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Tierärztliche Hochschule Hannover

Zentrum für Infektionsmedizin

Institut für Mikrobiologie

Identifizierung neuer virulenzassoziierter

Faktoren von Haemophilus parasuis und

Entwicklung einer Multiplex-PCR

INAUGURAL - DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades

Doktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -

- Dr. med. vet. -

vorgelegt von

Meike Sack

aus Wilhelmshaven

Hannover 2008

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. N. Baltes

1. Gutachten: Prof. Dr. N. Baltes

2. Gutachten: PD Dr. I. Hennig-Pauka

Tag der mündlichen Prüfung: 4. November 2008

Diese Arbeit wurde gefördert durch die Akademie für Tiergesundheit (AfT).

"Gehör ich doch zu den Narren,

die nach inwendig gucken,

wo bekanntermaßen nur spärlich beleuchtet wird."

Wilhelm Busch

Folgende Teile der vorliegenden These wurden bereits publiziert:

Sack, M. und Baltes, N. (2008) Identification and Characterization of New Virulence Associated Factors of Haemophilus parasuis Jahrestagung der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft Fachgruppe „Bakteriologie und Mykologie“ 25.-27. Juni 2008, Braunschweig, Deutschland

Sack, M. und Baltes, N. (2008) Identification and Characterization of New Virulence Associated Factors of Haemophilus parasuis, 108th General Meeting of the American Society for Microbiology 01.-05. Juni 2008, Boston, USA

Inhalt

A Einleitung ............................................................................................................13

B Schrifttum ...........................................................................................................14

1 Haemophilus parasuis ....................................................................................14

1.1 Allgemeine Eigenschaften ....................................................................... 14

1.2 Charakterisierung des Erregers ............................................................... 15

1.2.1 Nachweis des Erregers ...................................................................16

1.2.2 Virulenzfaktoren ..............................................................................18

1.2.2.1 Neuraminidase ............................................................................. 18

1.2.2.2 Eisenrezeptoren ........................................................................... 18

1.2.2.3 Fimbrien ....................................................................................... 20

1.2.2.4 Kapsel .......................................................................................... 20

1.2.2.5 Lipopolysaccharide, Lipooligosaccharide ..................................... 20

1.2.2.6 Toxine .......................................................................................... 21

1.2.2.7 Sonstige virulenzassoziierte Faktoren .......................................... 22

1.2.2.8 Vergleichsstudien zur Identifizierung von virulenzassoziierten Faktoren ....................................................................................... 22

1.2.3 Typisierung von H. parasuis ............................................................24

1.2.3.1 DNA-basierte Typisierungsmethoden .......................................... 24

1.2.3.2 Proteinbasierte Typisierungsmethoden ........................................ 27

1.2.3.3 Serologische Methoden ............................................................... 29

1.2.3.4 Vergleich der Typisierungsmethoden ........................................... 30

1.2.4 Tiermodelle ......................................................................................31

2 Ziel der Studie .................................................................................................35

C Material und Methoden .......................................................................................36

1 Material ...........................................................................................................36

1.1 Geräte, Verbrauchsmittel und Chemikalien ............................................. 36

1.2 Lösungen und Puffer ............................................................................... 36

1.3 Bakterienstämme ..................................................................................... 36

Inhalt

2 Methoden ........................................................................................................36

2.1 Mikrobiologische Methoden ..................................................................... 36

2.1.1 Kultivierung von Escherichia coli Stämmen .....................................36

2.1.2 Kultivierung von H. parasuis Stämmen............................................36

2.2 Molekularbiologische Methoden .............................................................. 37

2.2.1 Arbeiten mit DNA .............................................................................37

2.2.1.1 Präparation chromosomaler DNA ................................................ 37

2.2.1.2 Plasmidpräparationen .................................................................. 38

2.2.1.3 Polymerase-Kettenreaktion .......................................................... 39

2.2.1.3.1 Restriction Fragment Length Polymorphism-PCR .................41

2.2.1.4 Primer .......................................................................................... 42

2.2.1.5 Agarosegel-Elektrophorese .......................................................... 42

2.2.1.6 Polyacrylamidgel-Elektrophorese ................................................. 42

2.2.1.7 Koloniegel .................................................................................... 43

2.2.1.8 Klonierung .................................................................................... 43

2.2.1.8.1 Restriktionsenzymverdau ......................................................43

2.2.1.8.2 Ligation ..................................................................................44

2.2.1.9 Transformation ............................................................................. 44

2.2.1.10 Herstellung chemokompetenter E. coli Zellen .............................. 45

2.2.1.11 Repräsentative Differenzanalyse ................................................. 45

2.2.1.12 Markieren von Gensonden mit 32P-dCTP ..................................... 48

2.2.1.13 Southern Blot ............................................................................... 48

2.2.1.14 Southern Transfer ........................................................................ 48

2.2.1.15 Southern Hybridisierung ............................................................... 49

2.2.1.16 DNA-Sequenzierung und Sequenzanalyse .................................. 50

2.2.2 Arbeiten mit RNA .............................................................................50

2.2.2.1 Präparation von RNA ................................................................... 50

Inhalt

2.2.2.2 Reverse Transkriptase-PCR ........................................................ 50

2.2.3 Arbeiten mit Proteinen .....................................................................51

2.2.3.1 Eindimensionale SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese ............. 51

2.2.3.2 Ganzzelllysate .............................................................................. 51

2.2.3.3 Massenspektrometrie ................................................................... 52

2.2.3.4 Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-of-Flight-Mass Spectrometry ...................................................................... 53

2.2.3.5 Electro-Spray Injection Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry ................................................................................ 54

2.3 Infektionsversuche an Schweinen ........................................................... 55

2.3.1.1 Zeitplan ........................................................................................ 55

2.3.1.2 Herkunft und Unterbringung der Schweine .................................. 55

2.3.1.3 Präparation der Bakterien für die Infektion ................................... 56

2.3.1.4 Aerosolinfektion............................................................................ 56

2.3.1.5 Intratracheale Infektion ................................................................. 57

2.3.1.6 Überwachung während des Experiments ..................................... 57

2.3.1.7 Euthanasie und Sektion ............................................................... 57

2.3.1.8 Reisolation von H. parasuis ......................................................... 58

2.3.1.9 Enzyme Linked Immunosorbent Assay ........................................ 59

D Ergebnisse .........................................................................................................60

1 Isolierung H. parasuis spezifischer Fragmente mittels Repräsentativer Differenzanalyse .............................................................................................60

1.1 Überprüfung der Spezifität der RDA-Fragmente ...................................... 61

1.2 Homologiesuche und PCR ...................................................................... 62

1.3 Vorkommen der H. parasuis Serotyp 5 (Stamm Nagasaki) –spezifischen Fragmente in Referenz- und Feldstämmen ......................... 66

2 Proteomanalysen mittels SDS-PAGE .............................................................76

3 Proteomuntersuchungen mittels Massenspektrometrie ..................................78

3.1 MALDI-TOF-Analysen ............................................................................. 79

Inhalt

3.2 Q-TOF-Analysen ...................................................................................... 82

4 Entwicklung einer Multiplex-PCR ....................................................................84

4.1 Primerkonstruktion ................................................................................... 84

4.2 Überprüfung der Spezifität ....................................................................... 84

4.3 Optimierung der PCR-Bedingungen ........................................................ 86

4.4 Interne Kontrolle ...................................................................................... 86

4.5 Überprüfung der Referenzstämme .......................................................... 87

4.6 Überprüfung der aus pneumonischen Lungen isolierten Feldstämme ..... 89

1.1 Überprüfung der systemisch isolierten Feldstämme ................................ 90

1.1 Überprüfung der nasal isolierten Feldstämme ......................................... 91

4.7 Überprüfung weiterer Feldstämme .......................................................... 92

5 Infektionsversuch am Schwein mit H. parasuis ...............................................95

5.1 Infektion mit dem Referenzstamm für Serotyp 12 .................................... 95

5.2 Klinische Symptome in den belasteten Tieren ......................................... 95

5.3 Pathomorphologische Veränderungen .................................................... 96

5.4 Reisolierung von H. parasuis, Referenzstamm für Serotyp 12 ................ 98

5.5 PCR-Untersuchungen der reisolierten Stämme ....................................... 99

5.5.1 Untersuchung der reisolierten Stämme mittels Multiplex-PCR ......101

E Diskussion ........................................................................................................102

1 Identifizierung von virulenzassoziierten Genen .............................................102

2 Entwicklung einer Multiplex-PCR ..................................................................107

3 Identifizierung von Stamm spezifischen Proteinen .......................................111

4 Infektionsversuch ..........................................................................................115

F Zusammenfassung ...........................................................................................121

G Summary ..........................................................................................................123

H Literaturverzeichnis ..........................................................................................125

I Anhang .............................................................................................................137

Inhalt

1 Verbrauchsmittel und Chemikalien ...............................................................137

2 Lösungen und Puffer.....................................................................................142

3 Eingesetzte Stämme .....................................................................................147

4 Tabellarische Zusammenfassung der Ergebnisse der PCR-Untersuchungen ...........................................................................................149

5 Ergebnisse der massenspektrometrischen Untersuchungen ........................158

6 Tabellarische Zusammenfassung der Ergebnisse des Tierversuchs ............160

7 Tabellenverzeichnis ......................................................................................163

8 Abbildungsverzeichnis ..................................................................................165

Abkürzungen

Abkürzungsverzeichnis

® registered trademark (eingetragenes Warenzeichen) (v/v) volume per volume (Volumen pro Volumen) (w/v) weight per volume (Gewicht pro Volumen) A. Actinobacillus Abb. Abbildung Aqua dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser) bp Basenpaare bzw. beziehungsweise ca. circa cDNA complementary DNA (komplementäre DNA) Ci Curie dCTP 2‘-Desoxy-Cytosin-5‘-Triphosphat ddRT-PCR differential display reverse transcription PCR DNA deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) dNTP 2‘-Desoxy-Nucleotid-5‘-Triphosphat dUTP 2‘-Desoxy-Uridin-5‘-Triphosphat E. coli Escherichia coli et al. et alii (und andere) g Erdbeschleunigungskonstante H. Haemophilus HAD Haloacid Dehalogenase k kilo kb Kilobasenpaare (103 Basenpaare) KBE Kolonie bildende Einheiten kDa Kilodalton LOS Lipooligosaccharide LPS Lipopolysaccharide M Molarität (mol/l) M. Mannheimia min. Minuten mM millimolar (mmol/l) NAD Nikotinamidadenindinukleotid nm Nanometer OD optische Dichte P. Pasteurella PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerase-Kettenreaktion) RDA Repräsentative Differenzanalyse RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

(Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus) RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) RT Raumtemperatur RT-PCR Reverse Transkriptase-PCR s. siehe SDS-PAGE Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese sek. Sekunden

Abkürzungen

SPF spezifisch pathogenfrei ssp. subspecies (Subspezies) Tab. Tabelle U unit UV Ultraviolett V Volt Vol. Volumen

A Einleitung 13

A Einleitung

Haemophilus (H.) parasuis ist der Erreger der Glässerschen Krankheit, einer fiebri-

gen Allgemeinerkrankung von Schweinen, die im klassischen Erscheinungsbild mit

einer Polyserositis, Meningitis und Arthritis einhergeht. Weitere Erscheinungsformen,

z. B. Pneumonie oder perakute Septikämie, wurden beschrieben und auch symptom-

lose Besiedlungen des oberen Respirationstraktes kommen vor. H. parasuis-Infek-

tionen treten weltweit auf und sind verantwortlich für große wirtschaftliche Verluste,

die vor allem Betriebe mit hohen Hygienestandards betreffen. Trotz einer nahezu

vollständigen Durchseuchung der Herden mit H. parasuis kommt es durch Stress

oder den Eintrag eines anderen Stammes zu Krankheitsausbrüchen.

H. parasuis ist ein gramnegatives, NAD abhängiges Stäbchen der Familie der

Pasteurellaceae. Für die 15 beschriebenen Serotypen konnte eine Korrelation

zwischen Serotyp und Virulenz bislang nicht nachgewiesen werden, und einzelne

Stämme derselben Serotypen verhalten sich äußerst heterogen. Die Diagnostik wird

dadurch erschwert, dass in einer Herde oder sogar von Einzeltieren oftmals die

Isolation mehrerer Stämme gleichzeitig gelingt. Über die Virulenzfaktoren und Patho-

genitätsmechanismen des Erregers ist bislang wenig bekannt.

Zum jetzigen Zeitpunkt ist zwar eine Speziesdiagnose möglich, nicht jedoch die Aus-

sage über das Virulenzpotenzial einzelner Stämme. Daher beschäftigt sich diese

Studie mit der Identifizierung möglicher neuer Virulenzfaktoren von H. parasuis, wel-

che zur Entwicklung einer diagnostischen Multiplex-PCR verwendet wurden. Diese

ermöglicht sowohl den Speziesnachweis als auch den Nachweis dreier virulenzasso-

ziierter Gene. Zur Identifizierung geeigneter Kandidatengene wurde eine Repräsen-

tative Differenzanalyse mit den Referenzstämmen der Serotypen 5 und 11 sowie ein

Vergleich des Proteinexpressionsmusters verschiedener Stämme durchgeführt.

Da für eine funktionelle Charakterisierung der identifizierten Gene in vivo-Unter-

suchungen notwendig sind, wurden erste Versuche zur Etablierung eines Tiermo-

dells mit dem Referenzstamm von Serotyp 12 im Schwein unternommen.

B Schrifttum 14

B Schrifttum

1 Haemophilus parasuis

1.1 Allgemeine Eigenschaften

H. parasuis ist der Erreger der Glässerschen Krankheit (auch Glässer’s disease,

Transportkrankheit, Glässersyndrom oder „porcine polyserositis and arthritis“), wel-

che 1910 zum ersten Mal von Glässer als fibrinöse Pleuro-Perikardio-Peritonitis be-

schrieben wurde (GLÄSSER 1910) und als deren Verursacher seit 1943 H. suis galt

(HJÄRRE u. WRAMBY 1943). Die Beobachtung, dass nicht alle Stämme von H. suis

Hämin (X-Faktor) für ihr Wachstum benötigen, führte 1963 zur Abgrenzung des

Erregers Haemophilus parasuis (BIBERSTEIN et al. 1963), welcher nur NAD-abhän-

gig ist (V-Faktor). Eine erste Beschreibung erfolgte 1969 durch Biberstein und White

(BIBERSTEIN u. WHITE 1969).

Die Glässersche Krankheit ist weltweit verbreitet, so wurde beispielsweise über Fälle

in Deutschland (KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON 1992), Dänemark (ANGEN et

al. 2004), Spanien (RUBIES et al. 1999), USA (OLIVEIRA u. PIJOAN 2004; RAPP-

GABRIELSON u. GABRIELSON 1992), Kanada (RAPP-GABRIELSON u.

GABRIELSON 1992), Japan (MOROZUMI u. NICOLET 1986a) und Australien

(BLACKALL et al. 1996) berichtet. Es handelt sich um eine infektiöse Fakto-

renkrankheit, die entweder gemeinsam mit anderen Erregern von Atemwegserkran-

kungen als Mischinfektion, jedoch auch als Monoinfektion auftritt (KIELSTEIN et al.

1991b). Nahezu alle Schweinebetriebe sind mit H. parasuis infiziert und im Zusam-

menhang mit Stress (z.B. durch das Absetzen, Umstallen oder Transportieren) kann

es zu akuten Krankheitsausbrüchen kommen, die z. T. mit hohen wirtschaftlichen

Verlusten einhergehen. Zudem verursacht der Erreger in Betrieben mit einem hohen

Hygienestatus zunehmend Probleme, wenn naive Tiere mit Keimträgern gemeinsam

aufgestallt werden oder durch Zukauf von Tieren ein neuer Stamm eingetragen wird.

Bei dem typischen Krankheitsbild der Glässerschen Krankheit handelt es sich um

eine fiebrige Allgemeinerkrankung von Schweinen, die mit serofibrinösen Entzün-

B Schrifttum

15

dungen der serösen Häute einhergeht. Häufig betroffen sind Pleura und Peritoneum,

aber auch das Perikard. Weitere Erscheinungsformen sind nichteitrige Entzündungen

der Meningen mit entsprechenden neurologischen Symptomen, Arthritis mit Bewe-

gungsunlust und Lahmheit, Husten und Dyspnoe und in akuten Fällen auch eine

Septikämie, gefolgt von plötzlichen Todesfällen (AMANO et al. 1994; RAFIEE et al.

2000; SMART et al. 1993). Vornehmlich betroffen sind Ferkel, deren Empfänglichkeit

mit steigendem Alter sinkt (BAK u. RIISING 2002). Da eine klinische Erkrankung

durch Stress begünstigt wird, kommt es häufig bei Absetzern zu Ausbrüchen.

H. parasuis gilt jedoch nicht als obligat pathogen, da er häufig auch bei klinisch

gesunden Tieren aus den oberen Atemwegen isoliert werden kann (MOLLER u.

KILIAN 1990). Da die Pathogenitätsmechanismen des Erregers bislang weitgehend

ungeklärt sind und das Virulenzpotenzial einzelner Stämme derzeit nicht definiert

werden kann, ist die Rolle von H. parasuis im Zusammenwirken mit anderen fakul-

tativ pathogenen Keimen bei Erkrankungen ungeklärt.

Im Falle eines Krankheitsausbruches erfolgt eine antibiotische Behandlung der Tiere

zumeist mit Penicillin (MEISTERMANN 2006), zur Prophylaxe steht in Deutschland

eine auf Serotyp 5 basierende Vakzine zur Verfügung (Porcilis® Glässer, Intervet).

Desweiteren werden ebenfalls bestandsspezifische Vakzine verwendet.

1.2 Charakterisierung des Erregers

H. parasuis gehört zur Familie der Pasteurellaceae. Es handelt sich um gramne-

gative, kokkoide, unbewegliche Stäbchen mit gelegentlicher Fadenbildung. Bakos

beschrieb eine Neigung zur Dissoziation, wobei es bei den einzelnen Formen zur

Bildung einer Kapsel kommen kann, deren Nachweis z.B. durch eine Kapselfärbung

erfolgt (BAKOS et al. 1952; BAKOS 1955). Die M-Form (mukoid) weist große und

schleimige Kolonien auf, die teilweise konfluieren und eine glänzende Oberfläche

zeigen. Die Bakterien haben eine vollständige Kapsel. Die S-Form (smooth) zeigt

sich anhand von kleinen, feinen und nicht konfluierenden Kolonien und wird noch

einmal in die S1-Form (Kapsel teilweise vorhanden) und die S2-Form (keine Kapsel)

unterteilt. Die R-Form (rough) hat die größten Kolonien mit teilweise gezackten

Rändern, eine Kapsel kommt nicht vor. Laut Bakos (BAKOS et al. 1952) besteht kein

B Schrifttum 16

Zusammenhang zwischen der Herkunft der Stämme und ihrer Morphologie. Münch

(MÜNCH 1993) hingegen stellte fest, dass kleinere Kolonien vor allem von Stämmen

gebildet werden, die aus Tieren mit Glässerscher Krankheit isoliert wurden, und

größere Kolonien vor allem aus klinisch gesunden Tieren.

Bis 1992 wurde der Erreger anhand von verschiedenen unabhängigen Untersu-

chungen in die Serovare A-D (BAKOS 1955), Jena 6-12 (KIELSTEIN et al. 1991a),

1-7 (MOROZUMI u. NICOLET 1986b) und ND1-ND5 (RAPP-GABRIELSON u.

GABRIELSON 1992) eingeteilt. Diese wurden dann jedoch nach dem Kielstein-

Rapp-Gabrielson- (KRG-) Schema zu 15 Serotypen zusammengefasst (KIELSTEIN

u. RAPP-GABRIELSON 1992). Tierversuche mit dem jeweiligen Referenzstamm

ergaben für die Serotypen 1, 5, 10, 12, 13 und 14 eine hohe Virulenz (Tod der Tiere),

für 2, 4 und 15 mittlere (Polyserositis), für 8 eine schwache und für 3, 6, 7, 9 und 11

keine Virulenz (s. B1.2.4). Eine Untersuchung von 290 Stämmen aus der ehemaligen

DDR ergab, dass 1992 Serotyp 5 (23,8 %) und 4 (17,2 %) die höchste Prävalenz

aufweisen (KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON 1992). Dieses stimmt mit Ergeb-

nissen aus den USA und Kanada überein, wo sie mit einer Häufigkeit von 24,3 und

16,1 % vorkommen (RAPP-GABRIELSON u. GABRIELSON 1992), sowie Dänemark

(36 % und 22 %) (ANGEN et al. 2004) und Spanien (18,4 bzw. 16 %) (RUBIES et al.

1999). Da ein großer Teil der nach dem KRG-Schema untersuchten Stämme nicht

typisiert werden kann (26,2 % der Isolate der ehemaligen DDR), ist die Existenz von

weiteren Serotypen nicht ausgeschlossen.

1.2.1 Nachweis des Erregers

Der Nachweis von H. parasuis erfolgt zum einen kulturell auf NAD haltigen Nähr-

böden (Kochblutagar mit NAD-Zusatz oder Blutagar mit einer beta-hämolysierenden

Staphylokokken-Amme), die Isolierung ist jedoch schwierig und oft nicht erfolgreich

(CALSAMIGLIA et al. 1999). Aufgrund seines langsamen Wachstums wird der Keim

häufig durch andere Keime überwachsen, so dass der Nachweis auf molekularer

Ebene gerade aus stark kontaminiertem Probenmaterial (Nasen- oder Tonsillen-

tupfer) sinnvoll ist (CALSAMIGLIA et al. 1999). Obwohl allgemein angenommen wird,

dass ein einzelner Stamm für den jeweiligen Ausbruch verantwortlich ist, wird die

B Schrifttum

17

Diagnostik zusätzlich dadurch erschwert, dass in einem Betrieb oder sogar aus

einem Tier oftmals mehrere Stämme isoliert werden (OLVERA et al. 2006). Zur

Abgrenzung von anderen Spezies der Gattung Haemophilus des oberen Respi-

rationstraktes sind biochemische Untersuchungen notwendig, da sie sich in ihrer

Kulturmorphologie nicht ausreichend voneinander unterscheiden. H. parasuis ist

Katalase positiv, Indol und Urease negativ, anhämolysierend und kann Galaktose,

Glukuronsäure, Mannose, Maltose und Saccharose verwerten (MOLLER u. KILIAN

1990).

Eine von Oliveira (OLIVEIRA et al. 2001) entwickelte PCR amplifiziert mit den

Primern Hps-f und -r ein 821 bp großes Fragment aus der 16S rDNA von H. para-

suis. Die Methode weist eine hohe Sensitivität auf, zeigte aber auch Kreuzreaktionen

mit einigen Stämmen von Actinobacillus (A. indolicus, A. porcinus und A. minor).

Eine zweite PCR (ANGEN et al. 2007) amplifiziert mit drei Primern (HP1F3, HP2F2

und HP-Revx) ebenfalls aus der 16S rDNA ein 1086 bzw. 1090 bp großes Fragment.

Sie weist je nach Untersuchungsmaterial im Vergleich zur PCR von Oliveira zwar

eine niedrigere Sensitivität auf (kein Unterschied mit aufgereinigter DNA, jedoch eine

10 x niedrigere Sensitivität bei der Anwendung von Reinkulturen), hat sich jedoch als

100 % speziesspezifisch erwiesen.

Ein etwas aufwändigerer Erregernachweis gelingt mit einem Capture Plate

Hybridisation Assay (CALSAMIGLIA et al. 1999). Hierfür wird zunächst per PCR mit

universellen Bakterienprimern eine Gensequenz aus der 16S rDNA aller sich in der

Probe befindenden Bakterien amplifiziert. Hierbei wird das Amplifikat markiert, da

sich unter den zugefügten Nukleotiden auch mit Digoxigenin-11 markiertes dUTP

befindet. Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatten werden mit biotinylierten Oligo-

nukleotiden vorinkubiert, die die speziesspezifischen 16S rDNA Sequenzen von

H. parasuis beinhalten. Wird das PCR-Amplifikat auf diese Platten gegeben, binden

die H. parasuis spezifischen Anteile; diese werden mittels Peroxidase markierter

Antikörper gegen das Antidigoxigenin visuell sichtbar gemacht.

B Schrifttum 18

Alle drei PCR-Methoden ermöglichen zwar einen Speziesnachweis, nicht aber die

Detektion von virulenzassoziierten Faktoren.

Auch der Nachweis mittels Immunhistochemie (SEGALES et al. 1997) erlaubt nur

den Speziesnachweis und lässt ebenfalls keine Aussage über das Virulenzpotenzial

des jeweiligen Stammes zu, zudem treten Kreuzreaktionen mit A. pleuropneumoniae

auf. Aufgrund seiner Komplexität und des damit verbundenen Zeit- und Kostenauf-

wandes eignet sich diese Methode vor allem für wissenschaftliche Untersuchungen,

nicht jedoch für diagnostische Zwecke.

1.2.2 Virulenzfaktoren

1.2.2.1 Neuraminidase

Bislang ist wenig über die Virulenzfaktoren von H. parasuis bekannt. Lichtensteiger

und Vimr konnten 1997 eine Neuraminidaseaktivität nachweisen (LICHTENSTEIGER

u. VIMR 1997), da der Erreger aus Sialoglykokonjugaten Sialinsäure hydrolysiert,

welche er für sein Wachstum benötigt. Die Rolle des Enzyms in der Virulenz ist

bislang ungeklärt, möglicherweise dient es der Bereitstellung von Kohlenstoff und

Stickstoff, demaskiert Rezeptoren als Voraussetzung zur Adhäsion und Invasion

oder behindert die angeborene Immunabwehr des Wirtes (LICHTENSTEIGER u.

VIMR 2002). Bei Bacteroides fragilis und Streptococcus pneumoniae wurde beob-

achtet, dass die Inaktivierung der Neuraminidase zu abgeschwächter Virulenz führt

(GODOY et al. 1993; TONG et al. 2000) und es sich bei diesem Enzym um ein

protektives Antigen handelt (IFEANYI u. BAILIE 1992). Es gelang Lichtensteiger

2002 die Neuraminidase aus der Membranfraktion von H. parasuis aufzureinigen und

das Enzym zu reaktivieren (LICHTENSTEIGER u. VIMR 2002), das kodierende Gen

wurde bislang jedoch nicht identifiziert.

1.2.2.2 Eisenrezeptoren

Weitere bekannte Virulenzfaktoren sind transferrinbindende Proteine (TbpB und

TbpA, CHARLAND et al. 1995), die zu den Proteinen der äußeren Membran zählen

(OMPs, outer membrane proteins). Auch unter den Pasteurellaceae enthält die Grup-

pe der OMPs zahlreiche virulenzassoziierte oder -vermittelnde Moleküle. Hierbei

B Schrifttum

19

handelt es sich häufig um eisenregulierte OMPs (IROMPS, iron-regulated outer

membrane proteins). Diese spielen während einer Infektion eine wichtige Rolle, da

im Wirt kaum ungebundenes Eisen vorkommt und der Erreger dieses Defizit mittels

Rezeptoren ausgleicht, welche eisenhaltige Moleküle, z.B. das Transferrin des Wir-

tes, Hämoglobin oder mikrobielle Siderophoren, binden können. Transferrinbindende

Proteine sind streng wirtsspezifisch, so bindet der Tbp-Rezeptor von A. pleuro-

pneumoniae ausschließlich porzines Transferrin (GONZALEZ et al. 1995). Morton

and Williams zeigten, dass auch H. parasuis porzines Transferrin binden kann

(MORTON u. WILLIAMS 1989) und Charland et al. vermuteten, dass diese Fähigkeit

auf zwei potentielle Polypeptide zurück geht (CHARLAND et al. 1995), welche zwar

porzines Tansferrin, jedoch kein an porzines Lactoferrin gebundenes Eisen binden.

Del Río et al. wiesen in H. parasuis analog zu A. pleuropneumoniae eine TonB-

Region mit den Genen tonB, exbBD und tbpBA und eine verstärkte Expression der

transferrinbindenden Proteine unter Eisenmangelbedingungen nach (DEL RIO et al.

2005a). A. pleuropneumoniae besitzt zusätzlich einen Ferrichrom-Rezeptor, über

welchen er Siderophore aufnehmen kann: die Synthese eigener Siderophore konnte

bislang jedoch nicht nachgewiesen werden (MIKAEL et al. 2003). Allerdings zeigte

eine isogene Mutante für den Ferrichromrezeptor FhuA keine abgeschwächte Viru-

lenz (BALTES et al. 2003). Auch H. parasuis scheint einen solchen Rezeptor zu be-

sitzen, der mittels kreuzreaktiver polyklonaler Antikörper gegen FhuA von A. pleu-

ropneumoniae nachgewiesen wurde (DEL RIO et al. 2006b). Die DNA-Sequenzen

der entsprechenden Gene stimmen zu 99-100 % überein, über die Bedeutung des

Rezeptors ist jedoch bislang nichts bekannt. Allerdings konnte gezeigt werden, dass

das Protein konstitutiv exprimiert und durch Anzucht unter Eisenmangelbedingungen

nicht hochreguliert wird. Zusätzlich zum Ferrichromrezeptor FhuA exprimiert A. pleu-

ropneumoniae den Hämoglobinrezeptor HgbA (SHAKARJI et al. 2006). Im Gegen-

satz zu der fhuA-Mutante weist die hgbA-Mutante eine abgeschwächte Virulenz auf.

Die Existenz eines solchen Hämoglobinrezeptors bei H. parasuis wurde bislang nicht

beschrieben. Da transferrinbindende Proteine vermutlich bei allen Stämmen von

H. parasuis vorkommen, eignen sie sich nicht zur Identifizierung von virulenten Stäm-

men (METCALF u. MACINNES 2007).

B Schrifttum 20

1.2.2.3 Fimbrien

1992 entdeckte Münch die Existenz von Fimbrien bei H. parasuis (MUNCH et al.

1992). Es handelt sich hierbei um filamentöse Strukturen, die bei anderen Pasteu-

rellaceae häufig an der Adhäsion an Wirtszellen beteiligt sind. Die Ausbildung dieser

Strukturen findet bei H. parasuis nur sehr schwach statt, wenn die Kultur auf Agar-

platten gezogen wurde, und in größerer Menge, wenn der Erreger in Kontakt zu

Wirtsgewebe steht, z.B. zu der Chorioallantoismembran eines embryonierten

Hühnereis (MUNCH et al. 1992). Fimbrien kommen vermutlich ebenfalls in allen

Stämmen von H. parasuis vor (METCALF u. MACINNES 2007).

