artículo de revisión).

2. Mahdizadeh, V., Safaie, N., Goltapeh, E. M., Mayek-Pérez, N. 2011. Intra-species diversity of Macrophomina phaseolina in Iran. Archives of Phytopathology and Plant Protection.

3. Tijerina-Ramírez, N., Lira-Méndez, K., Moreno-Medina, V. R., González-Prieto, J. M., Mayek-Pérez, N. 2011. Efecto del estrés osmótico in vitro en el crecimiento, patogenicidad y producción de osmolitos en Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid. Revista Mexicana de Micología.

4. Lira-Méndez, K., Mayek-Pérez, N., Díaz-Franco, A., Salinas-García, J. R. 2011. Efectos de labranza, humedad y fertilización en el rendimiento del frijol y la patogenicidad de Macrophomina phaseolina. Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas.

Resúmenes en Memorias de Congresos

1. Rodríguez-López S y González Prieto JM. 2011. Posibles Mecanismos de

Infección del hongo fitopatógeno Macrophomina phaseolina. 1er. Congreso Nacional de Investigación en ciencia y Tecnología en Ingeniería Bioquímica. Morelia, México.

2. Rodríguez López ES, Méndez Moran L, González Prieto JM. 2011. Genes expresados durante la patogénesis de Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid. XIV Congreso Nacional de Biotecnología y Bioingeniería. Juriquilla, México.


3. Rodríguez-López S y González Prieto JM. 2011. Expresión de genes implicados en la patogénesis de Macrophomina phaseolina durante la infección de Phaseolus vulgaris. IX Congreso Nacional de Biología Molecular y Celular de Hongos. San Luis Potosí, México.

4. Rosas-Quijano R, Hernández-Delgado S, Rodríguez-Herrera SJ, Paz-González AD, González-Prieto JM, Mayek-Pérez N. 2011. Effects of water stress and Macrophomina phaseolina in growth, grain yield and gene differential expression of common bean (Phaseolus vulgaris L.). XIV National Congress of Biochemistry and Plant Molecular Biology and 7th Symposium Mexico-USA. Campeche. México.

Capítulos de Libro 1. Hernández-Delgado S, Lira-Méndez K, Mayek-Pérez N. 2011. Analysis of

Macrophomina phaseolina-common beans pathosystem. In: Phytopathology in the omics era. R. Rodríguez-Herrera, C. N. Aguilar, J.K. Simpson-Williamson, and G. Gutierrez-Sanchez (eds.). Research Ringspot. Kerala, India. pp. 231-250.

Tesistas 1. Sandra Judith Rodríguez Herrera. Licenciado en Biotecnología. Universidad

Latina de Panama. (Agosto de 2010-Marzo de 2011). Título de Tesis: Caracterización parcial de un gen de trealosa 6 fosfato sintetasa en frijol común (Phaseolus vulgaris). Fecha: 12 de Marzo de 2011. Situación: Aprobada por unanimidad con felicitación. Director: R Rosas-Quijano

2. Edgar Saul Rodríguez López. Doctorado en Tecnología Avanzada, CICATA-Altamira, IPN. Título de la tesis: Determinación del perfil de expresión de genes involucrados en la patogénesis de Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid’. Situación: En proceso. Director: JM González-Prieto

3. Jesús Gerardo García Olivares. Doctorado en Ciencias Agrícolas. Universidad Autónoma de Nuevo León (agosto de 2007-julio de 2010). Título de Tesis: Resistencia combinada a sequía y Macrophomina phaseolina en frijol común. Situación: Concluida. Director: N Mayek-Pérez

4. Reinaldo Méndez Aguilar. Doctorado en Tecnología Avanzada. CICATA-Unidad Altamira, Instituto Politécnico Nacional (agosto de 2008-julio de 2011). Título de Tesis: Loci de Caracteres Cuantitativos asociados con la resistencia a Fusarium solani f.sp. phaseoli, Macrophomina phaseolina y sequía en frijol. Situación: En proceso. Director: N Mayek-Pérez

5. Perla Abigail Alvarado Vázquez y Carlos E. Morado Urbina. Servicio Social. Universidad Autónoma de Tamaulipas Unidad Académica Multidisciplinaria Reynosa-Aztlán. Septiembre-Diciembre de 2011.

6. Lorena Gálvez López. Prácticas Profesionales. Universidad Autónoma de Chiapas. Mayo-Junio de 2011.


MATERIALES Y MÉTODOS

1) Análisis patogénico y filogenético de M. phaseolina

Cuarenta aislamientos de M. phaseolina de diferentes hospedantes (frijol, ajonjolí, algodón, maíz, sorgo y soya) y distintos países de origen (México, Estados Unidos, Brasil, Italia, Australia, Japón) se aislarán y mantendrán en conservación en medio de cultivo PDA. Dichos aislamientos se analizarán por su patogenicidad y su genotipo. 1.1 Análisis patogénico

La semilla de cuatro variedades de frijol (BAT 477, Azufrado Tapatío, SEQ 12 y Pinto UI-114) se desinfestará con NaOCl 2 % por 2 min, se enjuagará dos veces con agua desionizada estéril y se secará con papel secante estéril. Los tratamientos (aislamientos x variedad) se aleatorizarán en un diseño experimental completamente al azar con dos repeticiones. La unidad experimental será una caja Petri con crecimiento fúngico de 15 d en las cuales se colocarán 20 semillas de cada variedad. Las cajas Petri se incubarán 5 d a 30 ± 1 °C y se evaluará visualmente el daño en la semilla causado por el hongo con base en la escala descrita por Manici et al. (1995), la que ha ofrecido resultados consistentes sobre la patogenicidad de M. phaseolina en semillas de frijol in vitro, respecto a lo observado en plántulas en invernadero (Bañuelos-Balandrán y Mayek-Pérez, 2008). 1.2 Análisis filogenético

El ADN de los aislamientos de M. phaseolina se obtendrá con base en el protocolo de Raeder y Broda (1985). Los ADNs se someterán al análisis molecular a través de la amplificación de los espaciadores transcritos internos (ITS), el factor del alargamiento del gen 1-α y el análisis molecular de las secuencias repetidas en tándem (STRs). Las condiciones de amplificación, oligonucleótidos selectivos, visualización de productos amplificados y análisis estadístico y filogenético de secuencias se realizará de acuerdo como lo describen O‟Donnell et al. (2000); Purkayastha et al. (2006); Baird et al. (2010); Saleh et al. (2010) y Arias et al. (2011).

