Klinik mikrobiyoloji uzmanınınsorumluluğunda

kan hizmet birimleri

İMMÜNOHEMATOLOJİKTESTLER

İMMÜNOHEMATOLOJİKTESTLER

Dr.A.Esra KARAKOÇS.B.Ankara EAH

TKMTD, TKVKLİMUD-EGE Sürekli Tıp Eğitimi, Sürekli Mesleki Gelişim Etkinliği, 27.3.2012

İmmünohematolojik Testler

Kan gruplama

Çapraz Karşılaştırma

Antikor tarama

Antikor tanımlama

Kan gruplama

Çapraz Karşılaştırma

Antikor tarama

Antikor tanımlama

ISBT Kan Gruplama SistemleriAdı KısaltmaABO ABOMNS MNSP PRh RHLutheran LUKell KELLewis LEDuffy FYKiddJ KDiego DICartwright YTXG XGScianna SCDombrock DOColton COLandsteiner-Wiener LWChido/Rodgers CH/RGHh HKx XKGerbich GECromer CROMKnops KNIndian INOk OKRaph RAPHJMH JMH

Adı KısaltmaABO ABOMNS MNSP PRh RHLutheran LUKell KELLewis LEDuffy FYKiddJ KDiego DICartwright YTXG XGScianna SCDombrock DOColton COLandsteiner-Wiener LWChido/Rodgers CH/RGHh HKx XKGerbich GECromer CROMKnops KNIndian INOk OKRaph RAPHJMH JMH

ABO Kan Grup Sistemi

ABO sistemi iki özellik nedeniyle farklı

• Serumda aglutinin varlığı

• ABH ag’leri bir çok dokuda ve sekresyonlarda bulunur

• Serumda antikor gösterilme prensibine dayanan karşıt

gruplamanın yapıldığı tek kan grup sistemi

ABO sistemi iki özellik nedeniyle farklı

• Serumda aglutinin varlığı

• ABH ag’leri bir çok dokuda ve sekresyonlarda bulunur

• Serumda antikor gösterilme prensibine dayanan karşıt

gruplamanın yapıldığı tek kan grup sistemi

Eritrosit Transfüzyonu

Plazma Transfüzyonu

KAN GRUPLARININKAN GRUPLARININBELİRLENMESİBELİRLENMESİ

7

KAN GRUPLARININKAN GRUPLARININBELİRLENMESİBELİRLENMESİ

KAN GRUPLARIFORWARD

8

FORWARD

REVERSE

Kan Gruplarının Saptanması

1. Hemaglütinasyon• Lam (Slide) yöntemi• Tüp yöntemi• Jel Santrifügasyon yöntemi• Mikroplak yöntemi

2. RİA3. EİA4. PCR

9

1. Hemaglütinasyon• Lam (Slide) yöntemi• Tüp yöntemi• Jel Santrifügasyon yöntemi• Mikroplak yöntemi

2. RİA3. EİA4. PCR

Hemaglütinasyon SonuçlarınıEtkileyen Faktörler

1. Fiziksel Koşullar İnkübasyon ısısı IgM tipi antikorlar……4-27ºC (oda ısısı) IgG tipi antikorlar……30-37ºC (inkübatör)

İnkübasyon süresi Santrifüj hız ve süresi Ortam: pH, LISS solüsyonu, enzimler, makromoleküller

2. Eritrositler Yüzey antijenlerinin tipi, sayısı, lokalizasyonu ve immünojenitesi Homozigot veya heterozigot olmaları

3. Serum: Protein içeriği ve antikorların yapı ve türleri

10

1. Fiziksel Koşullar İnkübasyon ısısı IgM tipi antikorlar……4-27ºC (oda ısısı) IgG tipi antikorlar……30-37ºC (inkübatör)

İnkübasyon süresi Santrifüj hız ve süresi Ortam: pH, LISS solüsyonu, enzimler, makromoleküller

2. Eritrositler Yüzey antijenlerinin tipi, sayısı, lokalizasyonu ve immünojenitesi Homozigot veya heterozigot olmaları

3. Serum: Protein içeriği ve antikorların yapı ve türleri

Hasta Örneği

11

TÜP YÖNTEMİ

12

13

14

Aglütinasyonun Değerlendirilmesi

Aglütinasyon Değerlendirme++++ Bir tek büyük küme, serbest hücre yok

+++ Birkaç büyük küme, serbest hücre yok

++ Çok sayıda büyük ve küçük küme, serbest hücre yok

15

+ Çok sayıda küçük küme, zeminde serbest hücre var

Mikroaglütinasyon Makroskobik negatif, mikroskobik bazı alanlar 6-8 hücreli kümeli

