IMAGEN™ hMPV

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50 A direct immunofluorescence test for the detection of human metapneumovirus (hMPV).

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1 INTENDED USE The IMAGEN™ human metapneumovirus (hMPV) test is a qualitative immunofluorescence test for the direct detection of hMPV in clinical specimens. 2 SUMMARY Human metapneumovirus (hMPV) is an enveloped, spherical RNA virus of the family Paramyxoviridae, subfamily Paramyxovirinae and is classified within the genus Metapneumovirus1. hMPV is the only member of the genus that affects humans, with the other members including avian pneumoviruses A, B, C and D2,3. The virus was first reported in 2001 in the Netherlands and since then has been found to be distributed world wide and is associated with a significant proportion of the respiratory infections in early infancy and childhood, but is present in all age groups4,5. hMPV, like other common respiratory viruses including RSV and Influenza, causes seasonal epidemics centred around the winter months, and symptoms are very similar to those experienced by patients infected with RSV, including most commonly fever with upper respiratory symptoms such as cough and nasal congestion5,6. However, hMPV has also been associated with more severe illness and lower respiratory tract symptoms such as pneumonia and bronchiolitis6,7. hMPV has also been linked with an exacerbation of asthma and wheezing in infected individuals, although there is some evidence that it is not as common a cause of wheezing as RSV and rhinoviruses8,9. It has been shown that hMPV is associated with co-infections, particularly with respect to RSV10. Diagnostic methods have relied upon PCR, since hMPV is slow to grow in most cell lines commonly used for the isolation of respiratory viruses11,12. However, monoclonal antibodies have been described which are able to detect hMPV in nasopharyngeal aspirates and the concept of a traditional immunofluorescent assay has now been proven13. A direct immunofluorescence test utilising specific monoclonal antibodies offers a rapid, sensitive and specific method for direct detection of hMPV in clinical samples such as nasopharyngeal aspirates. IMAGEN™ hMPV is a direct immunofluorescence test for the rapid detection and identification of hMPV in human clinical specimens. The test utilises two monoclonal antibodies in order to detect specific structural proteins expressed in all strains of human metapneumovirus. 3 PRINCIPLE OF THE TEST The IMAGEN™ hMPV test contains monoclonal antibodies conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC). The conjugated antibodies bind specifically to viral antigens present in all strains of hMPV. The Reagent is used in a one-step direct immunofluorescence technique. Specimens are incubated with the Reagent containing FITC conjugated antibodies for 15 minutes, then excess Reagent is washed off with phosphate buffered saline (PBS). The stained area is mounted and viewed microscopically using epifluorescent illumination. If hMPV antigen is present, characteristic bright apple green fluorescence is seen within infected cells, which contrasts with the red background staining of uninfected cells.

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4 DEFINITIONS The following symbols and definitions have been used in the product information.

Product code and catalogue number

Consult the instructions for use N Contains sufficient for <N> tests

Manufactured by

Use by

Batch Code

Storage temperature limitations 5 REAGENTS PROVIDED 50 – Each kit contains sufficient materials for 50 direct specimens. - The shelf life of

the kit is as indicated on the outer box. 5.1 IMAGEN™ hMPV REAGENTS

One Instructions For Use booklet.

2 x 1 well Positive Control Slide containing acetone-fixed African green monkey cells (VERO) infected with hMPV.

One bottle of each of the following:

3mL of Mounting Fluid. The Mounting Fluid contains a photobleaching inhibitor in a glycerol solution (pH 10.0).

1.4mL of IMAGEN™ hMPV Reagent. The Reagent consists of a mixture of purified murine monoclonal antibodies specific to hMPV and conjugated to FITC. The monoclonal antibodies are directed against the Fusion protein and Nucleoprotein of hMPV.

5.2 PREPARATION, STORAGE AND RE-USE OF KIT COMPONENTS In order to ensure optimal kit performance, it is important that all unused kit components are stored according to the following instructions. 5.3 POSITIVE CONTROL SLIDES - Positive Control Slides are provided individually in sealed foil pouches with nitrogen. Store unused slides at 2-8°C. The slide should be left in its pouch for 5 minutes at room temperature (15-30°C) before opening. Stain the slide immediately after opening.

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5.4 MOUNTING FLUID - Ready to use. Store unused Mounting Fluid at 2-8°C. The Mounting Fluid should be left at room temperature (15-30°C) for 5 minutes before use. 5.5 REAGENT - Ready to use. Store unused Reagent in the dark at 2-8°C. The Reagent should be left at room temperature (15-30°C) for 5 minutes before use. 6 ADDITIONAL REAGENTS 6.1 REAGENTS Fresh acetone (for fixation). Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.5 for washing stained specimens and for specimen preparation. 6.2 ACCESSORIES The following products are intended for use in conjunction with IMAGEN™ hMPV. Contact your local Oxoid subsidiary or distributor for further information. Teflon coated glass microscope slides with single 6mm diameter well (100 slides per box) available from your local Oxoid subsidiary or distributor, (Code No. S611430-6). IMAGEN™ hMPV Positive Control Slide (Code No S612830-2). 7 EQUIPMENT The following equipment is required: Precision pipette and disposable tips to deliver 25µL Wash bath Cover slips suitable to cover 6mm diameter well Microscope slides for sample preparation with a 6mm well diameter Non-fluorescing immersion oil Epifluorescence microscope with filter system for FITC (maximum excitation wavelength 490nm, mean emission wavelength 520nm) and x200-x1000 magnification Incubator at 37°C Low speed centrifuge Mucus extractor (nasopharyngeal specimens only)

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8 PRECAUTIONS

- For in vitro diagnostic use. Anyone performing an assay with this product must be trained in its use and must be experienced in laboratory procedures. 8.1 SAFETY PRECAUTIONS 8.1.1 The IMAGEN™ hMPV Reagent contains 15mmol/L sodium azide, which is a poison. Sodium azide may react with copper and lead plumbing systems to form explosive metal azides. Always dispose of materials containing azide by flushing with large quantities of water. 8.1.2 hMPV on the Positive Control Slide has been shown to be non-infectious in cell culture, however, the slide should be handled and disposed of as though potentially infectious. 8.1.3 Evans blue dye is present in the Reagent. Contact with the skin should be avoided. 8.1.4 Care should be taken when using the Mounting Fluid as it may cause skin irritation. Skin should be flushed with water if contact occurs. 8.1.5 Do not eat, drink, smoke, store or prepare foods or apply cosmetics within the designated work area. 8.1.6 Do not pipette materials by mouth. 8.1.7 Wear disposable gloves while handling clinical specimens and infected cells and always wash hands after working with infectious materials. 8.1.8 Dispose of all clinical samples in accordance with local legislation. 8.1.9 Safety data sheet available for professional user on request. 8.2 TECHNICAL PRECAUTIONS 8.2.1 Components must not be used after the expiry date printed on the labels. Do not mix different batch lots of reagents. 8.2.2 The reagents are provided at fixed working concentrations. Test performance will be adversely affected if the reagents are not stored under conditions as detailed in Section 5. 8.2.3 Prepare fresh Phosphate Buffered Saline (PBS) as required on the day of use. 8.2.4 Avoid microbial contamination of reagents. 8.2.5 The reagents must not be frozen.

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9 COLLECTION AND PREPARATION OF SPECIMENS The collection and preparation of specimens is of fundamental importance in the diagnosis of hMPV by direct immunofluorescence. Specimens must be collected from the site of infection during peak time of viral shedding and be prepared in such a way as to preserve intact cells which are free from adherent mucus. The recommended respiratory sample is nasopharyngeal aspirate which, when correctly collected, should provide large numbers of respiratory epithelial cells. 9.1 NASOPHYARYNGEAL ASPIRATES/SECRETIONS Collection Collect secretions from the nasopharyngeal region into a mucus extractor through a size 8 feeding tube. The mucus extractor and tubing should be sent to the laboratory as soon as possible for processing. Cell separation techniques are necessary for direct immunofluorescence staining. Specimen or supernatant material from cell separation techniques may be used for virus culture inoculation. Cell Separation If necessary add 2mL phosphate buffered saline (PBS) to the specimen prior to centrifugation to reduce the viscosity and dilute the mucus. Centrifuge the mucus extractor at room temperature (15-30°C) for 10 minutes at 380g. Remove the supernatant which can be used for cell culture. Suspend the cell deposit in 2mL PBS and gently pipette the cells up and down with a wide bore pipette, or vortex gently, until the mucus is broken up and cellular material released. Avoid vigorous pipetting/vortexing to prevent damage to the cells. When a smooth suspension has been obtained add further PBS as required, pipetting or vortexing after addition of the extra volume to wash the cells further. Remove and discard any visible flecks of mucus remaining at this point. Excess mucus must be removed as it will prevent adequate penetration of the Reagent and may result in non-specific fluorescence. If all secretions remain in the feeding tube and none reach the mucus extractor, wash all secretions out of the tube into PBS. This is best achieved by inserting a pasteur pipette into the end of the tube which was attached to the mucus extractor. Suck up the appropriate fluid into the tube and expel it repeatedly until the secretions adhering to the wall of the tube have been dislodged. Pipette the suspension up and down until the mucus has been adequately broken up. Preparation of Slides After completing the cell separation process, centrifuge the resultant cell suspension at room temperature (15-30°C) for 10 minutes at 380g and discard the supernatant. Resuspend the cell deposit in sufficient PBS to dilute any remaining mucus while at the same time maintaining a high cell density. Place 25µL of the resuspended cell deposit into a 6mm well area on the slide. Allow the specimen to air dry thoroughly at room temperature (15-30°C) and fix in fresh acetone at room temperature (15-30°C) for 10 minutes. If the specimen is not stained immediately store at 4°C overnight or freeze at -20°C for longer storage periods.