2) Identificación de genes involucrados en la patogénesis de M. phaseolina

Las cepas de M. phaseolina a utilizar forman parte del cepario del Laboratorio de Biotecnología Vegetal del Centro de Biotecnología Genómica de la ciudad de Reynosa, Tamps. y provienen de muestras de plantas de frijol con síntomas de la enfermedad del municipio de Cotaxtla, Veracruz. Se realizará una revisión bibliográfica sobre el estudio de la patogénesis en hongos utilizados como modelos de estudio para delimitar los genes que participan en el este proceso, y que serán sujetos a estudio en la presente propuesta. Se obtendrán las secuencias de los genes a estudiar en las bases de datos disponibles (Broad Institute, European Bioinformatics Institute, The National Center of Biotechnology Information, The Candida Genome Database). Las secuencias obtenidas serán alineadas mediante el método Clustal W utilizando el paquete computacional DNASTAR, Lasergene, y se diseñarán oligonucleótidos degenerados sobre las regiones más conservadas en


cada uno de los genes para su posterior amplificación mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en un termociclador Perkin Elmer (modelo 9800 Fast Thermal Cycler, Applied Biosystem®) utilizando el DNA genómico de M. phaseolina como templado. 2.1 Reacción de amplificación de DNA por PCR

La reacción de amplificación por PCR se realizará, basándose en las

condiciones estándares, tomando en cuenta la temperatura de alineamiento de los oligonucleótidos (Tm), así como el tamaño del fragmento esperado a amplificar. En esta reacción se utilizarán aproximadamente 100 ng de DNA genómico o 20 ng de DNA plasmídico. Iniciadores de desoxirribonucleótidos 100 ng de cada uno, 1.5 mM de MgCl2. El volumen de la reacción será de 50 µl y ésta se iniciará agregando 5 U de Taq DNA polimerasa (Invitrogen®, 2005) y su regulador concentrado 10X. Un programa típico de PCR es el siguiente: desnaturalización inicial a 94 ºC, por 3 min, seguida de 30 ciclos con desnaturalización a 94 ºC por 45 seg, alineamiento a temperatura cercana a la Tm de los iniciadores por 30 seg y polimerización a 72 ºC tomando en cuenta que por cada 1000 pb se requiere de aproximadamente 1 min de extensión. Finalmente se continuará la polimerización a 72 ºC por 7 min, lo que permite la terminación de las cadenas amplificadas y la adición de adenina, que permite la ligación de estos productos a los vectores apropiados. Electroforesis en geles de agarosa. Los geles se prepararán a una concentración de 1 % de agarosa en TAE 1x (Tris-acetato 40 mM, EDTA 1 mM pH 8). Para la visualización de los fragmentos de DNA, a la agarosa se le adiciona bromuro de etidio a una concentración final de 0.5 µg mL-1. La separación de los fragmentos de DNA se realiza aplicando un voltaje constante de entre 60 y 100 V, en una cámara de electroforesis que contiene el mismo regulador TAE. El tamaño de los fragmentos resueltos se determina por comparación con marcadores de peso molecular de DNA comerciales (Boerhinger Mannheim). Los geles se fotografían en un sistema Eagle Eye IS-1000 Digital Imaging System® (Alpha Innotech Corporation, 1995). 2.2 Extracción de DNA de M. phaseolina.

El ADN de M. phaseolina se extraerá por el método descrito por Reader y Broda (1985). En dicho método se obtienen cultivos de punta de hifa provenientes de un solo microesclerocio en medio de cultivo PDA crecidos durante 8 días a 30 °C en oscuridad. Cada aislamiento se cultiva en medio de cultivo caldo papa dextrosa (PDB) durante seis días a 30 °C en oscuridad, la masa micelial se lava durante 5 min en 50 mL de TES (50 mM Tris-HCl, pH 8.0; 10 mM EDTA). El micelio lavado y libre de exceso de TES y medio de cultivo se coloca en tubos de plástico estériles los cuales se sellan con parafilm®, se perforan con aguja de disección y se sumergen en nitrógeno líquido para congelar el micelio. El micelio se liofiliza durante 5 días aproximadamente a -49 °C y 47 mbar de vacío en liofilizadora digital (modelo Freezone 4.5, Labconco Inc.). Posteriormente se tritura en mortero enfriado con nitrógeno líquido hasta obtener un polvo negruzco fino. Aproximadamente 40 mg de dicho micelio molido se colocan en tubos eppendorf estériles, agregándoles inmediatamente 500 µL de buffer de extracción (100 mM Tris- HCl pH 8.0; 50 mM EDTA; 500 mM NaCl; 10 mM mercaptoetanol; 1.3 % SDS). Las muestras se mezclan a homogeneidad y se les añaden 500 µL de fenol-cloroformo (50/50), se mezclan a homogeneidad y se mezclan en vortex a máxima velocidad durante 5 min. La fase


acuosa se transfiere a otro tubo eppendorf, se le adicionan 300 µL de isopropanol frío, se mezcla por inversión. Se centrifuga durante 3 min y el sobrenadante resultante se desecha. El DNA se seca invirtiendo los tubos sobre papel secante y se resuspende en 200 µL de agua desionizada estéril, se le agregan 5 µL de RNAsa (1 mg mL-1), la mezcla se incuba durante 30 min a 37 °C en un bloque térmico. El DNA se extrae con 500 µL de fenol-cloroformo y se mezcla en vortex durante 1 min, se centrifuga durante 5 min, se toma la fase acuosa y se extrae dos veces con cloroformo. El DNA se precipita con 500 µL de isopropanol frío, se mezcla por inversión y se centrifuga por 5 min. El sobrenadante se desecha y la pastilla se lava dos veces con 500 µL de etanol al 70 %. El DNA se seca invirtiendo los tubos eppendorf durante 20 a 30 min en papel secante. El DNA se resuspende en 50 µL de agua desionizada estéril y las muestras se mantienen a 4 °C hasta su uso.