Şüpheli Makroskobik negatif, çok nadir mikroskobik 6-8 hücreli küme

Rulo Oluşumu Mikroskobik olarak kümeler para dizisi şeklinde

Negatif Makroskobik ve mikroskobik küme yok

Mixed Field Çok sayıda büyük ve küçük küme, zeminde serbest eritrosit var

Forward Gruplama

16

Forward Gruplama

Temiz ve etiketli test tüplerine birer damlaanti-A, anti-B, anti-AB, anti-D ve hasta

serumu damlatılır

17

Her bir tüpe bir damla test edilecek eritrositlerin enaz 3 kez yıkanmış % 2-5’lik süspansiyonundan

(SF, serum veya plazma ile hazırlanmış) damlatılır

18

Tüp içerikleri yavaşça karıştırılır ve yaklaşık900-1000 x g’de 15-30 sn santrifüj edilir

(Alternatif olarak tüpler santrifüj edilmeden 1 saatoda ısısında bırakılır)

19

Tüplerin dibindeki eritrosit birikintileri tekraryavaşça süspanse edilir ve makroskobik olarakaglütinasyon açısından incelenir. Test sonuçları

okunur, yorumlanır ve kaydedilir

20

agglütinasyonhemoliz

21

Reverse Gruplama

22

Reverse Gruplama

Reverse gruplama

Hasta serumu

Test eritrositleri

23

agglütinasyonhemoliz

24

Forward Reverse

SONUÇLANDIRMA

25

A Ag pozitifD Ag negatif

A grubu Rh negatif

Anti-B Ab pozitif

A grubu

JEL YÖNTEMİ

26

27

28

29

AglütinasyonunDeğerlendirilmesi

30

+4 +3 +2 +1 0

31

MİKROPLAK YÖNTEMİ

32

Mikroplak ABD Gruplama

33

ÇAPRAZ KARŞILAŞTIRMAÇAPRAZ KARŞILAŞTIRMA(Cross-Match)

36

ÇAPRAZ KARŞILAŞTIRMAÇAPRAZ KARŞILAŞTIRMA(Cross-Match)

Transfüzyon sırasında veya sonrasındaoluşabilecek Ag-Ab reaksiyonunun laboratuvar

ortamında yapılan ön denemesidir.

Alıcı serumuyla verici eritrositleri karşılaştırılır

• Alıcı ve verici ABO uyumunun son kez doğrulanması• Panel dışı Ab varlığı durumunda bu Ab’ların belirlenmesi

Majör CRM; alıcı serumu → verici eritrositleri

Minör CRM; verici serumu → alıcı eritrositleri

37

Transfüzyon sırasında veya sonrasındaoluşabilecek Ag-Ab reaksiyonunun laboratuvar

ortamında yapılan ön denemesidir.

Alıcı serumuyla verici eritrositleri karşılaştırılır

• Alıcı ve verici ABO uyumunun son kez doğrulanması• Panel dışı Ab varlığı durumunda bu Ab’ların belirlenmesi

Majör CRM; alıcı serumu → verici eritrositleri

Minör CRM; verici serumu → alıcı eritrositleri

Çapraz Karşılaştırma

• ABO ve Rh sistemleri

dışında bulunan kan

grupları nedeniyle önemli

• Kan transfüzyonu öncesi

yapılması gerekir

• Lewis; Lea - Le - Leb• MN; M - N - S - s -

U• P; P1 - P2 - p• Luteren; Lua - Lub• Kell; K - k• Duffy; Fya - Fyb• İi; İ - i

• ABO ve Rh sistemleri

dışında bulunan kan

grupları nedeniyle önemli

• Kan transfüzyonu öncesi

yapılması gerekir

• Lewis; Lea - Le - Leb• MN; M - N - S - s -

U• P; P1 - P2 - p• Luteren; Lua - Lub• Kell; K - k• Duffy; Fya - Fyb• İi; İ - i

Çapraz Karşılaştırma

• ABO – Rh uygun kan % 98 uyum

• Antikor tarama -tanımlama

• Çapraz karşılaştırma

• % 2 ek uygunluk

• ABO – Rh uygun kan % 98 uyum

• Antikor tarama -tanımlama

• Çapraz karşılaştırma

• % 2 ek uygunluk

Çapraz Karşılaştırma

Aglutinasyon yok ~ uyumlu

Verici Eritrositi Hasta Serumu

Aglutinasyon yok ~ uyumlu

Aglutinasyon ~ uyumsuz

42

Çapraz Karşılaştırma

Acil Cross-Match (Immediate Spin)

Klinisyene göre, normal CRM prosedürünün uygulanmasıiçin geçecek süre hayati bir zaman kaybına neden

olacaksa → IS CRMIS CRM

Acil durumlar dışında kullanılmamalıdır

Acil bir durumda IS CRM yapılarak kan kliniğegönderildiğinde, mutlaka standart CRM işlemi de

yapılıp sonuç klinisyene bildirilmelidir!..