1.2.2.4 Kapsel

Für diverse Gattungen der Familie der Pasteurellaceae ist die Ausbildung einer Kap-

selstruktur bekannt. Polysaccharidhaltige Kapseln dienen einerseits dem Schutz des

Bakteriums und zur Adhäsion von Nährstoffen, andererseits aber auch der Adhäsion

an Wirtsstrukturen und der Abschirmung vor der Immunabwehr des Wirtes. Für 12

Serotypen von A. pleuropneumoniae (Biotyp 1, NAD abhängig) ist die Bildung einer

Kapsel beschrieben, und eine unbekapselte Mutante von Serotyp 1 erwies sich im

Tierversuch als avirulent (RIOUX et al. 2000). Untersuchungen zur Ausbildung einer

Kapsel von H. parasuis fanden schon früh statt (CHANDLER et al. 1939), sie wurden

zunächst im Zusammenhang zur Kolonieform gesehen (BAKOS 1955). Kielstein und

Rosner isolierten 1991 (ROSNER et al. 1991) aus Tieren mit Glässerscher Krankheit

häufiger unbekapselte Stämme als aus klinisch gesunden Tieren und sahen somit

eine fehlende Bekapselung als Hinweis auf Virulenz.

1.2.2.5 Lipopolysaccharide, Lipooligosaccharide

Ebenfalls eine Rolle als Virulenzfaktoren bei anderen Mitgliedern der Familie der

Pasteurellaceae spielen Lipopolysaccharide (LPS) und Lipooligosaccharide (LOS)

als Bestandteil der äußeren Membran gramnegativer Bakterien. Beide bestehen aus

drei Regionen: dem Lipid A als Anker in der Membran, einer Kernzone und dem

O-Antigen, welches aus Polysaccharidketten besteht; und erschweren die Phago-

zytose durch Abwehrzellen des Wirts. Mittels Bildung spezifischer Antikörper ist der

B Schrifttum

21

Wirt zwar in der Lage diesen Mechanismus aufzuheben, allerdings verändert sich bei

einigen Pasteurellaceae die Oberflächenstruktur (Phasenvariation). Zur Phagozytose

des Erregers ist in diesem Falle erneut die Bildung spezifischer Antikörper vonnöten.

Untersuchungen zur Phasenvariation von LOS von H. somnus konnten zeigen, dass

die innere Kernregion hoch konserviert ist, die äußeren Kernepitope jedoch eine

hohe Heterogenität und Phasenvariation aufweisen (ST. MICHAEL et al. 2005). Die

Kernregion des LPS spielt bei A. pleuropneumoniae eine Rolle in der Adhäsion der

Bakterien an den Zellen des Respirationstraktes (RIOUX et al. 1999).

Geht gleichzeitig eine hohe Anzahl gramnegativer Bakterien zugrunde (z. B. durch

den Einsatz von Antibiotika), haben LPS und LOS zudem eine Toxinwirkung („Endo-

toxin“). Da es sich bei H. parasuis um ein gramnegatives Bakterium handelt, sind

LPS und LOS ebenfalls Bestandteil seiner äußeren Membran. In Versuchen mit

verschiedenen Antiseren gegen LOS konnten Zucker et al. auch nach mehreren

Kulturpassagen keine Variationen in den Reaktionen beobachten, zudem ergab sich

keine Korrelation zwischen Virulenz und den ermittelten LOS-Gruppen (ZUCKER et

al. 1996).

1.2.2.6 Toxine

Über die Sekretion von Toxinen durch H. parasuis ist bislang nichts bekannt, obwohl

dieses für andere Pasteurellaceae beschrieben wurde. Pasteurella (P.) multocida

produziert das Pasteurella multocida-Toxin (PMT) und verursacht in einer Misch-

infektion mit Bordetella bronchiseptica das Krankheitsbild der Rhinitis atrophicans im

Schwein. Diese ist gekennzeichnet durch den Abbau der Knochensubstanz der

Nasenmuscheln. PMT beeinflusst hierbei Signalkaskaden in den Wirtszellen, wo-

durch neben verschiedenen anderen Wirkungen (mitogene Wirkung) verstärkt

Kalzium mobilisiert und der Knochen abgebaut wird (PULLINGER et al. 2001).

Andere Gattungen produzieren sogenannte RTX-Toxine (repeats in toxin), welche

Ähnlichkeiten in ihrer Synthese und Sekretion sowie ihrer biologischen Wirkung

aufweisen. An ihrem N-Terminus bestehen sie aus verschiedenen lipophilen Regio-

nen und formen Poren oder andere Membrandefekte. Durch osmotische Schwellung

kommt es zum Absterben der empfänglichen Zelle (BROWN et al. 1997). Hierzu

B Schrifttum 22

gehört das Leukotoxin (LKT) von Mannheimia (M.) haemolytica, welches an bovine

Leukozyten bindet und in diesen Apoptose vermittelt (BROWN et al. 1997). Auch die

schwache hämolytische Aktivität von M. haemolytica ist auf die Wirkung des LTKs

zurückzuführen (MURPHY et al. 1995). Ebenfalls zu dieser Toxingruppe gehören die

APX-Toxine I-IV von A. pleuropneumoniae. Neben der direkten Schädigung durch

Porenbildung kommt es hier auch zu einer massiven Freisetzung wirtseigener

inflammatorischer Mediatoren, welche ebenfalls gewebezerstörend wirken (BOSSE

et al. 2002).

1.2.2.7 Sonstige virulenzassoziierte Faktoren

Viele andere Pasteurellaceae sezernieren Enzyme, welche als Virulenzfaktoren die-

nen. Für H. influenzae und A. pleuropneumoniae ist beispielsweise eine IgA-Protea-

se beschrieben, welche die Fähigkeit zur Spaltung von Immunkomplexen besitzt

(KILIAN et al. 1979). Einige Stämme von P. multocida weisen eine Sialidaseaktivität

auf. Diese wird für die vermehrte Besiedlung des Respirationstrakts und die Ent-

stehung von Läsionen während der Infektion verantwortlich gemacht. Es handelt sich

hierbei um ein glykolytisches Enzym, welches dem Bakterium Kohlenstoff aus wirts-

eigenen Zuckerverbindungen zugänglich macht (SANCHEZ et al. 2004). Neben der

Neuraminidaseaktivität (s. B1.2.2.1) sind für H. parasuis keine weiteren Enzyme mit

einem möglichen Zusammenhang zur Virulenz bekannt.

1.2.2.8 Vergleichsstudien zur Identifizierung von virulenzassoziierten Faktoren

Mit dem Ziel, anhand von Stammdifferenzen die Ursache für unterschiedliche Viru-

lenzeigenschaften zu identifizieren, wurden verschiedene Vergleichsstudien einzel-

ner Stämme durchgeführt. Da eine vollständige Genomsequenz von H. parasuis bis-

lang nicht vorliegt, handelt es sich um Methoden, die ohne bekannte Sequenzen

durchführbar sind.

Die erste umfassende Studie zur Identifizierung von Virulenzfaktoren suchte mittels

Differential Display Reverse Transcription (ddRT) -PCR nach Unterschieden im

Transkriptom eines virulenten H. parasuis Stammes von Serovar 5 (HILL et al. 2003).

Dieser wurde unter verschiedenen Bedingungen kultiviert (35 °C, 40 °C, mit und

B Schrifttum

23

ohne Zugabe von hitzeinaktiviertem Schweineserum) und cDNA der einzelnen An-

sätze wurde als Template in einer ddPCR eingesetzt. Diese wurde unter unspezi-

fischen Bedingungen mit mehr als 20 verschiedenen Kombinationen willkürlicher

Primer durchgeführt. Nach der Analyse der PCR-Produkte per SDS-PAGE wurde

basierend auf den unterschiedlich transkribierten Genfragmenten eine zweite PCR

der cDNA mit spezifischen Primern durchgeführt und zur Quantifizierung der Trans-

kription genutzt. Sieben unterschiedlich transkribierte Genfragmente konnten identi-

fiziert werden, der Nachweis für einen Zusammenhang mit der Virulenz von H. para-

suis Stämmen konnte bislang nicht geführt werden. Da die Sequenzen in allen

Referenzstämmen der 15 Serotypen nachgewiesen wurden, eignet sich keines der

Fragmente auf genetischer Ebene für eine diagnostische Methode zur Unterschei-

dung von virulenten und avirulenten Stämmen von H. parasuis. Ein zweiter Ansatz

einer ddRT-PCR wurde ebenfalls mit einem virulenten Stamm von Serotyp 5 durch-

geführt, die Anzucht erfolgte parallel unter Eisenmangel bzw. dem Zusatz von porzi-

ner Cerebrospinalflüssigkeit (METCALF u. MACINNES 2007). Der Ansatz unter Ei-

senmangel ergab zehn, der unter Zusatz von Cerebrospinalflüssigkeit neun hochre-

gulierte Gene, bei denen es sich überwiegend um Stoffwechselgene handelte. Die

Untersuchung der Referenzstämme auf das Vorhandensein der 19 Sequenzen

zeigte, dass auch diese Gene in allen Referenzstämmen der Serotypen vorhanden

waren. Allerdings exprimierten nur fünf virulente Stämme (vier Feldstämme von

Serotyp 4, 5 und 12, sowie Stamm Nagasaki) ein Protein mit Homologien zu einer

Hydrolase der Haloacid Dehalogenase (HAD) Superfamilie. Eine nähere Charakteri-

sierung erfolgte bislang nicht.

Im Jahr 2005 verglichen del Río et al. mittels Repräsentativer Differenzanalyse

(RDA) den Referenzstamm von Serotyp 2 (ein Serotyp mit einer hohen Prävalenz in

Spanien) mit den Referenstämmen von Serotyp 1, 5 (beide hochvirulent) und 3

(schwach virulent). Die Methode geht auf Lisitsyn et al. zurück (LISITSYN et al.

1993) und sieht die Herstellung einer repräsentativen Probe des genetischen

Materials beider Genome und einen PCR-Schritt vor, um die Komplexizität der

Genome herabzusetzen und die Größe der Fragmente einzuschränken. Die Detek-

tion der Differenzen geschieht durch mehrere sich abwechselnde Schritte aus Sub-

B Schrifttum 24

traktion und anschließender selektiver Amplifizierung der unterschiedlichen Frag-

mente. Del Rio et al. verwendeten eine modifizierte Form der RDA, in der auf den

initialen PCR-Schritt verzichtet und nur ein Subtraktionsschritt mit anschließender

Amplifikation durchgeführt wurde (DEL RIO et al. 2005b). Diese Modifikation wurde

vorher bereits erfolgreich von Strommenger et al. angewendet (STROMMENGER et

al. 2001). Del Rio et al. wiesen ein Fragment nach, welches spezifisch für den

Referenzstamm von Serotyp 2 ist und Homologien zu einer Dihydropteroat-Synthase

(dhps) von Shigella sonnei aufweist. Dhps-Gene stehen im Zusammenhang mit einer

Sulfonamidresistenz, befinden sich bei anderen gramnegativen Erregern jedoch vor

allem auf Plasmid-DNA (RADSTROM et al. 1991). Da im Referenzstamm von Sero-

typ 2 keine solchen Plasmide nachgewiesen werden konnten, der Stamm diese Re-

sistenz jedoch besitzt, postulieren die Autoren eine chromosomale Variante des

Gens.

1.2.3 Typisierung von H. parasuis

Da die bisherige Einteilung in Serotypen keine Auskunft über die Virulenz einzelner

Stämme gibt und eine Klassifizierung von virulenten und avirulenten Stämmen

anhand von Virulenzfaktoren bislang nicht möglich ist, beschäftigten sich zahlreiche

Studien mit der Identifikation anderer Typisierungsmerkmale, die eine solche Aus-

sage zulassen. Die Schwerpunkte lagen hier auf der Identifizierung genetischer Un-

terschiede einzelner Stämme oder dem Nachweis abweichender Proteinexpression.

Durch Vergleiche mit der klinischen Erkrankung der Tiere, von denen die Isolate ge-

wonnen wurden, ergaben sich Rückschlüsse auf die Eignung der jeweiligen Methode

zur Beurteilung der Virulenz eines Stammes.

1.2.3.1 DNA-basierte Typisierungsmethoden

Bei der Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) -PCR wird mittels spe-

ziesspezifischer Primer ein Fragment amplifiziert und im Anschluss mit Restriktions-

enzymen geschnitten. Die entstehenden Bandenmuster werden miteinander ver-

glichen und zur Einteilung der Stämme in Gruppen verwendet. 2002 wurde diese

Methode am tbpA Gen angewendet (DE LA PUENTE REDONDO et al. 2003). Die

Untersuchung der Referenzstämme der 15 Serotypen ergab, dass die Serovare 5,

B Schrifttum

25

12, 14 und 15 das gleiche Muster zeigen, alle anderen Serovare jedoch voneinander

unterschieden werden können. Klinische Isolate wiesen eine hohe Heterogenität auf

und es wurden zahlreiche neue Muster identifiziert. Der Vergleich zwischen RFLP-

Gruppe und Serotyp ergab keine Korrelation. Eine zweite Studie wendete die gleiche

Methode an, nutzte jedoch ein Amplikon aus dem Gen aroA, einem Enzym der

Biosynthese von aromatischen Aminosäuren (DEL RIO et al. 2006a). Neben den 15

Referenzstämmen der Serotypen von H. parasuis wurden auch verschiedene Arten

der Gattung Actinobacillus (A.) untersucht. Der Versuch ergab sieben unter-

schiedliche Gruppen. Die Serovare 1, 2, 4-6 und 8-15 von H. parasuis gehören der

ersten Gruppe an, außerdem auch die beiden Stämme von A. porcinus und A. ureae.

Serotyp 3 und 7 von H. parasuis bilden mit den Serotypen 1, 4, 5, 9, 11 und 12 von

A. pleuropneumoniae die zweite Gruppe. Die restlichen Bakterien verteilen sich auf

die Gruppen III-VII. Die Methode ermöglicht eine Unterscheidung von verschiedenen

Isolaten, eine Aussage über das Virulenzpotenzial eines Stammes ist jedoch nicht

möglich.

Die Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (ERIC) -PCR basiert auf der

Amplifikation repetitiver Konsensussequenzen und dem Abgleich des entstandenen

Bandenmusters mittels Gelelektrophorese. Sie bietet die Möglichkeit genetische Un-

terschiede zwischen einzelnen Isolaten darzustellen, jedoch keine Unterteilung von

virulenten und avirulenten Stämmen. Laut einer Untersuchung durch Rafiee et al.

ergaben alle 15 Referenzstämme ein unterschiedliches Muster und ließen sich somit

voneinander unterscheiden (RAFIEE et al. 2000). Zwölf Feldstämme von vermutlich

zusammenhängenden Ausbrüchen der Glässerschen Krankheit ergaben ein einheit-

liches Muster, dieses entsprach jedoch keinem Muster der Referenzstämme. Ruiz et

al. verwendeten ebenfalls eine ERIC-PCR und verglichen deren Ergebnisse mit dem

Bandenmuster aus präparierten Membranproteinen in der SDS-PAGE (RUIZ et al.

2001). Oliveira et al. verwendeten die ERIC-PCR in Kombination mit der Serotypi-

sierung mittels Immunodiffusion zur Untersuchung von Clusterbildung und Prävalenz.

Sie fanden potenziell virulente Stämme unter den Serovaren 1, 2, 4, 5, 12, 13 und

14, bzw. unter den nicht typisierbaren Stämmen und wiesen eine hohe genetische

Heterogenität unter den Stämmen nach (OLIVEIRA et al. 2003a).

B Schrifttum 26

Smart et al. verglichen 1987 verschiedene Stämme mittels Restriction Endonuclease

Fingerprinting (REF), welches mittels Gelelektrophorese das Bandenmuster ver-

schiedener Stämme vergleicht, deren extrahierte DNA vorher mit Restriktionsenzy-

men verdaut wurde (SMART et al. 1988). Die untersuchten Referenzstämme (nach

dem KRG-Schema Serotyp 1-9) ließen sich zwar voneinander abgrenzen, die Feld-

isolate konnten jedoch anhand ihres Musters keinem dieser Serotypen zugeordnet

werden. Die Herden wiesen überwiegend mehr als einen Stamm auf, wobei stets ein

Stamm dominierte, und wenige Einzeltiere trugen mehr als einen Stamm. Die Auto-

ren treffen keine Aussage über einen beobachteten Zusammenhang zwischen Viru-

lenz und dem Bandenmuster. Auch diese Methode ermittelt genetische Unterschiede

zwischen einzelnen Stämmen, nicht jedoch ihr Virulenzpotenzial.

Eine weitere PCR-basierte Untersuchungsmethode ist das MLST (Multi Locus Se-

quence Typing), bei welcher Gensequenzen von housekeeping Genen einzelner

Stämme sequenziert und die Ergebnisse miteinander verglichen werden. Anhand der

Daten können Gemeinsamkeiten und Unterschiede analysiert, Clusteruntersuchun-

gen durchgeführt, einzelne Stämme in Sequenztypen eingeteilt und Verwandt-

schaftsgrade der Stämme untereinander errechnet werden. So werden die gene-

tischen Unterschiede verschiedener Stämme untersucht, ein Zusammenhang zu

ihrer Virulenz ergibt sich daraus jedoch nicht. Diese Methode wurde 2006 von Olvera

et al. durchgeführt (OLVERA et al. 2006), indem sie Primer für verschiedene konser-

vierte Gene verwendeten, die anhand von bekannten Sequenzen von H. influenzae

oder homologer Bereiche anderer Bakterien der Familie der Pasteurellaceae kon-

struiert wurden. In dieser Studie konnte erneut die große genetische Heterogenität

des Erregers belegt werden, da eine hohe Anzahl von Sequenztypen ermittelt wurde

und nur selten der gleiche Typ in mehreren Betrieben vorkam. Im Gegensatz zu

anderen Bakterien, wo bestimmte virulenzassoziierte Klone gehäuft auftreten

(SMITH et al. 2000), herrschten bei H. parasuis keine dominanten Klone vor. Neben

der Isolation verschiedener Stämme aus einem Bestand bzw. von Einzeltieren, wur-

den auch mehrere Stämme in derselben systemischen Läsion nachgewiesen. Dieses

führte die Autoren zu der Theorie, dass der Ausbruch einer Krankheit möglicherweise

B Schrifttum

27

auch durch mehrere Stämme gleichzeitig verursacht wird und nicht, wie allgemein

angenommen, nur auf einen Stamm zurückzuführen ist.

1.2.3.2 Proteinbasierte Typisierungsmethoden

Ebenfalls eine hohe Diversität unter Isolaten von H. parasuis ergab die Studie von

Blackall et al., die mittels Multilocus Enzyme Electrophoresis (MLEE) acht Referenz-

und 40 Feldstämme untersuchten (BLACKALL et al. 1997). Für die MLEE werden

lösliche Proteine präpariert und in einem Stärkegel aufgetrennt. Horizontale Schnitte

dieses Gels werden mit den Substraten verschiedener Enzyme inkubiert und die je

nach Enzymaktivität entstehenden Bandenmuster miteinander verglichen. Durch den

Vergleich der einzelnen Enzymnachweise und deren Laufweite im Gel konnten

Rückschlüsse auf die genetischen Unterschiede geschlossen und Elektrophorese-

typen (ET) eingeteilt werden. Es entstanden zwei Gruppen, Gruppe 1 enthielt alle

Isolate von Serotyp 4 und 5, darunter auch zwei Referenzstämme für Serotyp 5,

einige von Serotyp 13 und zwei nicht typisierbare Isolate. Gruppe 2 enthielt Feld-

stämme von Serotyp 1, 2, 7, 9, 10 und 13 sowie die Referenzstämme von Serotyp 1,

2, 3, 4, 8 und 9. Die Serovare 4 und 13 verhielten sich somit uneinheitlich und ließen

sich beiden Gruppen zuordnen. Ein Zusammenhang zwischen der Gruppeneinteilung

und Virulenz konnte nicht beobachtet werden, da sich in beiden Gruppen Isolate von

Tieren befanden, die Septikämie oder respiratorische Symptome aufwiesen. Diese

Ergebnisse decken sich mit denen einer Studie von Rapp-Gabrielson et al. (RAPP-

GABRIELSON et al. 1992a), welche ebenfalls mittels MLEE die Diversität von H. pa-

rasuis Isolaten aus Nordamerika zeigten. Viele ETs bestanden nur aus einem Isolat

und es konnte kein Zusammenhang zwischen genetischen Eigenschaften und der

Virulenz eines Stammes beobachtet werden.

Mehrere Studien beschäftigten sich mit der Methode des PAGE-Typings. In einer

älteren Untersuchung ergaben die Ganzzelllysate von acht Stämmen (zwei Isolate

aus an Pneumonie erkrankten Tieren, sechs aus Tieren mit Glässerscher Krankheit)

in SDS-PAGE-Gelen zwei unterschiedliche Proteinmuster, PAGE-Typ I und II

(NICOLET et al. 1980). Typ II wurde durch die Anwesenheit eines 37 kDa großen

Proteins definiert, Typ I über dessen Abwesenheit. Alle aus an Glässerscher Krank-

B Schrifttum 28

heit erkrankten Tieren isolierten Stämme gehörten Typ II an, woraus ein Zusam-

menhang zwischen dem Protein und der Virulenz der Stämme geschlossen wurde.

Auf dem selben Schema basierend analysierten Morozumi et al. weitere Feldstäm-

me, darunter Proben aus den Nasenhöhlen gesunder Tiere sowie aus Tieren mit

Pneumonie und Polyserositis (MOROZUMI u. NICOLET 1986a). Von den aus Na-

senhöhlen isolierten Stämmen gehörten sechs PAGE-Typ I an, die restlichen vier

Typ II. Sämtliche Isolate aus Läsionen konnten PAGE-Typ II zugeordnet werden. Aus

diesen Ergebnissen wurde erneut ein Zusammenhang zwischen dem 37 kDa großen

Protein und Virulenz geschlossen.

Rosner et al. hingegen konnten keine Korrelation zwischen PAGE-Typ und Virulenz,

bzw. Isolationsort und Virulenz ausmachen (ROSNER et al. 1991). Sie untersuchten

Feldstämme von H. parasuis und teilten sie anhand des Musters in sieben PAGE-

Typen ein, welche auf der Kombination bestimmter Proteinbanden basieren: Typ I

(29, 37, 39 und 51 kDa), Typ IIa (27 und 45 kDa), Typ IIb (47 kDa), Typ IIIa (45 kDa),

Typ IIIb (27 und 39 kDa), Typ IV (32 und 51 kDa) und Typ V (39 und 45 kDa).

Virulente Isolate befanden sich in den Typen I, IIa, IIb, IIIa und IIIb, avirulente Stäm-

me gehörten den Typen IIa, IV oder V an.

In einer Studie von Oliveira et al. wurde das Proteinprofil von 98 Feldstämmen un-

tersucht und computergestützt analysiert (OLIVEIRA u. PIJOAN 2004). Die Stämme

entstammten dem oberen Respirationstrakt, pneumonischen Lungen und syste-

mischen Lokalisationen (Perikard, Pleura, Gelenk, Gehirn und Lymphknoten). Es

konnten sechs Cluster ermittelt und in zwei unterschiedliche PAGE-Typen eingeteilt

werden, die anhand von Anwesenheit oder Abwesenheit von markanten Protein-

banden im Größenbereich von 36-38 kDa definiert wurden. Eine Identifizierung der

Proteine erfolgte nicht. Cluster 1 entsprach PAGE-Typ II und enthielt 77 Isolate, die

jeweils eine markante Bande aufwiesen. Es handelte sich hauptsächlich um Stäm-

me, die aus erkrankten Tieren isoliert wurden, darunter 29 Isolate aus Tieren mit

Pneumonie und 39 Isolate aus systemischen Lokalisationen. PAGE-Typ I enthielt die

Cluster 2-6, repräsentiert durch 21 Isolate, welche sämtlich keine dieser markanten

Banden des entsprechenden Größenbereichs zeigten. Vier der 21 Proben wurden an

B Schrifttum

29

systemischen Lokalisationen isoliert, sechs aus Lungen mit Pneumonie und zehn

Proben entstammten dem oberen Respirationstrakt von gesunden Schweinen.

PAGE-Typ II beinhaltete 27 unterschiedliche Muster, die Stämme entsprachen den

Serotypen1, 2, 4, 5, 7, 12, 13 und 14. Dazu kamen nach dem KRG-Schema nicht

typisierbare Isolate. In PAGE-Typ I waren bis auf Serotyp 3 die anderen oben ge-

nannten Serotypen ebenfalls vorhanden, insgesamt handelte es sich um 14 ver-

schiedene Proteinmuster aus fünf unterschiedlichen Clustern. In Typ I zeigten die

Stämme demnach eine größere genetische Heterogenität als in Typ II. Die Ergeb-

nisse dieser Studie zeigen anhand der Verteilung der Stämme einen möglichen Zu-

sammenhang zwischen dem Auftreten dieser markanten Proteinbanden im Größen-

bereich von 36-38 kDa und dem Virulenzpotenzial eines Stammes, jedoch keinen

zwischen PAGE-Typ und Serotyp.

Eine kombinierte Untersuchung von DNA und Proteinmuster unternahmen Ruiz et al.

(RUIZ et al. 2001). Sie präparierten von 84 Feldstämmen Membranproteine und

untersuchten diese in der SDS-PAGE. Zudem führten sie mit allen Stämmen eine

ERIC-PCR durch. Die Ergebnisse beider Untersuchungen verglichen sie mit den

bekannten Daten der Isolate über Isolationsort und Krankheitsbild. Ihre Studien

ergaben ein homogeneres Muster für systemisch isolierte Stämme, dies galt sowohl

für die SDS-PAGE als auch für das DNA-Profil. Daraus schlossen die Autoren eine

Korrelation mit der Virulenz eines Stammes, auch wenn sie beide Parameter für

unabhängig voneinander hielten, da Stämme des gleichen Genotyps unterschied-

liche Proteinmuster aufwiesen.

1.2.3.3 Serologische Methoden

Die ersten Versuche zu den antigenen Eigenschaften von H. parasuis wurden von

Bakos et al. (BAKOS et al. 1952; BAKOS 1955) mittels Präzipitationstests durch-

geführt und ergaben vier unterschiedliche Serotypen (A-D).

Morozumi und Nicolet (MOROZUMI u. NICOLET 1986b) führten 1986 eine Immuno-

diffusion mittels Agargel-Präzipitation mit Kaninchenseren durch und klassifizierten

die Serotypen 1-7 (NICOLET et al. 1986). Mit der gleichen Methode identifizierten

B Schrifttum 30

Kielstein et al. zusätzlich die Serotypen Jena 6-12 (KIELSTEIN et al. 1991a) und

Rapp-Gabrielson et al. ND1-5 (RAPP-GABRIELSON u. GABRIELSON 1992).

Kielstein et al. vereinheitlichten die Einteilung anhand der Untersuchungen weiterer

Isolate mit der gleichen Methode und entwickelten die heutige Einteilung in 15

Serotypen nach dem sogenannten Kielstein-Rapp-Gabrielson- (KRG-) Schema

(KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON 1992). Alle anderen zum damaligen Zeitpunkt

bekannten Serotypen wurden in dieses Schema eingegliedert.

Del Rio et al. verglichen 2003 die bekannte Immunodiffusionsmethode mit einem von

ihnen angewandten indirekten Hämagglutinations- (IHA-) und einem Koagulations-

test (DEL RIO et al. 2003). Der Koagulationstest zeigte diverse Kreuzreaktionen, der

IHA jedoch führte zu spezifischen Ergebnissen und bis auf eine Ausnahme wurden

durch IHA und Immunodiffusion alle untersuchten Stämme den gleichen Serotypen

zugeordnet. Zusätzlich konnte die IHA 80 % der 25 als per Immunodiffusion nicht

typisierbar einsortierten Stämme einem Serotypen zuordnen. Die gleiche Methode

wurde 2004 von Angen et al. an dänischen Isolaten durchgeführt und nur drei Isolate

ergaben in der IHA und der Immunodiffusion unterschiedliche Ergebnisse (ANGEN et

al. 2004). Auch in diesem Versuch gelang mit der IHA die Typisierung von einigen

Stämmen, die mit der Immunodiffusion misslang.

1.2.3.4 Vergleich der Typisierungsmethoden

Alle beschriebenen Methoden können einzelne Stämme voneinander abgrenzen. Je

nach angewandter Methode werden die Stämme in unterschiedlich viele Gruppen

eingeteilt, was entweder durch eine besonders sensitive Untersuchungsmethode

bedingt ist oder durch eine geringe Anzahl untersuchter Proben. Je sensitiver die

Methode, desto besser ist sie z.B. für epidemiologische Studien geeignet.

Sämtliche Methoden vermögen es jedoch nicht, einen virulenten Stamm von einem

avirulenten zu unterscheiden. Zwar wurde in den ersten Studien mittels PAGE-

Typing ein Zusammenhang zwischen Proteinmuster und Virulenz vermutet, weitere

Ergebnisse aus Untersuchungen mit dieser Methode konnten diesen jedoch nicht

bestätigen.

B Schrifttum

31

1.2.4 Tiermodelle

Verschiedene in vivo Versuche mit H. parasuis sind in der Vergangenheit durch-

geführt worden. Sie unterschieden sich im Ziel der Studie, dem Tiermodell und der

Wahl der Inokulationsroute.

Die ältesten Pathogenitätsstudien mit den Referenzstämmen der heute gültigen

Serotypen führten Kielstein et al. 1992 durch (KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON

1992), indem sie primäre SPF-Tiere intraperitoneal mit 5 x 108 KBE der 15 Refe-

renzstämme inokulierten. Die mit Serotyp 1, 5, 10 12, 13 und 14 infizierten Tiere

verstarben innerhalb von vier Tagen oder waren moribund. Tiere, die mit den Sero-

typen 2, 4 und 15 infiziert waren, litten unter Polyserositis, der Referenzstamm 8

verursachte nur milde Symptome. Mit den Serotypen 3, 6, 7, 9 und 11 traten keine

Symptome oder pathologische Veränderungen auf. Die Zuordnung eines Stammes

zu einem Serotypen ermöglicht allerdings keine Zusage bezüglich seiner Virulenz, da

sich die Isolate einer Serogruppe nicht einheitlich verhalten (OLIVEIRA u. PIJOAN

2004).

Auch durch andere Inokulationsrouten konnten Tiere erfolgreich infiziert werden. So

verwendeten Nielsen et al. die intranasale Route (NIELSEN 1993), Blanco et al.

infizierten die Versuchstiere intratracheal (BLANCO et al. 2004) und Miniats et al.

führten eine aerosolisierte Belastung durch (MINIATS et al. 1991).

Die Manifestation einer Erkrankung wird durch den Immunstatus der Versuchstiere

beeinflusst (BLANCO et al. 2004; NIELSEN 1980), weshalb die große Verbreitung

des Erregers für die Durchführung von Versuchen zunehmend Probleme bereitet, da

sie den Erwerb H. parasuis freier Tiere erschwert. Aus diesem Grund beschäftigten

sich einige Studien mit der Austestung von alternativen Modellen.