2.3 Secuenciación

Las amplificaciones provenientes de la PCR de los genes presentes en el genoma serán secuenciados siguiendo el protocolo que se describe a continuación. La finalidad de secuenciar los productos amplificados es comprobar que el gen amplificado (o parte del mismo) corresponde al seleccionado. La secuenciación cíclica se lleva a cabo utilizando un estuche comercial SequiTerm de Epicentro y el secuenciador semiautomático de la marca LICOR®. Clonación del fragmento amplificado. El fragmento amplificado se clonará en el vector comercial PCR 2.1, el proceso de ligación como el de transformación celular se realizará siguiendo las instrucciones del manual proporcionado por la casa comercial (Invitrogen®, 2005) y serán insertado en células competentes de E. coli. Transformación. Para la transformación se utilizarán 2 µl del volumen final de la ligación y 200 µl de células químicamente competentes provenientes del estuche comercial y siguiendo las instrucciones del protocolo de transformación propuesto por la casa comercial (Invitrogen®, 2005). Células competentes de Escherichia coli. La cepa utilizada será la TOP10 F (Invitrogen®). Las condiciones de cultivo son las descritas por Sambrook et al. (1989). Las células transformadas se siembran en placas de LB-agar (extracto de levadura, 1.0 %; Bacto triptona, 1.6 %; NaCl, 1 %; se llevó a pH 7.0 con NaOH, 5 N) con kanamicina (50 µg mL-1) y ampicilina (100 µg mL-1), como marcadores de selección e IPTG (4 µM mL-1) y X-gal (40 µM mL-1), para la complementación, donde se seleccionarán las colonias blancas indicando que han sido transformadas (Sambrook et. al., 1989). Las células se incuban a 37 oC por un tiempo no mayor a 24 h en agitación a 250 rpm. Aislamiento de DNA plasmídico de E. coli (Mini-prep). La obtención de DNA plasmídico de E. coli se realiza de acuerdo con los protocolos descritos por Sambrook et al., (1989), usando la técnica de lisis alcalina descrita por Birboim y Doly (1979). Cuando se requiera obtener DNA plasmídico de mayor pureza para usarse en la obtención de secuencias de DNA, éste se obtendrá mediante el uso de columnas de intercambio aniónico Qiagen (Qiagen®), o Wizard® (Promega®), de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Para la reacción de secuenciación se podrá utilizar los iniciadores universales forward y reverse (si fue clonado en vector comercial) o los iniciadores degenerados con los cuales se obtuvieron los genes en estudio, en las siguientes cantidades: 2.4 µL de DNA templado, 1 µL de iniciadores (1.0 pmol mL-1), 3.6 µL de buffer de secuenciación y 0.5 µL de DNA polimerasa II Excel, de esta mezcla se colocarán 2.0 µL a 4 tubos de capacidad de 0.2 mL marcados como A/C/G/T respectivamente, posteriormente se le agregará una mezcla de terminación a cada uno de los tubos con su


correspondiente nucleótido y se someterá al programa de secuenciación 92 oC por 2 min, 92 oC por 30 seg, 54 oC por 30 seg, 70 oC por 1 min, transcurrido el ciclo, se agregará 2 µL de solución de terminación a cada tubo y finalmente se desnaturalizará por 3 min a 94 oC, cargando en gel de poliacrilamida (vidrios de 40 cm, 2 mm de espesor y con 48 pocillos) al 10 % en condiciones desnaturalizantes en secuenciador LICOR a 1500 volts durante 10 horas. La secuencia obtenidas será alineada con las secuencias disponibles en el GenBank del National Center for Biotechnology Information (NCBI), empleando el programa ClustalW y Blastx.

2.4 RT-PCR y purificación de fragmentos de DNA separados en geles de

agarosa.

La reacción de RT (retro transcriptasa, o sea síntesis de cDNA usando RNA como molde) se realizará con la transcriptasa "reversa" Super ScriptII® (Invitrogen®), en un volumen final de 20 µL. El RNA (20 ng) se diluye en un volumen de 10 µL, la mezcla se calienta a 75 oC por un periodo de 5 min. Posteriormente se pasa a un baño de hielo y se incuba cuando menos 5 min. Se añade entonces la mezcla de reacción a un tubo de PCR que contiene 4 µL del regulador de reacción, la mezcla de los dNTPs 10 nM, inhibidor de RNasa (Invitrogen®) ditiotreitol 0.1 M, y finalmente 5 U de la transcriptasa reversa. La mezcla se incuba por 90 min a 42 oC para dar lugar a la síntesis del cDNA. Al final de este tiempo se inactiva la reacción por calor, incubando el tubo a 94 oC por 5 min. Para la reacción de PCR (reacción en cadena de la polimerasa), se toma el 10 % del volumen de la reacción de RT y se somete a una reacción de PCR. La purificación de los fragmentos de DNA de interés a partir de geles de agarosa se llevará a cabo con los métodos comerciales Gene Clean® (BIO101, 1998) o QIAquik Spin (Qiagen®), apegándose a las instrucciones del fabricante. Para la purificación de productos de PCR se utilizará el método QIAquik Spin (Qiagen®), siguiendo también las indicaciones del fabricante. El sistema para establecer las condiciones contrastantes de patogenicidad consistirá en dos matraces con medio de cultivo (caldo papa dextrosa, PDB) donde se crecerá al hongo M. phaseolina. En uno de ellos se introducirá una plántula de frijol dentro de una membrana semipermeable permitiendo el contacto con el medio de cultivo y M. phaseolina para simular el desarrollo del proceso infectivo, posteriormente se retirará la plántula con la membrana y se recuperará la biomasa fúngica de ambos matraces para extraer el RNA total. Para realizar los ensayos para la expresión génica, el RNA total se obtendrá por medio de Purelink Micro-Midi Total RNA (Invitrogene®) en las condiciones contrastantes, realizando una RT-PCR (Transcriptasa Reversa de la Reacción en Cadena de la Polimerasa). Esta técnica consiste en hacer una PCR con el RNA obtenido por medio de los oligonucleótidos específicos a M. phaseolina, obteniendo así el DNA complementario (cDNA) con el fin de determinar su expresión individual, la cual se visualizará en gel de agarosa al 1 %, pudiendo separar o no aquel RNA que presente una mayor expresión o de interés para estudios futuros. 2.5 Marcaje de sondas.

Además los genes sujetos a análisis se detectarán mediante la fijación de una

sonda en una membrana de nylon (macro arreglo) de forma ordenada, posteriormente se hibridará con RNA mensajero (RNAm, marcaje de sondas de ambas condiciones para determinar la expresión global de los genes seleccionados. El método se basa en la incorporación de un nucleótido de todas las posibles


secuencias a sintetizar, utilizando un DNA templado y fue descrita por Feinberg y Vogelstein (1984). La hebra complementaria de DNA es sintetizada por el fragmento largo de DNA polimerasa I (‘klenow’) utilizando oligonucleótidos aleatorios como iniciadores y sustituyendo un nucleótido marcado con 32P radiaactivo por su equivalente en la mezcla de reacción, incorporando de esta manera una hebra marcada de DNA complementario. Se realizará con el sistema Megaprime DNA Labelling System® (Amersham), siguiendo las instrucciones del proveedor. En algunos casos se utilizará el kit Random Prime Labelling System® (Rediprime II, Amersham), siguiendo también las instrucciones dictadas por el fabricante.

