Laurent Andréoletti (PU-PH)

Anciens et Nouveaux

Virus Respiratoires

Laurent Andréoletti (PU-PH)

Laboratoire de Virologie Médicale et Moléculaire, EA/IFR53

CHU et Faculté de Médecine de Reims

Virus et Infections Respiratoires

• Infections respiratoires hautes

Rhinite

Laryngite

PharyngiteOtite

• Infections respiratoires basses

Bronchites

Pneumonies

Enfants <2ans/ 0-5 ansAdultes immunocompétentsAdultes immunodéprimésPersonnes âgées > 65ans

Communautaires et /ouNosocomiales

Bronchiolites

Incidence annuelle de la pneumonie communautaire aiguëEnfants > adultes de moins 75 ans++ Enfants de moins de 5ans: 34 to 40 cases per 1000 (Europe et USA)

Pays en voie de développement =Europe = USA

Infections Respiratoires Communautaires

Etiologie des pneumopathies communautaires aiguës de l’enfantVirale dans 25 à 60 % des cas

McIntosh K, NEJM, 2002

McIntosh K, NEJM, 2002

Virus et Infections Respiratoires Basses de l’Enfant

Bronchiolite

460 000 cas /an (30 % de la population des moins de 2 ans)

Hospitalisations: augmentation de 9 % par an

Bronchiolites récidivantes= d’hyperréactivité bronchiqueBronchiolites récidivantes= d’hyperréactivité bronchique développement de l’asthme infantile

Exacerbation de l’asthme infantile

100 000 consultations /an aux urgences en France (2006)

Virus et Infections Respiratoires Basses

de l’Enfant En 2002

McIntosh K, NEJM, 2002

Identification de nouveaux virus respiratoires

Allander et al., 2005 Foulogne et al., 2006

Anciens et Nouveaux Virus Respiratoires en 2008

BOCAVIRUS Parvoviridae ADNPOLYOMAVIRUS KI & HU Polyomaviridae ADN

Virus et Pathologies Respiratoires

•• Infections respiratoires hautesInfections respiratoires hautes

•• Infections respiratoires bassesInfections respiratoires basses

RVH, Coronavirus , hMPV para influenza: Rhinite

ParaInfluenza Laryngite

Adenovirus Parainfluenza Pharyngite

VRS, Adenovirus Otite

•• Infections respiratoires bassesInfections respiratoires basses

Bronchites

Pneumonies

Bronchiolites

VRS, InfluenzaParaInfluenzaCoronavirus NL63,HKU

hMPVBocavirusPolyomavirus KI, HU

Anciens virus nouvellement identifiés

Emergence de nouveaux virus respiratoires

Surveillance viro-épidémiologique

Physiopathologie des Infections virales Respiratoires

VRS: la réponse inflammatoire participe au pouvoir pathogène

Days after infection

Oppenshaw, 2007 ESCV, Lyon

Epidemiologie des infections respiratoires virales

HRVs

RSVEVs

RSV

Infections virales au cours du temps chez des enfants souffrant deBronchiolite

HMPV

EVsHMPV

HRVs

Jacques et al. JCV 2006 Jaarti et al. EID 2004

Possibilités de co-infections respiratoires

Pourquoi documenter les infections virales

respiratoires ??

Permet d’établir un diagnostic étiologique

Prévention des infections nosocomiales

Diminution de la prescription inadaptée d’Antibiotiques

Meilleure prise en charge des patients

Diminution de la prescription inadaptée d’Antibiotiques

Utilisation rationnelle d’antiviraux

Suivi épidémiologique et virologique

Infection virale respiratoire : Le prélèvement nasopharyngé

Prélèvement de référence en pédiatriechez les 0 à 4 ans(CDC , WHO , 2007)

A

Infection virale respiratoire : Le prélèvement nasal

Prélèvement de référence pour les virusInfluenza chez l’adulte (Invs 2008)

Virocult

B

Prélèvement nasopharyngé à stocker à 4°c

PasteurCNR grippeGROG

Diagnostic virologique

• Recherche des anticorps = Sérologie = Diagnostic indirect

• Recherche du virus ou de ses constituants = Diagnostic direct

Diagnostic virologique directDiagnostic virologique direct

Culture cellulaire classique:MRC-5MA-104MDCK

Detection des Antigènes viraux par IFou techniques EIA

MA-104 MA-104

ou techniques EIA

Séroneutraisation sur culture par Ac

Detection moléculaire et identification par séquençage moléculaire:PCR TempsPCR Temps réelréel, TA cloning, séquençage des gènes codant pour les protéinesde surface ou de capside

GTG ACT CATCG ACCT G ATCT ACACTGGGG T AGTGC

180 190 200 210

2158 2557

1200

0

Influenza B

Influenza A

Anticorpsmonoclonal

Détection des antigènes viraux par Immunofluorescence

Cellule épithélialerespiratoire

VRS

Para influenzaI, II, III

Adénovirus

uv

Microscope

Rendu des résultats en 4 heures

Identification

Cellule épithélialerespiratoire infectée

virus libres

Détection des virus respiratoires par culture cellulaire

Rendu des résultats en 3 à 6 jours

Cellules permissivesEn culture

Anticorps monoclonaux

Interprétation des résultats virologiques

IF Culture Interprétation+ en attente Infection virale

+ + Infection virale

+ - Infection virale; prélèvement 4°c ??+ - Infection virale; prélèvement 4°c ??