1991 führten Morozumi et al. Versuche mit Mäusen und Meerschweinchen durch

(MOROZUMI et al. 1982). Die Tiere wurden vergleichend intraperitoneal, intramusku-

lär und intrapulmonal infiziert. Die Mäuse überlebten überwiegend und wiesen in der

Sektion keine H. parasuis typischen Veränderungen auf, wohingegen die Mehrzahl

der Meerschweinchen mit Septikämie, Serositis und Meningitis Symptome der klas-

B Schrifttum 32

sischen Glässerschen Kranktheit zeigte und verstarb. Die Empfindlichkeit von Meer-

schweinchen gegenüber H. parasuis bestätigten Rapp-Gabrielson et al. (RAPP-

GABRIELSON et al. 1992b). Sie stellten fest, dass Meerschweinchen bei intraperi-

tonealer Infektionsroute innerhalb von 24 Stunden verstarben, Unterschiede in der

Virulenz eines Stammes waren jedoch nur bei intratrachealer Infektion zu beob-

achten.

Neben Labornagern kommen als alternatives Tiermodell auch künstlich aufgezogene

Schweine in Betracht. Diese werden nach oder bereits während der Geburt von der

Muttersau separiert und erhalten wahlweise porzines, bovines oder gar kein Ko-

lostrum. So verwendeten Smart et al. in ihren Protektionsstudien Tiere aus einer H.

parasuis freien Herde, die mittels Kaiserschnitt entbundener Tiere aufgebaut wurde

(SMART u. MINIATS 1989), und Miniats et al. setzten Gnotobioten ein (MINIATS et

al. 1991). Hierbei handelt es sich um per Kaiserschnitt geborene Tiere, die keimfrei

aufgezogen werden. Eine andere Form sind natürlich geborene, aber künstlich

aufgezogene Ferkel (OLIVEIRA et al. 2003b) und sogenannte CDCD-Tiere (cesa-

rean derived colostrum deprived), die der Bezeichnung nach per Kaiserschnitt gebo-

ren und ohne Kolostrumgabe, nicht aber steril aufgezogen werden (VAHLE et al.

1997). Alle diese Modelle haben den Vorteil, dass die Studien am Wirtstier durch-

geführt werden können, weil die Tiere naiv gegenüber H. parasuis sind. Nachteilig ist

allerdings, dass sie ein äußerst schwaches Immunsystem besitzen und Versuche mit

derart immunsupprimierten Tieren oftmals mit hohen Verlusten vor Versuchsbeginn

einher gehen. In einer Studie, die die Eignung von natürlich geborenen und künstlich

aufgezogenen Ferkeln als Tiermodell für H. parasuis untersuchte, erlebten nur 50 %

der Tiere den Versuchsbeginn, obwohl sie ersatzweise bovines Kolostrum und eine

Antibiotikatherapie erhalten hatten (OLIVEIRA et al. 2003b). Der hohe Haltungsauf-

wand für solche empfindlichen Tiere und die Tierverluste machen Versuche mit

immunsupprimierten Tieren sehr kostenintensiv. Eine aus solchen Tieren aufgebaute

Herde stellt zwar optimale Versuchsbedingungen her, ist jedoch ebenfalls mit hohen

Kosten verbunden.

B Schrifttum

33

Andere in vivo-Versuche beschäftigten sich mit Immunisierungsstudien gegen H. pa-

rasuis. Hierfür wurden z.B. die Route per Aerosol (NIELSEN 1993), per subkutaner

(SMART u. MINIATS 1989) und intramuskulärer Injektion durchgeführt (BAK u.

RIISING 2002).

Zur Untersuchung möglicher Kreuzimmunitäten zwischen den einzelnen Stämmen

immunisierten Nielsen et al. Schweine mit einer Kultur der apathogenen Stämme 2,

3, 4 oder 7 und beobachteten eine Resistenz gegenüber einem dänischen Feld-

stamm von Serotyp 5 (NIELSEN 1993). Dahingegen stellten Takahashi et al. fest,

dass eine monovalente Immunisierung mit einem Feldstamm von Serotyp 2 oder

dem Referenzstamm von Serotyp 5 (Stamm Nagasaki) zwar gegen eine homologe,

nicht jedoch gegen eine heterologe Belastung schützt (TAKAHASHI et al. 2001). Im

Gegensatz zu Nielsen et al. setzten sie einen sogenannten Bakterinimpfstoff, das

heisst eine formalininaktivierte Ganzzellvakzine ein. Unvollständige Kreuzimmunität

bestätigten auch Miniats et al., die Versuche an Gnotobioten durchführten (MINIATS

et al. 1991). Sie immunisierten drei Tiergruppen mit verschiedenen Bakterinimpf-

stoffen, denen jeweils ein anderer Feldstamm zugrunde lag (zwei virulente Stämme

V1 und V2, ein avirulenter Stamm AV), je ein Drittel jeder Gruppe wurde per Aerosol

mit Lebendkulturen der drei Stämme belastet. Eine Vakzinierung mit den virulenten

Impfstämmen V1 oder V2 schützte sämtliche Tiere vor einer Belastung mit allen drei

Testisolaten, wohingegen die Impfung mit dem avirulenten Stamm AV zwar gegen

den einen virulenten V2, jedoch nicht gegen eine Belastung mit dem anderen viru-

lenten Stamm V1 schützte. Kreuzimmunitäten konnten demnach nachgewiesen wer-

den, ein vollständiger Schutz gegen alle Stämme wird jedoch nicht erlangt.

Versuche, die die Rolle maternaler Antikörper im Zusammenhang zu einem Impf-

schutz untersuchten, ergaben deutlich reduzierte Krankheitssymptome in Ferkeln,

deren Mütter vor der Geburt gegen H. parasuis (Serotyp 5) geimpft wurden

(SOLANO-AGUILAR et al. 1999). Miniats et al. immunisierten Ferkel unterschied-

lichen Alters mit einem Bakterinimpfstoff, um den optimalen Zeitpunkt für eine Vakzi-

nierung herauszufinden. Sie stellten keinen Unterschied zwischen Tieren fest, die in

der zweiten und vierten Lebenswoche geimpft wurden und denen, die in der dritten

B Schrifttum 34

und fünften, bzw. vierten und sechsten Lebenswoche geimpft wurden (MINIATS u.

SMART 1988).

Die in Dänemark (Glassinord®) und Deutschland (Porcilis® Glässer) zugelassenen

Impfstoffe der Firma Intervet sind auf Serotyp 5 basierende Totimpfstoffe, die sich in

dem verwendeten Adjuvans unterscheiden. Versuche mit Porcilis® Glässer haben er-

geben, dass die Tiere zuverlässig gegen eine homologe Belastung geschützt sind,

sich die Wirkung gegenüber einer heterologen Belastung mit Stämmen aus Serovar

1, 12, 13 und 14 jedoch als unvollständig erwiesen hat (BAK u. RIISING 2002). In

Deutschland werden deshalb häufig bestandsspezifische Bakterinimpfstoffe ver-

wendet.

Zusammenfassend ist es bisher zwar gelungen, klinische Erkrankungen durch

Vakzinierung der Tiere gegen H. parasuis zu verhindern, ein übergreifender Schutz

gegen heterologe Belastung wurde bislang jedoch nicht erreicht. Zudem ist die Un-

terscheidung von geimpften und infizierten Tieren mit den bisher erhältlichen Vakzi-

nierungsmethoden nicht möglich.

B Schrifttum

35

2 Ziel der Studie

Bei H. parasuis handelt es sich um einen Keim, der gerade in Betrieben mit hohen

Hygienestandards zunehmend Probleme bereitet. Über seine Virulenzfaktoren und

Pathogenitätsmechanismen ist bislang wenig bekannt, so dass derzeit keine Aus-

sage darüber möglich ist, ob ein Stamm das Potenzial besitzt Erkrankungen hervor-

zurufen oder ob es sich um einen avirulenten Kommensalen des oberen Respira-

tionstraktes handelt.

Kenntnisse über die Virulenzfaktoren des Erregers sind für die Entwicklung diag-

nostischer Methoden notwendig, welche neben dem Speziesnachweis auch Auskunft

über das Virulenzpotenzial eines Stammes geben. Langfristig können diese Daten

auch zur Entwicklung eines serovarübergreifenden Impfstoffes verwendet werden.

Als Voraussetzung für die Untersuchung potenzieller Virulenzfaktoren ist ein zuver-

lässiges Tiermodell notwendig.

Das Ziel der vorliegenden Studie war es deshalb, neue Virulenzfaktoren von H. para-

suis zu identifizieren und mit der Etablierung eines geeigneten Tiermodells zu be-

ginnen.

C Material und Methoden 36

C Material und Methoden

1 Material

1.1 Geräte, Verbrauchsmittel und Chemikalien

Die in dieser Arbeit verwendeten Verbrauchsmittel und Chemikalien sind in Anhang

I1 aufgelistet, die Geräte in den Fußnoten angegeben.

1.2 Lösungen und Puffer

Eine Auflistung der verwendeten Lösungen und Puffer findet sich in Anhang I2 auf-

gelistet. Sie wurden soweit notwendig autoklaviert oder sterilfiltriert.

1.3 Bakterienstämme

Die in dieser Arbeit eingesetzten Bakterienstämme sind in Anhang I3 aufgeführt.

2 Methoden

2.1 Mikrobiologische Methoden

2.1.1 Kultivierung von Escherichia coli Stämmen

Escherichia (E.) coli Stämme wurden in Luria-Bertani (LB) Medium kultiviert (s. An-

hang Tab. 11), welchem bei Bedarf Antibiotika zugesetzt wurden (100 µg Ampicillin).

Die Bebrütung der Bakterien erfolgte über Nacht aerob bei 37 °C im Brutschrank1

oder im Schüttelinkubator2.

2.1.2 Kultivierung von H. parasuis Stämmen

Die H. parasuis Stämme wurden als Flüssigkultur in Brain Heart Infusion (BHI) Me-

dium (s. Anhang Tab. 11) unter Zusatz von 5 % Pferdeserum und 1 x Ersatz-Isovita-

lex (EIVX) kultiviert. Die Bebrütung erfolgte für 24-48 Stunden bei 37 °C unter mikro-

aerophilen Bedingungen (5 % CO2)3. Bei der Anzucht im Schüttelinkubator wurde

das Medium zur Anreicherung mit CO2 vorher bei 37 °C über Nacht vorinkubiert. Zur

1 Memmert GmbH & Co. KG, Schwabach, Deutschland

2 innova 4300, NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC, Edison, USA

3 CO2-AUTO-ZERO, Heraeus, Hanau, Deutschland


Anzucht auf Agarplatten wurde in der Regel Kochblutagar mit Nicotinamid (NAD) -

Zusatz verwendet, je nach Bedarf wurden aber auch Schafsblut- oder Schweineblut-

Agar mit einer Staphylococcus aureus-Amme, PPLO-Agar oder Columbia Sheep

Blood (CSB) -Agar eingesetzt.

2.2 Molekularbiologische Methoden

2.2.1 Arbeiten mit DNA

2.2.1.1 Präparation chromosomaler DNA

Zur Präparation chromosomaler DNA von H. parasuis wurde ein Protokoll verwendet,

welches einen Aufreinigungsschritt mit Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) zur

Abtrennung von Proteinen und Polysacchariden beinhaltet (AUSUBEL et al. 1987).

An Tag 1 wurde ein fraktionierter Ausstrich des entsprechenden Stammes vorge-

nommen. Mit einem angefeuchteten Tupfer wurde an Tag 2 das Material von der

Platte entnommen und in insgesamt 3-4 Aliquots TEN-Puffer (s. Anhang Tab. 12)

resuspendiert (je 275 µl). Nach Zugabe von 10 µl RNAse (10 mg/ml) und 275 µl

Aqua dest. inkubierten die Ansätze für 30 Minuten im Wasserbad4 bei 37 °C. Im An-

schluss folgte ein Zusatz von 15 µl 20 %igem SDS und 10 µl Proteinase K (20

mg/ml). Die Probe wurde gründlich gemischt, erneut bei 37 °C für eine Stunde im

Wasserbad inkubiert und währenddessen das CTAB (s. Anhang Tab. 12) auf 50 °C5

erwärmt. Dem Ansatz wurden zunächst 125 µl 4M NaCl zugegeben, wieder gründlich

gemischt, danach 80 µl CTAB hinzugegeben, erneut gemischt und für zehn Minuten

im Wasserbad bei 65 °C erwärmt. Die Fällung begann mit der Zugabe von 780 µl

Chloroform/Isoamyl (24:1). Nach gründlichem Mischen erhielt die Lösung ein homo-

gen milchiges Aussehen. Durch einen Zentrifugationsschritt über fünf Minuten bei

12.000 g6 wurden drei unterschiedliche Phasen sichtbar, ausschließlich der Über-

stand wurde in ein zweites Eppendorf-Reagiergefäß überführt und der Rest verwor-

fen. Nach Zugabe von 780 µl Phenol/Chloroform/Isoamyl (25:24:1) wurde erneut

4 1004, Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel, Deutschland

5 Labtherm

®, Liebisch, Bielefeld, Deutschland

6 mini Spin plus

®, Eppendorf, Hamburg, Deutschland


gemischt, zentrifugiert (fünf Minuten bei 12.000 g), der Überstand zurück behalten

und der Rest verworfen. Die Präzipitation der DNA geschah durch Hinzufügen von

500 µl Isopropanol, vorsichtiges Mischen und erneutes Zentrifugieren (30 Minuten

bei 12.000 g). Ein nachfolgender Waschschritt des Pellets beinhaltete nach der

Zugabe von 500 µl 80 %igem Ethanol noch eine Zentrifugation für fünf Minuten bei

12.000 g. Nach dem Abnehmen des Alkohols wurde das Pellet für zehn Minuten an

der Luft getrocknet und anschließend in ca. 50 µl Aqua dest. oder TE-Puffer über

Nacht im Kühlschrank resuspendiert. Die Lagerung der chromosomalen DNA erfolgte

bei -20 °C im Gefrierschrank.

2.2.1.2 Plasmidpräparationen

Zur Präparation kleinerer Mengen Plasmid-DNA wurde das modifizierte Alkalilysis

Verfahren nach Birnboim angewendet (BIRNBOIM u. DOLY 1979). Hierfür wurden

am Vortag 3 ml Medium mit dem gewünschten E. coli-Stamm beimpft, über Nacht bei

37 °C im Schüttler inkubiert und am nächsten Tag abzentrifugiert7 (10 min, 8.000 g).

Die Resuspension des Bakterienpellets erfolgte in 300 µl Tris-EDTA-Puffer (50 mM

Tris-HCl, pH 8.0; 10 mM EDTA, 0,1 mg/ml RNAse). Nach Zugabe von 300 µl NaOH-

SDS-Lösung (0,2 M NaOH, 1 % SDS) wurde die Lösung bis zur Lyse der Bakterien,

maximal jedoch für fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend

wurden 300 µl K-Acetat-Puffer 3,2 M (pH 5,5) hinzugefügt, die Probe für zehn

Minuten bei 12.000 g zentrifugiert und der Überstand in ein neues Reagiergefäß

überführt. Die Präzipitation erfolgte durch Zugabe von 600 µl eiskaltem Isopropanol.

Einer Inkubation von fünf bis zehn Minuten bei Raumtemperatur folgte ein letzter

Zentrifugationsschritt (10 min, 12.000 g). Nach Abnahme des Überstands wurde das

Pellet an der Luft für zehn Minuten getrocknet und dann in 25 µl Aqua dest.

resuspendiert.

Für einen analytischen Verdau wurden maximal 5 µl der Präparation verwendet.

7 Sorvall

® RC-5B Refrigerated Superspeed Centrifuge, Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA


2.2.1.3 Polymerase-Kettenreaktion

In der Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) werden durch

das Enzym Taq-DNA-Polymerase DNA-Abschnitte amplifiziert (MULLIS et al. 1986).

Sämtliche für alle Ansätze identisch eingesetzten Reagenzien wurden gemäß Proto-

koll als Mastermix zusammen pipettiert und in Probengefäße aliquotiert. Es folgte

dann für jedes Gefäß einzeln die Zugabe jener Reagenzien, in denen sich die An-

sätze unterschieden, bis überall das erwünschte Gesamtvolumen (25 oder 50 µl)

erreicht wurde. Als Template diente chromosomale DNA, resuspendiertes Kolonie-

material oder Plasmid-DNA, die eingesetzte Menge betrug 10-20 ng/µl. Um die

Reaktionen zu überprüfen wurden stets mindestens eine Positivkontrolle und eine

Negativkontrolle mitgeführt. Zur Durchführung der PCR wurde ein Thermocycler8 ver-

wendet, wobei die zu durchlaufenden Programme den einzelnen Primern und Frau-

gestellungen angepasst wurden (s. Tab. 1). Die Standardpufferbedingungen: 1 x

PCR-Puffer, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM pro Nucleotid, 0,5 µmol pro Primer, 1,0 bis 2,5

Einheiten Taq-DNA-Polymerase® oder Gotaq®, Template in variabler Menge.

Die Analyse der PCR-Produkte geschah mittels Agarosegel-Elektrophorese unter

Mitführung eines Größenmarkers (2log Ladder®). Zur Aufreinigung von PCR-Produk-

ten wurde das NucleoSpin® Extract II-Kit (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland)

nach Anweisung des Herstellers verwendet.

8 primus 96 advanced

®, peQLab, Erlangen, Deutschland


Tab. 1 In dieser Arbeit verwendete Primer

Primerpaar Beschreibung Quelle

RBgl12 RBgl24

5’-GATCTGCGGTGA-3’ 5’-AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGCA-3’ Oligonukleotide für den Einsatz in der RDA (Adaptoren und Primer) PCR-Programm: 94 °C/3:00 min, 35 x (94 °C/1:00 min, 58 °C/1:00 min, 72 °C/3:00 min), 72 °C/10:00 min

(LISITSYN et al. 1993)

oMP_A1 oMP_A2

5’-GGTTCTAGTTCACAAACAGCCAATAC-3’ 5’-GATATTTACCCCTGCCTTCATTGTATC-3’ Produktgröße 964 bp Primer zum Nachweis des Virulenzmarkers hhdA PCR-Programm: 94 °C/3:00 min, 32 x (94 °C/1:00 min, 62 °C/0:45 min, 72 °C/1:30 min), 72 °C/10:00 min

diese Arbeit

oMP_B1 oMP_B2

5’-ATCTTGCCCTGATTAGAGAGTAGGAGT-3’ 5’-GTGAATATAGCCCTTATCCAAATAGGC-3’ Produktgröße 557 bp Primer zum Nachweis des Virulenzmarkers hhdB PCR-Programm: 94 °C/3:00 min, 32 x (94 °C/1:00 min, 62 °C/0:45 min, 72 °C/1:30 min), 72 °C/10:00 min

diese Arbeit

oMP_CirA1 oMP_CirA2

5’-GTATGCAGAATAAAGCCCTGCTAAAC-3’ 5’-AAAGAGCCGAGAAATATCGTAGATGTG-3’ Produktgröße 161 bp Primer zum Nachweis des Virulenzmarkers cirA PCR-Programm: 94 °C/3:00 min, 32 x (94 °C/1:00 min, 62 °C/0:45 min, 72 °C/1:30 min), 72 °C/10:00 min

diese Arbeit

oPhage13_1 oPhage13_2

5’-GCTTGCGGGTAATCTGTTGT-3’ 5’-AGAATCAACCTCAGCCGAAA-3’ Produktgröße 301 bp Primer zur gleichzeitigen Überprüfung auf das Vorhandensein der beiden phagenassoziierten Gene PCR-Programm: 94 °C/3:00 min, 32 x (94 °C/1:00 min, 55 °C/0:45 min, 72 °C/0:30 min), 72 °C/10:00 min

diese Arbeit

oPhage8_1 oPhage8_2

5’-GATCTCACCCGAGCATCAC-3’ 5’-GCTGGGGTGTACGATAATGC-3’ Produktgröße 266 bp Primer zur Überprüfung auf das Vorhandensein auf Gen des hypothetischen Proteins HPS_09285 PCR-Programm: 94 °C/3:00 min, 32 x (94 °C/1:00 min, 55 °C/0:45 min, 72 °C/0:30 min), 72 °C/10:00 min

diese Arbeit

oHhdA4 oHhdB1

5’-TTACACTGGGATTTGTCACC-3’ 5’-ATAATCCCTCGCCTGCTGTT-3’ Produktgröße 3368 bp Bindungsstellen in den Genen hhdBA PCR-Programm: 94 °C/3:00 min, 32 x (94 °C/1:00 min, 55 °C/0:45 min, 72 °C/4:00 min), 72 °C/10:00 min

diese Arbeit

Hps-f Hps-r

5’-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3’ 5’-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3’ Produktgröße 821 bp Primer zum Speziesnachweis von H. parasuis

PCR-Programm: 94 °C/3:00 min, 32 x (94 °C/1:00 min, 59 °C/0:45 min, 72 °C/1:00 min), 72 °C/10:00 min

(OLIVEIRA et al. 2001)


Primerpaar Beschreibung Quelle

5_8SR LR7

5’-TCGATGAAGAACGCAGCG-3’ 5’-TACTACCACCAAGATCT-3’ Produktgröße variabel Universelle Primer zur Spezifitätsüberprüfung der Primer für die Multiplex-PCR, basierend auf der 60S rDNA von Eukaryoten PCR-Programm: 94 °C/3:00 min, 32 x (94 °C/1:00 min, 53 °C/0:45 min, 72 °C/2:00 min), 72 °C/10:00 min

http://www.biology.duke.edu/ fungi/mycolab/ primers.htm

oRNA_1 oRNA_2

5’-TGCCAGCAGCCGCGGTAATA-3’ 5’-TGACGGGCGGTGTGTACAAG-3’ Produktgröße 892 bp Universelle Primer zur Spezifitätsüberprüfung der Primer für die Multiplex-PCR, basierend auf der 16S rDNA von Bakterien PCR-Programm: 94 °C/3:00 min, 32 x (94 °C/1:00 min, 57 °C/0:45 min, 72 °C/1:30 min), 72 °C/10:00 min

diese Arbeit

tbpA33 tbpA 55

5’-AAGCTTGAAACTAAGGTACTCTAA-3’ 5’-TTAGCCTTGCTCTTCTTAGCC-3’ Produktgröße 1,9 kb Primer zum Einsatz in der RFLP-PCR (Amplifzierung eines Produktes aus dem Gen tbpA) PCR-Programm: 94 °C/10:00 min, 36 x (94 °C/1:00 min, 50 °C/0:45 min, 72 °C/2:30 min), 72 °C/10:00 min

(DEL RIO et al. 2006a)

M13 forward M13 reverse

5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’ 5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’ Bindestelle in Plasmiden, Amplifizierung des Inserts aus einem Plasmid PCR-Programm: 94 °C/3:00 min, 32 x (94 °C/1:00 min, 55 °C/0:45 min, 72 °C/3:00 min), 72 °C/10:00 min

Amersham Bioscience

oPorin1 oPorin2

5’-TCAACAGGTGGTCACACTAA-3’ 5’-TAGCACCTAACGTCAAACCT-3’ stammabhängige Produktgröße (ca. 350-430 bp) Primer mit der Bindestelle im Gen des OMP P2 Proteins von H.parasuis PCR-Programm: 94 °C/3:00 min, 32 x (94 °C/1:00 min, 55 °C/0:45 min, 72 °C/0:30 min), 72 °C/10:00 min

diese Arbeit

2.2.1.3.1 Restriction Fragment Length Polymorphism-PCR

In der Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) -PCR wurde mittels H. pa-

rasuis speziesspezifischer Primer (tbpA33 und tbpA55, DE LA PUENTE REDONDO

et al. 2000) ein 1,9 kb großes Fragment aus dem Gen tbpA amplifiziert. An-

schließend erfolgte ein Verdau mit dem Restriktionsenzym RsaI sowie ein Vergleich

des entstandenen Bandenmusters in der Gelelektrophorese.


2.2.1.4 Primer

Die Primerauswahl erfolgte mit der Internet-Software „Primer3“ (http://fokker.wi.mit.

edu/primer3/input.htm, Version 0.4.0). Die Primer wurden von Invitrogen® oder bio-

mers.net GmbH bzogen.

Die vergewendeten Primer sind in Tabelle 1 aufgelistet.

2.2.1.5 Agarosegel-Elektrophorese

Die optische Darstellung von DNA erfolgte im Agarosegel per Elektrophorese

(SAMBROOK et al. 1989). Für analytische Zwecke wurden Gele in der gewünschten

Agarosekonzentration (größere Fragmente ab 1000 bp mit 0,8 %, kleinere Fragmen-

te unter 1000 bp mit 1,5 % oder 2 % Agarose) mit 0,5 x TBE-Puffer (s. Anhang Tab.

13) verwendet. Pro ml Gel bzw. Laufpuffer wurden 200 ng Ethidiumbromid zugesetzt.

Je nach gewünschter Laufgeschwindigkeit und -weite variierten die elektrischen

Spannungen sowie die Laufzeiten, in der Regel betrugen sie 180 V und 60 Minuten9.

Die Dokumentation erfolgte mit dem Gerät Gel Doc® und der Software Quantity One®

(Version 4.6.1) von BioRad (München, Deutschland), die anschließende Bildbear-

beitung mit dem Picture Manager® von Microsoft (Unterschleißheim, München,

Deutschland).

2.2.1.6 Polyacrylamidgel-Elektrophorese

Bei sehr geringen Fragmentgrößen (Herstellung der Adaptoren: Länge bis 24 bp)

wurde die Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE) verwendet (s. Anhang Tab. 14).

Die Kammer10 wurde mit 1 x TBE-Puffer aufgefüllt und die DNA-Fragmente bei 120 V

und 80 mA über 90 Minuten aufgetrennt. Die Färbung des Gels erfolgte mit

Ethidiumbromid (200 ng/ml TBE-Puffer), die Dokumentation analog zur Agarosegel-

Elektrophorese (s. C2.2.1.5).

9 Gelsystem Maxi M

®, peQLab, Erlangen, Deutschland

10 Minigel-Twin

®, Biometra, Göttingen, Deutschland


2.2.1.7 Koloniegel

Für Koloniegele wurde Koloniematerial in 30 µl vorgewärmtem Lysepuffer (40-45 °C)

resuspendiert (s. Anhang Tab. 15), für fünf Minuten bei derselben Temperatur

erwärmt und anschließend fünf Minuten auf Eis gestellt. Nach einem einminütigen

Zentrifugationsschritt bei 14.000 g erschien der Detritus als Pellet. Vom Überstand

wurden 15-30 µl auf ein TBE-Gel aufgetragen.

2.2.1.8 Klonierung

Bei Standard-Klonierungen von PCR-Produkten wurde das StrataClone PCR Cloning

Kit® (Stratagene, La Jolla, USA) nach Anweisung des Herstellers verwendet.

Für Klonierungen ohne Zuhilfenahme eines Kits wurde nach Anzucht einer ent-

sprechenden Zelllinie zunächst das gewünschte Plasmid mittels Alkalilysis-Verfahren

(s. C2.2.1.2) präpariert. Nach Linearisierung durch einen Restriktionsenzymverdau

(s. C2.2.1.8.1) und Behandlung des Vektors mit alkalischer Phosphatase (Antarctic

Phosphatase®) wurde das DNA-Fragment durch T4-DNA-Ligase® in den Vektor

integriert (s. C2.2.1.8.2) und dieser in chemisch kompetente Zellen transformiert (s.

C2.2.1.9).

2.2.1.8.1 Restriktionsenzymverdau

Der Verdau von DNA durch Restriktionsenzyme erfolgte nach der Methode von

Sambrook in Ansätzen von bis zu 100 µl (SAMBROOK et al. 1989). Pro 100 µl

Ansatz wurden maximal 10 µg DNA eingesetzt und die Restriktionsenzyme mit dem

entsprechenden Puffer nach Angaben des Herstellers verwendet. Anschließend

wurde das Volumen mit Aqua dest. auf 100 µl aufgefüllt. Die Inkubation erfolgte für

drei bis vier Stunden oder über Nacht bei der durch das Enzym vorgegebenen

Temperatur. Der Erfolg des Verdaus wurde per Agarosegel-Elektrophorese überprüft

und die DNA im Anschluss gegebenenfalls aufgereinigt (NucleoSpin® Extract II-Kit,

Macherey-Nagel, Düren, Deutschland).


2.2.1.8.2 Ligation

Mittels T4-DNA-Ligase® wurden doppelsträngige DNA-Abschnitte mit zueinander

komplementären überstehenden Enden (3‘- mit 5‘-Ende) kovalent verbunden

(SAMBROOK et al. 1989). Hierbei handelte es sich entweder um lineare DNA oder

um einen zirkulären Vektor, in welchen gezielt Fremd-DNA eingebracht wurde. Ein

25 µl-Ansatz bestand aus maximal 2,5 µg DNA, 2,5 µl 10 x Ligasepuffer und 0,75 µl

Ligase und wurde mit Aqua dest. aufgefüllt. Zur Insertion eines Fragments in einen

Vektor wurde dieser vorher per Restriktionsenzymverdau linearisiert und mit

Antarctic Phosphatase® behandelt. Das Mengenverhältnis von Vektor- und Insert-

DNA betrug in einem ersten Ansatz ca. 1:2, in einem zweiten Ansatz ca. 1:5. Ein

dritter Ansatz wurde ohne Insert mitgeführt, um die Behandlung mit alkalischer

Phosphatase zu überprüfen, in einem vierten Ansatz fehlte die T4-DNA-Ligase®, um

den Restriktionsenzymverdau zu kontrollieren.

Die Inkubation geschah über Nacht bei 16 °C im Wasserbad11. Zur Transformation in

E. coli wurde die Hälfte des Ligationsansatzes eingesetzt.

2.2.1.9 Transformation

In dieser Arbeit wurden Plasmide mit der Methode der chemischen Transformation in

E. coli Zellen eingebracht (SAMBROOK et al. 1989). Bei Arbeiten mit dem Strata-

Clone PCR Cloning Kit® (Stratagene, La Jolla, USA) wurde der Transformations-

schritt nach Anweisung des Herstellers durchgeführt.

Für Transformationen ohne Cloning Kit wurden chemokompetente E. coli Zellen auf

Eis aufgetaut und der 25 µl Ligationsansatz (Vektor mit Insert) zu mindestens 100 µl

Zellsuspension gegeben. Die Komponenten wurden vorsichtig vermischt und für 60

Minuten auf Eis inkubiert. Nach einem Hitzeschock bei 42 °C für drei Minuten12

wurden sie erneut für ein bis zwei Minuten auf Eis gestellt. Nach Zugabe von 200 µl

LB-Medium regenerierten die Zellen für 60 Minuten bei 37 °C im Schüttelinkubator13

11

RE104, Lauda GmbH & CO. KG, Lauda-Königshofen, Deutschland

12 Labtherm

®, Liebisch, Bielefeld, Deutschland

13 innova 4300, NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC, Edison, USA


und exprimierten die auf dem Plasmid befindlichen Antibiotika-Resistenzmarker. Das

Ausplattieren erfolgte auf LB-Agar mit dem entsprechenden Antibiotikazusatz.