2.6 Hibridación sustractiva.

Alternativamente se realizará una hibridación sustractiva para determinar la

totalidad de los genes expresados en M. phaseolina, donde se encontrarán genes involucrados en el proceso patogénico, algunos hipotéticos o de probable participación, esperando confirmar la participación de los genes seleccionados inicialmente. Para el primer caso, se tendrán dos poblaciones contrastantes. Se harán extracciones de RNA total para cada cepa por separado por medio del reactivo TRIZOL (Invitrogene®), apegándose a las recomendaciones de la casa comercial; y adaptado al protocolo del sistema Purelink Micro-Midi Total RNA (Invitrogene®). Los RNAs purificados serán visualizados después de una migración en gel de agarosa al 1.5% y teñidos con bromuro de etidio para digitalizar la imagen a través de un transiluminador acoplando a un digitalizador de imágenes; con la finalidad de observar su calidad y cantidad. Se hará un tratamiento con DNase I (Invitrogene®), siguiendo las recomendaciones del proveedor, para eliminar el posible DNA que pudiera acarrearse durante la extracción del RNA. Posteriormente se procederá sintetizar la primer y segunda hebra de cDNA de cada una de las muestra de RNA, donde se utilizarán 5 µg para ello se empleará el estuche comercial BD PCR-Select cDNA Substration kit (Clontech®), y se desarrollará de acuerdo a sus instrucciones. El siguiente paso es una digestión con la endonucleasa RsaI también apegándose al manual, quien al final de la digestión recomienda una limpieza para remover la enzima de restricción, de la muestra purificada es posible visualizar los productos de la restricción al correr una alícuota en gel de agarosa al 1.5%. El siguiente paso corresponde a la ligación de los adaptadores; debido a que se pretende realizar un escrutinio diferencial, se deberá realizar una substracción en ambos sentidos para el caso, se manejará como cDNA1 al cDNA de la condición patogénica y como cDNA2 al de la condición no patogénica. Cada población de cDNA se divide en dos y a una subpoblación se liga el adaptador 1 generando el cDNA1-1 y la otra parte con el adaptador 2R produciendo el cDNA1-2R, a estos cDNAs se les denomina problemas y en esta misma combinación el cDNA2 es el control al cual no se liga ningún adaptador; la reacción de ligación se ajustará a las indicaciones del proveedor, antes de continuar con las hibridaciones es imperativo probar la eficiencia de ligación, si es baja, es preferible realizar una nueva reacción de ligación. Las poblaciones cDNA1-1 y cDNA1-2R se hibridan en forma separada con el cDNA control. Posteriormente los productos de esa hibridación se mezclan y se realizan dos amplificaciones por PCR, sólo se obtendrán las amplificaciones de aquellos cDNAs de doble cadena (híbridos) que presentan diferentes adaptadores, los cuales se amplifican exponencialmente; estos productos de PCR serán insertados en un vector de clonación T/A (pDrive y pCR2.1), para transformar células de E. coli competentes, y así obtener las bibliotecas substractivas de cDNA.


Escrutinio de clonas positivas. Las clonas positivas obtenidas se analizarán para determinar la presencia de insertos. Para ello, los plásmidos se aislarán, se cortarán con la enzima EcoRI, se analizan por electroforesis en geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio. La expresión diferencial será confirmada por medio de hibridaciones tipo DNA-RNA o bien por amplificaciones tipo RT-PCR. las clonas diferenciales serán seleccionadas y serán secuenciadas. La comparación de la secuencia se hará en el banco de datos (Gen Bank) (Fig. 1).

Figura 1. Esquema de la técnica hibridación sustractiva con dos cepas contrastantes en su patogenicidad.

3) Respuesta fisiológica de M. phaseolina al déficit hídrico 3.1 Obtención de aislamientos

Se colectarán plantas de frijol (Phaseolus vulgaris L.), maíz (Zea mays L.), sorgo (Sorghum bicolor [L.] Moench) y soya [Glycine max (L.) Merr.], con síntomas de pudrición carbonosa en localidades de los estados de Sinaloa, Veracruz y Tamaulipas. Las plantas se lavarán, seccionarán y desinfestarán con NaOCl 2 % por 2 min y se enjuagarán con agua destilada estéril; el exceso de agua se retirará con papel secante estéril. Los tejidos con síntomas de la enfermedad se sembrarán en medio Papa-Dextrosa-Agar acidificado con ácido láctico y se incubarán 4 d a 30 °C.


Se espera contar con al menos cinco aislamientos del hongo con orígenes del hospedante y geográficos distintos.

3.2 El potencial osmótico en el crecimiento in vitro de M. phaseolina

El crecimiento de los aislamientos de M. phaseolina se evaluará en PDA con

0, 500 o 1000 mM de NaCl. La unidad experimental será una caja Petri con el medio de cultivo respectivo en cuyo centro se coloca un disco de 0.6 mm de diámetro de PDA con crecimiento fúngico de 4 d de edad. Las cajas se incuban 96 h a 30 + 1 °C en oscuridad. Los tratamientos (combinación de un aislamiento x concentración de NaCl) se aleatorizan en un diseño experimental completamente al azar con cuatro repeticiones. En cada unidad experimental se registrará el diámetro de la colonia (DC, mm) cada 24 h y se calculará la tasa relativa de crecimiento de la colonia (TRCC, mm d-1) (Mayek-Pérez et al., 1997).

3.3 Efecto del NaCl en la producción de micelio

Los aislamientos de M. phaseolina se cultivarán en 20 mL de medio de cultivo caldo de papa-dextrosa (PDB, DIFCO®; Detroit, EUA) con 0, 500 o 1000 mM de NaCl. Los tratamientos (aislamiento x concentración) se aleatorizarán en un diseño experimental completamente al azar con cinco repeticiones; la unidad experimental será un tubo de plástico (50 mL capacidad) con 20 mL del medio liquido inoculado con tres discos de 0.6 mm de diámetro con crecimiento fúngico de 4 d. Las muestras se incubarán 11 d a 30 °C con agitación constante a 250 rpm. La biomasa fúngica se obtendrá por centrifugación y se secará a 45 °C por 3 d para determinar su peso seco.

3.4 Patogenicidad de M. phaseolina en frijol

La semilla de cuatro variedades de frijol (BAT 477, Azufrado Tapatío, SEQ 12 y Pinto UI-114) se desinfestará con NaOCl 2 % por 2 min, se enjuagará dos veces con agua desionizada estéril y se secará con papel secante estéril. Los tratamientos (aislamientos x variedad) se aleatorizarán en un diseño experimental completamente al azar con dos repeticiones. La unidad experimental será una caja Petri con crecimiento fúngico de 15 d en las cuales se colocarán 20 semillas de cada variedad. Las cajas Petri se incubarán 5 d a 30 ± 1 °C y se evaluará visualmente el daño en la semilla causado por el hongo con base en la escala descrita por Manici et al. (1995), la que ha ofrecido resultados consistentes sobre la patogenicidad de M. phaseolina en semillas de frijol in vitro, respecto a lo observado en plántulas en invernadero (Bañuelos-Balandrán y Mayek-Pérez, 2008). 3.5 Identificación de osmolitos sintetizados

Los aislamientos de M. phaseolina se cultivarán durante 10 d en medio PDB con 0, 250 o 500 mM de NaCl a 30 °C con agitación a 200 rpm. El micelio se filtrará y lavará con agua desionizada. A 50 mg de micelio fresco se añadirá 1 mL de agua desionizada, la mezcla se hervirá por 5.5 min en agua y se enfriará a temperatura ambiente (25-30 ºC, aproximadamente). A cada muestra se aplicarán 650 µL de acetonitrilo:agua (40:60). Las muestras se mezclarán y centrifugarán a 13000 rpm por 15 min. Se tomará 1 mL del sobrenadante que se filtrará en filtro estéril


(Whatman) de 0.2 µm. Las muestras se colocan en viales de HPLC y se sellan para su análisis. La columna ZORBAX® se utilizará para el análisis en un cromatógrafo de líquidos de alta resolución donde se utilizará un volumen de inyección de la columna de 20 µL con un flujo de 1 mL min-1 a 30 0C y 190 nm de longitud de onda. En el análisis se utilizará el estuche de estándares de polioles que incluye D-(+)-arabitol, galactitol y glicerol (Sigma-Aldrich®, EUA).