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10 TEST PROCEDURE PLEASE REFER TO SECTION 8.2 TECHNICAL PRECAUTIONS BEFORE PERFORMING TEST PROCEDURE. 10.1 ADDITION OF REAGENT Add 25µL of IMAGEN™ hMPV Reagent to the fixed cell preparation on the slide (see Section 9) or to a Positive Control Slide. Ensure that the Reagent covers the entire well area. 10.2 FIRST INCUBATION Incubate the slides with Reagent in a moist chamber for 15 minutes at 37°C. Do not allow the Reagent to dry on the specimen, as this will cause the appearance of non-specific staining. 10.3 WASHING THE SLIDE Wash off excess Reagent with phosphate buffered saline (PBS) then gently wash the slide in an agitating bath containing PBS for 5 minutes. Drain off PBS and allow the slide to air dry at room temperature (15-30°C). 10.4 ADDITION OF MOUNTING FLUID Add one drop of IMAGEN™ hMPV Mounting Fluid to the centre of each well and place a cover slip over the Mounting Fluid and specimen ensuring that no air bubbles are trapped. 10.5 READING THE SLIDE Examine the entire well containing the stained specimen using an epifluorescence microscope. Fluorescence (see Section 11) should be visible at x400 magnification. (For best results specimens should be read immediately after staining, but specimens may be stored at 2-8°C in the dark for up to 2 hours without any loss of fluorescence). Due to the variable nature of hMPV infected cell presentation it is recommended that any samples giving a small area of specific cell associated apple green fluorescence under x400 are viewed under x1000 using oil immersion to confirm their status. 11 INTERPRETATION OF TEST RESULTS 11.1 CONTROLS 11.1.1 Positive Control Slides When stained and viewed (see Section 10) the control slide should show cells with apple-green fluorescent intracellular cytoplasmic granules or filaments contrasting against a red background of counterstained specimen. These cells are slightly larger than respiratory epithelial cells but show similar cytoplasmic fluorescence when infected with hMPV.

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Positive Control Slides should be used to check that the staining procedure has been satisfactorily performed. 11.1.2 Negative Control If a negative control is required, uninfected intact cells of the type used for the culture and isolation of respiratory viruses are recommended. The cells should be prepared, fixed and stained (see Section 10). 11.2 CLINICAL SPECIMENS 11.2.1 Appearance of hMPV Infected cells Apple-green fluorescent intracellular cytoplasmic granules or filaments are seen in respiratory epithelial cells infected with hMPV. Some delicate staining has been observed with this virus and any cells suspected of being positive following examination at x400 should be confirmed as positive at x1000 using oil immersion to confirm their status. Uninfected cells stain red with the Evans blue counterstain. 11.2.2 Interpretation A positive diagnosis is made when one or more cells show typical fluorescence in the fixed, stained specimen. A negative diagnosis is made when fixed stained specimens do not exhibit fluorescence after staining with the Reagent. For directly stained nasopharyngeal aspirate specimens at least 20 uninfected respiratory epithelial cells must be visible within the slide well before a negative result is reported (see Section 11.2.3 if insufficient cells are present). 11.2.3 Insufficient cells If insufficient cells are present in the slide well preparation, the remainder of the clinical specimen should be centrifuged at 380g for 10 minutes at room temperature (15-30°C). Resuspend the cells in a smaller volume of PBS before redistribution (25µL) on the slide. Alternatively, a repeat specimen should be requested. 12 PERFORMANCE LIMITATIONS 12.1 The FITC Reagent may non-specifically stain Staphylococcus aureus strains containing large amounts of protein A. This is due to non-immune interaction of protein A with the Fc region of the monoclonal antibody, an observation reported for other monoclonal and polyclonal based fluorescent assays14. However, this staining does not give the typical intracellular fluorescence pattern seen in cells infected with hMPV (see Section 11.2.1) and should be interpreted as non-specific staining.

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12.2 Use only the Mounting Fluid provided. 12.3 The visual appearance of the fluorescence image obtained may vary due to the type of microscope and light source used. 12.4 It is recommended that 25µL of Reagent is used to cover a 6mm well area. A reduction in this volume may lead to difficulties in covering the specimen area and may reduce sensitivity. 12.5 All reagents are provided at fixed working concentrations. Test performance may be affected if the reagents are modified in any way or not stored under the recommended conditions as outlined in Section 5. 12.6 Failure to detect hMPV may be a result of factors such as collection of specimen at an inappropriate time of the disease, improper sampling and/or handling of specimen, failure of cell culture etc. A negative result does not exclude the possibility of hMPV infection. 12.7 The presence of hMPV in nasopharyngeal secretions does not necessarily exclude the possibility of concomitant infection with other pathogens. 12.8 Test results should be interpreted in conjunction with information available from epidemiological studies, clinical assessment of the patient and other diagnostic procedures. 12.9 It is recommended that wells of 6mm diameter minimum are used for preparation of samples. Use of slides with wells smaller than 6mm in diameter may reduce the possibility of detecting small numbers of positive cells in weak positive samples. 13 EXPECTED VALUES The detection rate for hMPV is influenced by the time of specimen collection and the handling, storage and transportation of specimens. It is also dependent on age, general health, geographical location and socio-economic status of the population tested. hMPV is prevalent throughout the world and is associated with significant seasonal respiratory tract infections in temperate and tropical regions6,9,12. In temperate climates annual outbreaks of hMPV infection occur predominantly during winter months6. Lower respiratory tract infections are generally higher during these periods. Therefore, during seasonal outbreaks, a significant number of nasopharyngeal aspirates can be expected to be positive for hMPV. hMPV infections occur in all age groups but the symptoms are most severe in infants and the elderly12. 14 SPECIFIC PERFORMANCE CHARACTERISTICS 14.1 CLINICAL TRIALS

The IMAGEN™ hMPV test was evaluated at two clinical trial centres in Europe on nasopharyngeal secretions from hospitalised patients showing symptoms of respiratory infection. Trial centre 1 tested 91 specimens (41 male, 47 female, 3 unspecified sex, age range of 1 day to 66 years) collected during the 2006-2007 winter epidemics by IMAGEN™ hMPV test and the centre’s standard commercial hMPV diagnostic test, reverse transcription

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polymerase chain reaction (RT-PCR). A result was considered positive if both the IMAGEN™ hMPV test and the RT-PCR test were positive. The overall incidence of hMPV infected specimens in this trial was 3.4%. The IMAGEN™ hMPV test gave 100% agreement with the reference PCR method. Table 1 shows trial centre 1 findings. Table 1: Diagnosis of hMPV infection using IMAGEN™ hMPV and RT-PCR

Overall Agreement: 100% 95% Confidence Interval: 96-100% Positive Agreement: 100% 95% Confidence Interval: 29.2-100% Negative Agreement: 100% 95% Confidence Interval: 95.9-100% Trial centre 2 tested 359 specimens collected during the 2006-2007 winter epidemics from multiple patients (219 males, 140 females with an age range of 8 days to 73 years) by IMAGEN™ hMPV test and an indirect monoclonal antibody pool immunofluorescence method. Samples that were found to be positive by either the IMAGEN™ hMPV test or with the indirect monoclonal antibody pool were confirmed by real time RT-PCR used routinely at the trial site. Samples that were found to be positive by either the indirect monoclonal antibody pool or the IMAGEN™ hMPV test and RT-PCR were considered a confirmed positive sample. The overall incidence of hMPV in this set of trial samples was 3.3%. The IMAGEN™ hMPV test gave an overall agreement of 99.2% with the monoclonal antibody pool. Table 2 shows trial centre 2 findings for IMAGEN™ hMPV and the indirect monoclonal antibody pool. Table 2: Diagnosis of hMPV Infection using IMAGEN™ hMPV and a Monoclonal

Antibody Pool

RT-PCR

+ -

+ 3 0 IMAGEN™ hMPV

- 0 88

Monoclonal Antibody Pool + -

+ 9a 1a IMAGEN™ hMPV

- 2a 347

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a) Samples confirmed as hMPV Positive by real-time RT-PCR Overall Agreement: 99.2% 95% Confidence Interval: 97.6-99.8% Positive Agreement: 81.8% 95% Confidence Interval: 48.2-97.7% Negative Agreement: 99.7% 95% Confidence Interval: 98.4-100% Trial site 2 also tested the IMAGEN™ hMPV kit against a commercial ELISA kit with a subset of samples.153 samples were tested from specimens also collected during the 2006-2007 winter epidemics from multiple patients (100 males, 53 females with an age range of 7 days to 69 years). Samples found to be positive by either the IMAGEN™ hMPV test or with the commercial EIA were also tested using the same real time RT-PCR assay for confirmation. The overall incidence of hMPV in this set of trial samples was 7.8%. The IMAGEN™ hMPV test gave an overall agreement of 97.4% with the commercial EIA. Table 3 shows the findings of trial centre 2 with this sample subset. Table 3: Diagnosis of hMPV Infection using IMAGEN™ hMPV and a Commercial EIA

a) Samples confirmed as hMPV positive by real-time RT-PCR Overall Agreement: 97.4% 95% Confidence Interval: 93.4-99.3% Positive Agreement: 80.0% 95% Confidence Interval: 44.4-97.5% Negative Agreement: 98.6% 95% Confidence Interval: 95.0-99.8%

EIA

+ -

+ 8a 2a IMAGEN™ hMPV

- 2a 141

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14.2 CROSS REACTIVITY IMAGEN™ hMPV is highly specific for antigens from human metapneumovirus. No cross-reactivity was observed when testing the microorganisms listed below. Testing was performed on laboratory cultures of known organisms. Bacteria Chlamydia trachomatis Chlamydia pneumoniae Haemophilus influenzae Legionella pneumophila Moraxella catarrhalis Mycoplasma pneumoniae Neisseria meningitidis Neisseria gonorrhoeae Neisseria lactamica Streptococcus pneumoniae

Viruses Parainfluenza 1, 2, 3 Influenza A and B Cytomegalovirus Coxsackie Virus Strains B1, B2, B3, B4, B5 and B6 Echovirus 4, 6, 9, 11, 30 and 34 Varicella Zoster Adenovirus Respiratory Syncytial Virus Herpes Simplex Virus 1 and 2

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1 INTÉRÊT Le test IMAGEN™ Human Metapneumovirus (hMPV) est un test qualitatif destiné à la détection directe du hMPV par immunofluorescence dans des échantillons cliniques. 2 RÉSUMÉ Le métapneumovirus humain (hMPV) est un virus à ARN sphérique enveloppé de la famille des Paramyxoviridae, sous-famille des Paramyxovirinae et il a été classé dans le genre Métapneumovirus1. Le hMPV est le seul virus de ce genre qui affecte l'homme, les autres virus incluant les pneumovirus aviaires A, B, C et D2,3.