2.2.1.10 Herstellung chemokompetenter E. coli Zellen

Zur Herstellung chemisch kompetenter E. coli Zellen nach der Methode von Sam-

brook wurde zunächst der gewünschte Stamm auf LB-Agar ausplattiert und über

Nacht bei 37 °C bebrütet (SAMBROOK et al. 1989). Eine Einzelkolonie diente am

Folgetag darauf als Ausgangsmaterial zur Beimpfung von 1,5 ml LB-Flüssigmedium.

Dieses wurde als Standkultur erneut bei 37 °C über Nacht bebrütet. Gleichzeitig

wärmten über Nacht 150 ml LB-Medium mit 20 mM MgCl2 auf 37 °C vor. Diese

größere Menge Medium wurde am nächsten Tag mit der Standkultur beimpft und als

Schüttelkultur bei 37 °C bis zu einer OD66014 von 0,3-0,4 bebrütet. Die Probe wurde

nun 1-2 min auf Eis gestellt und anschließend in der vorgekühlten Zentrifuge (4 °C)

pelletiert (10 min, 7.000 g). Nach Verwerfen des Überstandes erfolgte die Resuspen-

sion des Pellets in 5 ml eisgekühlter TFB1-Lösung (s. Anhang Tab. 16). Einer

Inkubation auf Eis für mindestens 90 Minuten folgte ein erneutes Pelletieren bei 4 °C

(10 min, 7.000 g) und eine Resuspension des Pellets in 5 ml eiskalter TFB2 Lösung

(s. Anhang Tab. 16). Nach einer Inkubation auf Eis von maximal 30 Minuten wurde

die Lösung in ebenfalls auf Eis stehende Reagiergefäße aliquotiert (jeweils ca. 250 µl

pro Gefäß) und bei -70 °C eingefroren.

2.2.1.11 Repräsentative Differenzanalyse

In dieser Arbeit wurde eine modifizierte Form der 1993 von Lisitsyn et al. veröf-

fentlichten Methode angewendet (s. Abb. 1), um das Genom eines H. parasuis

Referenzstammes von dem eines zweiten zu subtrahieren, spezifische Sequenzen

des letzteren zu erhalten und selektiv zu amplifizieren (LISITSYN et al. 1993). Hierfür

wurden Referenzstämme mit unterschiedlichen Eigenschaften ausgewählt und das

Genom des als apathogen geltenden Serotyps 11 („Driver“) vom Genom der inva-

siven Stämme 5 bzw. 12 („Tester“) subtrahiert.

14

Ultraspec III, Pharmacia LKB, Freiburg, Deutschland


Chromosomale DNA beider Stämme wurde in getrennten Ansätzen einem Restrik-

tionsenzymverdau mit einer Kombination aus den Enzymen DpnI und DpnII unter-

zogen. Die generierten Fragmente wiesen einen 5’-GATC-Überhang auf. Die Präzipi-

tation der DNA erfolgte durch Zugabe von 1/10 Vol. 3M Natrium-Acetat (v/v), pH 5,2

und 2,5 Vol. 96 %igem Ethanol (v/v) mit anschließendem Kühlstellen bei -20 °C für

mindestens zwei Stunden. Die DNA wurde bei Raumtemperatur für 20 Minuten

abzentrifugiert (16.000 g), mit 500 µl 70 %igem Ethanol gewaschen, erneut für zehn

Minuten bei 16.000 g zentrifugiert und ebensolange luftgetrocknet. Die Resuspension

erfolgte in ca. 50 µl Aqua dest..

Aus Oligonukleotiden wurden teilweise doppelsträngige Adaptoren hergestellt, um

sie an die DNA-Fragmente zu ligieren. Jeweils 20 µl der 100 µM konzentrierten

Primer RBgl12 und RBgl24 wurden mit 10 µl 10 x Ligasepuffer vermischt und hybri-

disierten im Thermocycler. Dieser senkte die Temperatur in 10 minütigen Intervallen

von 94 °C, über 67 °C, 42 °C, 37 °C und 22 °C auf 16 °C ab. Das korrekte Annealing

der komplementären Primerbereiche wurde in einem 18 %igen TBE-Acrylamidgel (s.

Anhang Tab. 14) überprüft. Das überhängende 5‘-Ende des 12mer Primers war kom-

plementär zu dem durch den Restriktionsenzymverdau entstandenen Überhang der

chromosomalen DNA, die restlichen acht Basen waren komplementär zum 3‘-Ende

des 24mer Primers.

Für die Ligation der Adaptoren an die Tester-DNA wurden jeweils 25 µl Adaptor mit

25 µl aufgereinigtem Verdau gemischt und 2 µl 25 mM ATP und 1 µl T4-DNA-Liga-

se® zugefügt. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 37 °C, die Präzipitation durch

Zugabe von Natrium-Acetat und Ethanol (s.o.). Je 2,5 µl des Ansatzes dienten als

Template für eine PCR mit RBgl24 (s. Tab. 1). Die DNA-Taq-Polymerase® wurde erst

nach Erwärmen im Thermocycler15 auf 72 °C hinzugefügt und zunächst für fünf Mi-

nuten bei dieser Temperatur inkubiert, um ein Auffüllen der 5‘-Überhänge zu ermög-

lichen. Nach Beendigung der PCR wurden die Ansätze gepoolt und einer Natrium-

Acetat-Ethanol-Präzipitation (s. o.) unterzogen. Die Resuspension erfolgte in 100 µl

Aqua dest.

15

primus 96 advanced®, peQLab, Erlangen, Deutschland


Ein Gemisch aus 20 µg Driver und 20 bzw. 200 ng Tester wurde nach einer Natrium-

Acetat-Ethanol-Präzipitation in 4 µl PCR-Puffer resuspendiert. Nach Überschichtung

mit Mineralöl wurde die Probe im Thermocycler auf 95 °C erhitzt, dann um 1 µl einer

5 M NaCl-Lösung ergänzt und für 20 Stunden bei 67 °C im Thermocycler inkubiert.

Nach Zugabe von 20 µl Aqua dest. dienten 2,5 µl des Ansatzes und dessen Ver-

dünnungen (1:10, 1:100 und 1:1000) als Template in einer PCR mit RBgl24. Die

Analyse der Produkte erfolgte in einem 1,5 %igen Agarosegel.

Verdau mit Sau3A1Driver (11) Tester (5)

Ligation von Adaptoren

Mischen,

Denaturieren

& Inkubieren

Auffüllen der Enden und PCR mit

testerspezifische Fragmente

Abb. 1 Schemazeichnung Repräsentative Differenzanalyse (modifiziert)


2.2.1.12 Markieren von Gensonden mit 32P-dCTP

Zur radioaktiven Markierung von DNA wurde 32P-dCTP verwendet (FEINBERG u.

VOGELSTEIN 1983). Die eingesetzten 20-30 ng DNA wurden in 15,5 µl Aqua dest.

resuspendiert, für fünf Minuten bei 100 °C denaturiert und anschließend auf Eis ge-

stellt. Bei den weiteren Reagenzien handelte es sich um 5 µl OLB (s. Anhang Tab.

17), 1 µl acetyliertes BSA (10 mg/ml), 1 µl T4-DNA-Polymerase® (Klenow-Fragment)

und 2,5 µl des Isotops (32P-dCTP, 3000 Ci/mmol). Der Ansatz inkubierte für vier bis

fünf Stunden bei Raumtemperatur, bevor ihm 100 µl Stopp-Lösung (s. Anhang Tab.

17) hinzugefügt wurden. Vor Benutzung der Gensonde erfolgte ein Aufkochen für

fünf Minuten bei 100 °C16 mit anschließendem Herunterkühlen auf Eis für ca. eine

Minute. Pro Hybridisierung wurden 50-70 µl der Sonde eingesetzt.

2.2.1.13 Southern Blot

Im Southern Blot wird zunächst die in einem Agarosegel aufgetrennte DNA auf eine

positiv geladene Nylonmembran transferiert (Southern Transfer) und diese an-

schließend zur Detektion spezifischer DNA-Sequenzen mit einer Gensonde inkubiert

(Southern Hybridisierung).

2.2.1.14 Southern Transfer

Der Southern Transfer überträgt mittels Gelelektrophorese aufgetrennte DNA von

einem TBE-Gel auf eine positiv geladene Nylonmembran.

Das Agarosegel wurde zur Denaturierung der DNA für eine Stunde in drei- bis vier-

mal gewechselter Lösung 1 (1,5 M NaCl, 0,5 NaOH) geschwenkt. Das Gesamt-

volumen der eingesetzten Schwenkflüssigkeit betrug ca. das Zehnfache des Gelvolu-

mens. Die Neutralisation erfolgte für eine Stunde in Lösung 2 (1 M Tris-HCl, pH 8.0,

1,5 M NaCl), welche in der gleichen Gesamtmenge eingesetzt und ebenfalls drei- bis

viermal ausgewechselt wurde. Der Aufbau der Transfereinrichtung bestand aus ei-

nem Unterbau, welcher in eine Plastikschale gelegt wurde. Diesen bedeckten zwei

Lagen Filterpapier, wovon eine über den Unterbau hinaus bis in die Schale reichte.

16

Multi Block® Heater, LAB-LINE, Kleinfeld-Labortechnik GmbH, Gehrden, Deutschland


Die Schale wurde mit 10 x SSC-Puffer befüllt (Laufpuffer) und das Gel mit der

Unterseite nach oben auf das Filterpapier gelegt. Als nächstes wurde die mit Aqua

dest. angefeuchtete Nylonmembran luftblasenfrei auf das Gel gelegt, bedeckt von

zwei weiteren Schichten trockenem Filterpapier. Die obersten Lagen wurden durch

ein 3-5 cm dickes Kissen aus Papierhandtüchern gebildet, welches das Saugkissen

darstellte und mit einem Gewicht (ca. 500 g) beschwert wurde. Die Blottingdauer war

abhängig von der Anzahl der zu erzeugenden Membranen: Für eine Membran wurde

der Blot über Nacht angesetzt, bei zwei Membranen wurde die erste nach zwei

Stunden gewechselt und die zweite über Nacht in der Vorrichtung belassen, bei drei

Membranen wurde die erste Membran nach zwei Stunden gegen die zweite aus-

getauscht, die zweite nach einer weiteren halben Stunde und die dritte verblieb über

Nacht. Die Entnahme der Membranen begann jeweils mit dem Entfernen der Auf-

lagen und der gemeinsamen Abnahme von Gel und Membran. Nach dem Umdrehen

des Gels wurden die Taschen mit Bleistift auf der Membran vermerkt und diese dann

vom Gel abgezogen. Als zusätzliche Markierung fehlte sämtlichen Membranen die

linke untere Ecke. Die Membran wurde für fünf Minuten in 5 x SSC geschwenkt und

in Papierhandtüchern getrocknet. Das anschließende Backen erfolgte für eine Stun-

de bei ca. 90 °C17.

2.2.1.15 Southern Hybridisierung

Die Membran eines Southern Transfers wird in der Southern Hybridisierung mit einer

radioaktiv markierten Gensonde inkubiert (SAMBROOK et al. 1989; SOUTHERN

1975).

Die im Southern Transfer erzeugte Membran wurde in einer Glasflasche bei stän-

diger Rotation für zwei Stunden bei 60 °C mit ca. 50 ml Hybridisierungspuffer (s.

Anhang Tab. 18) prähybridisiert18. Nach dem Abgießen der Flüssigkeit erfolgte die

Zugabe einer frischen Menge (50 ml) Hybridisierungspuffer, 50-70 µl frisch dena-

turierter Gensonde und der Positivkontrolle. Die Hybridisierung erfolgt bei 60 °C über

Nacht, ebenfalls bei sich stets drehendem Rotor. Am nächsten Tag wurde die Mem-

17

Hitzeofen, Boskamp GmbH, Hersel, Deutschland

18 Mini Hybridisation Oven, Appligene, Heidelberg, Deutschland


bran nach Abgießen der Flüssigkeit zunächst zwei Mal für 30 Minuten mit einer Lö-

sung aus 3 x SSC und 0,5 % SDS gewaschen. Nach der Überprüfung der Strah-

lungsintensität wurde entweder mit anderer Stringenz erneut gewaschen (1 x SSC,

0,5 % SDS oder 0,1 x SSC, 0,5 % SDS) oder sofort ein Röntgenfilm exponiert. Die

Beschriftung der Membran erfolgte mit einem Radiographiestift. Die Membran wurde

zuunterst in eine Röntgenfilmkassette gelegt, darauf der bei Rotlicht eingelegte Rönt-

genfilm und zuoberst eine Verstärkerfolie. Die Exposition fand bei -70 °C statt. Die

Zeitdauer hing von der Aktivität des Blots ab und betrug ca. drei bis 48 Stunden.

2.2.1.16 DNA-Sequenzierung und Sequenzanalyse

Die Sequenzierung von DNA-Proben wurde durch die Firma Seqlab aus Göttingen,

Deutschland, an einem ABIPRISM-Sequenziergerät (Modell 3700) mit der Ketten-

abbruchmethode nach Sanger (SANGER et al. 1977) durchgeführt. Zur Sequen-

zierung größerer Abschnitte wurde „Primer-Walking“ verwendet. Die Analyse der Da-

ten geschah mittelst BLASTx, BLASTn und dem Alignprogramm der Homepage des

National Centre for Biotechnology Information (NCBI, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov,

Version 2.2.18+).

2.2.2 Arbeiten mit RNA

2.2.2.1 Präparation von RNA

H. parasuis wurde in einer Schüttelkultur (BHI-Medium mit Serumzusatz und EIVX, s.

C2.1.2) bei 37 °C bis zu einer OD60019 von 0,4 inkubiert. Die RNA wurde mit dem

RNeasy Mini Kit® (Qiagen, Hilden, Deutschland) aus 5 ml der Kultur nach den Anwei-

sungen des Herstellers präpariert. Zur DNAse Behandlung wurde Turbo-DNAse® (s.

Anhang Tab. 9) verwendet.

2.2.2.2 Reverse Transkriptase-PCR

Der Mastermix für die RT-PCR enthielt 5 µg RNA und 50 pmol Random-Hexamer-

Primer. Er wurde auf zwei Ansätze verteilt, wovon nur einem Reverse Transkriptase

zugegeben wurde. Nach einer Inkubation bei 37 °C für 60 Minuten wurde eine PCR

19

Ultraspec III, Pharmacia LKB, Freiburg, Deutschland


durchgeführt, wofür das cDNA-Template sowie der Kontrollansatz in einer 1:100-

Verdünnung mit Aqua dest. verwendet wurden. Die eingesetzten Primer waren spe-

zifisch für die zu überprüfenden RDA-Fragmente (s. Tab. 1). Die PCR wurde mit 0,25

Units GoTaq® und über 30 Zyklen durchgeführt, dabei wurden 5 µl der angesetzten

Verdünnungen als Template eingesetzt (PCR-Bedingungen: 94 °C/3:00 min, 30 x [94

°C/0:30 min, 55 °C/1:00 min, 72 °C/1:30 min], 72 °C/10:00 min). Alle Ansätze wurden

in dreifacher Ausführung durchgeführt.

2.2.3 Arbeiten mit Proteinen

2.2.3.1 Eindimensionale SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese

Zur Darstellung von Proteinen wurden diese in einem 10 %igen Polyacrylamidgel

(eindimensionale SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese, SDS-PAGE) aufgetrennt

(LAEMMLI 1970). Die Herstellung des Gels sowie des Laufpuffers erfolgte nach dem

Rezept im Anhang, Tabelle 19. Die Slots wurden mit 15-20 µl Probe (s. C2.2.3.2)

beladen und der Laufpuffer 1 x eingesetzt. Als Größenstandard wurden 2-3 µl des

Pageruler Protein Ladder® (gefärbt oder ungefärbt) mitgeführt. Zur Ansammlung der

Proteine im Sammelgel erfolgte initial ein 20 minütiger Lauf bei 80 V, gefolgt von

einem 60-80 minütigen Lauf bei 130 V zur Auftrennung der unterschiedlichen

Proteinfraktionen. Die Färbung der Gele erfolgte mit einer Coomassie-Blau-Färbung

(s. Anhang Tab. 19). Das Gel wurde den Glasplatten entnommen und in einer

Plastikschale für ca. eine Stunde mit der Färbelösung auf dem Schütteltisch20 inku-

biert. Nach Abgießen der Lösung folgte ein Schwenken in Entfärberlösung (s. An-

hang Tab. 19), wobei diese drei- bis viermal gewechselt wurde. Die Dokumentation

der Gele erfolgte mittels Durchlichtscanner, die Feststellung der Bandengrößen mit

der Analysesoftware Quantity One® (Version 4.6.1, BioRad, München, Deutschland).

2.2.3.2 Ganzzelllysate

Zur Vorbereitung der Proben von Ganzzelllysaten wurde eine ca. stecknadelkopf-

große Menge Koloniematerial einer über Nacht bei 37 °C bebrüteten Kochblut-NAD-

Platte (5 % CO2) in 100 µl Wasser resuspendiert und eine Teilmenge anschließend

20

Landgraf Hannover, Deutschland


1:1 mit 2 x Spaltpuffer (s. Anhang Tab. 19) versetzt. Nach einer Erhitzung für zwei

Minuten auf 100 °C21 waren die Proben ladefertig.

2.2.3.3 Massenspektrometrie

Die Probenaufbereitung erfolgte für beide Formen der Massenspektrometrie ein-

heitlich nach der Methode nach Wilm und Mann (SHEVCHENKO et al. 1996). Alle

flüssig verwendeten Chemikalien wurden in Millipore-Wasser resuspendiert. Zu-

nächst wurden die gewünschten Proteinbanden mit einem Skalpell aus dem Pro-

teingel geschnitten und dabei möglichst wenig des umgebenden Gels mit entfernt.

Um die Oberfläche zu erhöhen, wurde das Gelstück in möglichst kleine Stücke

zerschnitten und in ein Eppendorf-Reagiergefäß überführt. Zur vollständigen Entfär-

bung erfolgte ein erster Waschschritt mit ca. 500 µl 50-100 mM Ammoniumbicar-

bonat, die Waschlösung wurde anschließend verworfen. Es folgten zwei weitere

Waschungen mit ca. 500 µl 50 nM Ammoniumbicarbonat/50 % Acetonitril mit jeweils

30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur und drei- bis viermaligem Vortexen22. Die

Waschlösungen wurden ebenfalls verworfen. Die Gelstücke wurden nun mit 100 µl

100 % Acetonitril überschichtet und für fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

Von den nun geschrumpften und weißlichen Gelstücken wurde die Flüssigkeit abge-

nommen und verworfen. Durch Inkubation bei 37 °C oder Behandlung in der Vaku-

umzentrifuge23 wurde die vollständige Trocknung der Gelstücke erreicht. Zur Redu-

zierung des Cysteins erfolgte nach Zugabe von 30 µl eines 10 mM DTT/100 nM

Ammoniumbicarbonat-Puffers eine Inkubation im Wasserbad bei 56 °C für 60 Minu-

ten. Anschließend kamen zur Alkylierung der Cysteinreste 30 µl einer 55 mM Iod-

acetamid/100 mM Ammoniumbicarbonat-Lösung hinzu und die Probe wurde im Dun-

keln bei 25 °C für 45 Minuten inkubiert. Die Lösungen wurden abgenommen und

verworfen. Ein weiterer Waschschritt erfolgte bei Raumtemperatur für 10 Minuten mit

100 µl 50 mM Bicarbonat, welches im Anschluss wieder abgenommen wurde. Die

Trocknung der Proben erfolgte durch Zugabe von Acetonitril und einer Speedvac-

21

Labtherm®, Liebisch, Bielefeld, Deutschland

22 lab dancer, IKA

® GmbH & Co. KG, Staufen, Deutschland

23 DNA Speed Vac

® DNA 110, Savant Instruments Inc., New York, USA


Behandlung analog zu den oben beschriebenen Schritten. Die Schritte der Bicarbo-

natwaschung und der Trocknung wurden noch einmal wiederholt, bevor die Proteine

durch Zugabe einer 20 µg/ml Trypsin enthaltenden und in 25 mM Ammoniumbi-

carbonat gepufferten Lösung verdaut wurden. Die Menge war abhängig davon, wie

viel Flüssigkeit die Gelstücke aufsaugten (3-15 µl). Nach fünf Minuten Inkubation

wurde noch einmal so viel 25 mM Bicarbonat-Lösung dazugegeben, dass die Proben

vollständig bedeckt waren, die Gefäße dann verschlossen, mit Parafilm abgedichtet

und für 16 Stunden bei 37 °C inkubiert. Der Überstand wurde aufbewahrt und die

Gelstücke mit einer Lösung aus 0,5 % Ameisensäure und steigenden Acetonitrilkon-

zentrationen im Ultraschallbad24 inkubiert. Im ersten Schritt enthielt die Lösung 20 %,

im zweiten 50 % und im dritten 80 % Acetonitril. Zugegeben wurden jeweils 30-50 µl

und die Inkubationsdauer betrug pro Konzentration 30 Minuten. Vor dem Abnehmen

der Überstände wurden die Proben stets gevortext und anzentrifugiert. Die Überstän-

de der Extraktionsschritte wurden mit dem ersten Überstand vereint und in einem

Reagiergefäß in der Speedvac getrocknet.

2.2.3.4 Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-of-Flight-Mass Spectrometry

Die massenspektrometrische Untersuchung mittels Matrix Assisted Laser Desorp-

tion/Ionisation Time-of-Flight-Mass Spectrometry (MALDI-TOF, Voyager-DE® Pro,

Applied Biosystems, Forster City, USA) wurde am Institut für Mikrobiologie der

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt. Bei dieser Analyse werden

Probe und Matrix mit einem Laserstrahl beschossen, wobei die Matrix verdampft und

die Probenmoleküle mitreißt. Letztere wird bei diesem Vorgang ionisiert und die

Masse der Ionen anhand ihrer Flugzeit durch ein elektronisches Feld berechnet.

Für Untersuchungen mittels MALDI-TOF-MS wurden die aufgereinigten und ver-

dauten Proben zusammen mit einer Matrix auf einen Probenträger aufgetragen. Die

Matrix (α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure, ACHC) wurde zunächst in 50 % Acetonitril/0,1

% Trifluoressigsäure in der Konzentration von 10 mg/ml angesetzt, ca. fünf Minuten

gevortext und zur Entfernung eventueller Verunreinigungen noch einmal für fünf

24

3210 Branson, G. Heinemann, Schwäbisch-Gmünd, Deutschland


Minuten abzentrifugiert. Die obere Hälfte des Überstandes wurde im Anschluss auf 5

mg/ml verdünnt. Der Größenstandard bestand aus 1 µl Kalibriermix (CalMix1® und

CalMix2®) und 24 µl Matrix, wovon jeweils 0,5 µl neben jeder einzelnen Probe auf-

getragen wurden. Die eingedampften Proben wurden in 3 µl 50 % Acetonitril/0,1 %

Ameisensäure/50 % Aqua dest. resuspendiert und eine Teilmenge 1:1 mit der Matrix

verdünnt (maximal 2 µl Gesamtmenge) und zügig auf den Probenträger aufgetragen.

Nach dem Auskristallisieren der Proben wurden die Messungen mithilfe des Pro-

gramms Voyager Control Panel® durchgeführt. Pro Probe wurden zunächst drei Mes-

sungen mit dem Standard durchgeführt und addiert, dann zehn Messungen der

Probe.

Die Korrektur und Analyse der Spektren erfolgte mit dem Programm Data Explorer®

V 4.8 (Applied Biosystems, Forster City, USA), welches die Spektren zunächst korri-

gierte (Entfernung des Hintergrundrauschens, Herausrechnen des hinzugefügten

Trypsins, Zusammenfügen der Mehrfachdaten einzelner Isotope eines Peptids, Kali-

brierung anhand des mitgemessenen Größenstandards) und Listen mit Peptidmas-

sen ausgab. Diese Angaben wurden über den Peptide Mass Fingerprint Algorithmus

der Mascot Homepage (www.matrixscience.com) mit der NCBI Datenbank abge-

glichen. In den Einstellungen wurde die Datenbank NCBI festgelegt und keine ausge-

lassenen Schnittstellen durch das Trypsin erlaubt. Durch die Aufbereitung der Pro-

ben ergaben sich die Einstellungen der Modifikationen: als feste Modifikation wurde

„Carbamidomethyl (C)“ eingestellt, hierbei handelte es sich um eine durch den Iod-

acetamidschritt bedingte Methylierung des Cysteins. Als variable Modifikation wurde

„Oxidation (M)“ gewählt, da eine Oxidierung des Methionins nicht regelmäßig statt-

fand. Die Peptidtoleranz wurde auf 0,2 festgesetzt.

2.2.3.5 Electro-Spray Injection Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry

Die Untersuchungen der Proteinproben mittels Electro-Spray Injection Quadrupole

Time-of-Flight Mass Spectrometry25 (ESI Q-TOF MS) wurden am Institut für Mikro-

biologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule durchgeführt. Hierbei werden zunächst

25

Q-TOF Ultima®, Waters, Milford, USA


die Peptide der Proben ionisiert und ihre Masse anhand ihrer Fluggeschwindigkeit

detektiert. Optional erfolgt in einem zweiten Schritt ein Beschuss mit Argon, wodurch

die Peptide fragmentieren und ihre Aminosäuresequenz ermittelt werden kann. Zur

Identifikation der Proteine wurde das Programm des ProteinLynx Globals Server®

(Waters) verwendet, welches Vergleiche mit der Datenbank des NCBI anstellt.

2.3 Infektionsversuche an Schweinen

In dieser Studie wurde ein Infektionsversuch mit dem Referenzstamm von Serotyp

12 an fünf Wochen alten Ferkeln durchgeführt und dabei die intratracheale Infektion

mit der per Aerosol verglichen.

2.3.1.1 Zeitplan

Tag -4: Ankunft der Ferkel, Wiegen, Markieren und Gruppeneinteilung

Tag -3: Entnahme von Blutproben zur Untersuchung auf Antikörper gegen H. parasuis sowie von Nasentupfern und Tonsillenkratzproben zur Unter-suchung auf H. parasuis

Tag 0: Infektion der Ferkel mit H. parasuis, Referenzstamm Serotyp 12

Tag 8: Euthanasie und Sektion der Kontrollgruppe

Tag 9: Euthanasie und Sektion der beiden Versuchsgruppen

2.3.1.2 Herkunft und Unterbringung der Schweine

Von den zwölf eingesetzten Ferkeln waren sechs weiblich und sechs männlich. Die

männlichen Tiere stammten von einer vor sechs Monaten aus Frankreich zugekauf-

ten Sau ab, welche zu diesem Zeitpunkt frei von H. parasuis war. Seit Ankunft im Be-

trieb wurde sie nach vierwöchiger Quarantäne in den eigenen Bestand integriert. Die

weiblichen Ferkel stammten von einer in dem Betrieb selbst gezogenen Sau ab. Alle

Ferkel wiesen zum Zeitpunkt der Infektion keine Antikörper gegen H. parasuis auf (s.

C2.3.1.9). Die Einteilung der Tiere in drei Gruppen erfolgte zufällig, jede Gruppe be-

stand aus vier Tieren. Die intratracheal infizierten Tiere waren zusammen mit den

aerosolinfizierten Tieren untergebracht, die Kontrollgruppe in einer separaten Bucht.

Beide Räume wurden getrennt voneinander belüftet, geheizt und betreut. Die Hal-

tung fand in Übereinstimmung mit dem Europäischen Übereinkommen zum Schutz


der für Versuche und andere wissenschaftliche Zwecke verwendeten Wirbeltiere

(ETS 123) statt.

2.3.1.3 Präparation der Bakterien für die Infektion

Zwei Tage vor der Infektion wurde der Belastungsstamm aus dem Gefrierstock auf

einer Platte Kochblutagar mit NAD-Zusatz ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C

bebrütet (5 % CO2). Nach 24 Stunden wurden zur Absicherung gegen eventuelle

Kontamination zwei Schüttelkulturen mit je 40 ml Medium (s. C2.1.2) mit drei bis vier

Einzelkolonien beimpft und über Nacht als Standkultur bebrütet (37 °C, 5 % CO2-

Zusatz). Gleichzeitig wurden zwei Kolben mit je 200 ml Medium im selben Brut-

schrank (37 °C, 5 % CO2-Zusatz) vorinkubiert. Am Tag der Infektion wurde diesen je

40 ml Medium als Negativkontrolle entnommen und die restlichen 160 ml mit den

Standkulturen beimpft. Die Inkubation der vier Schüttelkulturen26 erfolgte aerob bei

37 °C und 200 rpm. Bei einer OD66027 von 0,5 wurden die Kulturen für zehn Minuten

auf Eis gestellt und während dieser Zeit eine Gramfärbung durchgeführt. Bei Vor-

liegen ausschließlich gramnegativer kokkoider Keime wurde durch Zugabe von eis-

gekühlter NaCl-Lösung die gewünschte Verdünnung der Keimsuspension hergestellt.

Die Lagerung der Lösung erfolgte auf Eis.

2.3.1.4 Aerosolinfektion

Die Infektion der Aerosolgruppe wurde in einer Aerosolkammer28 basierend auf den

Beschreibungen von Jacobsen et al. (JACOBSEN et al. 1996a) durchgeführt. Die

Kammer ermöglicht die gleichzeitige Infektion von vier Ferkeln eines Alters von 7-12

Wochen. Das Dach der Kammer besteht aus einem Acrylfenster, so dass die Tiere

während der Exposition gut beobachtet werden können. Zwei mit Filtern bestückte

Ventile ermöglichen den Luftaustausch, wovon das eine mit einem Kompressor

verbunden ist. Sämtliche Schläuche bestehen aus autoklavierbarem Silikon oder Tef-

lon®. Die Bakteriensuspension wird mittels komprimierter Luft29 durch eine Düse30

26

innova 4300, NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC, Edison, USA

27 Ultraspec III, Pharmacia LKB, Freiburg, Deutschland

28 Impfstoffwerk Thornau Dessau, Dessau, Deutschland

29 Linde, Hannover, Deutschland


aerosolisiert. Alle vier Ferkel der Aerosolgruppe wurden zusammen in die Kammer

getrieben. Die Düse wurde auf „5“ eingestellt, was eine große Sprühweite des Aero-

sols durch die Kammer erzeugte. Die Einstellung des den Durchfluss regulierenden

Ventils betrug „75“. Die Belastungsdosis wurde über einen Zeitraum von ca. zwei

Minuten bei einem Druck von 2 bar aerosolisiert und für zehn Minuten in der Kammer

belassen. Nach Öffnung des Frischluftventils erfolgte das Abpumpen des Aerosols

über eine Zeitspanne von 20 Minuten, was dem zehnfachen Luftvolumen der

Kammer entspricht. Die Ferkel wurden im Anschluss wieder zurück in ihren Stall

getrieben.