4) Reacción de germoplasma de frijol a M. phaseolina

Se generará una población de 98 líneas endogámicas recombinantes (LERs) a

partir de la cruza entre la línea resistente a pudriciones de raíz y sequía BAT 477 (Mayek-Pérez et al., 2001; 2004; 2005) y la variedad susceptible Pinto UI-114. Las cruzas y la semilla F1 y F2 se obtuvieron en Reynosa, Tamaulipas en 2004. Las generaciones filiales posteriores se obtuvieron en Cotaxtla, Veracruz y Reynosa, Tamaulipas. 4.1 Establecimiento de experimentos de campo

Las 98 LERs y los progenitores, BAT 477 (resistente) y Pinto UI-114

(susceptible) se sembrarán en predios con antecedentes de alta incidencia de M. phaseolina en al menos dos localidades de Tamaulipas y dos de Veracruz bajo un diseño experimental de látice 10 x 10 con cuatro repeticiones, dos de las cuales serán cultivadas en condiciones de riego y las otras dos, en condiciones de sequía terminal (riego normal hasta el inicio de la floración). Para evaluar la incidencia y severidad de M. phaseolina se utilizará la escala de Abawi y Pastor-Corrales (1990) durante las etapas fenológicas R6 – R8 (CIAT, 1987) de cada genotipo. Los valores de severidad de la pudrición carbonosa de 1 a 3 se consideran como resistentes y los valores de 4 a 9 se clasifican como susceptibles. Además, se evaluarán en cada material genético los días a floración y a madurez fisiológica; el número de plantas emergidas y cosechadas y el rendimiento de grano por parcela. 4.2 Evaluación de líneas y genotipos en invernadero

El germoplasma antes citado se evaluará también en condiciones de invernadero en el Centro de Biotecnología Genómica del IPN en Reynosa, Tamaulipas. El germoplasma se establecerá durante el ciclo biológico otoño-invierno de 2011 en charolas de plástico con sustrato de turba (Redi Earth Scott) previamente inoculado con microesclerocios de M. phaseolina. Las plantas (20 por material genético) se mantendrán con humedad a capacidad de campo (CC) hasta los 10 días después de la siembra. Luego, la mitad de las plantas (10) se mantendrán en condiciones de riego hasta los 20 d después de la siembra mientras que las diez restantes se someterán a deficiencia hídrica hasta el final del experimento vía la suspensión del riego. El germoplasma se sembrará bajo un diseño experimental completamente al azar con 10 repeticiones. Los datos obtenidos se someterán a un análisis de varianza (ANVA) y los promedios se compararán con la prueba de gama múltiple de Tukey (DMSH, P=0.05). El análisis estadístico se realizaras con el programa de computo SAS versión 6,03 (SAS Institute, 1998).

5) Bases genéticas de la resistencia a M. phaseolina en frijol


5.1 Análisis genético clásico

El germoplasma evaluado en el apartado 4 se someterá al análisis genético para así determinar las bases de la herencia de la resistencia genética a M. phaseolina y/o sequía en frijol. Para ello se considerarán los datos de reacción a la pudrición carbonosa y los datos de rendimiento de grano (campo) y de biomasa seca (invernadero). Adicionalmente, se evaluará la reacción del germoplasma al hongo in vitro (Bañuelos-Balandrán y Mayek-Pérez, 2008) con la técnica de la ‘hoja desprendida’. Los datos de reacción en todos los casos se sujetarán a la prueba de bondad de ajuste de ji-cuadrada asumiendo diferentes modos de acción génica de la resistencia a la pudrición carbonosa (Stansfield, 1995). Adicionalmente se realizará el análisis de varianza a través de años y localidades de los datos de campo. Posteriormente, se estimará la heredabilidad en sentido estricto para la reacción a enfermedades considerando el nivel de endogamia de las poblaciones (Hallauer y Miranda, 1981). Se evaluarán la normalidad de las distribuciones de frecuencias de las medias de cada LER par a las variables medidas con la prueba de Shapiro y Wilk (PROC Univariate, SAS, 1987). El nivel de probabilidad de P < 0.001 indicará la pérdida de ajuste a la distribución normal. 5.2 Identificación de QTLs asociados con resistencia a M. phaseolina y sequía en líneas endogámicas recombinantes. Las LERs más los dos progenitores se incluirán en el análisis para la identificación de QTLs utilizando la técnica de AFLPs (Polimorfismos en la Longitud de los Fragmentos Amplificados). El ADN genómico total será aislado de 2.5 g de tejido joven conjuntado a partir de diez plántulas colectadas a los 15 días después de su siembra en invernadero de acuerdo con el método de Dellaporta et al. (1983). Las concentraciones de AND se estimarán visualmente en geles de agarosa mediante su comparación con un estándar de peso molecular con concentración conocida (fago λ digerido con la enzima de restricción HindIII). El protocolo AFLP será realizado de acuerdo con Vos et al. (1995). Brevemente, se tomarán aproximadamente 250 ng de AND genómico mismos que serán digeridos con 10 U de cada una de las enzimas de restricción EcoRI y Tru91 a 37 °C por 4 h e incubadas a 70 °C por 15 min. Los fragmentos de ADN se ligarán a los adaptadores EcoRI y MseI a 15 °C por una noche. Posterior a una amplificación pre-selectiva por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) donde e utilizará el nucleótido A, se realizará una segunda amplificación selectiva por PCR utilizando al menos 30 combinaciones de iniciadores EcoRI y MseI. Las reacciones AFLP se desnaturalizarán por calentamiento con el buffer “Stock solution” de Li-Cor (Lincoln, EUA). Las muestras serán separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida en el equipo de secuenciación automática Li-Cor IR2 System. Cada marcador AFLP identificado como polimórfico entre los progenitores se analizará por ANVA de una vía con respecto a los valores de reacción a las pudriciones de raíz y a sequía con el procedimiento PROC GLM del paquete estadístico SAS (Sistema de análisis estadístico (SAS, 1987). Las pruebas significativas de F a un nivel de probabilidad de error P < 0.002 indicarán el ligamiento entre un marcador AFLP y un QTL. Posteriormente se conducirá un análisis de regresión múltiple del QTL independiente, por lo que un marcador será significativo al nivel de probabilidad del 15% para su entrada inicial en el análisis y será significativo al nivel del 5% para permanecer en el modelo. Luego, se realizará el análisis de dos vías con el procedimiento PROC GLM para interacciones


epistáticas (efecto aditivo x aditivo) con aquellos marcadores que detecten QTLs independientes en el análisis de primer orden. Se utilizará el programa de cómputo Mapmaker/EXP 3.0 (Lander et al., 1987) para obtener un mapa de ligamiento de los AFLP. Después, se realizará un análisis de ligamiento de los datos AFLP bajo el criterio de un valor de LOD mínimo de 3.8 y una distancia mínima de 30 cM para así establecer los grupos de ligamiento. Las distancias en cM entre loci ligados se basarán en fracciones de recombinación (Kosambi, 1944). Una vez que se construya el mapa de ligamiento, se utilizará el mapeo por intervalos (QGene; Nelson, 1996) para analizar los QTLs detectados por medio de regresión, donde un valor de LOD de 2.0 será considerado como valor de significancia.