Ce virus a été découvert aux Pays-Bas en 2001. Il a ensuite été détecté partout dans le monde, largement associé aux infections respiratoires de la petite enfance et de l'enfance, mais il est présent dans tous les groupes d'âge4,5. À l'instar des autres virus respiratoires courants y compris le RSV et l'influenza, le hMPV est responsable d'épidémies saisonnières concentrées sur les mois d'hiver. Ses symptômes sont très similaires à ceux des patients infectés par le RSV comprenant principalement une fièvre associée à des symptômes des voies aériennes supérieures tels que la toux et une congestion nasale5,6. Cependant, le hMPV a également été associé à des maladies plus graves et des symptômes affectant les voies aériennes inférieures, tels que la pneumonie et la bronchiolite6 7. Il a également été lié à une exacerbation de l'asthme et à une respiration sifflante chez les individus infectés, mais certaines évidences tendent à prouver qu'il n'est pas une cause de respiration sifflante aussi courante que le RSV et les rhinovirus8,9. L'association du hMPV à des co-infections, particulièrement avec le RSV, a été démontrée10. Les méthodes de diagnostic étaient antérieurement basées sur PCR, car la culture du hMPV dans la plupart des lignées cellulaires couramment utilisées pour isoler les virus respiratoires est lente11,12. Cependant, des anticorps monoclonaux capables de détecter le hMPV dans les prélèvements nasopharyngés ont été décrits et le concept d'une analyse traditionnelle par immunofluorescence a dorénavant été prouvé13. Un test par immunofluorescence directe utilisant des anticorps monoclonaux spécifiques offre un moyen rapide, sensible et spécifique de détection directe du hMPV dans des échantillons cliniques tels que des prélèvements nasopharyngés. Le test IMAGEN™ hMPV est un test par immunofluorescence directe destiné à la détection et à l'identification rapide du hMPV dans des échantillons cliniques humains. Il utilise deux anticorps monoclonaux pour détecter les protéines de structure spécifique exprimées dans toutes les souches du métapneumovirus humain. 3 PRINCIPE DU TEST Le test IMAGEN™ hMPV contient des anticorps monoclonaux conjugués à de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC). Les anticorps conjugués se lient spécifiquement aux antigènes viraux présents dans toutes les souches de hMPV. Le réactif est utilisé dans le cadre d'une technique d'immunofluorescence directe en une étape.

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Les échantillons sont incubés dans le réactif contenant les anticorps conjugués au FITC pendant 15 minutes, puis l'excédent de réactif est éliminé par lavage avec une solution tampon saline de phosphate (PBS). Les surfaces colorées sont montées et examinées au microscope à la lumière épifluorescente. Si l'antigène hMPV est présent, une fluorescence caractéristique vert pomme brillant apparaît dans les cellules infectées contrastant avec la contre-coloration rouge de l'arrière-plan des cellules non infectées. 4 DÉFINITIONS Les symboles et définitions suivants ont été utilisés dans la notice d'information du produit.

Code du produit et référence du catalogue

Consulter les instructions d'utilisation N Contenu suffisant pour <n> tests

Fabricant

Utiliser jusque

Code du lot

Limites de température 5 RÉACTIFS FOURNIS 50 – Chaque trousse contient suffisamment de réactifs pour tester 50 échantillons

directs. - La date de péremption de la trousse est indiquée sur l'emballage extérieur. 5.1 RÉACTIFS IMAGEN™ hMPV

Un livret d'instructions d'utilisation.

Deux lames de Contrôle Positif à 1 puits contenant des cellules de singe vert (VERO) infectées par le hMPV fixées dans de l'acétone.

La trousse contient un flacon de chacun des produits suivants :

3mL de Liquide de Montage. Ce liquide de montage contient un inhibiteur de blanchissage optique dans une solution de glycérol (pH 10,0).

1,4mL de Réactif IMAGEN™ hMPV. Le Réactif est composé d’anticorps monoclonaux murins purifiés spécifiques du hMPV conjugués à du FITC. Les anticorps monoclonaux sont dirigés contre la protéine de fusion et la nucléoprotéine du hMPV.

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5.2 PRÉPARATION, CONSERVATION ET RÉUTILISATION DES COMPOSANTS DE

LA TROUSSE Pour garantir des performances optimales, tous les composants inutilisés de la trousse doivent être stockés conformément aux consignes suivantes. 5.3 LAMES DE CONTRÔLE POSITIF - Les lames de Contrôle Positif sont fournies dans un emballage individuel scellé sous atmosphère d’azote. Conserver les lames inutilisées à une température comprise entre 2-8°C. Avant d’ouvrir l’emballage, laisser les lames emballées séjourner 5 minutes à température ambiante (15-30°C). Procéder à la coloration des lames immédiatement après ouverture. 5.4 LIQUIDE DE MONTAGE - Prêt à l’emploi. Conserver le Liquide de Montage inutilisé à une température comprise entre 2-8°C. Laisser le liquide de montage séjourner 5 minutes à température ambiante (15-30°C) avant de l’utiliser. 5.5 RÉACTIF - Prêt à l’emploi. Conserver le Réactif inutilisé à l'abri de la lumière et à une température comprise entre 2-8°C. Laisser le Réactif séjourner 5 minutes à température ambiante (15-30°C) avant de l’utiliser. 6 RÉACTIFS SUPPLÉMENTAIRES 6.1 RÉACTIFS Acétone frais (pour la fixation). Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à pH 7,5 pour le lavage et la préparation des lames. 6.2 ACCESSOIRES Les produits suivants sont destinés à être utilisés conjointement avec le test IMAGEN™ hMPV. Pour plus de renseignements, contactez votre filiale ou votre distributeur Oxoid local. Lames en verre pour microscope recouvertes de Téflon avec puits unique de 6 mm de diamètre (100 lames par boîte), disponibles auprès de votre filiale ou distributeur Oxoid local (Code S611430-6). Lame de contrôle positif IMAGEN™ hMPV (Code S612830-2). 7 MATÉRIEL Le matériel suivant est requis:

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Pipette de précision et embouts jetables pour délivrer 25µL Bain de lavage Lamelles adaptées pour puits de 6 mm de diamètre Lames de microscope pour préparation d'échantillons avec puits de 6mm de diamètre Huile d’immersion non fluorescente Microscope à épifluorescence avec filtre pour FITC (longueur d’onde d’excitation maximale 490nm, longueur d’onde d’émission moyenne 520nm) et lentilles pour amplification x200-x1000 Incubateur à 37°C Centrifugeuse basse vitesse Extracteur de mucus (échantillons nasopharyngés uniquement) 8 PRÉCAUTIONS D’EMPLOI

- Pour usage diagnostique in vitro. L’utilisateur doit maîtriser les procédures générales de laboratoire et être spécifiquement formé à I’emploi de ce test. 8.1 MESURES DE SÉCURITÉ 8.1.1 Le Réactif de la trousse IMAGEN™ hMPV 15mmol/L d’azide de sodium, un poison. L'azide de sodium est susceptible de réagir avec le plomb et le cuivre pour former des azides métalliques hautement explosifs. Lors de l'élimination des réactifs, rincer avec de grandes quantités d'eau. 8.1.2 Le virus hMPV de la lame de Contrôle Positif s’est révélé non infectieux lors de la culture cellulaire. Toutefois, la lame doit être manipulée et mise au rebut comme si elle était potentiellement infectieuse. 8.1.3 Le Réactif contient du bleu Evans. Éviter tout contact avec la peau. 8.1.4 L’utilisation du Liquide de Montage doit faire l'objet de précautions particulières, car il peut provoquer des irritations cutanées. En cas de contact avec la peau, rincer abondamment à l’eau. 8.1.5 Ne pas manger, boire, fumer, conserver ou préparer de la nourriture, ni se maquiller sur le lieu d’utilisation. 8.1.6 Ne pas pipeter les matériaux avec la bouche. 8.1.7 Porter des gants jetables pour manipuler les échantillons cliniques et les cellules infectées, et toujours se laver les mains après avoir manipulé des substances infectieuses. 8.1.8 Éliminer tous les échantillons cliniques conformément à la législation locale.