2.3.1.5 Intratracheale Infektion

Die intratracheale Belastung erfolgte an anästhesierten Ferkeln (Stresnil® und Urso-

tamin®, intramuskuläre Gabe von 2 mg Azaperon/kg KGW und 20 mg Ketamin/kg

KGW). Mittels eines Laryngoskops wurde den Tieren eine Ernährungssonde in die

Trachea eingeführt und die Belastungsdosis über eine Spritze appliziert.

2.3.1.6 Überwachung während des Experiments

Die Tiere wurden mindestens einmal, bei Bedarf auch mehrmals am Tag auf kli-

nische Anzeichen einer H. parasuis-Infektion untersucht. Dazu wurde die Rektaltem-

peratur jedes Tieres gemessen und adspektorisch das Allgemeinbefinden anhand

von Fressverhalten und Anteilnahme an der Umwelt beurteilt. Zusätzlich wurde auf

spezifischere Symptome wie Husten und Dyspnoe, Aufkrümmung des Rückens,

übermäßige Gelenkfüllung, Lahmheit oder Verhaltensweisen, die auf Störungen des

Zentralen Nervensystems hinweisen, geachtet.

2.3.1.7 Euthanasie und Sektion

Nach einer intramuskulär verabreichten Anästhesie (Stresnil® und Ursotamin®,

s. C2.3.1.5) wurde sämtlichen Tieren aus der Vena jugularis externa eine Blutprobe

entnommen und intravenös 4 ml Eutha® 77 verabreicht. Die Tiere wurden gewogen

und anschließend seziert.

30

Model Nr. 97058, Schlick Duesen, Untersiemau, Deutschland


Es wurden sterile Tupferproben aus der Nasenhöhle, Bauch- und Brustraum, Peri-

kard, einem Kniegelenk und den Meningen des Großhirns entnommen, außerdem

Organproben aus den Tonsillen, der Lunge und einem Lungenlymphknoten. Die ad-

spektorische Untersuchung erfolgte nach vollständiger Eröffnung der jeweiligen Kör-

perregion.

2.3.1.8 Reisolation von H. parasuis

Das Ausplattieren der Tupfer- und Organproben erfolgte parallel auf vier verschiede-

nen Nährböden: Kochblutagar mit NAD-Zusatz, Blut- und Gassner- sowie CSB-Agar.

Die Kochblut- und CSB-Platten wurden bei 37 °C mit 5 % CO2-Zusatz inkubiert, die

Blut- und Gassnerplatten aerob bei 37 °C. Nach 24 Stunden erfolgte eine erste

Durchsicht mit Subkultivierung verdächtiger Kolonien (glattrandig, feucht, weiß-grau

und transparent) auf Blutplatten mit einer Staphylococcus aureus-Amme und Koch-

blutplatten mit NAD-Zusatz. Zusätzlich wurde von den Kochblut- und CSB-Platten mit

einem Trockentupfer eine Hälfte des dicken Impfstrichs abgenommen, in Aqua dest.

resuspendiert und bei -20 °C eingefroren. Nach 48 Stunden Bebrütungsdauer wur-

den noch einmal verdächtige Kolonien subkultiviert. Insgesamt wurden alle Platten

72 Stunden inkubiert.

Alle NAD-abhängig wachsenden Stämme wurden mittels PCR mit den Primern Hps-f

und -r (OLIVEIRA et al. 2001) überprüft und bei Entstehung eines 821 bp großen

Amplifikats als H. parasuis eingruppiert. Die positiven Stämme wurden als Gefrierkul-

tur konserviert, indem Kulturmaterial von einer über Nacht bebrüteten Agarplatte (5

% CO2) in 500 µl Medium (LB oder PPLO-Medium) resuspendiert und mit derselben

Menge 50 %igem Glycerin versetzt wurde. Die Aufbewahrung der Gefrierkulturen er-

folgte bei -80 °C.


2.3.1.9 Enzyme Linked Immunosorbent Assay

Die Untersuchungen auf Antikörper gegen H. parasuis mittels Enzyme Linked Im-

munosorbent Assay (ELISA) wurden durch die Gesellschaft für Innovative Veteri-

närdiagnostik mbH (IVD GmbH, Hannover, Deutschland) durchgeführt. Der verwen-

dete Test Swinecheck® HPS der Firma Biovet® (Auckland, New Zealand) basiert auf

nicht näher bezeichneten spezifischen Antigenen von H. parasuis.

D Ergebnisse 60

D Ergebnisse

1 Isolierung H. parasuis spezifischer Fragmente mittels Reprä-sentativer Differenzanalyse

In dieser Arbeit wurde eine modifizierte Form der Repräsentativen Differenzanalyse

(RDA) durchgeführt, bei der auf die initiale Amplifizierung der Fragmente mittels PCR

verzichtet wurde. Als Driver und Tester dienten die Referenzstämme zweier Sero-

typen, welche unterschiedliche Eigenschaften bezüglich ihrer Virulenz aufweisen. Als

Driver wurde der Referenzstamm von Serotyp 11 eingesetzt, welcher sich im Tierver-

such als avirulent erwiesen hatte, wohingegen der als Tester verwendete Refe-

renzstamm von Serotyp 5 (Stamm Nagasaki) eine hohe Virulenz aufwies und syste-

mische Läsionen verursachte (KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON 1992). Der An-

satz wurde an Fragmenten chromosomaler DNA aus einem Restriktionsenzym-

verdau mit DpnI und DpnII durchgeführt (s. Abb. 2).

Abb. 2 PCR des RDA-Ansatzes mit dem Primer RBgl24 Ansatz in verschiedenen Verdünnungen als Template eingesetzt: 1:1 (1), 1:10 (2), 1:100 (3), Kontrollansätze mit Tester (4), Driver (5) und Aqua dest. (6)

Das Amplifikat wurde mittels StrataClone® PCR Cloning Kit (Stratagene, La Jolla,

USA) nach den Angaben des Herstellers in den Vektor pSC-A kloniert und in den

mitgelieferten E. coli-Stamm (chemokompetent) transformiert, welcher ein Screening

durch Blau-Weiß-Selektion ermöglicht. 85 Klone wurden gepickt und in einer PCR

mit den Primern M13 forward und reverse eingesetzt, die Analyse der Produkte er-

folgte auf einem 1,5 % Agarosegel (s. Abb. 3).

D Ergebnisse 61

500 bp1000 bp

M Klone 1-41

M Klone 42-82

M 83-85

500 bp1000 bp

500 bp

1000 bp

Abb. 3 PCR von 85 RDA-Klonen mit den Primern M13 forward und reverse

1.1 Überprüfung der Spezifität der RDA-Fragmente

Die Überprüfung der Spezifität aller 85 PCR-Produkte erfolgte zunächst im Southern

Blot. Die im Agarosegel aufgetrennten PCR-Produkte wurden mittels Southern

Transfer auf positiv geladene Nylonmembranen übertragen, wobei von jedem Gel

zwei Membranen angefertigt wurden. Die Hybridisierung der ersten Membran erfolg-

te mit einer radioaktiv markierten Gensonde aus einem Verdau chromosomaler

Tester-DNA mit DpnI und DpnII, die der zweiten Membran mit einer Sonde aus

ebenfalls mit DpnI und DpnII verdauter chromosomaler Driver-DNA. Als Positiv-

kontrolle wurde jedem Ansatz noch eine Membran hinzugefügt, auf welche Proben

der jeweils zur Sondenherstellung verwendeten DNA in drei Verdünnungsstufen

aufgetropft wurde. Aus dem Vergleich der Bindungsmuster beider Sonden ergab sich

die Spezifität der Produkte: Bei testerspezifischen Produkten band die Sonde aus

Tester-DNA um ein Vielfaches stärker, als die Sonde aus Driver-DNA (s. Abb. 4).

Von den 85 untersuchten Proben wurden 29 als spezifisch eingestuft, sequenziert

und einer Homologiesuche per Datenbankabgleich unterzogen. Für eine Auswahl an

Sequenzen wurden Primer konstruiert und weitere Stämme auf dieses Fragment hin

untersucht.

D Ergebnisse 62

Abb. 4 Southern Blot der 85 PCR-Produkte aus den RDA-Klonen mit M13-Primern A: Inkubation mit einer markierten Gensonde aus dem Verdau chro-mosomaler DNA von Serotyp 5, Nr. 1-29: Kennzeichnung der Proben für die Sequenzierung B: Inkubation mit einer markierten Gensonde aus dem Verdau chro-mosomaler DNA von Serotyp 11 eingesetzte Kontrollen: zur Sondenherstellung eingesetzte DNA in drei Verdünnungsstufen (200 ng, 20 ng und 2 ng/µl)

1.2 Homologiesuche und PCR

Die im Southern Blot spezifischen Fragmente für den Referenzstamm von Serotyp 5

wurden sequenziert und die Daten nach Bereinigung um die Adaptorsequenzen einer

Datenbankrecherche unterzogen. Die 29 sequenzierten Produkte waren zwischen

152 und 768 bp groß und ergaben 18 unterschiedliche Suchergebnisse. Tabelle 2

D Ergebnisse 63

gibt eine Übersicht über Sequenzen, für die zur erneuten Spezifitätsüberprüfung per

PCR Primer konstruiert wurden.

Sechs sich überschneidende Sequenzen wiesen Ähnlichkeiten mit einem hypothe-

tischen Protein von H. parasuis auf (HPS_09285, identische Aminosäuren = 69/102

[67 %], ähnliche Aminosäuren = 75/102 [73 %], ZP_02479249), zeigten zusätzlich

aber auch Homologien zu dem Protein gp 229 des Bakteriophagen SFi18 von Strep-

tococcus thermophilus (identische Aminosäuren = 68/109 [62 %], ähnliche Amino-

säuren = 75/109 [68 %], AF158601).

Ermittelt aus einem einzigen RDA-Klon ergaben sich zwei Sequenzen, die Homo-

logien mit hypothetischen Proteinen von H. parasuis zeigten (HPS_08882: identische

Aminosäuren = 40/43 [93 %], ähnliche Aminosäuren = 42/43 [97 %], ZP_02477853;

HPS_08887: identische Aminosäuren = 65/69 [94 %], ähnliche Aminosäuren = 68/69

[98 %], ZP_02477854). Diese finden sich in einem Teil der unvollständigen Genom-

sequenz von H. parasuis (NZ_ABKM01000009) und liegen direkt hintereinander

(HPS_08882: 34.385-34.747, HPS_08887: 34.757-35.068). Es zeigten sich aber

auch Ähnlichkeiten zu Proteinen von A. pleuropneumoniae, da HPS_08882 Ähnlich-

keiten zu einer phagenassoziierten Restriktionsendonuklease aufwies (identische

Aminosäuren = 32/43 [74 %], ähnliche Aminosäuren = 36/43 [83 %], YP_001968611)

und HPS_08887 zu einem putativen Protein zum Verpacken von Phagen-DNA (iden-

tische Aminosäuren = 55/69 [79 %], ähnliche Aminosäuren = 64/69 [92 %],

YP_001968612).

Zwei Sequenzen zeigten Übereinstimmungen mit einem Hämolysin: die eine war

identisch mit einem möglichen Hämolysinvorläufer (HhdA) von H. parasuis (iden-

tische Aminosäuren = 134/134 [100 %], ähnliche Aminosäuren = 134/134 [100 %],

AAZ67675), die zweite ähnelte dem Vorläufer der Untereinheit HhdB des ent-

sprechenden Proteins von H. ducreyi (identische Aminosäuren = 64/145 [44 %], ähn-

liche Aminosäuren = 101/145 [69 %], AAC43537). Beide Sequenzen fanden sich in

der unvollständigen Genomsequenz von H. parasuis wieder (NZ_ABKM00000000,

Position 125-1.912 und 1.948-2.640), in welcher mit dem Programm BPROM

(http://linux1.softberry.com/berry.phtml) kurz vor dem Beginn der Sequenz von hhdB

D Ergebnisse 64

die wahrscheinlichste Promotorregion identifiziert wurde (Promotorposition: 66, -10

Box an Position 31 und -35 Box an Position 51).

Das letzte Suchergebnis zeigte einerseits Homologien zum Protein CirA von M. hae-

molytica (identische Aminosäuren = 59/77 [76 %], ähnliche Aminosäuren = 68/77 [88

%], YP_088507), andererseits zu einem hypothetischen ATP bindenden ABC-Trans-

porter-Protein von A. pleuropneumoniae (identische Aminosäuren = 59/77 [76 %],

ähnliche Aminosäuren = 65/77 [84 %], ZP_00134583), einem TonB-abhängigen Si-

derophoren-Rezeptor von A. succinogenes (identische Aminosäuren = 49/77 [63 %],

ähnliche Aminosäuren = 64/77 [83 %], YP_001344473) sowie zu einem putativen

TonB abhängigen Rezeptorprotein von Neisseria meningitidis (identische Amino-

säuren = 47/75 [62 %], ähnliche Aminosäuren = 54/75 [72 %], YP_975298). Auch

diese Sequenz findet sich in einem Teil der unvollständigen Genomsequenz von

H. parasuis wieder (NZ_ABKM01000010, Position 26.558-26.890), in diesem Bereich

ist jedoch bislang kein putatives Protein vermerkt.

Von den 29 sequenzierten Proben wurden für fünf Sequenzen Primer konstruiert, um

erneut die Spezifität des Gens für den Referenzstamm von Serotyp 5 zu überprüfen:

oMP_A1 und 2 für das putative Hämolysin von H. parasuis, oMP_B1 und 2 für die

Untereinheit HhdB von H. ducreyi, oPhage8_1 und 2 für das Fragment mit den

Homologien zu dem Phagen von Streptococcus thermophilus, oPhage13_1 und 2

übergreifend für die Sequenz mit den Übereinstimmungen zu zwei phagenasso-

ziierten Genen von A. pleuropneumoniae und oMP_CirA1 und 2 für das Fragment

mit den Ähnlichkeiten zum Protein CirA von M. haemolytica.

In der PCR erwiesen sich die Gene hhdA, hhdB, cirA und die beiden phagenasso-

ziierten Gene mit der Homologie zu A. pleuropneumoniae als spezifisch (s. D1.3).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=NC_006300.1

D Ergebnisse 65

Tab. 2 Ergebnisse der Homologiesuche spezifischer Sequenzen für Serotyp 5

Sequenz (Klonnummer)

Protein identische Amino-säuren

ähnliche Amino-säuren

Fehlerwahr-scheinlichkeit

GenBank accession number (Protein)

1 (A 3, A 7, B 6, B 10, C 10, F 7)

hypothetisches Protein HPS_09285

69/102 (67 %)

75/102 (73 %)

5e-31

ZP_02479249

gp 229, Bakteriophage SFi18 von Streptococcus thermophilus

68/109 (62 %)

75/109 (68 %)

1e-28

AF158601

2 (A 11)


40/43 (93 %)

42/43 (97 %)

7e-18

ZP_02477853


65/69 (94 %)

68/69 (98 %)

9e-32

ZP_02477854

hypothetisches Bakteriophagenprotein von A. pleuropneumoniae

32/43 (74 %)

36/43 (83 %)

2e-11

YP_001968611

hypothetisches Bakteriophagenprotein von A. pleuropneumoniae

55/69 (79 %)

64/69 (92 %)

2e-26

YP_001968612

3 (C 3) putativer Hämolysinvorläufer (HhdA) von H. parasuis

134/134 (100 %)

134/134 (100 %)

3e-58

AAZ67675

4 (C 9)

Vorläufer der Untereinheit HhdB eines Hämolysins von H. ducreyi

64/145 (44 %)

101/145 (69 %)

3e-24

AAC43537

5 (C 8)

CirA von M. haemolytica

59/77 (76 %)

68/77 (88 %)

2e-27

YP_088507

hypothetisches ATP bindendes ABC-Transporterprotein von A. pleuropneumoniae

59/77 (76 %)

65/77 (84 %)

3e-26

ZP_00134583

TonB-abhängiger Siderophoren-Rezeptor von A. succinogenes

49/77 (63 %)

64/77 (83 %)

8e-23

YP_001344473

putatives TonB abhängiges Rezeptorprotein von Neisseria meningitidis

47/75 (62 %)

54/75 (72 %)

4e-18

YP_975298

D Ergebnisse 66

1.3 Vorkommen der H. parasuis Serotyp 5 (Stamm Nagasaki) –spezifischen Fragmente in Referenz- und Feldstämmen

Für Fragmente, die sich in der PCR nochmals als spezifisch für den Tester (Refe-

renzstamm 5) erwiesen haben, wurde das Vorkommen per PCR in allen 15 Refe-

renzstämmen überprüft. Falls Amplifikate überwiegend in als virulent bekannten Re-

ferenzstämmen auftraten, wurden zusätzlich weitere Feldstämme untersucht. Hierbei

handelte es sich um zwölf nasal isolierte Stämme von klinisch gesunden Tieren (s.

Anhang Tab. 23), 16 aus der Lunge isolierten Stämmen von Tieren, die zwar an

Pneumonie erkrankt waren, für die jedoch nicht sicher feststeht, ob der hochgradig

und in Reinkultur nachgewiesene Stamm von H. parasuis für die Erkrankung

verantwortlich war (s. Anhang Tab. 21). Dazu kamen zehn weitere Isolate, die aus

systemischen Läsionen gewonnen wurden und deren Trägertiere auch die ent-

sprechenden klinischen Symptome aufwiesen (s. Anhang Tab. 22). Übersichten der

Verteilung der Gene in den Referenzstämmen und Feldisolaten finden sich in den

Tabellen 3, 4, 5 und 6.

Zudem wurde für diese Fragmente ein zweiter Southern Blot durchgeführt, in wel-

chem chromosomale DNA aller 15 Referenzstämme mit dem Enzym DpnI und II ver-

daut und auf eine positiv geladene Nylonmembran geblottet wurde. Zur Erzeugung

der Sonde wurde das PCR-Produkt aus der Nachweis-PCR verwendet, welches

auch als Positivkontrolle diente. Zusätzlich wurde für die Gene hhdA, hhdB und cirA

mittels RT-PCR untersucht, ob sich Transkripte des jeweiligen Bereichs nachweisen

lassen (s. Abb. 13).

Mit den Primern oMP_A1 und 2 wurde ein 964 bp großes PCR-Produkt amplifiziert,

für welches die Referenzstämme 5, 12, 13, 14 und 15 positiv waren (s. Abb. 5). Die

Primer oMP_B1 und 2 amplifizierten in den gleichen Referenzstämmen ein PCR-

Produkt von 557 (s. Abb. 7). Die Verteilung in diesen Stämmen wurde durch

Southern Blots bestätigt, allerdings war in diesen Untersuchungen der Referenz-

stamm für Serotyp 13 für beide Fragmente negativ (s. Abb. 5 und 7). Die Bin-

dungsstellen beider Gensonden befanden sich auf unterschiedlich großen DNA-

Fragmenten (hhdA: 350 und 2000 bp; hhdB: 300 bis 1500 bp). Von zwölf getesteten

D Ergebnisse 67

nasal isolierten Feldstämmen waren sechs positiv für hhdA (s. Abb. 6) und hhdB (s.

Abb. 8), von den 16 getesteten aus pneumonischen Lungen isolierten Feldstämmen

waren sechs positiv für hhdA (s. Abb. 6). Für hhdB waren davon sechs Stämme

deutlich positiv und drei weitere schwach (s. Abb. 8). Von den zehn systemisch

isolierten Feldstämmen waren vier deutlich und einer schwach positiv für hhdA (s.

Abb. 6), für hhdB war nur ein Stamm deutlich positiv und zwei weitere schwach (s.

Abb. 8). Mittels RT-PCR wurden Transkripte von beiden Sequenzen nachgewiesen

(s. Abb. 13).

Aus einer Kombination fragmentspezifischer Primer beider Fragmente (oHhdA4 und

oHhdB1) ergab sich ein 3368 bp großes Fragment, aus dem sich die Organisations-

struktur HhdBA ableiten ließ (keine Abbildung).

D Ergebnisse 68

Abb. 5 Überprüfung auf das Vorkommen des Gens hhdA in den Refe-renzstämmen 1-15. A: PCR mit den Primern oMP_A1 und 2 (964 bp) B: Southern Blot mit verdauter chromosomaler DNA der Referenz-stämme 1-15, inkubiert mit einer Gensonde aus dem markierten PCR-Produkt aus Referenzstamm 5 mit den Primern oMPA_1 und 2 (964 bp)

Abb. 6 PCR-Überprüfung auf das Vorkommen des Gens hhdA in Feldisolaten mit den Primern oMP_A1 und 2 (964 bp) A: 16 Isolate aus pneumonischen Lungen B: zwölf nasale Isolate C: zehn Isolate aus systemischen Lokalisationen

D Ergebnisse 69

Abb. 7 Überprüfung auf das Vorkommen des Gens hhdB in den Refe-renzstämmen 1-15. A: PCR mit den Primern oMPB_1 und 2 (557 bp) B: Southern Blot mit verdauter chromosomaler DNA der Referenz-stämme 1-15, inkubiert mit einer Gensonde aus dem markierten PCR-Produkt aus Referenzstamm 5 mit den Primern oMPB_1 und 2 (557 bp)

Abb. 8 PCR-Überprüfung auf das Vorkommen des Gens hhdB in Feldisolaten mit den Primern oMPB_1 und 2 (557 bp) A: 16 Isolate aus pneumonischen Lungen B: zwölf nasale Isolate C: zehn Isolate aus systemischen Lokalisationen

D Ergebnisse 70

Mit den Primern oMP_CirA1 und 2 wurde ein 161 bp großes Produkt nachgewiesen,

für welches die Referenzstämme der Serotypen 3 (schwach), 5, 12, 13, 14 und 15

positiv waren (s. Abb. 9). Im Southern Blot waren die Stämme 3, 5, 8, 9, 10, 12, 14

und 15 positiv, die Bindungsstellen der Gensonde befanden sich auf DNA-Sequen-

zen der Größe 350 bis 1500 bp (s. Abb. 9). Von den zwölf getesteten nasal isolierten

Feldstämmen waren dieselben sechs positiv wie bei hhdA und hhdB, allerdings

ergaben vier weitere Stämme schwache Banden (s. Abb. 10). Von den 16 getesteten

Feldstämmen aus pneumonischen Lungen waren sechs deutlich positiv und acht

weitere schwach positiv (s. Abb. 10). Von den zehn systemisch isolierten Feldstäm-

men waren fünf deutlich positiv und einer schwach positiv (s. Abb. 10). In Re-

ferenzstamm 5 konnten per RT-PCR Transkripte der Sequenz gezeigt werden (s.

Abb. 13).

Die Primer oPhage13_1 und 2 amplifizierten ein 301 bp großes Produkt in den

Referenzstämmen 2, 5 und 12, dieses Ergebnis wurde im Southern Blot noch um die

Referenzstämme 14 und 15 erweitert (s. Abb. 11). Die Gensonde band auf DNA-

Sequenzen der Größe 550 bis 1200 bp. Von den 16 aus Lungen isolierten Feld-

stämmen waren drei positiv sowie einer der zehn systemisch isolierten Feldstämme

(s. Abb. 12). Von den zwölf aus der Nase isolierten Stämmen ergaben vier in der

PCR deutliche Banden und einer eine schwache Bande (s. Abb. 12).

D Ergebnisse 71

Abb. 9 Überprüfung auf das Vorkommen des Gens cirA in den Refe-renzstämmen 1-15. A: PCR mit den Primern oMPCirA_1 und 2 (135 bp) B: Southern Blot mit verdauter chromosomaler DNA der Referenz-stämme 1-15, inkubiert mit einer Gensonde aus dem markierten PCR-Produkt aus Referenzstamm 5 mit den Primern oMPCirA_1 und 2 (135 bp)

Abb. 10 PCR-Überprüfung auf das Vorkommen des Gens cirA in Feldisolaten mit den Primern oMPCirA_1 und 2 (135 bp) A: 16 Isolate aus pneumonischen Lungen B: zwölf nasale Isolate C: zehn Isolate aus systemischen Lokalisationen

D Ergebnisse 72

Abb. 11 PCR-Überprüfung auf das Vorkommen der beiden phagenassoziierten Gene in den Referenzstämmen 1-15 mit den Primern oPhage13_1 und 2 (301 bp). A: PCR mit den Primern oPhage13_1 und 2 (301 bp) B: Southern Blot mit verdauter chromosomaler DNA der Referenz-stämme 1-15, inkubiert mit einer Gensonde aus dem markierten PCR-Produkt aus Referenzstamm 5 mit den Primern oPhage13_1 und 2 (301 bp)

Abb. 12 PCR-Überprüfung auf das Vorkommen der beiden phagenassoziierten Gene in Feldisolaten mit den Primern oPhage13_1 und 2 (301 bp) A: 16 Isolate aus pneumonischen Lungen B: zwölf nasale Isolate C: zehn Isolate aus systemischen Lokalisationen

D Ergebnisse 73

Abb. 13 RT-PCR mit Serotyp 5 (Stamm Nagasaki) zum Nachweis der Transkription der Serotyp 5 spezifischen DNA-Se-quenzen aus der RDA und einem Genfragment der 16S rDNA aus der PCR zum Nachweis von H. parasuis (1, 5, 9): Überprüfung der Transkription von hhdA mit den Primern oMP_A1 und 2 mit Reverser Transkriptase (RT) (1), ohne RT (5), Posi-tivkontrolle mit chromosomaler DNA (9) (2, 6, 10): Überprüfung der Transkription von hhdB mit den Primern oMP_B1 und 2 mit RT (2), ohne RT (6), Positivkontrolle mit chromo-somaler DNA (10) (3, 7, 11): Überprüfung der Transkription des Fragments aus der 16S rDNA mit den Primern Hps-f und -r mit RT (3), ohne RT (7), Positiv-kontrolle mit chromosomaler DNA (11) (4, 8, 12): Überprüfung der Transkription von cirA mit den Primern oMP_C1 und 2 mit RT (4), ohne RT (8), Positivkontrolle mit chromoso-maler DNA (12) (13): Negativkontrolle mit Aqua dest.

D Ergebnisse 74

Tab. 3 Verteilung der spezifischen Sequenzen innerhalb der Referenzstämme 1-15

Referenzstämme der 15 Serotypen (Ergebnisse der Southern Blots)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

hhdA - - - - + - - - - - - + - + +

hhdB - - - - + - - - - - - + - + +

cirA - - + - + - - + + + - + - + +

phagen-assoz. Gene

- + - - + - - - - - - + - + +

Tab. 4 Verteilung der spezifischen Sequenzen innerhalb der zwölf nasal isolier-ten Feldstämme

Isolation aus der Nase (PCR-Ergebnisse)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

HhdA - - - - - + + + - + + +

HhdB - - - - - + + + - + + +

CirA - (+) (+) (+) - + + + (+) + + +

phagen-assoz. Gene

(+) + + + + - - - - - - -

Tab. 5 Verteilung der spezifischen Sequenzen innerhalb der 16 aus pneumo-nischen Lungen isolierten Feldstämme

Isolation aus der Lunge (PCR-Ergebnisse)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

HhdA - - + + + - - + - - - + + - - -

HhdB - - + + + (+) - + - (+) - + + - - -

CirA - - + + + (+) (+) + (+) (+) (+) + + (+) (+) (+)

phagen-assoz. Gene

- - (+) - - - - + - - (+) - (+) - - -

D Ergebnisse 75

Tab. 6 Verteilung der spezifischen Sequenzen innerhalb der zehn systemisch isolierten Feldstämme

Isolation systemisch (PCR-Ergebnisse)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

HhdA - - - - + - + + (+) +

HhdB - - - - (+) - - (+) - +

CirA - - - - + - + + (+) +

phagen-assoz. Gene

- - - - - + - - (+) -

D Ergebnisse 76

2 Proteomanalysen mittels SDS-PAGE

In der SDS-PAGE wurden Ganzzelllysate aller 15 Referenzstämme sowie von 16

aus pneumonischen Lungen isolierten Stämmen und neun aus systemischen Lokali-

sationen gewonnenen Isolaten untersucht. Sämtliche Proben wiesen sehr ähnliche

Bandenmuster auf (s. Abb. 14). Unterschiede ergaben sich einerseits durch eine

Gruppe von Banden im Größenbereich 32 bis 42 kDa, andererseits durch An- oder

Abwesenheit eines Proteins von >200 kDa. Unterschiedliche Bebrütungszeiten der

Ausgangskulturen veränderten die Ausprägung der Banden nicht. Pro Stamm

existierte nur je eine markante Proteinbande im Bereich 32 bis 42 kDa. Innerhalb der

Referenzstämme wiesen 3, 6, 8, 9 und 10 mit 38-40 kDa die größten dieser Banden

auf, die kleinsten mit etwa 32 kDa zeigten die Referenzstämme 2, 5 und 7. Die

Proteinbande von >200 kDa trat ausschließlich bei den Referenzstämmen 3, 6, 9 und

10 zu Tage. Von den untersuchten Feldstämmen wies keiner der aus pneumo-

nischen Lungen isolierten Stämme das Protein der Größe >200 kDa auf, wohl aber

die systemisch isolierten Stämme 2 und 3 (entspricht Maas 2 und 3). Beide Stämme

(42 kDa) zeigen gemeinsam mit Stamm 9 (Ahlem 847, 40 kDa) die größte markante

Bande im Größenbereich 32 bis 42 kDa der systemisch isolierten Stämme, die

Stämme 1, 5 und 8 (Maas 1, Ahlem 332 und 751) hingegen mit ca. 33-35 kDa die

kleinsten. Auch bei den pneumonisch isolierten Stämmen variiert die Größe der

markanten Bande in diesem Bereich von 33 bis 39 kDa (Stamm 12 und 13 bzw. 10,

entspricht Ahlem 684 und 696 bzw. 621).

D Ergebnisse 77

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

30 kDa

40 kDa

200 kDa

I

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 10 11 12 13 14 15 16

30 kDa

40 kDa

200 kDa

II

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

30 kDa

40 kDa

200 kDa

III

Abb. 14 SDS-PAGE mit Ganzzelllysaten, Commassie gefärbt (I) Referenzstämme 1-15 (II) 16 Feldstämme aus pneumonischen Lungen (III) 9 invasive Feldstämme Maas 1-3, Baums 1 und Ahlem 332, 532,

549, 751 und 847

D Ergebnisse 78

3 Proteomuntersuchungen mittels Massenspektrometrie

Aus den Proteingelen der Ganzzelllysate von Referenzstamm 1 bis 15 wurden 14

Banden für weitere Untersuchungen ausgewählt, für die 16 aus pneumonischen

Lungen isolierten Stämme sechs Banden (s. Abb. 15). Alle 20 Proben wurden für

massenspektrometrische Untersuchungen aufbereitet, was einen tryptischen Verdau

zur Aufspaltung der einzelnen Peptide beinhaltete.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

30 kDa

40 kDa

200 kDa

12

56

7

84

9 10

1112 14 15

3

I

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 10 11 12 13 14 15 16

30 kDa

40 kDa

200 kDa

162019

21

1718

II

Abb. 15 SDS-PAGE mit Ganzzelllysaten, Coomassie gefärbt (I) Referenzstämme 1-15 (II) 16 Feldstämme aus pneumonischen Lungen

Mittels Massenspektrometrie untersuchte Banden sind mit Pfeilen ge-kennzeichnet (Probe 13 fehlt).