6) Identificación de genes involucrados en la patogénesis de M. phaseolina 6.1 Cultivo de plantas, proceso de infección y purificación de RNA

Las plantas de frijol común que se utilizarán, serán de las variedades BAT 477 (resistente a M. phaseolina) y Pinto UI-114 (susceptible) (Mayek-Pérez et al., 2004) se cultivarán en condiciones de invernadero. Las semillas se colocarán en macetas de plástico de 0.5 L utilizando tierra negra como sustrato y se regarán diariamente con agua por un tiempo de 20 días; las plantas serán cosechadas y se lavarán las raíces con agua corriente. Los hongos serán cultivados en medio PDA, a una temperatura de 30° C durante 7 días y en oscuridad. Se tomarán cuatro discos de 1 cm de diámetro del cultivo fúngico y se mezclarán con la tierra a donde se depositarán las semillas de frijol al momento de la siembra; se realizará un conteo de unidades formadoras de colonias (CFU) de los discos; también se hará un conteo de esclerocios. La severidad de la pudrición carbonosa causada por M. phaseolina sobre las raíces e hipocotilos será registrada en cada unidad experimental utilizando la escala descrita por Abawi y Pastor-Corrales (1990). Los resultados obtenidos se utilizaran para seleccionar aquellas cepas que muestren un patrón de severidad alto y por otro lado que sean avirulentas o sea bajo su capacidad patogénica. 6.2 Construcción de bibliotecas sustractivas

Para la construcción de la biblioteca sustractiva, se partirán de dos líneas de frijol, contrastantes a la infección, una con síntomas de infección severa y otra con menor grado de infección. Se harán extracciones de RNA total para cada línea por separado por medio del reactivo TriZOL (Invitrogene), apegándose a las recomendaciones de la casa comercial; y adaptado al protocolo del sistema Purelink Micro-Midi Total RNA (Invitrogene). Los RNAs purificados serán visualizados después de una migración en gel de agarosa al 1.5% y teñidos con bromuro de etidio para digitalizar la imagen a través de un transiluminador acoplando a un editor de imágenes, con la finalidad de observar su calidad y cantidad. Se hará un tratamiento con DNase I (Invitrogene), siguiendo las recomendaciones del proveedor, para eliminar el posible DNA que pudiera acarrearse durante la extracción del RNA. Posteriormente se procederá sintetizar la primer y segunda

hebra de cDNA de cada una de las muestra de RNA, a donde se utilizarán 5 g de RNA molde y se empleará el estuche comercial BD PCR-Select cDNA Substration kit (Clontech). El siguiente paso es una digestión con una endonucleasa como la enzima Rsa I. El siguiente paso corresponde a la ligación de los adaptadores; debido a que se pretende realizar un escrutinio diferencial, se deberá realizar una


substracción en ambos sentidos para el caso, se manejará como cDNA1 al cDNA de la línea susceptible y como cDNA2 al de la asintomática, cada población de cDNA se divide en dos y a una subpoblación se liga el adaptador 1 generando el cDNA1-1 y la otra parte con el adaptador 2R produciendo el cDNA1-2R, a estos cDNAs se les denomina problemas y en esta misma combinación el cDNA2 es el control al cual no se liga ningún adaptador. Las poblaciones cDNA1-1 y cDNA1-2R se hibridan en forma separada con el cDNA control. Posteriormente los productos de esa hibridación se mezclan y se realizan dos amplificaciones por PCR, sólo se obtendrán las amplificaciones de aquellos cDNAs de doble cadena (híbridos) que presentan diferentes adaptadores, los cuales se amplifican exponencialmente; estos productos de PCR serán insertados en un vector de clonación T/A (pDrive y/o pCR2.1), para transformar células de E. coli competentes, y así obtener las bibliotecas substractivas de cDNA, o banco de etiquetas de cDNA diferencial.

6.3 Escrutinio de las etiquetas positivas.

Las clonas positivas obtenidas se analizarán para determinar la presencia de insertos. Para ello, los plásmidos se aislarán, se cortarán con la enzima EcoRI, se analizan por electroforesis en geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio. La expresión diferencial será confirmada por medio de hibridaciones tipo DNA-RNA o bien por amplificaciones tipo RT-PCR. Las clonas diferenciales serán seleccionadas y serán secuenciadas. La comparación de la secuencia se hará en el banco de datos (Gen Bank), la información servirá para determinar la posible función de dichos genes. Algunos de ellos serán analizados exhaustivamente. 6.4 Análisis de la expresión de las etiquetas génicas diferenciales con las que ya se cuentan.

El laboratorio cuenta con algunas etiquetas génicas obtenidas de un protocolo de DDRT-PCR, las cuales es necesario cuantificar su nivel de expresión en y durante el proceso de infección por M. phaseolina. Para este punto, se utilizará el cDNA sintetizado de la etapa anterior y será sujeto a un ensayo de PCR semicuantitativo, partiendo de que para dichas etiquetas, ya se cuenta con los oligonucleótidos específicos; aquellas etiquetas que muestren un patrón diferencial, se procederá a montar una estrategia para conocer y caracterizar el gen y evidenciar su papel biológico. 6.5 Análisis de expresión de genes homólogos involucrados en la resistencia a las infecciones

Para la identificación de genes homólogos de los elementos génicos, primeramente se recurrirá a las bases de datos como la del European Bioinformatics Institute (EBI) y el National Center for Biotechnology Information (NCBI), en busca de los diferentes genes homólogos reportados hasta la fecha y con ayuda de programas bioinfomáticos como la suite del DNASTAR (LASERGENE), Gene Construction kit (TEXCO), DNASIS (Hitachi, inc.), oligo 8. CLC DNA Workbench 7, se harán distintos alineamientos a nivel de residuos de aminoácidos destacando las zonas altamente conservadas para diseñar oligonucleótidos degenerados, los cuales se amplificarán por medio de PCR usando como DNA molde el de frijol común; se secuenciará el producto de amplificación y se comparará con el banco de datos, y


verificará que se trata del gen homólogo de interés; posteriormente se construirán minigenotecas, de tal manera de hibridar estas minigenotecas, usando como sonda el producto de la amplificación, de esta manera secuenciar en su totalidad cada gen homólogo, la secuencia se comparará frente al banco de datos y así poder asignar la identificación del gen y posible función, ésta última se podrá analizar realizando un acercamiento de transcriptomica; para esto, se pretende hacer un macroarreglo con cada unos de los genes homólogos identificados así como algunas de las etiquetas obtenidas del banco de cDNA diferencial e hibridar frente RNAs de M. phaseolina provenientes de distintos tratamientos.