44

Klinisyene göre, normal CRM prosedürünün uygulanmasıiçin geçecek süre hayati bir zaman kaybına neden

olacaksa → IS CRMIS CRM

Acil durumlar dışında kullanılmamalıdır

Acil bir durumda IS CRM yapılarak kan kliniğegönderildiğinde, mutlaka standart CRM işlemi de

yapılıp sonuç klinisyene bildirilmelidir!..

AglütinasyonunKolaylaştırılması

1. Eritrositler arası uzaklığı kısaltma Proteolitik enzimler (papain, bromelin, ficin, neuroaminidase,

trypsin vs) Albümin: Muhtemelen eritrosit yüzeyindeki negatif yükü nötralize

etmekte Polikatyonlar (polybrene, protamine): Ortamın katyon yoğunluğunu

artırarak eritrosit yüzeyindeki negatif yükü nötralize ederler LISS (Low Ionic Strength Solution): Ortamdaki iyon sayısını azaltır Santrifüj: Santrifüj gücü ile eritrositler birbirine yaklaşır

2. İki eritrosit arasında köprü oluşturma: Coombs serumu45

1. Eritrositler arası uzaklığı kısaltma Proteolitik enzimler (papain, bromelin, ficin, neuroaminidase,

trypsin vs) Albümin: Muhtemelen eritrosit yüzeyindeki negatif yükü nötralize

etmekte Polikatyonlar (polybrene, protamine): Ortamın katyon yoğunluğunu

artırarak eritrosit yüzeyindeki negatif yükü nötralize ederler LISS (Low Ionic Strength Solution): Ortamdaki iyon sayısını azaltır Santrifüj: Santrifüj gücü ile eritrositler birbirine yaklaşır

2. İki eritrosit arasında köprü oluşturma: Coombs serumu

ANTİGLOBULİN TESTLERANTİGLOBULİN TESTLER

46

ANTİGLOBULİN TESTLERANTİGLOBULİN TESTLER

Doğal ve İmmün EritrositAntikorlarının Özellikleri

Doğal Antikorlar İmmün Antikorlar

Eritrositlerin karbonhidratantijenlerine yönelik

Eritrositlerin protein antijenlerineyönelik

Komplet İnkomplet

Soğuk Sıcak

Genellikle IgM Genellikle IgG

Plasentadan geçmez Plasentadan geçer

47

Doğal Antikorlar İmmün Antikorlar

Eritrositlerin karbonhidratantijenlerine yönelik

Eritrositlerin protein antijenlerineyönelik

Komplet İnkomplet

Soğuk Sıcak

Genellikle IgM Genellikle IgG

Plasentadan geçmez Plasentadan geçer

Komplet ve İnkomplet Antikorlarİzotonik tuzlu su ortamında eritrositleri kümeleştirebilen antikorlara

“komplet”, kümeleştiremeyenlere “inkomplet” adı verilir.

48

Antiglobulin Testler• Direkt Antiglobulin Test (DAT, Direkt Coombs

Testi): Otoimmun hemolitik anemi, ilaca bağlı hemoliz,yenidoğanın hemolitik hastalığı ve yakın zamandayapılmış kan transfüzyonuna bağlı alloimmünizasyonaraştırılır

• İndirekt Antiglobulin Test (İAT, İndirekt CoombsTesti): Antikor tarama ve tanımlama, kan gruplama veuygunluk testlerinde kullanılır

49

• Direkt Antiglobulin Test (DAT, Direkt CoombsTesti): Otoimmun hemolitik anemi, ilaca bağlı hemoliz,yenidoğanın hemolitik hastalığı ve yakın zamandayapılmış kan transfüzyonuna bağlı alloimmünizasyonaraştırılır

• İndirekt Antiglobulin Test (İAT, İndirekt CoombsTesti): Antikor tarama ve tanımlama, kan gruplama veuygunluk testlerinde kullanılır