D Ergebnisse 79

3.1 MALDI-TOF-Analysen

Alle 20 Proben wurden per MALDI-TOF-Massenspektrometrie untersucht. Anhand

der ermittelten Massenzahlen einzelner Peptide wurde für jede Probe ein Spektrum

ausgegeben. Da sich die Spektren einiger Proben stark ähnelten bzw. nahezu iden-

tisch waren, wurde eine Einteilung in 2 Gruppen vorgenommen. Gruppe 1 bestand

aus 14 Proben (1, 2, 4, 5, 6, 8, 12, 14, 16, 17, 18, 19, 20 und 21) aus dem Bereich 32

bis 39 kDa (s. Abb. 16).

Abb. 16 Beispielhaftes Spektrum Gruppe 1 (Probe 6) aus der massenspektrometrischen Untersuchung mittels MALDI-TOF.

Die zweite Gruppe umfasste die Proben 7, 9, 10 und 13, hierbei handelte es sich um

die Banden >200 kDa (s. Abb. 17). Die Spektren von Nummer 3 und 15 wiesen

keinerlei Ähnlichkeiten mit anderen Proben auf (s. Abb. 18 und 19), obwohl Nummer

3 im Proteingel nicht von den anderen Proteinen der zweiten Gruppe zu unter-

scheiden war und Nummer 15 nicht von denen der ersten. Das Spektrum von Probe

11 hatte eine zu schlechte Qualität, um es einer Gruppe zuordnen zu können,

aufgrund der Gesamtproteinmasse gehörte es jedoch zu Gruppe 1 (keine Ab-

bildung).

D Ergebnisse 80

Abb. 17 Beispielhaftes Spektrum Gruppe 2 (Probe 7) aus der massenspektrometrischen Untersuchung mittels MALDI-TOF.

Abb. 18 Spektrum Probe 3 (ohne Ähnlichkeiten zu den Spektren anderer Proben) aus der massenspektrometrischen Untersuchung mittels MALDI-TOF.

D Ergebnisse 81

Abb. 19 Spektrum Probe 15 (ohne Ähnlichkeiten zu den Spektren anderer Proben) aus der massenspektrometrischen Untersuchung mittels MALDI-TOF.

Die den Spektren zugrunde liegenden Peptidmassen wurden zum Datenbankableich

verwendet (Peptide Mass Fingerprint Algorithmus der Mascot Homepage

[www.matrixscience.com], Abgleich mit der NCBI Datenbank). Zehn der 14 Proben

aus Gruppe 1 wiesen auf den Vorläufer eines P2 Proteins der äußeren Membran

(MOMP, major outer membrane protein) von H. parasuis hin, von welchem eine

Sequenz von 359 Aminosäuren (ZP_02477753) bzw. 1080 bp veröffentlicht ist. Mit

den Primern oPorin1 und 2 wurde mittels PCR die Verteilung des Gens in den

Referenzstämmen 1-15 untersucht (s. Abb. 20). Sämtliche Stämme ergaben zwar ein

Produkt, welches jedoch anstatt der erwarteten Produktgröße von 394 bp je nach

Stamm um bis zu ca. 40 bp abwich. Die Größenverteilung entsprach hierbei an-

nähernd der aus dem Proteingel, das heisst die Referenzstämme 3 und 4 sowie 8, 9

und 10 wiesen sowohl im Proteingel als auch in der PCR vergleichsweise große

Banden im entsprechenden Größenbereich auf, die Stämme 5 und 7 zeigten hin-

gegen in beiden Untersuchungen vergleichsweise kleine Banden. Für die Proben aus

Gruppe 2 konnten keine Homologien gefunden werden.

D Ergebnisse 82

Abb. 20 PCR mit den Referenzstämmen 1-15 mit den Primern oPorin1 und 2 zur Überprüfung auf das Vorkommen der Gensequenz des OMP P2 Proteins von H. parasuis.

3.2 Q-TOF-Analysen

Es wurden ebenfalls alle 20 Proben mit der Q-TOF-Massenspektrometrie untersucht.

Die Analyse setzte sich aus der Detektion der Peptidmassen, der durchgeführten de

novo Sequenzierung von Probe 7 (Aminosäuresequenz, s. Anhang Tab. 35) sowie

aus dem Datenbankabgleich mit der NCBI-Datenbank zusammen. Letzteres geschah

über das Programm des ProteinLynx Globals Server (Waters). Ein beispielhaftes

Spektrum der Detektion der Peptidmassen findet sich in Abbildung 21, die Peptidliste

der de novo Sequenzierung befindet sich in Tabelle 35.

Alle 16 Proben aus Gruppe 1 wurden mittels Q-TOF-Massenspektrometrie eindeutig

identifiziert, da sie mit zwei (Probe 18) bis neun Peptiden (Probe 19) mit einem sich

in der Datenbank befindenden Protein von H. parasuis identisch waren (s. Anhang

Tab. 32 und 33). Es handelt sich um den Vorläufer eines P2 Proteins der äußeren

Membran (OMP P2) und ist identisch mit dem mittels MALDI-Massenspektrometrie

identifizierten Protein (ZP_02477753). Bei einem Teil der Proben derselben Gruppe

(Probe 2, 4, 5, 8, 11, 14, 15, 16, 17, 19, 20 und 21) existiert jeweils eine Überein-

stimmung mit einem zweiten Protein (je ein Peptid). Dieses weist in der Datenbank

insgesamt nur eine Länge von 21 Aminosäuren auf und ergibt in der BLAST-Suche

eine Homologie zu demselben OMP P2-Protein (identische Aminosäuren = 20/21 [95

%], ähnliche Aminosäuren = 20/21 [95 %]). Bei einem beschriebenen OMP P2

Protein von H. influenzae (AAA24993) handelt es sich um ein Porin. Im Vergleich

beider Proteine weisen sie 130 von 381 (34 %) identische sowie 196 von 381 (51 %)

ähnliche Aminosäuren auf.

D Ergebnisse 83

Aus Gruppe 2 (Bandengröße >200 kDa) ergaben nur Probe 3 und 7 Überein-

stimmungen. Probe 3 wies ein identisches Peptid mit dem hypothetischen Protein

HPS_03084 (ZP_02479473) von H. parasuis auf, von welchem in der Datenbank 154

Aminosäuren bzw. 465 bp vorliegen, jedoch kein Hinweis auf eine mögliche Funk-

tion. Aus Probe 7 war ein Peptid identisch mit der größeren Untereinheit der Pseudo-

uridin-Synthase B (ribosomal large subunit pseudouridine synthase B) von H. pa-

rasuis (ZP_02477992). Die in der Datenbank verfügbare Sequenz beträgt 339

Aminosäuren (s. Anhang Tab. 34).

Abb. 21 Beispielhaftes Spektrum der massenspektrometrischen Untersuchung mittels Q-TOF (Probe 6)

D Ergebnisse 84

4 Entwicklung einer Multiplex-PCR

Mit dem Ziel, zukünftig in einer diagnostischen PCR virulente von avirulenten H. pa-

rasuis Stämmen unterscheiden zu können, wurden Fragmente, die spezifisch für

Serotyp 5 waren und zudem in überwiegend als virulent bekannten Referenz-

stämmen (KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON 1992) vorkamen, zur Entwicklung

einer Multiplex-PCR ausgewählt. Hierbei handelte es sich um hhdA, hhdB und cirA.

Als Kontrolle, ob es sich bei der zu untersuchenden Probe tatsächlich um H. parasuis

handelte, wurden Primer für ein Genfragment, welches für die 16S rDNA kodiert

(OLIVEIRA et al. 2001), mit in die PCR integriert.

4.1 Primerkonstruktion

Für drei der zu integrierenden Sequenzen wurden Primer konstruiert (Programm

Primer3, http://fokker.wi.mit.edu/primer3/input.htm, Version 0.4.0). Als Kriterien wur-

de ein Größenunterschied der PCR-Produkte von mindestens 100 bp festgelegt, um

sie in der Gelelektrophorese gut voneinander abgrenzen zu können, eine maximale

Größe von 1000 bp und eine minimale Produktgröße von 120 bp. Zudem betrug die

geforderte optimale Annealingtemperatur 62 °C, um eine hohe Spezifität zu er-

reichen.

Für das Genfragment der 16S rDNA existierten bereits Primer (Hps-f und -r,

(OLIVEIRA et al. 2001), welche ein PCR-Produkt von 821 bp amplifizieren. Diese

wurden unverändert eingesetzt. Für das Fragment hhdA wurden die Primer oMP_A1

und 2 benutzt (Fragmentgröße 964 bp), für hhdB die Primer oMP_B1 und 2 (557 bp)

und für cirA die Primer oMP_CirA1 und 2 (135 bp). Die gewählten PCR-Bedingun-

gen: 94 °C/3:00 min, 32 x (94 °C/1:00 min, 62 °C/0:45 min, 72 °C/1:30 min), 72

°C/10:00 min..

4.2 Überprüfung der Spezifität

Sämtliche Primerpaare wurden in der PCR anhand von Ganzzelllysaten anderer

Bakterien bzw. Eukaryoten (je ein Stamm von Candida albicans, Mucor ssp., E. coli

DH5-α, Klebsiella pneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Pasteurella multocida,

Histophilus somni, A. minor, A. indolicus und A. suis sowie zwei Stämme von A. por-

D Ergebnisse 85

cinus, s. Anhang Tab. 25) auf ihre Spezifität überprüft (s. Abb. 22). In keinem der

Ansätze entstand ein Amplifikat. Zum Nachweis des DNA-Gehaltes in allen Bak-

terienproben wurden universelle Primer erstellt (oRNA_1 und oRNA_2, basierend auf

der 16S rDNA) und in einer PCR mit den Bakterien eingesetzt. Alle Proben ergaben

ein 892 bp großes Amplifikat. Für die Eukaryoten wurde eine PCR mit den univer-

sellen Primern 5_8SR und LR7 durchgeführt (http://www.biology.duke.edu/fungi/

mycolab/ primers.htm), welche auf der großen Untereinheit ribosomaler DNA (60S)

von Eukaryoten basieren und eine unterschiedliche Produktgröße ergeben (C. albi-

cans ca. 1,7 kb, Mucor ssp. ca. 950 bp, s. Abb. 22).

Abb. 22 PCR zum Nachweis des DNA-Gehalts mittels universeller Primer (A) mit Eukaryoten (I) und Bakterien (II), bzw. Multiplex-PCR zur Spezifitätsun-tersuchung der eingesetzten Primer (B), A: (I) (1) Candida albicans, (2) Mucor ssp., (B) H. parasuis, Referenz-stamm von Serotyp 5, (-) Negativkontrolle mit Aqua dest.; (II) (1) E. coli DH5-α, (2) Klebsiella pneumoniae, (3) Bordetella bronchiseptica, (4) Pasteurella multocida, (5) A. minor, (6) A. indolicus, (7) A. suis, (8, 9) A. porcinus, (10) Histophilus somni, (-) Negativkontrolle mit Aqua dest., (+) Positivkontrolle mit H. parasuis, Referenzstamm von Serotyp 5 B: (I) (1) Candida albicans, (2) Mucor ssp., (+) Positivkontrolle mit der internen Kontrolle, (-) Negativkontrolle mit Aqua dest.; (II) (1) E. coli DH5- α, (2) Klebsiella pneumoniae, (3) Bordetella bronchiseptica, (4) Pasteurella multocida, (5) A. minor, (6) A. indolicus, (7) A. suis, (8, 9) A. porcinus, (10) Histophilus somni, (-) Negativkontrolle mit Aqua dest., (+) Positivkontrolle mit der internen Kontrolle Universelle Primer für A: 5_8SR, LR7 (60S rDNA) Universelle Primer für B: P7-f/r (16S rDNA)

D Ergebnisse 86

4.3 Optimierung der PCR-Bedingungen

Da die Primer PCR-Produkte von unterschiedlichen Größen amplifizierten, wiesen

sie von groß nach klein zunehmende Amplifikationsraten auf, wenn sämtliche Primer

in gleicher Konzentration eingesetzt wurden. Um gleich starke Banden zu erhalten,

wurden deshalb die Primerpaare in unterschiedlicher Konzentration eingesetzt, bis

sich ein einheitliches Bild ergab (s. Abb. 23). Hierbei wurde nach dem Prinzip der

Endpunkt-PCR vorgegangen, das heisst die Primer für die kleineren und in der PCR

bevorzugt amplifizierten Fragmente wurden in so geringer Menge hinzugegeben,

dass sie nach Erreichen der gewünschten Bandenstärke aufgebraucht waren und

danach die größeren Fragmente amplifiziert wurden, bis auch sie die gewünschte

Bandenstärke erreicht hatten. Von den Primern oMP_A1 und 2 wurden pro Ansatz je

3,2 µl (40 pmol) eingesetzt, von Hps-f und -r je 2,8 µl (20 pmol), oMP_B1 und 2 4,0 µl

(5 pmol) und von den Primern oMP_CirA1 und 2 je 2,5 µl (5 pmol).

Zum Einstellen der Konzentrationen wurde eine Verdünnung chromosomaler DNA

des Referenzstammes 5 verwendet, da diesem die den Primern zugrunde liegenden

Sequenzen entstammen.

4.4 Interne Kontrolle

Um sicherzustellen, dass zwischen falsch negativen und richtig negativen Proben

unterschieden werden kann, wurde eine interne Kontrolle entwickelt (s. Abb. 23).

Falsch negative Ergebnisse entstehen vor allem durch Hemmstoffe im eingesetzten

Probenmaterial, welche die Entstehung eines Amplifikats sowohl im Probenansatz,

als auch im Kontrollansatz verhindern. Hierfür wurde in vier verschiedenen Ansätzen

mit den vier Primerpaaren das entsprechende PCR-Produkt amplifiziert und mit dem

StrataClone PCR Cloning Kit® (Stratagene, La Jolla, USA) zunächst in den Vektor

pSC-A kloniert und dann in die dazu gehörigen kompetenten Zellen transformiert.

Aus einer Schüttelkultur mit 3 ml Medium wurde für jede Probe eine Plasmid-

präparation durchgeführt und deren DNA-Gehalt auf einem TBE-Gel überprüft.

Anschließend erfolgte die Mischung zu gleichen Teilen. Da bei der Verwendung einer

Mischung von Plasmiden als PCR-Template ebenfalls die kleineren Inserts bevorzugt

amplifiziert werden, das Ziel jedoch eine möglichst gleichmäßige Amplifikation der

D Ergebnisse 87

Fragmente war, wurde eine Feinjustierung der Plasmidverhältnisse durch Zugabe

einzelner Plasmidfraktionen und/oder Verdünnungsschritte vorgenommen. Als inter-

ne Kontrolle wurde die 1:50-Verdünnung einer Stocklösung mit folgender Endkon-

zentration eingesetzt: 0,03 µg Plasmid oMP_A1 und 2/µl, 0,001 µg von Plasmid Hps-

f und -r/µl, 0,003 µg Plasmid oMP_B1 und 2/µl und 0,001 µg Plasmid oMP_CirA1

und 2/µl. Die PCR-Bedingungen und Primerkonzentrationen wurden aus den An-

sätzen mit chromosomaler DNA übernommen.

Der Einsatz der internen Kontrolle erfolgte derart, dass jeder Ansatz einer zu unter-

suchenden Probe doppelt ausgeführt wurde. Der erste Ansatz enthielt ausschließlich

Probenmaterial, dem zweiten wurde 1 µl des Plasmidgemisches hinzugefügt und

enthielt somit die zur Amplifikation jeder Bande notwendige DNA. Eine optisch sicht-

bare Bande wurde unabhängig von ihrer Stärke als positiv beurteilt.

500 bp

1000 bp

500 bp

1000 bp

I II

M M

Abb. 23 Multiplex-PCR mit chromosomaler DNA von Serotyp 5 (I) und der in-ternen Kontrolle (II) Hierbei handelt es sich um ein Plasmidgemisch, welches als Inserts Template für alle vier eingesetzten Primerpaare enthält.

4.5 Überprüfung der Referenzstämme

Die Anwendung der entwickelten Multiplex-PCR wurde zunächst an aufgereinigter

DNA der Referenzstämme der 15 Serotypen durchgeführt. Die Verteilung innerhalb

dieser Stämme in der Monoplex-PCR ist aus Tabelle 3 ersichtlich, eine Übersicht der

Ergebnisse aus dem Multiplex-Ansatz gibt Abbildung 24. Jede Probe wurde im Dop-

D Ergebnisse 88

pelansatz durchgeführt, dem zweiten Ansatz wurde zusätzlich zum Gesamtvolumen

1 µl der internen Kontrolle zugefügt.

Alle Referenzstämme ergaben ein Produkt mit den Primern Hps-f und -r, für 1-4 und

6-11 handelte es sich um die einzige Bande. Die Referenzstämme 5, 12 und 14

zeigten mit allen vier Primerpaaren ein deutliches Amplifikat, 13 und 15 wiesen

neben der deutlichen Bande für die Fragmente hhdA und cirA nur ein schwaches

Produkt mit den Primern oMP_B1 und 2 auf.

Im Vergleich zur Untersuchung der Referenzstämme mit den Primern oMP_A1 und

2, oMP_B1 und 2 und oMP_CirA1 und 2 im Monoplex-Ansatz zeigte sich, dass die

Ergebnisse für oMP_A1 und 2 und oMP_B1 und 2 übereinstimmten, bei Probe 3 in

der Multiplex-PCR jedoch keine Bande mit den Primern oMP_CirA1 und 2 entstand,

wohingegen im Monoplex-Ansatz eine schwache Bande auftrat.

Eine Zusammenfassung der Ergebnisse in tabellarischer Form findet sich im Anhang

in Tabelle 26.

D Ergebnisse 89

Abb. 24 Multiplex-PCR der Referenzstämme 1-15, im zweiten Ansatz (+) jeweils mit Zusatz von 1 µl Interner Kontrolle (-) Negativkontrolle, (+) Positivkontrolle mit Interner Kontrolle, zur Überprüfung auf das Vorhandensein der postulierten Virulenzmarker hhdA, hhdB und cirA.

4.6 Überprüfung der aus pneumonischen Lungen isolierten Feld-stämme

Bei der Untersuchung der Feldstämme wurde auf den Einsatz der internen Kontrolle

für jede einzelne Probe verzichtet und diese beispielhaft für alle Ansätze neben der

Negativkontrolle mitgeführt. Die Multiplex-PCR der 16 aus pneumonischen Lungen

isolierten Feldtämme wurde mit Bakterienlysat durchgeführt, neun Isolate ließen nur

den Speziesnachweis zu und wiesen keine Produkte für virulenzassoziierte Gene auf

(s. Abb. 25). Vier Stämme zeigten zusätzlich eine Bande für das Produkt aus den

Primern oMP_A1 und 2 und oMP_CirA1 und 2 und nur zwei Isolate wiesen für alle

vier Primerpaare ein Produkt auf.

Der Vergleich beider PCR-Ansätze (Mono- und Multiplex-PCR) ergab für die aus

pneumonischen Lungen isolierten Feldstämme die größten Abweichungen. Aus

Probe 1 wurde mit den Primern oMP_A1 und 2 in der Multiplex-PCR ein sehr

schwaches Amplifikat erzeugt, welches im Monoplex-Ansatz nicht vorhanden war.

Die Primer oMP_B1 und 2 ergaben im Monoplex-Ansatz ein deutliches Produkt für

D Ergebnisse 90

die Stämme 4 und 5. Im Multiplex-Ansatz fehlte die Bande für Probe 4 komplett, für

Probe 5 war sie sehr schwach. Auch in Probe 6, 10 und 14 wurde das Gen im

Monoplex-Ansatz mit einer schwachen Bande nachgewiesen sowie in Probe 8, 12

und 13 mit einer deutlichen. Alle diese Stämme zeigten in der Multiplex-PCR kein

Amplifikat. Für das Gen cirA stimmten die Ergebnisse für die Proben 3-5, 8, 12 und

13 überein, welche alle im Monoplex-Ansatz eine starke Bande ergeben hatten. Die

Proben 6, 7, 9-11 und 14-16 wiesen im selben Ansatz nur ein schwaches Amplifikat

auf und waren im Multiplex-Ansatz negativ.

Eine Übersicht der Ergebnisse befindet sich im Anhang (s. Anhang Tab. 27).

1.1 Überprüfung der systemisch isolierten Feldstämme

Fünf der zehn überprüften systemisch isolierten Stämme wiesen in der PCR mit

Bakterienlysat ausschließlich die Bande für den Speziesnachweis auf (Hps-f und -r)

(s. Abb. 25). Die anderen fünf Isolate zeigten zusätzlich Amplifikate für die virulenz-

assoziierten Marker hhdA und cirA. Für den Marker hhdB waren sämtliche Stämme

negativ.

Im Multiplex-Ansatz ergaben die Primer oMP_A1 und 2 mit der Probe Maas 1 im

Gegensatz zum Monoplex-Ansatz eine Bande. Dieses Resultat konnte bei wieder-

holten Ansätzen jedoch nicht reproduziert werden, da die Ergebnisse beider PCR-

Ansätze für diese Probe stets übereinstimmten. Probe 9 ergab im Monoplex-Ansatz

eine schwache Bande, in der Multiplex-PCR jedoch keine. Im Multiplex-Ansatz ergab

keine Probe eine Bande mit den Primern oMP_B1 und 2, in der Monoplex-PCR

ergaben jedoch die Stämme 5, 8 und 10 eine schwache Bande. Auch für das

Primerpaar oMP_CirA1 und 2 ergaben sich abweichende Ergebnisse, da der Multi-

plex-Ansatz für Stamm 1 eine Bande ergab, die im Monoplex-Ansatz nicht vorkam,

und der umgekehrte Fall trat bei Probe 9 auf.

Eine Zusammenfassung der Ergebnisse in tabellarischer Form findet sich im

Anhang, Tabelle 28.

D Ergebnisse 91

1.1 Überprüfung der nasal isolierten Feldstämme

Die Hälfte der nasal isolierten Stämme zeigten in der PCR mit Bakterienlysat nur das

speziesspezifische PCR-Produkt mit den Primern Hps-f und -r, vier andere wiesen

für alle vier Primer ein Amplifikat auf (s. Abb. 25). Zwei Isolate hatten nur ein Produkt

mit den Primern oMP_A1 und 2 und oMP_CirA1 und 2, nicht jedoch mit den Primern

oMP_B1 und 2.

Der Vergleich zwischen Monoplex- und Multiplex-Ansatz ergab, dass die Stämme 11

und 12 in der Multiplex-PCR keine Bande für das Gen hhdB aufwiesen, in der Mono-

plex-PCR jedoch schon. Zudem ergaben die Stämme 2, 3, 4 und 9 im Monoplex-

Ansatz schwache Banden mit den Primern oMP_CirA1 und 2, nicht jedoch im Multi-

plex-Ansatz.

Eine Tabelle zur Übersicht der Ergebnisse befindet sich im Anhang (s. Anhang Tab.

29).

D Ergebnisse 92

Abb. 25 Multiplex-PCR der Feldstämme zur Überprüfung auf das Vorhanden-sein der postulierten Virulenzmarker hhdA, hhdB und cirA. A: 16 Isolate aus pneumonischen Lungen B. zwölf nasale Isolate C: zehn Isolate aus systemischen Läsionen (-) Negativkontrolle, (+) Positivkontrolle mit interner Kontrolle

4.7 Überprüfung weiterer Feldstämme

Eine Anzahl von 214 weiteren Feldstämmen wurde ebenfalls anhand von Bakterien-

lysaten mittels der entwickelten Multiplex-PCR untersucht (s. Abb. 26 und 27).

Hierbei handelt es sich um die Stammsammlung eines diagnostischen Labors

D Ergebnisse 93

welche sich aus eingesandten Proben des norddeutschen Raumes zusammensetzt.

Der überwiegende Teil der Stämme wurde mit den Daten des Einsenders übermittelt,

so dass eine Aussage zur Klinik des jeweiligen Tieres oder dem Isolationssort des

Stammes in unterschiedlicher Ausführlichkeit möglich war. Offen blieb oftmals je-

doch, um welchen isolierten Stamm es sich bei dem Gefrierstock handelte, wenn der

Erreger in mehreren klinischen Materialien desselben Tieres nachgewiesen wurde.

Die auf Kochblutagar mit NAD-Zusatz ausgestrichenen Isolate wiesen unterschied-

liche Koloniemorphologien auf. Die Größe reichte von ca. 0,5 bis 1,5 mm Durch-

messer, zudem variierten die Kolonien in Farbe (grau, weiß oder selten auch leicht

gelb) und Transparenz. Diese Erscheinungsbilder fanden sich in Einzelfällen auch

innerhalb eines einzigen Isolates wieder, dieses hatte jedoch keinen Einfluss auf die

Ergebnisse des Stammes in der Multiplex-PCR, das heisst diese waren für alle Mor-

phologieformen eines Isolates identisch.

Eine Tabelle mit den einzelnen Ergebnissen der Stämme findet sich im Anhang

(s. Anhang Tab. 30), eine Übersicht der Verteilung der Gene bzw. ihrer nachge-

wiesenen Kombinationen findet sich in den Abbildungen 26 und 27.

Jeder der 214 Feldstämmen ergab in der Multiplex-PCR eine Bande für den Spe-

ziesnachweis (Primerpaar Hps-f und -r), bei 141 Isolaten (65,9 %) handelte es sich

um die einzige Bande. Insgesamt konnte für 71 Stämme (33,2 %) zusätzlich das Gen

hhdA nachgewiesen werden, für zehn Stämme (4,7 %) das Gen hhdB und für 73

Stämme (34,1 %) das Gen cirA. 61 Stämme (28,5 %) trugen gleichzeitig die Gene

hhdA und cirA, und zehn (4,7 %) Stämme ergaben zusätzlich auch ein Amplifikat für

das Gen hhdB. Bei zwei Stämmen wurde neben dem Speziesnachweis ausschließ-

lich ein Produkt mit den Primern oMP_CirA1 und 2 ermittelt, wohingegen kein Stamm

nur für die Primer oMP_A1 und 2 oder oMP_B1 und 2 ein Amplifikat ergab.

Eine Gruppe von 20 Stämmen lässt gemäß Vorbericht einen invasiven Stamm

vermuten, da es sich z. B. um Tiere mit ZNS-Läsionen oder Gelenkschwellung han-

delt, bzw. Betriebe mit gehäuften plötzlichen Todesfällen. Der Erregernachweis er-

folgte jedoch nicht oder nicht eindeutig aus systemischen Läsionen. 15 dieser Stäm-

me zeigen ausschließlich ein Amplifikat mit den Primern Hps-f und -r, vier ergaben

D Ergebnisse 94

zusätzlich eine Bande für die Gene hhdA und cirA, und ein Stamm wies Amplifikate

mit allen vier Primerpaaren auf. Bei den anderen neun Stämmen, bei denen alle vier

Gene nachgewiesen wurden, handelte es sich in vier Fällen um Kümmerer, in einem

Fall um ein Tier mit Atemwegsproblemen und bei drei Tieren fehlten die Angaben zur

Klinik des Tieres.

Abb. 26 Vorkommen der identifizierten Gene hhdA, hhdB und cirA in den 214 Feldstämmen verschiedener Lokalisationen, Angaben in Prozent. In 66 % der Stämme wurde kein putativer Virulenzmarker nachgewie-sen.

Abb. 27 Ermittelte Kombinationen der putativen Virulenzmarker hhdA, hhdB und cirA in den 214 Feldisolaten unterschiedlicher Lokalisation, Anga-ben in Prozent. In 66 % der Stämme wurde kein putativer Virulenzmarker nachgewie-sen.

D Ergebnisse 95

5 Infektionsversuch am Schwein mit H. parasuis

Mit dem Ziel, die Virulenz einzelner Stämme von H. parasuis überprüfen zu können,

wurde ein Infektionsversuch zur Entwicklung eines Tiermodells am Schwein vorge-

nommen. Eine tabellarische Übersicht der Ergebnisse findet sich im Anhang I6.

Die zwölf Ferkel wurden in drei Gruppen zu je vier Tieren aufgeteilt, bei Gruppe zwei

und drei handelte es sich um die Versuchsgruppen, bei Gruppe 1 um die Kontroll-

gruppe. Allen Tieren wurde am Tag nach der Ankunft Blut zur Untersuchung auf

Antikörper gegen H. parasuis entnommen, welcher bei sämtlichen Tieren negativ

ausfiel. Zudem wurden bei den Tieren eine Tonsillenkratzprobe und ein Nasentupfer

zur kulturellen Untersuchung entnommen. Der Erreger konnte kulturell bei sechs

Tieren gering- bis mittelgradig nachgewiesen werden, per PCR sogar bei allen zwölf

Tieren. Als PCR-Template diente hier resuspendiertes Koloniematerial der Tonsillen-

tupferproben.

5.1 Infektion mit dem Referenzstamm für Serotyp 12

Zum Zeitpunkt der Infektion zeigte kein Tier klinische Symptome einer Erkrankung

oder Antikörper gegen H. parasuis. Die Kontrollgruppe (Tier 1, 4, 7 und 8) wurde

intratracheal mit 5 ml Kochsalzlösung belastet, Gruppe 2 (Tier 2, 5, 11 und 12)

bekam intratracheal 2 x 108 Bakterien (Gesamtvolumen 5 ml) des Referenzstammes

von Serotyp 12 verabreicht und für Gruppe 3 (Tier 3, 6, 9 und 10) wurden 1,1 x 1010

Keime desselben Stammes in der Aerosolkammer vernebelt (Gesamtvolumen 15

ml).

5.2 Klinische Symptome in den belasteten Tieren

Die Tiere wurden über acht Tage täglich überwacht. Die Tiere der Kontrollgruppe

zeigten zu keinem Zeitpunkt Lethargie, Husten, Dyspnoe, Appetitmangel, neurolo-

gische Symptome oder einen aufgekrümmten Rücken. Die gemessene Rektaltempe-

ratur lag im gesamten Untersuchungszeitraum zwischen 38,6 und 40,1 °C, einmalig

auch 40,5 °C.