AVANCES DE RESULTADOS Análisis patogénico y filogenético de M. phaseolina A la fecha se han obtenido 40 aislamientos de M. phaseolina de diferentes hospedantes (frijol, ajonjolí, algodón, maíz, sorgo y soya) y distintos países de origen (México, Estados Unidos, Brasil, Italia, Australia, Japón), mismos que se conservan en medio de cultivo PDA. Se están estandarizando actualmente los procedimientos para las pruebas de patogenicidad en condiciones controladas de dichos aislamientos en frijol así como del análisis filogenético. Identificación de genes involucrados en la patogénesis de M. phaseolina Las cepas de M. phaseolina que se utilizan en este módulo son parte del cepario del Laboratorio de Biotecnología Vegetal del Centro de Biotecnología Genómica de la ciudad de Reynosa, Tamps. y provienen de muestras de plantas de frijol con síntomas de la enfermedad del municipio de Cotaxtla, Veracruz. Se ha revisado bibliográficamente acerca del estudio de la patogénesis en hongos utilizados como modelos de estudio para delimitar los genes que participan en el este proceso, y que serán sujetos a estudio en la presente propuesta. Se obtuvieron las secuencias de los genes a estudiar en las bases de datos disponibles (Broad Institute, European Bioinformatics Institute, The National Center of Biotechnology Information, The Candida Genome Database). Las secuencias obtenidas se alinearon por el método Clustal W utilizando el paquete computacional DNASTAR, Lasergene y se diseñaron oligonucleótidos degenerados sobre las regiones más conservadas en cada uno de los genes para su posterior amplificación mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en un termociclador Perkin Elmer (modelo 9800 Fast Thermal Cycler, Applied Biosystem®) utilizando el DNA genómico de M. phaseolina como templado. Respuesta fisiológica de M. phaseolina al déficit hídrico En un primer trabajo se determinó el crecimiento in vitro, la patogenicidad y la producción de osmolitos en seis aislamientos de M. phaseolina de frijol, maíz, sorgo y soya cultivados en condiciones de NaCl variable. El crecimiento de los aislamientos se midió en PDA con 0, 500 y 1000 mM de NaCl y la patogenicidad en cuatro variedades de frijol (Azufrado Tapatío, BAT 477, Pinto UI-114, SEQ12) in vitro. Por cromatografía de líquidos de alta resolución se midió la concentración de glicerol, arabitol, D-fructosa y D-glucosa en aislamientos del hongo cultivados a 0, 250 y 500 mM de NaCl. M. phaseolina redujo más de 50 % su crecimiento con 500


mM de NaCl. BAT 477 y SEQ 12 fueron tolerantes al hongo mientras que Pinto UI-114 y Azufrado Tapatío fueron susceptibles; los aislamientos HMP4 y HMP46, de Río Bravo, Tamaulipas fueron los más agresivos. La concentración de glicerol, D-fructosa y D-glucosa se incrementó al aumentar el NaCl in vitro, mientras que el arabitol se redujo hasta 90 %. No hubo relación entre la producción de osmolitos con el origen del aislamiento. El mayor crecimiento de M. phaseolina se asoció negativamente con la síntesis de osmolitos en ausencia de NaCl pero positivamente con la concentración de D-glucosa en 500 mM de NaCl. Por el contrario, la patogenicidad se asoció negativamente con la producción de osmolitos. El estrés osmótico indujo la síntesis de novo de osmolitos en M. phaseolina pero redujo su agresividad en frijol. En un segundo estudio, cuatro aislamientos de M. phaseolina de maíz, frijol, sorgo y soya se cultivaron in vitro en PDA con 0, 120 y 240 mM de NaCl y se midió el crecimiento y características de la colonia, así como la producción y tamaño de microesclerocios. Luego, se evaluó la patogenicidad en dos variedades de frijol (BAT 477 y Pinto Ul-114); finalmente, se identificaron y cuantificaron los osmolitos producidos bajo estrés osmótico. El NaCl redujo hasta 10 % el crecimiento de la colonia de M. phaseolina así como el tamaño y la producción de microesclerocios. Los aislamientos de maíz y frijol fueron más agresivos en frijol bajo estrés por NaCl y redujeron la producción de biomasa aunque no significativamente en comparación con el testigo. El estrés por NaCl incrementó la síntesis de glicerol, arabitol y galactitol a partir de las 48 h en incubación. La cepa de M. phaseolina de maíz fue más tolerante al NaCl variable, más agresiva en frijol y con mayor producción de osmolitos. Lo anterior indica que la síntesis de novo de osmolitos activos en M. phaseolina puede favorecer la supervivencia en condiciones ambientales adversas sin menoscabo de la habilidad parasítica del hongo en cultivos. Reacción de germoplasma de frijol a M. phaseolina El análisis de varianza detectó diferencias significativas (p≤0.05) entre ambientes y genotipos así como en la interacción genotipo x ambiente (GA) para rendimiento de grano y reacción a pudrición carbonosa. Los análisis de la estabilidad del rendimiento y de la reacción a pudrición carbonosa indicaron que la mayoría de las líneas endogámicas recombinantes muestran buena respuesta a ambientes desfavorables, seguidas de germoplasma estable y sin interacción y, finalmente, germoplasma con mejor respuesta a ambientes favorables. El ANVA del modelo AMMI para ambas características medidas mostró que todas las fuentes de variación del modelo soportaron aproximadamente 49% de la suma de cuadrados total. La suma de cuadrados de la interacción GA indicó que la IGA = 0 para el primer componente principal (CP1). En este sentido, observamos 13 LERs estables para rendimiento de grano y nueve en el PC2. Para reacción a pudrición carbonosa detectamos 14 LERs estables en el CP1 y ocho en el CP2. EL análisis biplot mostró un gráfico dividido en seis secciones para la reacción a M. phaseolina y en cinco secciones para el rendimiento de grano. Los vectores mayores se observaron en Díaz Ordaz (riego y temporal 2008) donde se detectaron los mayores y más variables rendimientos de grano; mientras que los vectores menores se observaron en Isla (temporal 2007) y Río Bravo (riego y temporal 2008) donde ocurrieron los menores y menos variables rendimientos de grano. Los resultados demuestran la respuesta diferencial de las LERs y sus progenitores a través de localidades de prueba, años y condiciones de humedad en suelo, así como interacciones GA