- + prélèvement moyen: peu de cellules

Acellulaire + mauvais prélèvement

Acellulaire - mauvais prélèvement

- - Absence d’infection virale

Détection des infections respiratoires par culture cellulaire

11509 aspirations nasophayngées traitées par culture + IF

2444 (21.2%) de détections positives pour des virusrespiratoirescommuns

AdenovirusPara Influenza Virus III

Enterovirus

(10.3%)

Influenza Virus A

(10.%)

Adenovirus

(6.2%)

Para Influenza Virus III

(2.8%)Influenza Virus B

(0.9%)

Rhinovirus

(12.4%)

RSV

(55.2%)

Absence de détection des nouveaux virus respiratoires

Diagnostic virologique moléculaireDiagnostic virologique moléculaire

Detection moléculaire et identification par séquençage moléculaire:

PCR Temps réelPCR Temps réel TA cloning, séquençage

Développement des test de RT-PCR Temps réel multiplex (9 à 12 virus respiratoires)

Augmentation significative des taux de détectiondes virus respiratoires

+ 40 à +65 % de positivité

Diagnostic étiologique viral de la bronchiolite dunourrisson

VRS37%

NEGATIFS59%

INFL A1%PARA 3

3%

Diagnostic

+ 42%

Diagnostic virologique classique

Combinaison du diagnosticvirologique classique et de la

détection moléculaire

3%

NEGATIFS17%

E+RH9%

MPV9%

EV2%

RH22%

INFL A1%

PARA 33%

VRS37%

2ème agent étiologique

RV

22%

3ème agent étiologiqueMPVh

10%

VRS

Épidémiologie de la bronchiolite du nourrissonHiver 2001-2002

RVH

2 pics épidémiquesde RVH et EV au

mois de mars et mai

EV

18

16

14

12

10

sept Oct. Nov. Déc. Janv. Fév. Mar. Avr. Mai Juin.

RVH

MPVh

Cas de bronchiolitessurvenant au

printemps

10

8

6

4

2

0

Liste des souches de virus détectées

Barrettes de 8 puces à ADN

Lecteur de barrettes de puces à ADN

Exemple d’interprétation d’une puce à ADN Genomica.Positif RSV A et Bocavirus

Carré servant àaligner la Grille

de lecture

Carré servant àaligner la Grille

de lecture

Témoin deCI

RSV ARSV A

BOC 1BOC 1

BOC 2

Carré servant àaligner la Grille

de lecture

Témoin derévélation

Témoin derévélation

CI

CIRSV ABOC 1

BOC 2 BOC 2

Diagnostic virologique classique des souches virales

< 3 jours après le début des signes cliniquesEcouvillons- Nez-pharynx-Aspiration Rhinopharyngée

Examen immédiatImmunofluorescence (IF), EIA

Détection des antigènes NP A&B30Min. à 2 heures

Virus Influenza B

Virus Influenza A

30Min. à 2 heures

RT-PCR2 jours

Culture virale, Labo L2MDCK+Trypsine

2 à 4 jours

IF

IF

Test rapide EIA

Diagnostic virologique classique des souches virales

Détection des souches classiques virales à tropisme respiratoireDiagnostic journalier

Si période épidémique VRS=Tests rapides VRS

Prélèvement= ANP

Tests rapides VRS+

Tests d’Immunoflurescence

Monoclonal VRSAc polyvalents

Adeno, fluA, FluB,Parainfluenza I, II,III

Ac monoclonaux

+

1

2

Diagnostic virologique classique des souches virales

Si période épidémique Influenza=Tests rapides FLU A/B

+Tests d’Immunoflurescence

Prélèvement= ANP

Monoclonal FLU A Monoclonal FLU B1

Ac polyvalentsAdeno, fluA, FluB,Parainfluenza I, II,III

Ac monoclonaux+

Monoclonal FLU A Monoclonal FLU B

Monoclonal VRS2

3

4

Diagnostic virologique classique des souches virales

Si période hors épidémie de VRS et Grippe=Tests d’Immunoflurescence

Ac polyvalentsAdeno, fluA, FluB,

Prélèvement= ANP

VRS1

Adeno, fluA, FluB,Parainfluenza I, II,III

Ac monoclonaux+

VRS

hMPV2

CONCLUSIONS

Virus respiratoires : Rôle dans la bronchioliteExacerbation de l’asthme infantileInfections graves chez les greffés de poumonsInfections communautaires en réanimationInfections nosocomiales

Virus nouvellement découverts: BOCAVIRUS, SAFFOLD, hMPVrôle agent étiologique ou de cofacteur à démonter !!

Virus respiratoires : diagnostic classique; culture cellulaire, EIA, IF

Virus respiratoires : Diagnostic MoléculaireRT-PCR multiplex,

Avenir puces ADN: combinaison: bactéries+virus

Virus émergents : Recombinaison virus animal et humain: coronavirus, influenzaRisque pandémique!!

Unité de Virologie Médicale et

Moléculaire CHU de REIMS, EA/IFR53

•Laurent Andréoletti•Nicolas Lévêque•Véronique Brodard•Jérôme Jacques

RemerciementsRemerciements

Service de Pneumologie

•François Lebargy•Gaetan deslée•Jeanne Marie Perotin

Service de Pédiatrie A•Jérôme Jacques•Fanny RENOIS

Service de Pédiatrie A

•Jacques Motte•Michel Abely•Kathia Bessaci•Delphine Minette