D Ergebnisse 96

Tier 2 der intratracheal belasteten Gruppe wies über den gesamten Beob-

achtungszeitraum keine Krankheitssymptome auf. Bei den Tieren 5 und 12 waren

geringgradige respiratorische Symptome in Form von Husten und Niesen zu beob-

achten. Dieses begann am ersten Tag nach der Belastung und dauerte bis zum ach-

ten Tag (Tag der Euthanasie) an, die Ausprägung blieb jedoch konstant. Ihre Tempe-

raturen schwankten zwischen 38,1 und 39,7 °C, bei Tier 12 wurde an Tag 5 jedoch

ein kurzer Anstieg auf 40,8 °C gemessen. Beide Tiere zeigten zu keiner Zeit ein

beeinträchtigtes Allgemeinbefinden. Bei Tier 11 wurde am Abend des zweiten Tages

nach der Infektion eine Temperatur von 40,6 °C gemessen, die bereits am nächsten

Morgen auf 39,2 °C gesunken war. Jedoch fiel das Tier an Tag 3 mit zunächst

gering- und später mittelgradigem Appetitmangel auf, welcher sich bis zum Tag der

Sektion fortsetzte. An Tag 5 und 6 post infectionem wurde eine Temperatur von 41,0

bzw. 40,4 °C gemessen, an Tag 6 kamen Bewegungsunlust mit einem geringgradig

aufgekrümmten Rücken und geringgradiger Lethargie hinzu (s. Abb. 28). Bis zum

Sektionstag hatte sich der Zustand normalisiert und das Tier zeigte keine Symptome

mehr.

In der aerosolbelasteten Gruppe zeigte keines der vier Tiere ein beeinträchtigtes

Allgemeinbefinden. Tier 6 zeigte während des gesamten Beobachtungszeitraums

keinerlei Symptome. Jedoch fielen die anderen drei Tiere mit geringgradigem Husten

und Niesen auf, wovon Tier Nr. 3 zusätzlich gelegentlich geringgradigen Appetit-

mangel aufwies und Nr. 10 an Tag 2 post infectionem eine Rektaltemperatur von

40,3 °C. Die Rektaltemperaturen schwankten ansonsten zwischen 38,2 und 40,1 °C.

5.3 Pathomorphologische Veränderungen

An Tag acht bzw. neun wurden die Ferkel nach einer intramuskulären Anästhesie

(Stresnil® und Ursotamin®, intramuskuläre Gabe von 2 mg Azaperon/kg KGW und 20

mg Ketamin/kg KGW) intravenös mit 4 ml Eutha® 77 euthanasiert.

Pathomorphologisch waren acht Tiere vollkommen unauffällig. Der Lungenanschnitt

von Tier 3 ergab gering- bis mittelgradige Eiteransammlungen in den Bronchien der

rechten Lunge, zudem waren der rechte und linke Spitzenlappen mittelgradig atelek-

tatisch. Ebenfalls atelektatisch waren 2/3 des Lobus accessorius von Tier 10 und ein

D Ergebnisse 97

ca. 1 cm2 großer Bereich im rechten Spitzenlappen von Tier 12. Tier 11 wies Ver-

klebungen über mehrere cm2 zwischen Lunge und Brustwand auf, die sich jedoch

ohne Substanzverlust lösen ließen. Die Lunge des Tieres war insgesamt gering-

gradig vergrößert und zeigte mittelgradige Fibrinauflagerungen. Im Anschnitt der

rechten Lunge wurde ein etwa erbsengroßer Abszess sichtbar, das restliche Lun-

gengewebe war unauffällig. Auch im Herzbeutel befand sich eine mittel- bis hoch-

gradige Fibrinansammlung. In der Bauchhöhle fanden sich auf Leber und Darm

ebenfalls mittelgradige Fibrinauflagerungen, die Milz quoll leicht über die Schnitt-

fläche empor (s. Abb. 28).

I

II

III

IV

V

Abb. 28 Tier 11 nach der Infektion mit dem Referenzstamm von Serotyp 12 (I) Klinische Symptome: Aufgekrümmter Rücken

Sektionsbefunde: (II) Fibrinauflagerungen in der Bauchhöhle, hier auf der Milz (III) Perikarditis (IV) Verklebungen zwischen Lunge und Brustwand (V) Aufsicht der Lunge mit Fibrinauflagerungen

Die Reisolierung ergab M. hyorhinis.

D Ergebnisse 98

5.4 Reisolierung von H. parasuis, Referenzstamm für Serotyp 12

Während der Sektion wurden bei allen zwölf Tieren Tupferproben aus der Nasen-

höhle, dem Brust- und Bauchraum, dem Herzbeutel, einem Kniegelenk und von den

Meningen des Großhirns entnommen, zudem Organproben von Lunge, Lungen-

lymphknoten und Tonsillen. Sämtliche Proben wurden parallel auf Kochblutplatten

mit NAD-Zusatz, Blut- und Gassneragar sowie CSB-Agar ausgestrichen. Die Bebrü-

tung der Blut- und Gassnerplatten erfolgte aerob, die der Kochblut- und CSB-Platten

unter Zusatz von 5 % CO2. Verdächtige Kolonien (glattrandig, feucht, weiß-grau und

transparent) wurden auf Blutplatten mit einer Staphylococcus aureus-Amme subkul-

tiviert, NAD-abhängig wachsende Stämme mittels PCR überprüft (s. Anhang Tab.

31). Die Verteilung der reisolierten Proben bei den einzelnen Tieren sowie die Stärke

des Befalls gehen aus der Tabelle im Anhang hervor (I6).

Zusammenfassend wurde aus elf von zwölf Tieren nach der Infektion kulturell H. pa-

rasuis nachgewiesen und bei allen elf Tieren war der Nasentupfer positiv. Bei sieben

von elf positiv getesteten Tieren wurde der Erreger zusätzlich aus der Lunge isoliert,

bei drei von elf Tieren aus der Tonsille, bei zwei Tieren im Herzbeutel bzw. von den

Meningen und bei einem Tier von der Pleura. Von den sieben aus der Lunge

isolierten Proben stammten eine aus der Kontrollgruppe, drei aus der intratracheal

und drei aus der per Aerosol belasteten Gruppe. Die drei positiven Proben aus der

Tonsille gingen auf je ein Tier aus jeder Gruppe zurück, die beiden aus dem Herz-

beutel isolierten Proben kamen beide von Tieren aus der Kontrollgruppe. Die Proben

von den Meningen entstammten einem Tier aus der aerosol- und einem Tier aus der

intratracheal belasteten Gruppe, die Probe aus dem Pleuratupfer von einem Tier der

intratrachealen Gruppe. Insgesamt wurden 58 reisolierte Stämme von H. parasuis als

Gefrierkultur konserviert. Davon stammten 34 aus Nasentupfern, 14 aus Lungen-

proben, vier von Perikardtupfern, eine aus einem Pleuratupfer, zwei aus Meningen-

tupfern und drei aus Tonsillenproben.

Die Tupferproben von Bauch- und Brusthöhle der Tiere, die in der PCR-Unter-

suchung auf Mycoplasma (M.) hyorhinis positiv waren (s. Anhang Tab. 38) wurden

eine Woche nach Probenentnahme durch die diagnostische Abteilung des Instituts

D Ergebnisse 99

für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover auch kulturell auf

M. hyorhinis untersucht. Die Proben von Tier Nummer 11 waren positiv.

5.5 PCR-Untersuchungen der reisolierten Stämme

Neben der kulturellen Untersuchung wurde von den Kochblut- und Blutplatten der

Nasentupfer und Tonsillenprobe Koloniematerial in Aqua dest. resuspendiert und mit

den Primern Hps-f und -r in der PCR untersucht. Die Proben der Nasentupfer waren

bei allen Tieren positiv, die Organproben der Tonsillen bei neun Tieren.

Zusätzlich wurden in der Sektion von jedem Tier Sammelproben der serösen Häute

von Bauch- und Brusthöhle in Form von Trockentupfern sowie ein Stück Lunge

entnommen und durch die IVD GmbH mittels PCR auf H. parasuis und M. hyorhinis

untersucht. Für H. parasuis war Tier 7 aus der Kontrollgruppe im Sammeltupfer posi-

tiv, gleiches gilt für die Tiere 10 (Aerosolgruppe) und 11 (intratracheale Belastung).

Die Tiere 11 und 12 aus der intratracheal belasteten Gruppe waren in der PCR aus

Lungenmaterial für H. parasuis positiv. Bei den Untersuchungen auf M. hyorhinis

waren die Sammeltupfer der Kontrolltiere negativ, die Sammeltupfer der Tiere 5 und

11 (intratracheale Belastung) sowie 10 (Aerosolgruppe) waren jedoch positiv.

Um die einzelnen reisolierten Stämme näher zu charakterisieren wurde eine RFLP-

PCR mit den für H. parasuis speziesspezifischen Primern tbpA33 und tbpA55 (DE LA

PUENTE REDONDO et al. 2003) durchgeführt (s. Abb. 29). Von den 58 unter-

suchten Stämmen ergab einer zwar ein Produkt in der PCR mit den Primern Hps-f

und -r, aber keines mit den Primern der RFLP-PCR. Bei den restlichen 57 Stämmen

glich das Bandenmuster von 51 Stämmen dem von Serotyp 5, 12, 14 und 15 (DE LA

PUENTE REDONDO et al. 2003), sechs Stämme zeigten einheitlich ein Muster,

welches bislang noch nicht beschrieben wurde (s. Abb. 29). Die Stämme mit diesem

Muster wurden aus Nasentupfern, Lunge und Tonsillenproben reisoliert. Von sieben

Stämmen, die von systemischen Lokalisationen reisoliert wurden (Hirn, Perikard und

Pleura), gehörten sechs dem RFLP-Muster von Serotyp 5, 12, 14 und 15 an, bei dem

siebten handelte es sich um jenen Stamm, welcher kein Amplifikat ergab.

D Ergebnisse 100

Unter den zwölf Stämmen, welche bereits vor der Infektion aus der Nase isoliert

wurden, war ebenfalls einer, der sich zwar mit den Hps-Primern als H. parasuis ein-

stufen ließ, jedoch kein Produkt mit den RFLP-Primern ergab. Sechs der restlichen

elf Stämme wies das gleiche Fragmentmuster wie der Referenzstamm von Serotyp

12 auf, die übrigen fünf zeigten das bislang nicht beschriebene Muster.

Abb. 29 RFLP-PCR mit den isolierten Feldstämmen der Versuchstiere (I) vor der Belastung (A) (II) nach der Belastung, intratracheale Infektion (III) nach der Belastung, Infektion per Aerosolkammer (IV) nach der Belastung, Kontrollgruppe

Die Amplifikate einer PCR mit Bakterienlysat und den Primern tbpA33 und tbpA55 (1,9 kb) wurden mit dem Enzym RsaI verdaut und das Schnittmuster mit dem der Referenzstämme verglichen. Das sich aus Serotyp 12 (Belastungsstamm) ergebende Muster ist in Bild I (B) er-sichtlich.

D Ergebnisse 101

Zusätzlich wurde an den zwölf vor der Infektion aus Nasentupfern reisolierten

Stämmen sowie den 58 Stämmen nach der Infektion eine PCR mit den Primern

oPhage13_1 und 2 durchgeführt. Die vor der Infektion aus den Versuchstieren

isolierten Stämme waren in sechs Fällen schwach positiv, hierbei handelte es sich

um die Stämme, welche das gleiche RFLP-Muster wie die Serotypen 5, 12, 14 und

15 aufwiesen. Von den nach der Infektion isolierten Stämmen waren 18 deutlich

positiv und vier weitere schwach positiv. Alle positiven Stämme gehörten der glei-

chen RFLP-Gruppe an wie Serotyp 12. Von den insgesamt 22 positiven Stämmen

post infectionem wurden zehn aus Lungenproben reisoliert, elf aus Nasentupfern und

einer aus der Tonsille.

Eine Übersicht der reisolierten Proben, ihre RFLP-Gruppen sowie das Ergebnis der

PCR mit den Primern oPhage13_1 und 2 findet sich im Anhang (s. Anhang Tab. 31).

5.5.1 Untersuchung der reisolierten Stämme mittels Multiplex-PCR

53 von 58 reisolierten Proben wiesen in der Multiplex-PCR mit Bakterienlysat eine

Bande mit den Primern Hps-f und -r auf, die restlichen fünf zeigten dieses nur in der

Monoplex-PCR. 51 Proben (87,9 %) zeigten eine Bande für das Gen hhdA, 48

(82,7 %) für das Gen hhdB und 49 Proben (84,5 %) für das Gen cirA. 48 Stämme

(82,7 %) wiesen alle drei Virulenzmarker auf, fünf Stämme keinen (9,4 %). Ein

Stamm zeigte zwar eine Bande für die Gene hhdA und cirA, nicht aber für hhdB. Alle

Stämme, die ein Amplifikat mit den Primern oMP_B1 und 2 ergaben, zeigten auch

eines für die beiden anderen Virulenzmarker. Fünf von sechs systemisch isolierten

Stämmen trugen alle drei virulenzassoziierten Gene, der sechste zeigte für keins der

Gene ein PCR-Produkt (keine Abbildung). Eine Übersicht der PCR-Ergebnisse findet

sich im Anhang, Tabelle 31.

E Diskussion 102

E Diskussion

1 Identifizierung von virulenzassoziierten Genen

H. parasuis ist als Verursacher der Glässerschen Krankheit und anderer Erkrankun-

gen für große wirtschaftliche Verluste in der Schweinefleischproduktion verantwort-

lich. Es sind vor allem Betriebe mit einem hohen Hygienestatus betroffen, wenn Fer-

kel nach dem Absetzen umgestallt oder aufgrund unterteilter Produktionseinheiten

nach dem Transport einem anderen Keimspektrum ausgesetzt werden.

Der Erreger ist weltweit verbreitet und nahezu alle Betriebe sind infiziert. Er wird

sowohl bei klinisch unauffälligen Tieren aus der Nasenhöhle isoliert, als auch bei

erkrankten Tieren aus der Lunge oder systemischen Lokalisationen, wie Gelenken,

Meningen und der Bauch- oder Brusthöhle, weshalb er als fakultativ pathogener

Keim gilt. Bislang ist unbekannt, worin die variablen Auswirkungen einer Infektion

begründet sind. Als Ursachen kommen grundsätzlich Unterschiede in der gene-

tischen Ausstattung einzelner Stämme, ihrer Proteinexpression sowie dem Immun-

status des Wirts infrage. In dieser Studie wurde daher sowohl auf genetischer Ebene

als auch auf der Ebene der Proteinexpression nach Unterschieden zwischen Isolaten

mit unterschiedlichem Virulenzpotenzial gesucht. Da eine Voraussage über die

Virulenz eines Isolats in der diagnostischen Untersuchung derzeit nicht möglich ist,

wurden die Gene, welche als spezifisch für virulente Stämme identifiziert wurden, für

die Entwicklung einer diagnostischen Multiplex-PCR verwendet. Die Eignung der

Methode, virulente Stämme anhand von drei Virulenzmarkern zu ermitteln, wurde an

insgesamt 240 Feldstämmen untersucht. Da das Virulenzpotenzial eines Isolates

sicher nur durch eine Überprüfung am Tier ermittelt werden kann, wurde zudem ein

Infektionsversuch zur Etablierung eines Tiermodells im Schwein vorgenommen.

Die Identifizierung genetischer Unterschiede erfolgte mittels Repräsentativer Diffe-

renzanalyse (RDA). Hierbei handelt es sich um eine Methode, welche durch sub-

traktive Schritte selektiv jene Abschnitte der DNA zweier engverwandter Genome

amplifiziert, die den eingesetzten Testkeim (Tester) vom Vergleichskeim (Driver)

E Diskussion 103

unterscheiden. Die Durchführung erfolgte in dieser Studie aufgrund der Annahme,

dass der Referenzstamm für Serotyp 5 (eingesetzt als Tester), welcher sich im Tier-

versuch als hochvirulent und invasiv erwiesen hatte (KIELSTEIN u. RAPP-

GABRIELSON 1992), Gene für Virulenzfaktoren aufweist, die dem avirulenten

Referenzstamm für Serotyp 11 (eingesetzt als Driver) fehlen. Die Methode wurde

anstatt in der ursprünglich veröffentlichten Form (LISITSYN et al. 1993) in einer

modifizierten Variante eingesetzt, die initial auf einen PCR-Schritt zum Anreichern

von DNA-Fragmenten im optimalen Größenbereich verzichtet. Mit dieser Abwand-

lung wurden vorher bereits erfolgreich Unterschiede in den Genomen von Myco-

bacterium avium ssp. paratuberculosis und Brachyspira hyodysenteriae nachge-

wiesen (ROTHKAMP et al. 2002; STROMMENGER et al. 2001). In dieser Studie

wurden nach Durchführung der RDA und einer nachfolgenden Transformation 85

Klone im Southern Blot auf ihre Spezifität überprüft und 29 Proben sequenziert, die

deutlich stärker mit einer 32P-markierten Gensonde aus Tester-DNA reagierten, als

mit einer Gensonde aus Driver-DNA. Für Sequenzen, deren Abgleich mit der Daten-

bank Homologien zu Proteinen ergab, die im Zusammenhang mit der Virulenz eines

Erregers stehen, wurde mittels PCR erneut die Spezifität der Fragmente überprüft,

gleichzeitig aber auch die Verteilung innerhalb der 15 derzeit bekannten Serotypen

von H. parasuis ermittelt. Da für diese 15 Stämme aus Tierversuchen das Virulenz-

potenzial bekannt ist (KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON 1992), war aus den Er-

gebnissen ersichtlich, ob das Fragment vorwiegend in virulenten oder avirulenten

Stämmen vorkommt. Aus den 29 sequenzierten Proben wurden fünf bislang bei

H. parasuis unbeschriebene Gene identifiziert, deren Expression im Referenzstamm

für Serotyp 5 (Stamm Nagasaki) mittels RT-PCR nachgewiesen werden konnte.

Hierbei handelt es sich um ein putatives Hämolysin und seine Transporteinheit,

HhdBA, ein mögliches Protein des Eisenstoffwechsels, CirA, eine putative phagen-

assoziierte Restriktionsendonuklease und ein mögliches Protein zum Verpacken von

Phagen-DNA.

Die Sequenz des putativen Hämolysins weist Homologien zu den Untereinheiten

HhdB und HhdA eines Hämolysins von H. ducreyi auf (AAC43537). Für das Gen

hhdA von H. parasuis wurde in der Datenbank bereits eine Sequenz von 1521 bp

E Diskussion 104

(AAZ67675) bzw. 1788 bp (ZP_02479316) hinterlegt, wovon erstere 31 % identische

und 55 % ähnliche Aminosäuren zur Untereinheit HhdA von H. ducreyi aufweist. Die

Übereinstimmung bzw. Ähnlichkeit des Sequenzabschnittes mit der Untereinheit

HhdB betrug 44 bzw. 69 %. Bei der Untereinheit HhdA von H. ducreyi handelt es sich

um den funktionsgebenden Bereich, da aufgereinigtes HhdA hämolytische Aktivität

aufweist (DUTRO et al. 1999), zudem besteht eine Homologie zu der funktionellen

Untereinheit shlA eines Hämolysins von Serratia marcescens (PALMER u.

MUNSON, JR. 1995). Da die Untereinheit shlB von Serratia marcescens für die

Sekretion und Aktivierung von ShlA zuständig ist (BRAUN et al. 1993), wird diese

Funktion auch für die Untereinheit HhdB von H. ducreyi angenommen (WOOD et al.

1999).

Die Rolle des Hämolysins in der Virulenz von H. ducreyi ist nicht abschließend

untersucht. Deletionsmutanten für hhdBA erwiesen sich in Studien am Menschen im

ersten Infektionsstadium als nicht attenuiert, weshalb diesen Proteinen zumindest zu

Beginn der Infektion vermutlich keine Hauptrolle in der Ausbildung der Erkrankung

(weicher Schanker, Ulcus molle) zukommt (THROM u. SPINOLA 2001). Andere

Untersuchungen ergaben, dass das Hämolysin von H. ducreyi die Fähigkeit zur Lyse

einer Vielzahl verschiedener menschlicher Zellarten besitzt, am stärksten betroffen

sind Makrophagen und T- Lymphozyten, gefolgt von Fibroblasten und Epithelzellen

(WOOD et al. 1999). Zudem konnte in der gleichen Studie gezeigt werden, dass die

Expression des Hämolysins die Invasion bestimmter Zellen (HEp-2) für H. ducreyi

erleichtert, nicht aber für andere Keime. Aus diesen Ergebnissen leiten die Autoren

eine wichtige Rolle des Proteins in der Pathogenese der Erkrankung ab, z.B. der

Ausbildung der Ulzerationen (Zerstörung von Gewebezellen), der Invasion von Epi-

thelzellen bzw. dem Ausweichen der Immunantwort des Wirts (Lyse von Immun-

zellen). Dutro et al. wiesen nach, dass alle von ihnen untersuchten Stämme von

H. ducreyi Homologe der Gene hhdA und hhdB aufwiesen, hämolytische Aktivität

zeigten und immunogen waren (DUTRO et al. 1999). Im Gegensatz zu H. ducreyi

zeigt H. parasuis weder auf Schafsblut-, noch auf Schweineblutagar hämolytisches

Wachstum. Falls es sich bei dem identifizierten Gen tatsächlich um ein Hämolysin

E Diskussion 105

handelt, ist dieses möglicherweise nur im Wirt funktionell, eine nähere Charakteri-

sierung des Proteins ist jedoch für die Beurteilung der Funktion notwendig.

In der Familie der Pasteurellaceae sind bereits andere Toxine beschrieben, z. B. das

PMT von P. multocida oder die RTX-Toxine, zu denen das Leukotoxin von M. hae-

molytica und die APX-Toxine von A. pleuropneumoniae gehören. Da das in H. para-

suis identifizierte Gen jedoch außer zu dem Hämolysin von H. ducreyi keinerlei

Homologien zu den für diese Toxine kodierenden Genen aufweist, stellen Vermu-

tungen über eine andere Toxinwirkung reine Spekulation dar. Die Verteilung des

Gens innerhalb der 15 Referenzstämme lässt einen Zusammenhang mit der Virulenz

vermuten, da sich alle Stämme, in denen das Gen nachgewiesen werden konnte, im

Tierversuch als virulent erwiesen (KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON 1992). Da

das Gen mit den verwendeten Primern umgekehrt jedoch nicht in allen virulenzasso-

ziierten Referenzstämmen nachgewiesen wurde (ein Nachweis erfolgte nicht für die

hochpathogenen Referenzstämme der Serotypen 1 und 10), scheint die Abwesenheit

eines PCR-Amplifikats nicht gleichbedeutend mit einem avirulenten Stamm zu sein.

Diese Ergebnisse wiederholten sich auch in den Untersuchungen von zehn Feld-

stämmen, die aus systemischen Lokalisationen (ZNS, Gelenk, Perikard) von erkrank-

ten Tieren isoliert wurden. Das Vorkommen des Gens hhdA konnte zwar in 50 % der

Stämme gezeigt werden, für die zweite Hälfte der Stämme konnte der Nachweis

jedoch nicht geführt werden. Der PCR-Nachweis für hhdB war sogar nur in drei

Fällen positiv. Dieses könnte entweder auf eine weniger wichtige Rolle des Gens in

der Invasion hindeuten bzw. auf eine Kompension seiner Funktion durch andere

Gene, möglich wäre jedoch auch eine abweichende Gensequenz innerhalb der

einzelnen Isolate, so dass das Gen zwar im Genom vorhanden ist, aber der Nach-

weis mittels PCR und Southern Blot nicht gelingt. Dieses könnte auch die Diskrepanz

zwischen dem Vorkommen von hhdA und hhdB sowie die unterschiedlichen Größen

der DNA-Sequenzen mit Bindungsstellen für die Gensonde im Southern Blot erklä-

ren. Für die gut untersuchten Untereinheiten ShlA und ShlB des Hämolysins von

Serratia marcescens konnte gezeigt werden, dass bei Deletionsmutanten für shlB

das Protein ShlA weder sekretiert wird noch in seine aktive Form übergeht (BRAUN

et al. 1992). Das Protein besitzt somit nur noch 0,1 % der Aktivität des

E Diskussion 106

normalerweise sekretierten und aktivierten Proteins (BRAUN et al. 1993). Deshalb

wäre das gleichzeitige Vorkommen beider Untereinheiten des Proteins innerhalb

eines Genoms wahrscheinlich, falls es sich bei den Genen hhdA und hhdB

tatsächlich um jene Untereinheiten handelt. Unterschiede in den Allelen

verschiedener Isolate derselben Bakterienart sind auch von anderen

Pasteureallaceae bekannt. So tragen die Serotypen 4 und 7 von A. pleuropneu-

moniae ein anderes Allel für den Ferrichromrezeptor fhuA als die anderen Serotypen

(BALTES et al. 2003; MIKAEL et al. 2002).

Die dritte testerspezifische Sequenz (NZ_ABKM01000010, Position 26.558-26.857)

zeigte Homologien zu dem Protein CirA von M. haemolytica (YP_088507) und einem

Rezeptor der äußeren Membran von A. pleuropneumoniae, welcher vermutlich eine

Funktion im Eisentransport aufweist (3141 bp, ZP_00134583). Das Gen konnte in

der Untersuchung mittels PCR sowie im Southern Blot neben den hochvirulenten und

überwiegend invasiven Referenzstämmen für Serotyp 5, 10, 12, 13, 14 und 15 auch

in den schwach virulenten bzw. avirulenten Stämmen 3, 8 und 9 nachgewiesen

werden. In Serotyp 1 (hochvirulent) gelang der Nachweis hingegen nicht. In einer

Untersuchung von 16 aus pneumonischen Lungen isolierten Feldstämmen mittels

PCR zeigten sechs Stämme eine deutliche Bande und acht eine schwache, weshalb

auch bei diesem Fragment die Vermutung nahe liegt, dass unter den Stämmen

Sequenzunterschiede bestehen. Diese wird zusätzlich durch die unterschiedliche

Größe der DNA-Sequenzen mit Bindungsstellen für die Gensonde im Southern Blot

unterstützt. Das bei M. haemolytica nicht genauer beschriebene Protein CirA wird als

Rezeptorprotein der äußeren Membran erwähnt und weist eine Länge von 2174 bp

auf, in E. coli ist es 1926 bp lang. Als Hauptfunktion beschrieben Nikaido et al. bei E.

coli die Wiederaufnahme von Enterobaktin, einem Siderophor gramnegativer

Bakterien (NIKAIDO u. ROSENBERG 1990). Gleichzeitig wiesen sie nach, dass CirA

ebenfalls als Rezeptor für bestimmte Antibiotika (Catechol und Catechol substituierte

Cephalosporine) dient. Untersuchungen der Proteinexpression von E. coli ergaben,

dass CirA bei einer erhöhten Umgebungstemperatur von 37 °C und Eisenmangel

hochreguliert wird, wobei die Regulation über die Temperatur von der durch Eisen

übersteuert wird (WHITE-ZIEGLER et al. 2007). Da während einer Infektion im Wirt

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=NC_006300.1

E Diskussion 107

freies Eisen nur begrenzt verfügbar ist, steht die Fähigkeit, wirtseigenes Eisen

aufzunehmen, bei vielen Bakterien in engem Zusammenhang zur Virulenz (BALTES

et al. 2002).

Die Sequenz mit Homologien zu zwei phagenassoziierten Proteinen von A. pleuro-

pneumoniae war ausschließlich in virulenzassoziierten Referenzstämmen nachweis-

bar (2, 5, 12, 14 und 15), unter den Feldstämmen mit drei von 16 (pneumonisch

isoliert) bzw. einer von zehn (systemisch isoliert) allerdings seltener vertreten als die

anderen identifizierten Gene. Von den zwölf nasal isolierten Stämmen aus gesunden

Tieren war die Hälfte schwach positiv für dieses Gen, was erneut ein Hinweis für

Sequenzunterschiede zwischen einzelnen Stämmen sein kann. Ohne eine komplette

Sequenz der Gene sind Aussagen über ihre Funktion nicht möglich, jedoch ist

bekannt, dass Phagen an der Virulenz vieler Erreger beteiligt sind. Beispiele hierfür

sind das Shigatoxin von E. coli sowie das Choleratoxin von Vibrio cholerae, welche

unter der Kontrolle eines Repressorsystems solange als Prophage im Ruhezustand

verbleiben, bis Signale der Wirtszelle sie aktivieren (WALDOR u. FRIEDMAN 2005).

Da sämtliche Hypothesen zu der Funktion der Proteine bislang nur auf der Existenz

von Homologien zu besser bekannten Proteinen anderer Bakterien sowie in silico

Analysen beruhen, sind weitere Untersuchungen notwendig, um ihre mögliche Rolle

in der Virulenz des Erregers beurteilen zu können. Eine Möglichkeit hierfür wäre die

Konstruktion von Deletionsmutanten eines hochvirulenten Stammes und die Über-

prüfung der Auswirkungen des defekten Gens im Tierversuch.

2 Entwicklung einer Multiplex-PCR

Die Gene hhdA, hhdB und cirA, für die der Datenbankabgleich und die Verteilung

innerhalb der Referenzstämme einen Hinweis auf eine mögliche Beteiligung an der

Virulenz des Erregers ergab, wurden zur Entwicklung einer Multiplex-PCR einge-

setzt, um über den Nachweis einer oder mehrerer Virulenzmarker eine Aussage über

das Virulenzpotenzial eines Stammes treffen zu können. Dieses gelingt für Strepto-

coccus suis mit dem Nachweis von vier Genen, welche für virulenzassoziierte

Faktoren kodieren (Unterscheidung von vier Kapselstrukturen bzw. cps-Typen, Nach-

weis des extrazellulären Faktors EF [epf], des durch Muraminidase freigesetzten Pro-

E Diskussion 108

teins MRP [mrp], einem Hämolysin SLY [sly] und der Arginin-Deiminase [arcA]) sowie

einem housekeeping Gen zum Speziesnachweis (SILVA et al. 2006). Die anhand der

bekannten Genfragmente von H. parasuis konstruierten Primer wurden auf ihre

Spezifität hin an zwölf verschiedenen Bakterien bzw. Eukaryoten untersucht, welche

häufig in klinischen Proben aus dem oberen Respirationstrakt vorkommen (je ein

Feldstamm von Candida albicans, Mucor ssp., E. coli DH5-α, Klebsiella pneumoniae,

Bordetella bronchiseptica, Pasteurella multocida, Histophilus somni, A. minor, A. in-

dolicus und A. suis sowie zwei Feldstämme von A. porcinus). Keines der unter-

suchten Isolate ergab Amplifikate in der PCR, somit erwiesen sich alle eingesetzten

Primer als spezifisch für H. parasuis.

Zum Ausschluss falsch negativer Resultate in der PCR, z. B. durch die Anwesenheit

von Hemmstoffen, wurde eine interne Kontrolle entwickelt (HOORFAR et al. 2004).