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8.1.9 Une fiche de données de sécurité est disponible sur demande pour les utilisateurs professionnels. 8.2 PRÉCAUTIONS TECHNIQUES 8.2.1 Ne pas utiliser les composants après la date de péremption imprimée sur les étiquettes. Ne pas mélanger différents lots de réactifs. 8.2.2 Les réactifs sont fournis à des concentrations dosées fixes. Les performances du test seront altérées si les réactifs ne sont pas stockés dans les conditions décrites dans le paragraphe 5. 8.2.3 Préparer uniquement la quantité de solution tampon saline de phosphate (PBS) nécessaire pour un jour. 8.2.4 Éviter toute contamination microbienne des réactifs. 8.2.5 Ne pas congeler les réactifs. 9 PRÉLÈVEMENT ET PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS Le prélèvement et a préparation des échantillons sont d’une importance fondamentale dans le diagnostic de l’infection par le hMPV par immunofluorescence directe. Les échantillons doivent être prélevés sur le site de l'infection pendant les pics de libération virale et être préparés de manière à préserver intactes les cellules libres de mucus adhérent. L'échantillon respiratoire recommandé est un prélèvement nasopharyngé qui, lorsqu'il est correctement prélevé, doit fournir une grande quantité de cellules épithéliales respiratoires. 9.1 PRÉLÈVEMENTS/SÉCRÉTIONS NASOPHYARYNGÉS Prélèvement Prélever les sécrétions dans la région nasopharyngée dans un extracteur de mucus à l'aide d'une sonde d'intubation n°8. L'extracteur de mucus et la sonde doivent être envoyés au laboratoire dès que possible pour la préparation. La coloration par immunofluorescence directe exige l'utilisation de techniques de séparation cellulaire. L'échantillon ou le surnageant obtenu par une technique de séparation cellulaire peuvent être utilisés pour l'inoculation d'une culture virale. Séparation cellulaire Si nécessaire, ajouter 2mL de solution tampon saline de phosphate (PBS) à l'échantillon avant la centrifugation pour réduire la viscosité et diluer le mucus. Centrifuger l'extracteur de mucus à température ambiante (15-30°C) pendant 10 minutes à 380g. Retirer le surnageant qui pourra être utilisé pour une culture cellulaire. Mettre le dépôt cellulaire en suspension dans 2mL de PBS et pipeter lentement les cellules de haut en bas à l'aide d'une pipette de grand diamètre ou agiter doucement jusqu'au fractionnement du mucus et la libération du matériau cellulaire. Ne pas pipeter ou agiter vigoureusement pour éviter d'endommager les cellules. Une fois qu'une suspension homogène a été obtenue, ajouter du PBS selon les besoins puis pipeter ou agiter pour continuer le lavage des cellules.

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Retirer et éliminer tous les résidus de mucus visibles restant à ce stade. L'excédent de mucus doit être éliminé, car il empêcherait la bonne pénétration du réactif et pourrait causer une fluorescence non spécifique. Si toutes les sécrétions restent dans la sonde d'intubation et qu'aucune n'atteint l'extracteur de mucus, laver la sonde dans du PBS. Pour cela, il est recommandé d'insérer une pipette Pasteur dans l'extrémité de la sonde ayant été fixée à l'extracteur de mucus. Aspirer un volume de liquide approprié dans la sonde, puis l'expulser de manière répétée jusqu'à ce que les sécrétions adhérant à la paroi soient délogées. Pipeter la suspension de haut en bas jusqu'à ce que le mucus soit correctement fractionné. Préparation des lames Une fois le processus de séparation cellulaire terminé, centrifuger la suspension cellulaire obtenue à température ambiante (15-30°C) pendant 10 minutes à 380g, puis jeter le surnageant. Remettre le dépôt cellulaire en suspension dans une quantité de PBS suffisante pour diluer tout le mucus restant tout en conservant une forte concentration cellulaire. Mettre 25µL de dépôt cellulaire remis en suspension dans un puits de 6 mm sur la lame. Laisser sécher entièrement à l’air libre à température ambiante (15-30°C) et fixer dans de l’acétone frais pendant 10 minutes à température ambiante (15-30°C). Si l’échantillon n’est pas coloré immédiatement, le conserver une nuit à 4°C ou le congeler à -20°C pour des périodes de stockage prolongées. 10 MODE OPÉRATOIRE VEUILLEZ CONSULTER LE PARAGRAPHE 8.2, PRÉCAUTIONS TECHNIQUES, AVANT DE RÉALISER LE TEST. 10.1 AJOUT DE RÉACTIF Ajouter 25µL de réactif IMAGEN™ hMPV à la préparation cellulaire fixée sur la lame (voir paragraphe 9) ou sur une lame de contrôle positif. Vérifier que le Réactif recouvre bien toute la surface du puits. 10.2 PREMIÈRE INCUBATION Incuber les lames avec le réactif pendant 15 minutes à 37°C dans une chambre humide. Ne pas laisser sécher le réactif sur l’échantillon, car cela peut causer l’apparition d’une coloration non spécifique. 10.3 LAVAGE DE LA LAME Éliminer l’excès de réactif par lavage en utilisant la solution tampon saline de phosphate puis laver la lame en agitant légèrement dans un bain de PBS pendant 5 minutes. Éliminer le PBS et laisser sécher la lame à l’air libre et à température ambiante (15-30°C). 10.4 AJOUT DE LIQUIDE DE MONTAGE Ajouter une goutte de liquide de montage IMAGEN™ hMPV au centre de chaque puits et placer une lamelle couvre-objet sur l'échantillon et le liquide en évitant la formation de bulles d’air.

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10.5 LECTURE DE LA LAME Examiner tout le puits contenant l'échantillon coloré à l'aide d’un microscope à épifluorescence. Une fluorescence (voir paragraphe 11) doit être visible à un grossissement de x400 (pour obtenir des résultats optimaux, les échantillons doivent être examinés immédiatement après la coloration, mais ils peuvent être conservés à une température de 2-8°C à l’abri de la lumière, jusqu’à 2 heures sans perte de fluorescence). Étant donné la nature variable de la présentation des cellules infectées par le hMPV, il est recommandé d'examiner les échantillons montrant une petite surface de cellule spécifique indiquée par une fluorescence vert pomme à x400, à un grossissement de x1000 avec une huile d'immersion pour confirmer le résultat. 11 INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS DU TEST 11.1 CONTRÔLES 11.1.1 Lames de Contrôle Positif Lors de l'examen d'une lame de contrôle colorée (voir paragraphe 10), on doit observer des cellules avec des granulés cytoplasmiques intracellulaires ou des filaments fluorescents vert pomme contrastant avec la contre-coloration d'arrière-plan rouge de l’échantillon. Ces cellules sont légèrement plus grandes que les cellules épithéliales respiratoires mais montrent une fluorescence cytoplasmique similaire lorsqu'elles sont infectées par le hMPV. Les lames de Contrôle Positif doivent être utilisées pour vérifier que la procédure de coloration a été exécutée de manière satisfaisante. 11.1.2 Contrôle Négatif Si un contrôle négatif s’avère nécessaire, il est recommandé d’utiliser des cellules intactes non infectées de type semblable à celui utilisé pour la culture et l'isolement des virus respiratoires. Ces cellules doivent être préparées, fixées et colorées (voir paragraphe 10). 11.2 ÉCHANTILLONS CLINIQUES 11.2.1 Aspect des cellules infectées par le hMPV On peut observer des granulés cytoplasmiques intracellulaires ou des filaments fluorescents vert pomme dans les cellules épithéliales respiratoires infectées par le hMPV. Une coloration très légère a été observée avec ce virus et toutes les cellules qu'on soupçonne être positives après un examen à un grossissement de x400 doivent être réexaminées pour être confirmées comme telles à un grossissement de x1000 avec une huile d'immersion. Les cellules non infectées sont colorées en rouge par le bleu Evans. 11.2.2 Interprétation Un diagnostic positif peut être posé lorsqu'une ou plusieurs cellules montrent une fluorescence typique dans l'échantillon fixé et coloré.

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De même, un diagnostic négatif peut être posé lorsqu'aucune fluorescence n'est visible dans l'échantillon fixé après coloration avec le réactif. Dans le cas des échantillons nasopharyngés directement colorés, au moins 20 cellules épithéliales respiratoires non infectées doivent être visibles dans le puits de la lame avant de pouvoir poser un diagnostic négatif (voir le paragraphe 11.2.3. si le nombre de cellules présentes est insuffisant). 11.2.3 Nombre de cellules insuffisant Si le nombre des cellules présentes dans la préparation de la lame est insuffisant, centrifuger le reste de l'échantillon clinique à 380g pendant 10 minutes à température ambiante (15-30°C). Remettre les cellules en suspension dans un volume moins important de PBS avant de les déposer (25µL) sur la lame. Le cas échéant, il faudra demander un nouvel échantillon clinique. 12 LIMITES DE PERFORMANCE 12.1 Il est possible que le réactif FITC colore de manière non spécifique les souches de Staphylococcus aureus contenant une grande quantité de protéine A. Cela est dû à une interaction non immune de la protéine A avec la région Fc de l'anticorps monoclonal, une observation faite dans le cadre d'autres analyses monoclonales et polyclonales par fluorescence14. Cependant, cette coloration ne donne pas le schéma de fluorescence intracellulaire typique observé dans les cellules infectées par le hMPV (voir paragraphe 11.2.1) et doit être interprétée comme une coloration non spécifique. 12.2 Utiliser exclusivement le liquide de montage fourni. 12.3 L’aspect visuel de la fluorescence obtenue peut varier en fonction du type de microscope et de la source lumineuse utilisés. 12.4 Il est recommandé d’utiliser 25µL de réactif pour recouvrir la surface d’un puits de 6 mm de diamètre. Si ce volume est réduit, il peut s’avérer difficile de recouvrir la surface de l’échantillon, au risque de diminuer la sensibilité du test. 12.5 Tous les réactifs sont fournis à des concentrations dosées fixes. Les performances du test sont altérées en cas de modification des réactifs ou de stockage dans des conditions autres que celles décrites dans le paragraphe 5. 12.6 La non détection du hMPV peut être due à différents facteurs, tels que le prélèvement de l’échantillon à une période inadéquate d'évolution de la maladie, un prélèvement non conforme et/ou une mauvaise manipulation de l’échantillon, l’échec de la culture cellulaire, etc. Un résultat négatif ne doit pas exclure la possibilité d’une contamination par le hMPV. 12.7 La présence du hMPV dans les sécrétions nasopharyngées n'exclut pas forcément la possibilité la possibilité d’une infection concomitante due à d'autres agents pathogènes.