significativas con base en el rendimiento de grano y la reacción a M. phaseolina. Así mismo, el análisis de la estabilidad del rendimiento de grano y de la resistencia a la pudrición carbonosa y el análisis AMMI más el biplot demostraron complementarse y proporcionar información propicia para la selección de germoplasma altamente rendidor de grano y estable así como con resistencia a la pudrición carbonosa en condiciones de temporal del noreste de México. Bases genéticas de la resistencia a M. phaseolina en frijol Para este trabajo se generó una población de 94 líneas endogámicas recombinantes (LERs) F9:10 a partir de la cruza entre la línea resistente a pudriciones de raíz y sequía BAT 477 y la variedad susceptible Pinto UI-114. Para determinar la herencia de la resistencia a M. phaseolina y sequía se realizaron pruebas en campo en cuatro localidades y dos años en cada sitio así como en condiciones de invernadero. Con los datos genotípicos obtenidos mediante la técnica AFLP (Polimorfismos de la Longitud de los Fragmentos Amplificados) se construyó un mapa de ligamiento genético y, posteriormente, se identificaron QTls asociados con la resistencia a M. phaseolina y sequía, misma que se hereda poligénicamente. Un mapa de ligamiento genético se obtuvo con 190 marcadores AFLP distribuidos en 10 grupos de ligamiento (LG) con una cobertura de 718.1 cM. En dicho mapa se identificaron tres QTLs asociados con la resistencia a M. phaseolina, tres de ellos en el LG 3 y próximos a QTLs asociados con la resistencia a la sequía. Los marcadores asociados con dichos QTLs son candidatos para transformarse en marcadores SCARs que puedan usarse en programas de selección asistida por marcadores moleculares de ADN y facilitar la identificación de germoplasma con resistencia a los dos factores adversos. Identificación de genes involucrados en la patogénesis de M. phaseolina Los resultados de este proyecto indican que, tanto en invernadero como en campo, el déficit hídrico y M. phaseolina reducen el contenido relativo de agua al inicio y al quinto día del punto de marchitez permanente; así como la acumulación de materia seca en los órganos vegetativos y el rendimiento de grano a la cosecha, aunque el efecto negativo mayor lo ocasionó la sequía particularmente en Pinto UI-114. Por el contrario, la inoculación con M. phaseolina favorece la infección y desarrollo de la pudrición carbonosa en mayor medida en Pinto UI-114 y este efecto es agravado por la sequía. También, en términos de las relaciones hídricas tales como el contenido relativo de agua, de la acumulación de biomasa seca en los diferentes órganos vegetativos y del rendimiento de grano, BAT 477 es resistente a sequía y a M. phaseolina; la sequía agrava los efectos negativos causados por la pudrición carbonosa en frijol común. De 100 bandas diferenciales observadas en el análisis genómico de la interacción 15 corresponden a bandas únicas a algún tratamiento y 85 son bandas sobre-expresadas o de baja expresión. Actualmente se trabaja en la identificación y caracterización de las bandas diferenciales detectadas.


CONCLUSIONES E IMPACTO DE LA INVESTIGACIÓN Las conclusiones de este proyecto multidisciplinario son parciales y, por tanto, se darán con el segundo informe anual y final del proyecto, con la base de contar con la información completa en cada caso. Respecto al impacto de este proyecto, consideramos que la resistencia genética a la pudrición carbonosa causada por M. phaseolina es una opción de manejo integrado durable, barata y práctica en el cultivo del frijol. Se ha detectado germoplasma de frijol con resistencia genética a M. phaseolina (Mayek-Pérez et al., 2002; 2005) y sequía (Singh et al., 2001; Terán y Singh, 2002; Frahm et al., 2004) en México y otros países. La combinación de la resistencia a factores adversos de fuentes de resistencia diferentes proveerá de resistencia durable a dichos factores. Olaya et al. (1996) y Mayek-Pérez et al. (2001b) determinaron que la resistencia a M. phaseolina en BAT 477 está condicionada por el efecto de dos genes dominantes con efectos complementarios y denominados Mp-1 and Mp-2. mientras que Hernández-Delgado et al. (2009) identificaron un QTL asociado con la resistencia a la pudrición carbonosa en BAT 477. Por su parte, Méndez-Aguilar también identificaron números variables de QTLs ligados con la resistencia a M. phaseolina o sequía, en condiciones de campo y controladas de invernadero. No obstante lo anterior, no se ha demostrado la relación directa entre la resistencia a Macrophomina y sequía en frijol y mucho menos, se han identificado los genes que, en conjunto, codifican su expresión. Para escapar a este problema y mejorar la SAM y particularmente desarrollarla en México como una estrategia que actualmente no se utiliza y se hace indispensable en el mejoramiento genético eficiente y rápido de cultivos, se deben desarrollar marcadores moleculares específicos a partir de las secuencias amplificadas e identificadas como ligadas o estrechamente asociadas con caracteres fenotípicos de interés (Paran y Michelmore, 1993). A partir de dichos iniciadores se podrán generar SCARs (Regiones amplificadas con secuencia conocida) que podrán ser útiles en el monitoreo de la herencia de la región marcada en el genoma de la especie de interés. Tales marcadores moleculares ya han sido desarrollados para frijol en el caso de diversas enfermedades, pero no para Macrophomina o sequía (Miklas, 2005). Lo más que se tiene a la fecha son aproximaciones en cuanto a la identificación de marcadores moleculares tipo RAPD asociados con la resistencia a M. phaseolina (Olaya et al., 1996; Miklas et al., 1998; Miklas et al., 2000) o sequía (Schneider et al., 1997). La conversión de aquellos marcadores moleculares ligados a las características de interés en SCARs mejorará la reproducibilidad y la confiabilidad de las pruebas con PCR y, adicionalmente, impactará positivamente en los menores costos y reducción del tiempo en la identificación de genes útiles y el proceso de mejoramiento genético del frijol común contra dichos factores adversos. La otra opción es mejorar el conocimiento sobre la biología y patología en el patosistema M. phaseolina-frijol, de modo que dicho conocimiento mejorará las perspectivas para el diseño de estrategias del complejo y de manejo integrado, mediante estrategias eficientes, eficaces, económicas y con reducido impacto al ambiente. El patosistema como tal es poco conocido en sus fundamentos, los trabajos de investigación particularmente se enfocan en la búsqueda de nuevas fuentes de resistencia al hongo en Phaseolus o bien, en aspectos de la patología del hongo en frijol y sus otros múltiples hospedantes. Hay pocos esfuerzos para caracterizar y mejorar el conocimiento de la biología integrando los dos componentes del patosistema y, menos aún, incluyendo las condiciones ambientales


favorables para que la interacción positiva ocurra, como las condiciones de deficiencia hídrica.

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