in vitro experiments in radiobiology and examples of
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In vitro experiments in radiobiology and examples of
systems radiation biology approaches
Gabriele Babini et al. Dipartimento di Fisica, Università di Pavia
Email: [email protected]
Website: http://radbiophys.unipv.eu/
G. Babini - Congresso del Dipartimento di Fisica – UniPv - 13/14 Settembre 2018
Il nostro gruppo
PostDocs
Prof. Ordinario Andrea Ottolenghi
RTDa Giorgio Baiocco
PhD student Sofia Barbieri
Contratto di collaborazione per H2020-Concert Vere Smyth
Laureandi: • Leonardo Lonati (Fisica) • Giuseppina Borsci (Biotecnologia)
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Jacopo Morini
Gabriele Babini
Il focus del nostro gruppo Particolare attenzione alla deposizione di energia al DNA ma non solo: ciclo cellulare, segnalazione proteica e funzioni cellulari vengono fortemente perturbate dalle diverse dosi di radiazioni e in maniera differente a seconda del tipo di radiazione incidente!
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Le attività del gruppo RadBioPhys
RadBioPhys RadBioPhys
Esperimenti in vitro (irraggiamenti e
analisi)
Citofluorimetria (facility
interdipartimentale)
Bioinformatica e Systems Biology Space research
Simulazione di interazioni radiazioni
materia (e.g. DNA)
Modellizzazione matematica di
fenomeni biologici
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Progetti e finanziamenti per attività di ricerca
• Europei (EURATOM, Agenzia Spaziale Europea)
• Nazionali:
– INFN: Meridian, Radiostem, etc,
– Associazione Italiana Sindrome di Swachman,
– Agenzia Spaziale Italiana
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RadBioPhys Lab Lab “Sterile” per colture cellulari
Lab per effettuare analisi di campioni
biologici
J. Morini, G. Babini et al, Frontiers in Immunology, 8:223. doi: 10.3389/fimmu.2017.00223
PBMC CYTOKINES
Caco-2 monolayer
X-RAYS
Le cellule Caco-2 sono cellule epiteliali del carcinoma del colon-retto. In vitro creano una barriera impermeabile agli ioni, come nell’intestino.
I PBMC sono invece i globuli bianchi presenti nel sangue
Un esempio: Esperimento INFN-Meridian
Analisi effettuate
J. Morini, G. Babini et al, Frontiers in Immunology, 8:223. doi: 10.3389/fimmu.2017.00223 J. Morini, G. Babini et al, Frontiers in Immunology, 8:223. doi: 10.3389/fimmu.2017.00223
Studio dell’espressione delle giunzioni serrate
Studio dei livelli di rilascio di proteine di segnalazione
Resistenza Elettrica Trans-Epiteliale
A 48h
A 48h
Ogni 3-4 ore
Vitalità cellulare
A 24h e 48h
J. Morini, G. Babini et al, Frontiers in Immunology, 8:223. doi: 10.3389/fimmu.2017.00223
PBMC CYTOKINES
Caco-2 monolayer
X-RAYS
Una seconda pubblicazione legata all’esperimento INFN-MERIDIAN è
focalizzata sul protocollo sperimentale:
https://www.jove.com/video/56908/a-co-culture-method-to-investigate-crosstalk-between-x-ray-irradiated
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Citofluorimetria @RadBioPhys Lab
A partire da Gennaio 2017 è in funzione nel nostro laboratorio un citofluorimetro Attune NxT (Thermo Fisher Scientific)
Caratteristiche tecniche del nostro Attune NxT:
• Blue laser (488nm, 50mW) con FSC, SSC e 4 canali (530/30nm, 574/26nm, 695/40nm, 780/60nm);
• Violet laser (405nm, 50mW) con 4 canali (440/50nm, 512/25nm, 603/48nm, 710/50nm) -> Upgrade a fine 2017 con il contributo economico del Dipartimento di Medicina Molecolare;
• Rate campionamento: 12.5 – 1000µl/min; Acquisizione dati fino a 35000 eventi/secondo;
• Acquisizione e analisi tramite Attune NxT software.
• RadBioPhys Lab effettua regolarmente analisi quali: contenuto di DNA, morte e proliferazione cellulare, e immunofenotipizzazione (analisi da 2 a 8 colori sullo stesso campione).
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Flow Cytometer is made up of 3 subsystem: • Fluidics – To introduce and focus the cells for interrogation
•Optics – To generate and collect the light signals
•Electronics – To convert the optical signals to proportional electronic signals for computer analysis
from: Attune Nxt 2-Day Basic Training, Darmstadt, 2017
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Di cosa è composto un citofluorimetro?
Principle of Flow Cytometry
from: Attune Nxt 2-Day Basic Training, Darmstadt, 2017
Principi della citofluorimetria
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Principle of Flow Cytometry
• Cells in a single profile pass through the flow cell
→ Cells Focusing • Laser hits individual cell
passing through the narrow tube called flow cell
→ Interrogation Point • Deflected light hits a
series of detectors (PMT) • The signals from
detectors are collected by a computer
from: Attune Nxt 2-Day Basic Training, Darmstadt, 2017
Principi della citofluorimetria
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What happens to light when it hits a cell?