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12.8 Les résultats des tests doivent être interprétés en regard des résultats des études épidémiologiques, des évaluations cliniques du patient et d’autres procédures diagnostiques. 12.9 Il est recommandé d'utiliser des puits de 6mm de diamètre minimum pour la préparation des échantillons. L'utilisation de lames avec des puits d'un diamètre inférieur à 6mm risque de réduire la possibilité de détection de petits nombres de cellules positives dans des échantillons faiblement positifs. 13 VALEURS ESCOMPTÉES Le taux de détection du hMPV est influencé par le moment du prélèvement de l'échantillon, ainsi que par la manipulation, le stockage et le transport des échantillons. Il dépend également de l'âge, de l'état de santé général, de la situation géographique et du statut socio-économique de la population testée. Le hMPV est prévalent partout dans le monde et il est associé à des infections significatives saisonnières des voies aériennes dans les régions tempérées et tropicales6,9,12. Dans les régions tempérées, les épidémies de maladies infectieuses à hMPV surviennent principalement en hiver6. Les infections des voies aériennes inférieures sont généralement plus prépondérantes à ces périodes. On peut donc s'attendre à ce qu'un nombre significatif de prélèvements nasopharyngés soit positif pour le hMPV pendant ces épidémies saisonnières. Les infections à hMPV sont présentes dans tous les groupes d'âge, mais les symptômes sont plus graves chez les nourrissons et les personnes âgées12. 14 CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCE SPÉCIFIQUES 14.1 ESSAIS CLINIQUES

Le test IMAGEN™ hMPV a été évalué dans deux centres d'essais cliniques en Europe sur des sécrétions nasopharyngées prélevées sur des patients hospitalisés présentant des symptômes d'infection respiratoire. Dans le centre d'essai 1, 91 échantillons (41 hommes, 47 femmes, 3 de sexe inconnu, tranche d'âge de 1 jour à 66 ans) prélevés pendant l'épidémie de l'hiver 2006-2007 ont été testés avec le test IMAGEN™ hMPV et le test de diagnostic hMPV commercial standard du centre, un test RT-PCR. On considérait un résultat comme positif si les deux tests, IMAGEN™ hMPV et RT-PCR, étaient positifs. L'incidence globale des échantillons infectés par le hMPV dans cet essai était de 3,4%. Le test IMAGEN™ hMPV a donné des résultats 100% en accord avec la méthode PCR de référence. Les résultats du centre d'essai 1 sont présentés dans le tableau 1. Tableau 1: Diagnostic d'infections à hMPV avec le test IMAGEN™ hMPV et le test

RT-PCR

RT-PCR

+ -

+ 3 0 IMAGEN™ hMPV

- 0 88

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Accord global: 100% Intervalle de confiance: 95 %: 96-100% Accord positif: 100% Intervalle de confiance: 95%: 29,2-100% Accord négatif: 100 % Intervalle de confiance: 95%: 95,9-100% Dans le centre d'essai 2, 359 échantillons prélevés pendant l'épidémie de l'hiver 2006-2007 sur plusieurs patients (219 hommes, 140 femmes, tranche d'âge de 8 jours à 73 ans) ont été testés avec le test IMAGEN™ hMPV et une méthode par immunofluorescence indirecte sur pool d'anticorps monoclonaux. Les échantillons trouvés positifs soit par le test IMAGEN™ hMPV, soit par le pool d'anticorps monoclonaux ont été confirmés par un test RT-PCR en temps réel utilisé couramment sur le site de l'essai. Les échantillons trouvés positifs soit par le pool d'anticorps monoclonaux indirect, soit par le test IMAGEN™ hMPV et le test RT-PCR ont été considérés comme confirmés positifs. L'incidence globale de hMPV dans cet essai était de 3,3%. Le test IMAGEN™ hMPV a montré une concordance globale de 99,2% avec le pool d'anticorps monoclonaux. Les résultats du centre d'essai 2 pour le test IMAGEN™ hMPV et le pool d'anticorps monoclonaux indirect sont présentés dans le tableau 2. Tableau 2: Diagnostic d'infections à hMPV avec le test IMAGEN™ hMPV et un pool

d'anticorps monoclonaux

a) Échantillons confirmés hMPV positifs par RT-PCR en temps réel. Accord global: 99,2% Intervalle de confiance 95%: 97,6-99,8% Accord positif: 81,8% Intervalle de confiance 95%: 48,2-97,7% Accord négatif: 99,7% Intervalle de confiance: 95%: 98,4-100% Le centre d'essais 2 a également testé la trousse IMAGEN™ hMPV par rapport à une trousse ELISA commerciale sur un sous-ensemble d'échantillons. Cent cinquante-trois (153) échantillons également prélevés pendant l'épidémie de l'hiver 2006-2007 sur plusieurs patients (100 hommes, 53 femmes, tranche d'âge de 7 jours à 69 ans) ont été testés. Les échantillons trouvés positifs soit par le test IMAGEN™ hMPV, soit par la trousse EIA commerciale ont également été testés par RT-PCR en temps réel pour confirmation.

Pool d'anticorps

monoclonaux

+ -

+ 9a 1a IMAGEN™ hMPV

- 2a 347

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L'incidence globale de hMPV dans cette série d'essais était de 7,8%. Le test IMAGEN™ hMPV a donné une concordance globale de 97,4% avec la trousse EIA commerciale. Les résultats du centre d'essais 2 avec ce sous-ensemble d'échantillons sont présentés dans le tableau 3. Tableau 3: Diagnostic d'infections à hMPV avec le test IMAGEN™ hMPV et une

trousse EIA commerciale

a) Échantillons confirmés hMPV positifs par RT-PCR en temps réel. Accord global : 99,2 % Accord global: 97,4% Intervalle de confiance: 95%: 93,4-99,3% Accord positif: 80,0% Intervalle de confiance: 95%: 44,4-97,5% Accord négatif: 98,6% Intervalle de confiance: 95,0-99,8% 14.2 RÉACTIVITÉ CROISÉE Le test IMAGEN™ hMPV est hautement spécifique pour les antigènes du métapneumovirus humain. Aucune réactivité croisée n'a été observée lors de tests avec les micro-organismes ci-dessous. Les tests ont été réalisés sur des cultures en laboratoire d'organismes connus. Bactéries Chlamydia trachomatis Chlamydia pneumoniae Haemophilus influenzae Legionella pneumophila Moraxella catarrhalis Mycoplasma pneumoniae Neisseria meningitidis Neisseria gonorrhoeae Neisseria lactamica Streptococcus pneumoniae

Virus Parainfluenza 1, 2, 3 Influenza A et B Cytomégalovirus Virus Coxsackie, souches B1, B2, B3, B4, B5 et B6 Échovirus 4, 6, 9, 11, 30 et 34 Varicelle-zona Adénovirus Virus respiratoire syncytial Virus Herpès Simplex 1 et 2