DAT POZİTİFLİK• Eritrosit antijenlerine karşı oluşmuş otoantikorların

komplemanla birlikte veya tek başına eritrosit yüzeyini

kaplaması

• Transfüzyon sonrası alıcı antikorların donör eritrosit

yüzeyini kaplaması

• Verici plazmasındaki antikorların alıcı eritrositlerin

yüzeyini kaplaması

• Eritrosit antijenlerine karşı oluşmuş otoantikorların

komplemanla birlikte veya tek başına eritrosit yüzeyini

kaplaması

• Transfüzyon sonrası alıcı antikorların donör eritrosit

yüzeyini kaplaması

• Verici plazmasındaki antikorların alıcı eritrositlerin

yüzeyini kaplaması

DAT

51

DAT

52

DAT•Hasta eritrositlerinden SF içerisinde %2-5’lik eritrosit süspansiyonu hazırlanır.•Bu süspansiyondan bir damla test tüpüne konur.•SF ile eritrositler 4 kez yıkanır.•Üstteki süpernatan tamamen döküldükten sonra 1-2 damla polispesifik AHG reageni ilave edilir

53

DAT•1000 x g’de 1 dak. santrifüj edilir.•Santrifüj sonrası aglütinasyon değerlendirilir ve sonuçlar kaydedilir

54

DAT

55

İAT

56

İAT

57

• Bir tüpe 2-3 damla hastaserumu konur.

• Üzerine bir damla %2-5’lik testeritrosit süspansiyonu ilaveedilir.

• Ortalama 30-60 dk. Benmarideinkübe edilir

• İnkübasyon sonrası 1000 xg’de 1 dak. santrifüj edilir

• Santrifüj sonrası tüpler hemolizyönünden kontrol edilir. Dahasonra dibe çöken eritrositlerresüspanse edilir, aglütinasyonolup olmadığı değerlendirilir

58

• Bir tüpe 2-3 damla hastaserumu konur.

• Üzerine bir damla %2-5’lik testeritrosit süspansiyonu ilaveedilir.

• Ortalama 30-60 dk. Benmarideinkübe edilir

• İnkübasyon sonrası 1000 xg’de 1 dak. santrifüj edilir

• Santrifüj sonrası tüpler hemolizyönünden kontrol edilir. Dahasonra dibe çöken eritrositlerresüspanse edilir, aglütinasyonolup olmadığı değerlendirilir

• Aglütinasyon yoksa eritrositler%0.9 SF ile en az 4 kezyıkanır. Böylece eritrositlerebağlanmamış antikorlar veserumda bulunan diğerproteinler uzaklaştırılmış olur.

• Yıkanmış eritrositlerin üzerine2 damla AHG reageni eklenir

59

• Aglütinasyon yoksa eritrositler%0.9 SF ile en az 4 kezyıkanır. Böylece eritrositlerebağlanmamış antikorlar veserumda bulunan diğerproteinler uzaklaştırılmış olur.

• Yıkanmış eritrositlerin üzerine2 damla AHG reageni eklenir

• 1000 x g’de 1 dak. santrifüj edilirve aglütinasyon değerlendirilir.

• Negatif AHG testini konfirmeetmek için IgG kaplı kontroleritrositlerinden 1 damla tüplereilave edilir. 1000 x g’de 1 dak.santrifüj edilir. Santrifüj sonrasıaglütinasyon değerlendirilir, en az2+ aglütinasyon görülmelidir

60

• 1000 x g’de 1 dak. santrifüj edilirve aglütinasyon değerlendirilir.

• Negatif AHG testini konfirmeetmek için IgG kaplı kontroleritrositlerinden 1 damla tüplereilave edilir. 1000 x g’de 1 dak.santrifüj edilir. Santrifüj sonrasıaglütinasyon değerlendirilir, en az2+ aglütinasyon görülmelidir

Jel Yöntemi ile İAT

61

Jel Yöntemi ile İAT

62

Enzim

63

Enzim

64

Antikor Tarama - Tanımlama

• Antikor Tarama Testi

Eritrosit antijenlerine karşı antikorolup olmadığını saptamak için yapılır

• Antikor Tanımlama Testi

Varolan antikorun hangi kan grup sistemi ile ilişkiliolduğunu ve hangi eritrosit antijenine karşı geliştiğinisaptamak için yapılır

• Antikor Tarama Testi

Eritrosit antijenlerine karşı antikorolup olmadığını saptamak için yapılır

• Antikor Tanımlama Testi

Varolan antikorun hangi kan grup sistemi ile ilişkiliolduğunu ve hangi eritrosit antijenine karşı geliştiğinisaptamak için yapılır