Laser Light Scatter • When laser light interacts with a cell, light is scattered in all direction • The light scatter depends on size and internal complexity of the cell
• Forward Scatter (FSC) is proportional to cell surface area or size. • Side Scatter (SSC) is proportional to cell granularity/internal complexity of the cell.
from: Attune Nxt 2-Day Basic Training, Darmstadt, 2017
Cosa succede alla luce quando colpisce la cellula?
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Immunofenotipizzazione attraverso 10-parametri per l’identificazione di multipli subsets di cellule T e mieloidi
from: www.thermofisher.com, application note
Un esempio di applicazione: Immunofenotipo
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Whole Blood
CD45+
CD3+
(all T cells)
CD4+
(only T helper)
CD8+
(only T killer)
CD3-
(no T cells)
CD19+
(only B cells)
CD56+
(only NK cells)
Come individuare sottopopolazioni cellulari?
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Interfaccia software
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Linfociti CD4+ Vs CD8+
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Collaborazioni attive (UNIPV) per l’uso dell’Attune NxT:
• Prof. L. Stivala, Dr. M. Savio et al (Dip. Medicina Molecolare)
• Dr. G. Guidetti, Dr. I. Canobbio et al (Dip. Biologia e Biotecnologie)
• Prof. A. Forlino, Dr. R. Besio et al (Dip. Medicina Molecolare)
• Prof. L. Visai, Dr. N. Bloise et al (Dip. Medicina Molecolare)
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Bioinformatica e
Systems (Radiation) Biology
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Silverman et al, Discov Med 14 (75): 143-52 (2012)
Today
Systems Biology’s iterative cycle
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Time-series “omics” integration
Avendo a disposizione informazioni in merito a geni/mRNAs/proteine a differenti punti temporali permette la stima delle dinamiche di ciascun elemento e, di conseguenza, l’identificazione di quali elementi sono maggiormente perturbati a seguito dello stress (e.g. radiazione ionizzante) in esame.
t1 t2 t3
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Integrazione multi-scala di “omiche”
http://www.snubi.org/cancer.html
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Alyass et al. BMC Medical Genomics, 8:33, (2015)
Studiare la variazione genetica della sindrome, per
poter correlare variazione genetica con i molteplici
aspetti del fenotipo SDS.
SCOPO DEL PROGETTO
Collaborazione tra RadBioPhys e Dipartimento di Medicina Molecolare (Prof. Cesare Danesino). J. Morini è stato titolare di 2 grant di ricerca annuali (finanziati dalla AISS) ed ha ricevuto un finanziamento ulteriore per l’anno 2018-2019.
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n. case ID case SBDS mutations
1 UPN 20 258+2T>C/ 183_184TA>CT
2 UPN 6 258+2T>C/ 101A>T
3 UPN 68 258+2T>C/ 183_184TA>CT
4 UPN 57 258+2T>C/ G63C
5 UPN 58 258+2T>C/ 183_184TA>CT
6 UPN 15 258+2T>C/ 183_184TA>CT
7 UPN 65 258+2T>C/ 258+2T>C
8 UPN 64 258+2T>C/ 624+1G>C
Variant Call Format (VCF format)
Screening dell’esoma dei pazienti
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Dal totale delle varianti geniche di ogni paziente SDS, è stata ottenuta la lista delle sole varianti genetiche caratterizzanti un set di geni di un pathway (cell cycle e pancreatic secretion) in tutti gli 8 pazienti SDS
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Network tra i geni che presentano varianti geniche negli
8 pazienti SDS
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Ce
ll cy
cle
pat
hw
ay
Algoritmi di clusterizzazione per facilitare
l’identificazione di somiglianze/differenze tra pazienti
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Alcune pubblicazioni in collaborazione con C. Danesino et al. sullo studio di malattie rare
(solo nel 2018):
Oltre a:
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Analisi di “omiche” in collaborazione con ENEA (Roma – Casaccia, M. Mancuso et al.)
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B .Tanno, S Leonardi, G Babini, et al., Scientific Reports 2017, 7 (1), 14238 B. Tanno, G. Babini et al, Oncotarget 2016, 18;7(42):68253-68269. I. De Stefano, …, G. Babini, et al, Radiation research 2016, 186 (3), 315-321 G. Babini et al, submitted to Rad Prot Dosimetry (under second revision).
Obiettivi: Identificare quali sono le funzioni cellulari maggiormente perturbate a seguito dell’esposizione a basse dosi e/o nel confronto tessuto sano Vs tumorale a partire dall’analisi di interi set molecolari (mRNA, proteine, microRNA, etc).
Algoritmi di Machine Learning: dati grezzi -> classification trees -> random forests
Collaborazione con il Policlinico IRCCS Gemelli (Roma) – Prof. G. Scambia et al.
Obiettivi: Individuare biomarker diagnostici per alcuni tumori della donna e biomarker prognostici legati all’efficacia della terapia adottata.
Altri due lavori in preparazione su: - Tumore all’ovaio - Malattia di Paget vulvare
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Acknowledgements
UniPv
Sofia Barbieri
Jacopo Morini
Andrea Ottolenghi
Gabriele Babini
Giorgio Baiocco
Vere Smyth
Giuseppina Borsci
Leonardo Lonati
ENEA (Rome, Italy)
M. Mancuso
S. Pazzaglia
A. Saran et al.
Policlinico Gemelli IRCCS (Rome, Italy) G. Scambia D. Gallo et al.
IRCCS S. Maugeri (Pavia, Italy) G. B. Ivaldi M. Liotta P. Tabarelli de Fatis C. Gaetano
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