EIA

+ -

+ 8a 2a IMAGEN™ hMPV

- 2a 141

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1 ZWECKBESTIMMUNG Der IMAGEN™-Test für humanes Metapneumovirus (hMPV) ist ein qualitativer Immunfluoreszenztest zum direkten Nachweis von hMPV in klinischen Proben. 2 ZUSAMMENFASSUNG Humanes Metapneumovirus (hMPV) ist ein umhülltes, kugelförmiges RNA-Virus der Familie Paramyxoviridae, Unterfamilie Paramyxovirinae und ist im Genus Metapneumovirus1 klassifiziert. hMPV ist der einzige Vertreter des Genus, der den Menschen befällt, während zu den anderen Arten des Genus die aviären Pneumoviren A, B, C und D2,3 zählen. Über das Virus wurde zuerst 2001 in den Niederlanden berichtet, und es hat sich seitdem herausgestellt, dass es weltweit verbreitet ist und mit einem signifikanten Anteil der Atemwegsinfekte bei Säuglingen und Kleinkindern assoziiert ist, aber in allen Altersgruppen4, 5 vorhanden ist. Wie andere verbreitete respiratorische Viren, etwa RS- und Influenza-Viren, verursacht hMPV saisonale Epidemien mit Schwerpunkt in den Wintermonaten, und die Symptome sind sehr ähnlich denen, wie sie mit RSV infizierte Patienten erfahren, etwa in den meisten Fällen Fieber mit Symptomen an den oberen Atemwegen wie Husten und Anschwellen der Nasenschleimhaut5,6. hMPV ist jedoch auch mit ernsteren Erkrankungen und Symptomen der unteren Luftwege, wie Pneumonie und Bronchiolitis assoziiert worden6,7. hMPV wird auch mit einer Verschlimmerung von Asthma und keuchender Atmung bei infizierten Personen in Verbindung gebracht, obwohl einige Hinweise existieren, dass es eine nicht so verbreitete Ursache für keuchende Atmung ist, wie RSV and Rhinoviren8,9. Es wurde nachgewiesen, dass hMPV mit Koinfektionen assoziiert ist, insbesondere in Bezug auf RSV10. Diagnostische Verfahren beruhen auf der PCR-Methode, da hMPV in den meisten gemeinhin für die Isolierung von respiratorischen Viren verwendeten Zelllinien nur langsam wächst11,12. Es wurden jedoch monoklonale Antikörper beschrieben, mit denen hMPV in nasopharyngealen Aspiraten nachgewiesen werden konnte, und das Konzept eines traditionellen Immunfluoreszenztests hat sich nun bewährt13. Ein direkter Immunfluoreszenztest unter Verwendung spezifischer monoklonaler Antikörper bietet eine schnelle, sensitive und spezifische Methode für den direkten Nachweis von hMPV in klinischen Proben wie etwa nasopharyngealen Aspiraten. Der IMAGEN™-hMPV-Test ist ein direkter Immunfluoreszenztest für schnellen Nachweis und schnelle Ermittlung von hMPV in humanen klinischen Proben. Bei diesem Test werden zwei monoklonale Antikörper eingesetzt, um spezifische strukturelle, in allen Stämmen des humanen Metapneumovirus exprimierte Proteine nachzuweisen. 3 PRINZIP DES VERFAHRENS Der IMAGEN™-hMPV-Test enthält monoklonale, an Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) konjugierte Antikörper . Die konjugierten Antikörper binden spezifisch an in allen hMPV-Stämmen vorliegende Virusantigene. Das Reagenz wird bei einem direkten Einschritt-Immunfluoreszenzverfahren eingesetzt.

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Die Proben werden mit dem FITC-konjugierte Antikörper enthaltenden Reagenz 15 Minuten inkubiert und überflüssiges Reagenz wird durch Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) entfernt. Die angefärbte Fläche wird eingedeckt und mikroskopisch mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop ausgewertet. Falls hMPV-Antigen vorliegt, ist mit den infizierten Zellen eine charakteristische, helle apfelgrüne Fluoreszenz zu beobachten, die im Kontrast zur roten Hintergrundfärbung nicht infizierter Zellen steht. 4 DEFINITIONEN Die folgenden Symbole und Definitionen werden in der Produktinformation verwendet.

Produktcode und Bestellnummer

Gebrauchsanleitung beachten N Inhalt ausreichend für <N> Ansätze

Hersteller

Verwendbar bis

Chargenbezeichnung

Zulässiger Temperaturbereich 5 GELIEFERTE REAGENZIEN 50 – Jedes Kit enthält Material ausreichend für 50 direkte Proben. - Die Lagerfähigkeit

des Kits ist der äußeren Verpackung zu entnehmen. 5.2 IMAGEN™-hMPV-Reagenzien

Eine Gebrauchsanleitung.

2 x als Positivkontrolle vorgesehene Objektträger mit einer Vertiefung und Aceton-fixierten Zellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze (VERO) mit hMPV infiziert.

Jeweils eine Flasche der folgenden Reagenzien:

3mL Eindeckmedium. Das Eindeckmedium enthält eine Hemmsubstanz gegen lichtbedingtes Ausbleichen in einer Glycerol-Lösung (pH 10,0).

1,4mL IMAGEN™-hMPV-Reagenz. Das Reagenz besteht aus einer Mischung gegen hMPV spezifischer, FITC-konjugierter, gereinigter, muriner monoklonaler Antikörper. Die monoklonalen Antikörper sind gegen das Fusionsprotein und Nukleoprotein von hMPV gerichtet.

5.2 ANSETZEN, LAGERUNG UND ERNEUTE VERWENDUNG DER KIT-

KOMPONENTEN

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Um optimale Leistung der Kit-Komponenten zu gewährleisten, müssen alle nicht genutzten Komponenten in Übereinstimmung mit den folgenden Anleitungen gelagert werden: 5.3 OBJEKTTRÄGER POSITIVKONTROLLE - Zur Positivkontrolle dienende Objektträger werden einzeln in versiegelten Kunststoffbeuteln (mit Stickstoff) geliefert. Nicht verwendete Objektträger bei 2-8°C aufbewahren. Vor dem Öffnen den verpackten Objektträger 5 Minuten lang Raumtemperatur (15-30°C) annehmen lassen. Den Objektträger unmittelbar nach dem Öffnen anfärben. 5.4 EINDECKMEDIUM - Gebrauchsfertig. Nicht verwendetes Eindeckmedium bei 2-8°C aufbewahren. Vor der Verwendung das Eindeckmedium 5 Minuten lang Raumtemperatur (15-30°C) annehmen lassen. 5.5 REAGENZ - Gebrauchsfertig. Nicht verwendetes Reagenz im Dunkeln bei 2–8°C aufbewahren. Vor der Verwendung das Reagenz 5 Minuten lang Raumtemperatur (15-30°C) annehmen lassen. 6 ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE REAGENZIEN 6.1 REAGENZIEN Frisches Azeton (zur Fixierung). Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,5, zum Waschen der gefärbten Proben und für die Probenvorbereitung. 6.2 ZUBEHÖR Die folgenden Produkte sind für die Anwendung zusammen mit IMAGEN™-hMPV bestimmt. Weitere Informationen können von der örtlichen Oxoid-Niederlassung oder vom örtlichen Händler angefordert werden. Von der örtlichen Oxoid-Niederlassung oder vom örtlichen Händler können Teflon-beschichtete Glasobjektträger mit einer einzelnen Vertiefung mit einem Durchmesser von 6mm bezogen werden (100 Objektträger pro Gebinde; Code-Nr. S611430-6). IMAGEN™-hMPV Objektträger für die Positivkontrolle (Code Nr. S612830-2). 7 AUSSTATTUNG Folgende Ausstattung wird benötigt: Präzisionspipette mit Einwegspitzen für 25µL Waschtrog

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Deckgläser zum Eindecken einer Vertiefung mit 6mm Durchmesser Mikroskop-Objektträger zur Probenvorbereitung mit einer Vertiefung mit 6mm Durchmesser Nicht-fluoreszierendes Immersionsöl Epifluoreszenz-Mikroskop mit einem Filtersystem für FITC (maximale Anregungswellenlänge 490nm, mittlere Emissionswellenlänge 520nm) und 200- bis 1000-facher Vergrößerung Inkubator für 37°C Niedertourige Zentrifuge Schleim-Extraktor (nur für nasopharyngeale Proben) 8 VORSICHTSMASSNAHMEN

- Zur Verwendung für In-vitro-Untersuchungen. Personen, die Tests mit diesem Produkt durchführen, müssen in die Durchführung eingewiesen sein und über entsprechende Laborerfahrung verfügen. 8.1 SICHERHEITSMASSNAHMEN 8.1.1 Das IMAGEN™-hMPV-Reagenz enthält Natriumazid (15mmol/L), eine toxische chemische Verbindung. Natriumazid kann mit in Wasserleitungen vorhandenem Blei oder Kupfer reagieren und zur Bildung von explosiven Metallaziden führen. Bei der Entsorgung von Materialien, die Natriumazid enthalten, muss immer mit großen Mengen Wasser nachgespült werden. 8.1.2 hMPV auf den positiven Kontrollobjektträgern hat sich in Zellkulturen nachweislich als nicht infektiös erwiesen; trotzdem ist es als potentiell infektiös zu handhaben und zu entsorgen. 8.1.3 Das Reagenz enthält Evans-Blau. Hautkontakt ist unbedingt zu vermeiden. 8.1.4 Bei Verwendung des Eindeckmediums muss vorsichtig vorgegangen werden, da es Hautreizungen verursachen kann. Falls es zu einem Kontakt kommt, muss die Haut mit Wasser abgewaschen werden. 8.1.5 Essen, Trinken, Rauchen, Aufbewahren und Zubereiten von Speisen sowie Schminken sind im für Arbeiten vorgesehenen Bereich (Labor) verboten. 8.1.6 Reagenzien dürfen nicht mit dem Mund pipettiert werden. 8.1.7 Bei der Handhabung von klinischen Proben und infizierten Zellen Einweghandschuhe tragen und nach Arbeiten mit infektiösem Material immer die Hände waschen. 8.1.8 Alle klinischen Proben müssen entsprechend den geltenden gesetzlichen Vorschriften entsorgt werden.