Antikor Tarama• Klinik önemi olan antikorlar mutlaka araştırılmalı

• Klinik önem

– Antikorun 37oC’de reaktif olması

– Hemoliz yapması

– Eritrosit yaşam süresini azaltması

• Klinik önemi olan antikorlar mutlaka araştırılmalı

• Klinik önem

– Antikorun 37oC’de reaktif olması

– Hemoliz yapması

– Eritrosit yaşam süresini azaltması

Hücreler

Fenotipik yapısı (tercihan homozigot) 2 veya 3

farklı donörden alınmış test hücreleri tarama,

daha fazla sayıda test hücreleri ise tanımlama

testlerinde kullanılmalı

Fenotipik yapısı (tercihan homozigot) 2 veya 3

farklı donörden alınmış test hücreleri tarama,

daha fazla sayıda test hücreleri ise tanımlama

testlerinde kullanılmalı

IAT

1 2 3

1 damla hücre

+

2 damla hasta serumu

ANTİKOR TARAMA (IAT-ET)

++++ +++ ++ + - -

I II III I II III

Santrifüj10 Dakika

DeğerlendirmeTest hücreleri ekindeki tablodeğerlendirmede kullanılır.

Hücre vetablonun Lot numarası aynı

olmalıdır.

Dağıtım50 µL etiketine uyan test hücresi25 µL hasta serumu veya plazma

++++ +++ ++ + - -

Test HücrelerininHazırlanması

( IP, IIP, IIIP )Hücreler resüspanse edilerek

oda ısısına getirilir

İnkübasyon37 °C’de 15 Dakika

I II III I II III

Test HücrelerininHazırlanması( I, II, III )

Hücreler resüspanse edilerekoda ısısına getirilir

++++ +++ ++ + - -

I II III I II III

ANTİKOR TARAMA - CA

Santrifüj10 Dakika

DeğerlendirmeTest hücreleri ekindeki tablodeğerlendirmede kullanılır.

Hücre vetablonun Lot numarası aynı

olmalıdır.

Dağıtım50 µL etiketine uyan test hücresi25 µL hasta serumu veya plazma

++++ +++ ++ + - -

İnkübasyon4 °C’de 15 Dakika

I II III I II III

Test HücrelerininHazırlanması( I, II, III )

Hücreler resüspanse edilerekoda ısısına getirilir

* Normal Hücre ve Nacl / Enzym / Cold Aglutinin KartıKullanılır

* *

Test Hücreleri

Tüpte Antikor Tanımlama

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1 damla hücre

+

2 damla hasta serumu

ANTİKOR TANIMLAMA - IAT

++++ +++ ++ + - -

1 2 3 4 5 6

++++ +++ ++ + -

7 8 9 10 11

Santrifüj10 Dakika

DeğerlendirmeTest hücreleri ekindeki tablodeğerlendirmede kullanılır.

Hücre vetablonun Lot numarası aynı

olmalıdır.

Dağıtım50 µL etiketine uyan test hücresi25 µL hasta serumu veya plazma

Test HücrelerininHazırlanması

( 11’li Normal Panel Hücresi )Hücreler resüspanse edilerek

oda ısısına getirilir

++++ +++ ++ + - -

1 2 3 4 5 6

İnkübasyon37 °C’de 15 Dakika

++++ +++ ++ + -

7 8 9 10 11

Adı SoyadıTarih

++++ +++ ++ + - -

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

++++ +++ ++ + -

ANTİKOR TANIMLAMA – ET

Santrifüj10 Dakika

DeğerlendirmeTest hücreleri ekindeki tablodeğerlendirmede kullanılır.

Hücre vetablonun Lot numarası aynı

olmalıdır.

Dağıtım50 µL etiketine uyan test hücresi25 µL hasta serumu veya plazma

++++ +++ ++ + - -

İnkübasyon37 °C’de 15 Dakika

++++ +++ ++ + -

Test HücrelerininHazırlanması

( 11’li Enzimli Panel Hücresi )Hücreler resüspanse edilerek

oda ısısına getirilir

1 2 3 4 5

67 8 9 10 11

Adı SoyadıTarih

++++ +++ ++ + - -

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

++++ +++ ++ + -

ANTİKOR TANIMLAMA – CA

Santrifüj10 Dakika

DeğerlendirmeTest hücreleri ekindeki tablodeğerlendirmede kullanılır.

Hücre vetablonun Lot numarası aynı

olmalıdır.

Dağıtım50 µL etiketine uyan test hücresi25 µL hasta serumu veya plazma

++++ +++ ++ + - -

İnkübasyon4 °C’de 15 Dakika

++++ +++ ++ + -

Test HücrelerininHazırlanması

( 11’li Normal Panel Hücresi )Hücreler resüspanse edilerek

oda ısısına getirilir

1 2 3 4 5

6

7 8 9 10 11

* Normal Hücre ve Nacl / Enzym / Cold Aglutinin KartıKullanılır

**

Değerlendirme

Antikor Tanımlama

Anti-E