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8.1.9 Von fachlich qualifizierten Anwendern kann ein Sicherheitsdatenblatt angefordert werden. 8.2 TECHNISCHE VORSICHTSMASSNAHMEN 8.2.1 Die Testkit-Komponenten dürfen nach Ablauf des auf den Etiketten vermerkten Verfalldatums nicht mehr verwendet werden. Reagenzien aus verschiedenen Chargen dürfen nicht miteinander vermischt werden. 8.2.2 Die Reagenzien werden in festgelegten Arbeitskonzentrationen geliefert. Die Testleistung wird beeinträchtigt, falls Reagenzien unter anderen als den in Abschnitt 5 spezifizierten Bedingungen gelagert werden. 8.2.3 Die erforderliche Menge phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ist am Tag der Anwendung frisch anzusetzen. 8.2.4 Mikrobielle Kontamination der Reagenzien muss vermieden werden. 8.2.5 Die Reagenzien dürfen nicht tiefgekühlt werden. 9 GEWINNUNG UND VORBEREITUNG DER PROBEN Gewinnung und Vorbereitung der Proben sind bei der Diagnose von hMPV mittels direkter Immunfluoreszenz von grundlegender Bedeutung. Die Proben müssen vom Infektionsort zum Zeitpunkt der maximalen Freisetzung von Viren gewonnen werden und sie müssen so vorbereitet werden, dass intakte Zellen erhalten bleiben, die frei von anhaftendem Mukus sind. Die empfohlene respiratorische Probe ist nasopharyngeales Aspirat, das, wenn auf korrekte Weise gewonnen, große Mengen respiratorischer Epithelzellen ergeben sollte. 9.1 NASOPHARYNGEALE ASPIRATE/SEKRETE Gewinnung Proben aus dem nasopharyngealen Bereich durch eine Ernährungssonde (Größe 8) in einen Mukusextraktor gewinnen. Mukusextraktor und Schlauchmaterial müssen so schnell wie möglich zur Verarbeitung ans Labor weitergeleitet werden. Zellseparationsverfahren sind notwendig für direkte Immunfluoreszenz-Anfärbung. Proben- oder Überstandmaterial aus Zellseparationsverfahren kann für die Beimpfung von Viruskulturen verwendet werden. Zellseparation Falls notwendig, der Probe vor der Zentrifugierung 2mL phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) zugeben, um die Viskosität zu verringern und den Schleim zu verdünnen. Den Schleim-Extraktor bei Raumtemperatur (15-30°C) 10 Minuten bei 380g zentrifugieren.

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Den Überstand, der für Zellkulturen verwendet werden kann, entfernen. Das Zellsediment in 2mL PBS suspendieren und die Zellen mit einer Weitschaft-Pipette vorsichtig auf und ab pipettieren oder auf einem Vortexmischer vorsichtig mischen, bis der Schleim separiert und das Zellmaterial freigegeben wird. Heftiges Pipettieren/Mischen ist zu vermeiden, um eine Beschädigung der Zellen zu verhindern. Sobald sich eine gleichmäßige Suspension gebildet hat, je nach Bedarf weitere PBS zugeben und nach Zugabe der zusätzlichen Menge wieder pipettieren oder auf einem Vortexmischer mischen, um die Zellen weiter zu waschen. Jegliche sichtbaren, bis zu diesem Stadium noch verbliebenen Schleimteilchen entfernen und entsorgen. Überschüssiger Schleim muss entfernt werden, weil sonst eine adäquate Penetration des Reagenz verhindert wird, was zu einer unspezifischen Fluoreszenz führen kann. Falls das ganze Sekret in der Ernährungssonde verbleibt und nichts davon den Schleim-Extraktor erreicht, das gesamte Sekret aus der Sonde in PBS herauswaschen. Das wird am besten erreicht, indem eine Pasteur-Pipette in das Sondenende eingeführt wird, das sich am Schleim-Extraktor befand. Die entsprechende Flüssigkeit in die Sonde saugen und wiederholt hinausdrücken, bis sich das an der Sondenwand anhaftende Sekret gelöst hat. Die so erhaltene Suspension wird solange auf und ab pipettiert, bis der Schleim adäquat aufgelöst wurde. Vorbereitung der Objektträger Nach der Separation wird die Zellsuspension bei Raumtemperatur (15-30°C) 10 Minuten bei 380g zentrifugiert und der Überstand entsorgt. Das Zellsediment in ausreichend PBS resuspendieren, um jegliche verbliebene Schleimreste zu verdünnen und gleichzeitig eine hohe Zelldichte beizubehalten. 25µL des resuspendierten Zellsediments in einen Vertiefungsbereich von 6mm auf dem Objektträger geben. Probe bei Raumtemperatur (15-30°C) an der Luft trocknen lassen und daraufhin bei Raumtemperatur (15-30°C) 10 Minuten lang mit frischem Azeton fixieren. Falls der Objektträger nicht sofort angefärbt wird, kann er über Nacht bei 4°C aufbewahrt werden oder frieren Sie ihn bei -20°C ein, um ihn über längere Zeiträume zu lagern. 10 TESTVERFAHREN VOR DURCHFÜHRUNG DES TESTVERFAHRENS SIND DIE IN ABSCHNITT 8.2 AUFGEFÜHRTEN TECHNISCHEN VORSICHTSMASSNAHMEN ZU BEACHTEN. 10.1 ZUSETZEN VON REAGENZ Der fixierten Zellzubereitung auf dem Objektträger (siehe Abschnitt 9) bzw. einem als Positivkontrolle dienenden Objektträger 25µL Reagenz zusetzen. Dafür sorgen, dass das Reagenz den gesamten Bereich der Vertiefung bedeckt. 10.2 ERSTE INKUBATION Objektträger mit Reagenz 15 Minuten lang in einer feuchten Kammer bei 37 °C inkubieren. Das Reagenz darf nicht auf der Probe eintrocknen, da dies zu unspezifischer Anfärbung führt. 10.3 WASCHEN DES OBJEKTTRÄGERS

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Überschüssiges Reagenz mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) abwaschen, dann den Objektträger in einem PBS enthaltenden Schüttelbad vorsichtig waschen. PBS ablaufen lassen und Objektträger bei Raumtemperatur (15-30°C) trocknen lassen. 10.4 ZUSETZEN VON EINDECKMEDIUM Der Mitte jeder Vertiefung einen Tropfen IMAGEN™-hMPV-Eindeckmedium zusetzen und Eindeckmedium sowie Probe mit einem Deckglas eindecken. Hierbei darauf achten, dass dabei keine Luftblasen eingeschlossen werden. 10.5 ABLESEN DES OBJEKTTRÄGERS Mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop den gesamten Bereich der Vertiefungen mit der angefärbten Probe untersuchen. Die in Abschnitt 11 beschriebene Fluoreszenz sollte bei 400-facher Vergrößerung sichtbar sein. (Für optimale Ergebnisse sollten die Proben sofort abgelesen werden, können aber bis zu 2 Stunden lang im Dunkeln bei 2-8°C ohne Fluoreszenzverlust aufbewahrt werden). Wegen der variablen Art der Präsentation von hMPV-infizierten Zellen ist es empfehlenswert, dass Proben mit einer kleinen Fläche spezifischer zellassoziierter apfelgrüner Fluoreszenz mit weniger als 400-facher Vergrößerung bei weniger als 1000-facher Vergrößerung mit Ölimmersion zur Bestätigung ihres Status abgelesen werden. 11 INTERPRETATION DER TESTERGEBNISSE 11.1 KONTROLLEN 11.1.1 Objektträger Positivkontrolle Beim positiven Kontrollobjektträger, der gemäß Abschnitt 10 angefärbt und abgelesen wurde, sollten Zellen mit apfelgrünen, fluoreszenten, intrazellulären zytoplasmatischen Zellkörnchen sichtbar werden, die mit einem Hintergrund rot gegengefärbten Materials kontrastiert. Diese Zellen sind etwas größer als Epithelzellen der Atemwege, weisen aber bei hMPV-Infektion zytoplasmatische Fluoreszenz auf. Objektträger für die Positivkontrolle müssen verwendet werden, um überprüfen zu können, ob das Anfärbverfahren ordnungsgemäß durchgeführt wurde. 11.1.2 Negativkontrolle Falls ein Objektträger für die Negativkontrolle erforderlich ist, wird die Verwendung von nicht infizierten, intakten Zellen des Typs empfohlen, der zur Kultur und Isolierung von respiratorischen Viren verwendet wird. Die Zellen sind wie in Abschnitt 10 beschrieben zu präparieren, zu fixieren und anzufärben. 11.2 KLINISCHE PROBEN 11.2.1 Erscheinungsbild hMPV-infizierter Zellen Apfelgrüne, fluoreszente, intrazelluläre zytoplasmatische Zellkörnchen oder Filamente werden bei mit hMPV befallenen Epithelzellen der Atemwege sichtbar.

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Bei diesem Virus wurde etwas zarte Anfärbung beobachtet, und Zellen, die nach der Untersuchung bei 400-facher Vergrößerung als vermutlich positiv erscheinen, sollten bei 1000-facher Vergrößerung mit Ölimmersion als positiv bestätigt werden. Nicht infizierte Zellen sind bei Gegenfärbung mit Evans-Blau rot gefärbt. 11.2.2 Interpretation Eine positive Diagnose wird gestellt, wenn bei einer oder mehreren Zellen typische Fluoreszenz in der fixierten angefärbten Probe zu sehen ist. Eine negative Diagnose wird gestellt, wenn die fixierten, angefärbten Proben nach dem Anfärben mit dem Reagenz keine Fluoreszenz aufweisen. Bei direkt angefärbten nasopharyngealen Aspiratproben müssen mindestens 20 nicht infizierte Epithelzellen der Atemwege in der Vertiefung des Objektträgers sichtbar sein, bevor ein negatives Ergebnis registriert wird (siehe Abschnitt 11.2.3 falls eine unzureichende Anzahl Zellen vorliegt). 11.2.3 Zu wenig Zellen Falls auf dem Objektträger zu wenig Zellen vorhanden sind, wird der Rest der klinischen Probe 10 Minuten bei 380g und Raumtemperatur (15-30°C) zentrifugiert. Die Zellen werden in einer kleineren Menge PBS resuspendiert, bevor sie wieder auf dem Objektträger aufgebracht werden (25µL). Alternativ hierzu sollte eine neue Probe angefordert werden. 12 GRENZEN DER METHODE 12.1 Das FITC-Reagenz kann Stämme von Staphylococcus aureus, die große Mengen Protein A enthalten, unspezifisch anfärben. Dies liegt an nicht immuner Interaktion von Protein A mit der Fc-Region des monoklonalen Antikörpers, einer Beobachtung, über die bei anderen Fluoreszenztests auf monoklonaler und polyklonaler Grundlage berichtet wird14. Diese Anfärbung ergibt jedoch nicht das normale intrazelluläre Fluoreszenzmuster, das mit hMPV infizierte Zellen aufweisen (siehe Abschnitt 11.2.1), und sollte als unspezifische Anfärbung interpretiert werden. 12.2 Nur das mitgelieferte Eindeckmedium verwenden. 12.3 Das Erscheinungsbild der Fluoreszenz kann je nach Mikroskoptyp und Art der genutzten Lichtquelle unterschiedlich sein. 12.4 Zum Abdecken der 6mm großen Vertiefung empfiehlt sich die Verwendung von 25µL Reagenz zu verwenden. Eine Reduzierung dieses Volumens kann zu Schwierigkeiten beim Abdecken der von der Probe eingenommenen Fläche führen und die Empfindlichkeit herabsetzen. 12.5 Alle Reagenzien werden in festgelegten Arbeitskonzentrationen geliefert. Die Testleistung kann beeinträchtigt werden, falls Reagenzien modifiziert oder unter anderen als den in Abschnitt 5 spezifizierten Bedingungen gelagert werden.

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12.6 Wird hMPV nicht nachgewiesen, kann das verschiedene Ursachen haben: Probengewinnung zu einem ungeeigneten Zeitpunkt der Krankheit, unkorrekte Probengewinnung und/oder Handhabung der Proben sowie eine mangelhafte Zellkultur usw. Ein negatives Resultat schließt die Möglichkeit des Vorliegens einer hMPV-Infektion nicht aus. 12.7 Das Vorliegen von hMPV in nasopharyngealen Sekreten schließt nicht notwendigerweise die Möglichkeit einer begleitenden Infektion mit anderen Pathogenen aus. 12.8 Die Testergebnisse müssen im Kontext mit Informationen aus epidemiologischen Studien, der klinischen Bewertung des Patienten sowie weiteren diagnostischen Verfahren interpretiert werden. 12.9 Es ist empfehlenswert, für die Vorbereitung der Proben Vertiefungen von mindestens 6mm Durchmesser zu verwenden. Die Verwendung von Objektträgern mit Vertiefungen, die kleiner als 6mm im Durchmesser sind, verringern die Wahrscheinlichkeit kleinere Mengen von positiven Zellen in schwachen positiven Proben nachzuweisen. 13 ERWARTETE WERTE Die Nachweisrate für hMPV ist abhängig von der Zeit, zu der die Proben gewonnen wurden, sowie von Handhabung, Aufbewahrung und Transport der Proben. Sie ist ebenfalls abhängig von Alter, allgemeinem Gesundheitszustand, geografischer Lage und sozioökonomischem Status der getesteten Bevölkerung. hMPV ist weltweit verbreitet und mit signifikanten saisonalen Infektionen der Atemwege in gemäßigten und tropischen Regionen assoziiert6,9,12. In gemäßigten Klimaten erfolgen die jährlichen Ausbrüche von hMPV-Infektionen überwiegend während der Wintermonate6. Infektionen der unteren Luftwege sind während dieser Zeiten im Allgemeinen häufiger. Daher kann während saisonalen Ausbrüchen davon ausgegangen werden, dass eine signifikante Zahl von nasopharyngealen Aspiraten positiv auf hMPV getestet werden. hMPV-Infektionen treten in allen Altersgruppen auf, aber die Symptome sind bei Kleinkindern und alten Menschen am schwersten12. 14 SPEZIFISCHE LEISTUNGSKRITERIEN 14.1 KLINISCHE STUDIEN

Der IMAGEN™-hMPV-Test wurde an zwei klinischen Prüfzentren in Europa an nasopharyngealen Sekreten von hospitalisierten Patienten mit Symptomen von Infektionen der Atemwege evaluiert. In Prüfzentrum 1 wurden 91 Proben (41 männlich, 47 weiblich, 3 Geschlecht unbekannt, Altersspanne zwischen 1 Tag und 66 Jahren), die während der Winterepidemie 2006-2007 gewonnen wurden, mit dem IMAGEN™-hMPV-Test und dem kommerziellen Standard hMPV-Diagnosetest des Zentrums, die Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), getestet. Ein Ergebnis wurde als positiv betrachtet, wenn sowohl der IMAGEN™-hMPV-Test als auch der RT-PCR-Test positiv ausfielen. Die Gesamtzahl der hMPV-infizierten Proben bei diesem Test betrug 3,4%. Der IMAGEN™-hMPV-Test ergab 100% Übereinstimmung mit dem PCR-Referenzverfahren. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse von Prüfzentrum 1.

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Tabelle 1: Diagnose von hMPV-Infektion mittels IMAGEN™-hMPV und RT-PCR

Gesamtübereinstimmung: 100% 95% Konfidenzintervall: 96-100% Positive Übereinstimmung: 100% 95% Konfidenzintervall: 29,2-100% Negative Übereinstimmung: 100% 95% Konfidenzintervall: 95,9-100% In Prüfzentrum 2 wurden 359 Proben, die während der Winterepidemie 2006-2007 von zahlreichen Patienten (219 männlich, 140 weiblich mit einer Altersspanne von 8 Tagen bis 73 Jahren) gewonnen wurden, mit dem IMAGEN™-hMPV-Test und einem indirekten monoklonalen Antikörperpool-Immunfluoreszenzverfahren getestet. Proben, die entweder beim IMAGEN™-hMPV-Test oder beim indirekten monoklonalen Antikörperpool positiv getestet wurden, wurden mittels eines Echtzeit-RT-PCR bestätigt, der routinemäßig am Prüfort eingesetzt wird. Proben, die entweder beim indirekten monoklonalen Antikörperpool oder beim IMAGEN™-hMPV-Test sowie beim RT-PCR positiv getestet wurden, wurden als bestätigte Positivprobe betrachtet. Die Gesamtzahl von hMPV bei diesem Set von Testproben betrug 3,3%. Der IMAGEN™-hMPV-Test ergab eine Gesamtübereinstimmung von 99.2% mit dem monoklonalen Antikörperpool. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse von Prüfzentrum 2 für IMAGEN™-hMPV und den indirekten monoklonalen Antikörperpool. Tabelle 2: Diagnose von hMPV-Infektion mittels IMAGEN™-hMPV und eines

monoklonalen Antikörperpools

a) Als hMPV-positiv durch Echtzeit-RT-PCR bestätigte Proben Gesamtübereinstimmung: 99,2% 95% Konfidenzintervall: 97,6-99,8% Positive Übereinstimmung: 81,8% 95% Konfidenzintervall: 48,2-97,7% Negative Übereinstimmung: 99,7% 95% Konfidenzintervall: 98,4-100%

RT-PCR

+ -

+ 3 0 IMAGEN™-hMPV

- 0 88

Monoklonaler

Antikörperpool

+ -

+ 9a 1a IMAGEN™

-hMPV - 2a

347

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In Prüfzentrum 2 wurde ebenfalls das IMAGEN™-hMPV-Kit gegenüber einem kommerziellen ELISA-Kit mit einer Teilmenge von Proben getestet. 153 Proben wurden aus Präparaten getestet, die ebenfalls während der Winterepidemie 2006-2007 von zahlreichen Patienten (100 männlich, 53 weiblich mit einer Altersspanne von 7 Tagen bis 69 Jahren) gewonnen wurden. Proben, die entweder beim IMAGEN™-hMPV-Test oder beim komerziellen EIA positiv getestet wurden, wurden ebenfalls mittels eines Echtzeit-RT-PCR-Tests zur Bestätigung getestet. Die Gesamtzahl von hMPV bei diesem Set von Testproben betrug 7,8%. Der IMAGEN™-hMPV-Test ergab eine Gesamtübereinstimmung von 97,4% mit dem kommerziellen EIA. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse von Prüfzentrum 2 mit dieser Probenteilmenge. Tabelle 3: Diagnose von hMPV-Infektion mittels IMAGEN™-hMPV und eines

kommerziellen EIA

a) Als hMPV-positiv durch Echtzeit-RT-PCR bestätigte Proben Gesamtübereinstimmung: 99.2%

Gesamtübereinstimmung: 97,4% 95% Konfidenzintervall: 93,4-99,3% Positive Übereinstimmung: 80,0% 95% Konfidenzintervall: 44,4-97,5% Negative Übereinstimmung: 98,6% 95% Konfidenzintervall: 95,0-99,8% 14.2 KREUZREAKTIVITÄT IMAGEN™-hMPV ist hochspezifisch für Antigene vom humanen Metapneumovirus. Für keinen der unten aufgeführten Mikroorganismen wurde eine Kreuzreaktivität nachgewiesen. Die Tests wurden an Laborkulturen bekannter Organismen durchgeführt. Bakterien Chlamydia trachomatis Chlamydia pneumoniae Haemophilus influenzae Legionella pneumophila Moraxella catarrhalis Mycoplasma pneumoniae Neisseria meningitidis Neisseria gonorrhoeae Neisseria lactamica Streptococcus pneumoniae

Viren Parainfluenza 1, 2, 3 Influenza A und B Cytomegalovirus Coxsackievirus Stämme B1, B2, B3, B4, B5 und B6 Echovirus 4, 6, 9, 11, 30 und 34 Varicella-Zoster Adenovirus Respiratory-Syncytial-Virus Herpes-simplex-Virus 1 und 2

EIA

+ -

+ 8a 2a IMAGEN™-hMPV

- 2a 141

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July 2007 9807085EFG