Diese bestand aus einem Gemisch der vier zu amplifizierenden PCR-Produkte,

welche in den Vektor pSC-A (Stratagene, La Jolla, USA) kloniert wurden. Zur Unter-

suchung der Referenzstämme erfolgte der Einsatz der Kontrolle so, wie er auch in

einer diagnostischen Untersuchung notwendig ist, das heisst: Jede Probe wurde in

einem Doppelansatz angesetzt und jeweils dem zweiten Ansatz 1 µl der internen

Kontrolle zugefügt. Da der Kontrollansatz somit Template-DNA für jedes Primerpaar

enthält, zeigt das Fehlen einer Bande einen Reaktionsausfall an.

Die Verteilung der drei eingesetzten Virulenzmarker innerhalb der Referenzstämme

und den pneumonisch und systemisch isolierten Feldstämme wurde bereits in Kapitel

D1.3 anhand von PCR-Untersuchungen im Monoplex-Ansatz erläutert. Der Vergleich

von Mono- und Multiplex-PCR ergab für die Referenzstämme nahezu vollkommene

Übereinstimmung. Allein die Primer oMP_CirA1 und 2 ergaben für den

Referenzstamm 3 im Multiplex-Ansatz kein PCR-Produkt, wohingegen im Monoplex-

Ansatz eine schwache Bande entstand. Mittlere Abweichungen ergaben sich hin-

gegen in den ebenfalls parallel untersuchten Feldstämmen aus systemischen und

pneumonischen Isolaten, für die der Einsatz der internen Kontrolle gesammelt in

einem Kontrollansatz durchgeführt wurde. Es blieben im Multiplex-Ansatz über-

wiegend jene Amplifikate aus, welche im Monoplex-Ansatz bereits nur schwach

E Diskussion 109

ausgeprägt waren. Eine mögliche Ursache hierfür könnten Sequenzunterschiede

sein, da vergleichsweise schlechter bindende Primer im Multiplex-Ansatz in der Am-

plifikation verstärkt benachteiligt sind. Ein Reaktionsausfall kann zwar über eine

vollständige interne Kontrolle ausgeschlossen werden, diese enthält jedoch Plas-

mide, deren Inserts aus PCR-Produkten der verwendeten Primer bestehen, so dass

alle Paare in der Kontrolle optimal binden können. Je nach Sequenz ist das nicht in

jeder untersuchten Probe der Fall.

Eine Sammlung von 214 Feldstämmen verschiedener Isolationsorte wurde bisher

ausschließlich im Multiplex-Ansatz untersucht. Der Speziesnachweis war für sämt-

liche Stämme erfolgreich, für 141 Stämme (65,9 %) konnte keiner der drei Virulenz-

marker nachgewiesen werden. Obwohl das Gen cirA innerhalb der Referenzstämme

deutlich häufiger nachgewiesen wurde als hhdA, waren sie in dieser Gruppe Feld-

stämme nahezu gleich verteilt. Bei 61 Stämmen (28,5 %) konnten gleichzeitig die

Gene hhdA und cirA gezeigt werden, nur zwei Stämme trugen zwar das Gen cirA,

nicht aber hhdA. Das auffallend häufige gemeinsame Auftreten könnte entweder auf

einen funktionellen Zusammenhang beider Gene hindeuten, möglicherweise besitzt

ein virulenter Stamm aber auch unabhängig voneinander wirkende Virulenzfaktoren.

Nur insgesamt zehn Stämme trugen das Gen hhdB, hierbei handelte es sich stets

um Isolate, bei denen auch die anderen beiden Virulenzmarker nachgewiesen

wurden. Vermutlich liegt dieser Tatsache eine hohe genetische Heterogenität zu-

grunde, wodurch sich auch das wie bei den systemischen Feldstämmen beobachtete

unterschiedlich häufige Vorkommen der beiden Untereinheiten hhdB und hhdA er-

klären ließe.

Der Umfang der übermittelten Angaben zu den 214 Feldstämmen weicht stark von-

einander ab, insbesondere zum klinischen Status des jeweils beprobten Tieres liegen

unterschiedlich ausführliche Daten vor. Soweit als möglich wurden PCR-Ergebnis

und Gesundheitszustand miteinander verglichen. Beobachtungen ergaben, dass die

Isolation von Stämmen mit allen drei Virulenzmarkern sowohl aus gesunden Tieren

(Routineuntersuchungen) bzw. Tieren mit lokalen Veränderungen (Atemtrakt) gelang,

wie auch aus Tieren mit systemischen Läsionen. Bei den letzteren handelte es sich

E Diskussion 110

überwiegend um Kümmerer mit unspezifischer Symptomatik. Umgekehrt trugen auch

Stämme, die laut Vorbericht mit einer klinischen Erkrankung im Zusammenhang

standen, keinen der drei Virulenzmarker. Dieses wurde auch bei 50 % der unter-

suchten systemisch isolierten Stämme beobachtet. Ohne die Überprüfung des Viru-

lenzpotenzials der isolierten Stämme im Tiermodell kann über einen Zusammenhang

zwischen dem PCR-Ergebnis und der Virulenz eines Stammes nur spekuliert

werden. Da zu keinem der Tiere der Durchseuchungsgrad des Herkunftsbetriebes

bekannt ist, muss davon ausgegangen werden, dass die jeweilige Herde mit einem

oder mehreren Stämmen von H. parasuis infiziert ist. Demnach ist unklar, ob es sich

bei einer klinischen Erkrankung bei dem vorliegenden Stamm auch um den verur-

sachenden Keim handelt. Fest steht einerseits, dass offensichtlich nicht jeder mit

allen drei untersuchten Virulenzfaktoren ausgestattete Stamm stets auch eine Er-

krankung auslöst. Möglicherweise ist für den Ausbruch einer Erkrankung eine

Prädisposition des Wirtes notwendig. Andererseits kann aus einem fehlenden

Nachweis der drei eingesetzten virulenzassoziierten Gene nicht automatisch auf die

Avirulenz des Stammes geschlossen werden. Denkbar wäre, dass aufgrund einer

hohen Heterogenität innerhalb der Gensequenzen nicht alle vorkommenden Viru-

lenzmarker detektiert werden, Sequenzunterschiede deuteten sich ja bereits in ande-

ren PCR-Untersuchungen an. Zudem können neben den bisher identifizierten Genen

weitere Faktoren an der Virulenz eines Stammes beteiligt sein.

Zur Fortführung der Studien ist einerseits ein Tiermodell notwendig, um virulente und

avirulente Stämme voneinander abgrenzen und die Bedeutung des Vorkommens der

identifizierten Gene sicher auswerten zu können. Andererseits werden zur Optimie-

rung der Primer weitere Informationen über die Gensequenz mehrerer Isolate an den

entsprechenden Bindungsstellen benötigt, damit die Erzeugung von Amplifikaten in

der PCR bei Vorhandensein des entsprechenden Gens zuverlässig erfolgt.

In wenigen Fällen wurden in der Anzucht der Feldstämme auf Kochblutagar unter-

schiedlich große Kolonien beobachtet, hierbei handelt es sich vermutlich um Phasen-

variationen, wie sie bereits von Bakos (BAKOS et al. 1952) beschrieben wurden.

E Diskussion 111

Fünf Stämme aus den Reisolaten des Tierversuchs ergaben im Multiplex-Ansatz

wiederholt kein Amplifikat für die Primer Hps-f und -r, es wurden jedoch

Virulenzmarker nachgewiesen. Im Monoplex-Ansatz ergaben alle fünf Isolate eine

Bande mit dem entsprechenden Primerpaar. Da sich die anderen drei eingesetzten

Primerpaare in der Überprüfung anhand von anderen Bakterienspezies/-gattungen

als spezifisch für H. parasuis erwiesen haben, ist der Speziesnachweis auch bei Aus-

bleiben eines Amplifikats mit den Primern Hps-f und -r gegeben. In Zweifelsfällen

kann ein Isolat zusätzlich im Monoplex-Ansatz überprüft werden.

Die entwickelte Multiplex-PCR hat sich als wirksame Methode erwiesen, Feldstämme

gleichzeitig auf das Vorkommen von drei potenziell virulenzassoziierten Faktoren zu

screenen. Es handelt sich um eine schnelle und kostengünstige Methode zur Bear-

beitung großer Probenmengen, auch wenn vereinzelt durch Sequenzunterschiede

falsch negative Ergebnisse auftreten. Die mit aufgereinigter DNA durchgeführten

Ansätze der Referenzstämme stimmten überwiegend mit den Ergebnissen der

Monoplex-Ansätze überein, nur für die Primer oMP_CirA1 und 2 blieb im Multiplex-

Ansatz eine Bande aus, während im Monoplex-Ansatz ein Amplifikat aufgetreten war.

Diskrepanzen traten beim Einsatz von Bakterienlysat aus Reinkulturen (Stämme aus

pneumonischen Lungen und systemisch isolierte Stämme) auf. Deshalb muss in

Einzelfällen die Verwendung von aufgereinigter DNA in Betracht gezogen werden,

um die Wahrscheinlichkeit falsch negativer Ergebnisse zu minimieren. Für den Ein-

satz von klinischen Proben, das heisst Tupferproben oder Organmaterial, muss das

Verhältnis der eingesetzten Primer bzw. der Plasmide der internen Kontrolle unter

Umständen wegen möglicher Hemmstoffe neu abgestimmt werden. Falls in Zukunft

mehr Daten bezüglich der Gensequenz verschiedener Stämme vorliegen, sollten die

Primer überprüft und eventuell optimiert werden, um falsch negative Ergebnisse

weiter zu minimieren.

3 Identifizierung von Stamm spezifischen Proteinen

Neben der Identifizierung von genetischen Unterschieden wurde in dieser Studie

außerdem die Proteinexpression von H. parasuis Stämmen mit verschiedenen Viru-

lenzeigenschaften untersucht, da diese Stämme möglicherweise zwar die gleiche

E Diskussion 112

genetische Ausstattung besitzen, jedoch verschiedene Proteine exprimiert werden.

Mit diesem Ansatz beschäftigten sich bereits zahlreiche Studien, die heute einge-

teilten Referenzstämme wurden bislang jedoch nicht berücksichtigt. So teilten Nicolet

et al. (NICOLET et al. 1980) acht Stämme unbekannter Herkunft in zwei PAGE-Type-

Gruppen ein, welche durch die An- oder Abwesenheit eines Proteins von 37 kDa

gekennzeichnet waren, und stellten fest, dass die Stämme aus Tieren mit Glässer-

scher Krankheit dieses Protein exprimierten. Die Ergebnisse wurden durch weitere

Studien bestätigt (MOROZUMI u. NICOLET 1986a). Rosner et al. hingegen teilten

ihre untersuchten Stämme in sieben verschiedene PAGE-Type-Gruppen ein, welche

auf der Kombination verschiedener Proteinbanden im ähnlichen Größenbereich (29-

51 kDa) basierten, konnten durch ihre Ergebnisse aber keinen Zusammenhang

zwischen Proteinmuster und Virulenz erkennen (ROSNER et al. 1991). Oliveira et al.

teilten die von ihnen untersuchten Stämme wiederum in zwei Gruppen ein und

bezogen sich auf markante Proteinbanden im Größenbereich von 36-38 kDa, aus

deren Auftreten sie einen Zusammenhang zu virulenten Stämmen schlossen

(OLIVEIRA u. PIJOAN 2004). In keiner dieser Studien wurden die entsprechenden

Proteine identifiziert.

Auch in den Untersuchungen der vorliegenden Studie wurden markante Banden im

erwähnten Größenbereich nachgewiesen. Es wurden Proteingele von allen 15 Refe-

renzstämmen und 25 Feldstämmen (16 aus pneumonischen Lungen und neun aus

systemischen Läsionen) angefertigt und beurteilt. Dabei zeigten sämtliche Stämme

jeweils ein Protein mit einer Masse zwischen 32 und 42 kDa, Isolate ohne solche

Proteine wurden nicht beobachtet. Der Vergleich der Bandengröße virulenter und

avirulenter Referenzstämme ergab, dass virulente Stämme überwiegend kleinere

Proteinbanden trugen (32-36 kDa), avirulente vor allem größere (39-40 kDa). In bei-

den Gruppen traten jedoch Ausnahmen auf, da der hochvirulente Referenzstamm für

Serotyp 10 ein Protein von 38 kDa aufwies und der avirulente Serotyp 7 eine Pro-

teinbande von 33,5 kDa. Auch die Ergebnisse der systemisch und pulmonal isolier-

ten Feldstämme lassen keinen Zusammenhang zwischen der Virulenz eines Stam-

mes und der Größe dieser Proteine erkennen, da sowohl unter den pneumonisch als

auch den systemisch isolierten Stämmen kleinere und größere Proteine auftreten

E Diskussion 113

(minimale Größe 33 kDa, maximale Größe 42 kDa). 16 dieser Proteinbanden wurden

mittels massenspektrometrischer Untersuchung mit zwei unterschiedlichen Verfahren

(MALDI- und Q-TOF-Massenspektrometrie) identifiziert. Alle Proben ergaben, dass

es sich um ein P2 Protein der äußeren Membran (OMP P2) handelt. Mit Primern für

das Gen des P2 Proteins wiederholten sich die unterschiedlichen Größen auf gene-

tischer Ebene, da die Bandengröße in der Untersuchung der Referenzstämme um

bis zu ca. 80 bp voneinander abwich. Das Muster aus größeren und kleinen Ampli-

fikatbanden entsprach dem Muster der einzelnen Stämme aus verschieden großen

Proteinbanden. Ein OMP P2 Protein mit stammspezifischer Größe ist auch für H. in-

fluenzae beschrieben (SIKKEMA u. MURPHY 1992). Dort handelt es sich um ein

Porin, welches in unterschiedlichen nicht typisierbaren Stämmen eine Größe von 36

bis 42 kDa aufweist. Diese Abweichungen sind auf einzelne Bereiche großer

genetischer Heterogenität zurückzuführen. Damit steht in Verbindung, dass es sich

zwar um ein immunogenes Protein handelt, es aber nicht zur Ausbildung eines

kreuzreaktiven Schutzes führt und somit durch Infektion mit einem anderen Stamm

erneut Krankheitsausbrüche vorkommen können. Auch bei H. parasuis kommt es

nicht zur Ausbildung einer kreuzeraktiven Immunität und trotz nahezu vollständiger

Durchseuchung der Bestände kommt es bei Neuinfektion mit einem anderen Isolat

(z. B. durch Tiertransporte) häufig zu Erkrankungen. Zudem ist es bislang durch den

Einsatz von Vakzinen zwar gelungen, Tiere gegenüber einer homologen Belastung

zu schützen, zuverlässige Protektion gegenüber einer heterologen Belastung wurde

bisher jedoch nicht erreicht. Dieses zeigt, dass auch bei H. parasuis stammspe-

zifische Unterschiede immunogener Strukturen vorkommen.

Den deutlichsten Stammunterschied im Proteingel machte eine bislang unbe-

schriebene Bande von >200 kDa aus, welche nur bei den avirulenten Referenz-

stämmen der Serotypen 3, 6 und 9, dem hochvirulenten Referenzstamm von Serotyp

10 sowie den systemisch isolierten Feldstämmen Maas 2 und 3 zu erkennen war.

Die massenspektrometrische Untersuchung dieser Proben war nicht in allen Fällen

erfolgreich, da Proteine dieser Größe aufgrund der Gitterstruktur im SDS-Gel oftmals

nicht mit ins Trenngel hinübertreten und somit keine vollständige Auftrennung erfolgt.

Die Untersuchung mittels Massenspektrometrie benötigt jedoch exakt aufgereinigte

E Diskussion 114

Proben, da ein Gemisch aus Peptiden verschiedener Proteine im Datenbankabgleich

keine sinnvollen Ergebnisse liefert. So konnten die Proben 9 und 10 (Referenzstamm

9 und 10) nicht identifiziert werden. Probe 3 aus dem Referenzstamm für Serotyp 3

wies ein identisches Peptid mit einem hypothetischen Protein von H. parasuis auf

(ZP_02479473), es ergaben sich jedoch keine Hinweise auf eine mögliche Funktion.

Zudem liegt in der Datenbank nur eine Sequenz von 154 Aminosäuren vor, so dass

es sich entweder nicht um das vollständige Protein oder um eine Kontamination

handelt. Probe 7 aus Serotyp 6 ergab ein identisches Peptid mit der größeren Unter-

einheit der Pseudouridin-Synthase B (ribosomal large subunit pseudouridine

synthase B) von H. parasuis (ZP_02477992). Pseudouridin-Synthasen wandeln Uri-

din in Pseudouridin um (LEPPIK et al. 2007). Pseudouridine sind die häufigsten

Modifikationen in stabilen RNA-Molekülen und werden sowohl in der kleinen, als

auch der großen Untereinheit ribosomaler RNA von Prokaryonten und Eukaryonten

gefunden (WRZESINSKI et al. 1995). Bakin et al. wiesen 1994 für das einzige Pseu-

douridin der kleinen Untereinheit der ribosomalen RNA von E. coli eine Funktion in

der Kodonerkennung nach (BAKIN et al. 1994). Da dieses Gen bei E. coli jedoch nur

eine Größe von 945 bp besitzt, ist fraglich, ob es sich bei dem Protein von H. para-

suis tatsächlich um eine Pseudouridinsynthase handelt.

Zukünftig können durch Sequenzuntersuchungen und -vergleiche des OMP P2 Gens

verschiedener Isolate die den Größenunterschieden zu Grunde liegenden Bereiche

identifiziert werden. Möglicherweise gibt es bei H. parasuis ähnlich konservierte und

variable Bereiche wie bei H. influenzae. Auch wenn die jetzigen Ergebnisse keine

eindeutige Verbindung zwischen Proteingröße und Virulenzpotenzial zulassen, er-

scheint eine nähere Untersuchung lohnenswert: Einer der beiden Ausreißer, der als

hochvirulent geltende Referenzstamm von Serotyp 10, weist zwar im Vergleich zu

anderen virulenten Stämmen nur eine kleine Proteinbande auf, dieses Isolat wurde

jedoch aus der Nasenhöhle eines gesunden Schweines isoliert und erwies sich erst

bei intraperitonealer Inokulation als virulent (KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON

1992). Durch Western Blots mit Seren rekonvaleszenter Tiere kann die Immunogeni-

tät des Proteins ermittelt und durch die Konstruktion von Deletionsmutanten seine

Funktion näher charakterisiert werden.

E Diskussion 115

4 Infektionsversuch

Um die Funktion einzelner Gene oder Proteine bezüglich ihres Zusammenhangs mit

der Virulenz eines Stammes einschätzen zu können, sind Stämme mit einem

definierten Virulenzpotenzial notwendig. Eine Aussage anhand der klinischen

Symptome des beprobten Tieres oder des Isolationsortes ist unsicher, da bereits

hochvirulente Stämme aus der Nasenhöhle gesunder Tiere gewonnen wurden

(Referenzstamm Serotyp 10), ein einzelnes Tier oftmals mehrere unterschiedliche

Stämme trägt und der genaue Immunstatus des beprobten Tieres in vielen Fällen

nicht bekannt ist. Daher sind Versuche am Tier notwendig, um einzelne Stämme

unter definierten Bedingungen bezüglich ihres Virulenzpotenzials testen zu können.

Für die in dieser Studie verwendeten Stämme ist das Virulenzpotenzial aus-

schließlich für die 15 Referenzstämme im Tierversuch definiert worden (KIELSTEIN

u. RAPP-GABRIELSON 1992), weshalb die Untersuchungsergebnisse dieser Stäm-

me stärker gewichtet wurden. Zur Etablierung eines Tiermodells im Schwein für die

Überprüfung weiterer Stämme wurde ein erster Infektionsversuch mit dem als hoch-

virulent bekannten Referenzstamm von Serotyp 12 vorgenommen.

Aufgrund einer nahezu vollständigen Durchseuchung der Betriebe mit H. parasuis ist

die Verwendung von spezifisch pathogenfreien (SPF-) Schweinen kaum zu reali-

sieren. Andere Studien berichten zwar über den Einsatz von Tieren aus einer SPF-

Herde (SMART u. MINIATS 1989), aus wirtschaftlichen Gründen wurde auf eine

Anlieferung solcher Tiere jedoch verzichtet. Stattdessen wurden in dieser Studie

sechs Ferkel verwendet, deren Muttersau durch den Zulieferer aus einem H. para-

suis freien Bestand importiert wurde, und sechs Ferkel einer im selben Zuliefer-

betrieb gezogenen Muttersau. Die importierte Sau wurde zusammen mit den Tieren

des restlichen Bestandes gehalten, so dass sie Kontakt zu dem gesamten Keim-

spektrum des Betriebes hatte.

Bei Ankunft der fünf Wochen alten Ferkel wurden alle Tiere per Nasentupfer und

Tonsillenkratzprobe auf H. parasuis getestet sowie eine Blutprobe serologisch auf

Antikörper gegen den Erreger untersucht. Bei sämtlichen Tieren ergab die PCR zum

Speziesnachweis ein Amplifikat, aus sieben Tieren wurden kulturell zusätzlich ins-

E Diskussion 116

gesamt zwölf Stämme isoliert, es konnten jedoch bei keinem Tier Antikörper nachge-

wiesen werden. Es handelte sich demnach um serologisch negative Tiere, die bereits

Kontakt zu H. parasuis hatten. Die RFLP-PCR der in Reinkultur isolierten Stämme

ergab zwei verschiedene Restriktionsmuster, von denen eins dem Muster der viru-

lenten Referenzstämme 5, 12, 14 und 15 glich und das andere bislang nicht be-

schrieben wurde. Drei von fünf Stämmen mit dem neu identifizierten Muster waren in

der PCR-Untersuchung für die in dieser Studie identifizierten putativen Virulenz-

marker für das Gen cirA positiv. Die sechs Stämme mit dem gleichen Muster wie die

Referenzstämme 5, 12, 14 und 15 trugen die Gene hhdA, hhdB und cirA, zudem

konnten in einer zweiten PCR auch die beiden phagenassoziierten Gene nachge-

wiesen werden, für das die Stämme mit dem bislang unbekannten Restriktions-

muster durchgehend negativ waren. Ein einziger Stamm ergab zwar ein Amplifikat

mit den Primern Hps-f und -r zum Speziesnachweis, jedoch keines mit den Primern

der RFLP-PCR. Möglicherweise handelt es sich bei diesem Stamm nicht um H. pa-

rasuis, da mit der PCR nach Oliveira et al. in Einzelfällen auch falsch positive

Ergebnisse auftreten (ANGEN et al. 2007). Bereits vor der Infektion hatten die Ferkel

demnach Kontakt mit mindestens zwei verschiedenen Stämmen von H. parasuis,

wovon der eine genetische Ähnlichkeit mit virulenten bzw. hochvirulenten Referenz-

stämmen aufweist und auch sämtliche in dieser Studie identifizierten putativen

Virulenzmarker trägt.

Die künstliche Infektion wurde mit dem Referenzstamm von Serotyp 12 durchgeführt.

Vergleichend wurden zwei verschiedene Inokulationsrouten eingesetzt: einerseits die

bereits häufig beschriebene und erfolgreich eingesetzte intratracheale Infektion, an-

dererseits die Infektion in einer Aerosolkammer nach dem Protokoll von Jacobsen et

al. (JACOBSEN et al. 1996b). Die Vorteile der Infektion in der Kammer bestehen

zum einen in der für die Versuchstiere vollkommen stressfreien Durchführung,

welche ohne eine Anästhesie auskommt. Zum anderen nehmen die Tiere in der

Kammer den Erreger gleichzeitig über mehrere Wege auf, da sie diesen sowohl über

das Aerosol einatmen, als auch oral über sich niederschlagende Feuchtigkeit auf

Futterpartikeln und Artgenossen aufnehmen. Die Infektion in der Aerosolkammer

E Diskussion 117

kommt der natürlichen Infektionsroute des Erregers daher deutlich näher als die

intratracheale Inokulation.

In Anlehnung an andere Infektionsversuche bekam die Gruppe der intratracheal

belasteten Tiere 2 x 108 Bakterien verabreicht (BLANCO et al. 2004), in der Aero-

solkammer wurden 1,1 x 1010 Keime desselben Stammes vernebelt. Im Vergleich zu

Miniats et al., die 1991 eine aerosolisierte Infektion mit 8 x 109 KBE durchführten,

handelte es sich um eine verhältnismäßig hohe Infektionsdosis (MINIATS et al.

1991). Die Tiere der Kontrollgruppe, welche intratracheal eine Kochsalzlösung erhiel-

ten, zeigten über den kompletten Versuchsverlauf keine Anzeichen einer klinischen

Erkrankung. In der per Aerosol infizierten Gruppe wurde bei zwei Tieren gering-

gradiges Husten und Niesen ohne Störung des Allgemeinbefindens beobachtet, die

restliche Gruppe wies keinerlei klinische Symptome auf. Die Tiere der intratracheal

belasteten Gruppe waren ebenfalls überwiegend gesund, das heisst auch hier zeig-

ten zwei Tiere geringgradiges Husten und Niesen bei unbeeinträchtigtem Allgemein-

befinden, und bei einem weiteren Tier wurden überhaupt keine Symptome beob-

achtet. Das vierte Tier der aerosolbelasteten Gruppe war allerdings geringgradig le-

thargisch, zeigte ab Tag 3 nach der Infektion Appetitmangel, ab Tag 5 Fieber, einen

aufgekrümmten Rücken und Bewegungsunlust. Obgleich es sich hier um eher un-

spezifische Symptome handelt, treten diese typischerweise während einer Pleuritis

bzw. Peritonitis auf, wie sie durch H. parasuis verursacht wird. In der Sektion zeigte

das Tier fibrinöse Auflagerungen in Brust- und Bauchhöhle sowie dem Perikard und

Verklebungen zwischen Lunge und Brustwand. Aus diesen Läsionen gelang jedoch

keine Reisolation von H. parasuis, sondern nur aus Nasen- und Tonsillentupfer.

Allerdings ergaben Bauch- und Brusthöhlentupfer in der PCR-Untersuchung auf

M. hyorhinis ein starkes Amplifikat und auch eine Woche nach Probenentnahme

konnte der Erreger noch kulturell aus den Tupfern isoliert werden. Auch wenn ein

Nachweis von H. parasuis selbst bei hochgradigen Veränderungen oft nicht erfolg-

reich ist, ist in diesem Fall eine M. hyorhinis Infektion des Tieres wahrscheinlich.

Hierbei handelt es sich um eine der zu beachtenden Differentialdiagnosen von

H. parasuis, da es ebenfalls zu einer Polyserositis kommt (FRIIS u. FEENSTRA

1994). Palzer et al. stellten in Feldstudien eine signifikante Assoziation beider

E Diskussion 118

Erreger fest und gehen von einer gegenseitigen Beeinflussung aus, da Tiere mit

einer Koinfektion höhere klinische Scores erreichten als bei einer Monoinfektion

(PALZER et al. 2006).

Die restlichen Tiere waren in der Sektion unauffällig, zwei Tiere zeigten jedoch kleine

atelektatische Bereiche in der Lunge, welche ebenfalls durch Mykoplasmen verur-

sacht worden sein können. Die PCR-Untersuchung ergab diesbezüglich jedoch für

beide Tiere kein positives Ergebnis.

Neben der Isolation von H. parasuis aus Nasen- und Tonsillentupfern gelang diese in

allen drei Versuchsgruppen auch aus der Lunge (sechs Tiere) und aus systemischen

Lokalisationen (Perikard: zwei Tiere, Pleura: ein Tier, Meningen: zwei Tiere). Ein

Zusammenhang zwischen Infektionsroute und Isolationsort konnte somit nicht

beobachtet werden. Da H. parasuis zudem auch von Tieren der Kontrollgruppe aus

systemischen Lokalisationen isoliert werden konnte, weist einer der Stämme, den die

Tiere bereits vor der künstlichen Infektion trugen, offensichtlich Potenzial zur inva-

siven Besiedlung auf. Aufgrund der großen Ähnlichkeiten zwischen Belastungs-

stamm und etwa der Hälfte der vor der Infektion isolierten Stämme ist eine Unter-

scheidung kaum möglich, mit 19 von 58 Reisolaten ergeben 32,8 % der Stämme

nach der Infektion in der Multiplex-PCR, der RFLP-PCR und der Test-PCR auf die für

die beiden phagenassoziierten Proteine kodierenden Gene dasselbe Ergebnis wie

der Referenzstamm von Serotyp 12. Ob es sich bei dem bereits im Herkunftsbetrieb

vorkommenden Keim möglicherweise sogar um einen Stamm von Serotyp 12 han-

delt, kann anhand der vorliegenden Ergebnisse nicht beurteilt werden. Auffällig ist,

dass alle vor der Infektion reisolierten Stämme mit dem gleichen Restriktionsmuster

in der RFLP-PCR wie der Belastungsstamm in der Test-PCR auf die für die beiden

phagenassoziierten Proteine kodierenden Gene positiv waren, ebenso der

Belastungsstamm selbst. Bei allen von systemischen Lokalisationen gewonnenen

Isolaten konnte dieses Fragment jedoch nicht nachgewiesen werden. Dieses könnte

bedeuten, dass neben den vor der künstlichen Infektion isolierten Stämmen im

Herkunftsbetrieb noch weitere in der ersten Untersuchung nicht identifizierte Stämme

E Diskussion 119

von H. parasuis vorkommen. Eine andere Möglichkeit ist eine inkonstante PCR-

Untersuchung aufgrund von Hemmstoffen oder Sequenzunterschieden.

Keines der Tiere, bei denen aus systemischen Lokalisationen Keime reisoliert

wurden, zeigte Symptome der Glässerschen Erkrankung. Dieses spricht für eine

protektive Immunität der Tiere gegen den Belastungsstamm. Aufgrund der

vorliegenden genetischen Ähnlichkeiten der Stämme sind Kreuzreaktionen

wahrscheinlich. Im ELISA konnten zwar keine Antikörper gegen H. parasuis

nachgewiesen werden, allerdings könnten bei zum Belastungszeitpunkt ca. fünf

Wochen alten Ferkeln maternale Antikörper noch eine Rolle spielen, die

möglicherweise im ELISA nicht detektiert werden. Dass maternale Antikörper die

Ausbildung einer klinischen Erkrankung beeinflussen, zeigten Solano-Aguilar et al.

(SOLANO-AGUILAR et al. 1999).

Die Reisolationsergebnisse an unterschiedlichen Lokalisationen und die genetischen

Untersuchungen der Stämme ergaben aufgrund der Ähnlichkeiten zu den bereits vor-

her im Tier vorkommenden Feldstämmen keine eindeutigen Hinweise auf die Aus-

breitung des Belastungsstammes im Wirtsorganismus. Der Versuch bestätigt jedoch

erneut das Vorkommen mehrerer unterschiedlicher Stämme in einem Bestand und

die symptomlose Besiedlung von Schweinen. Zum ersten Mal konnten Stämme von

H. parasuis in klinisch gesunden Tieren auch aus systemischen Lokalisationen iso-

liert werden.

Bei der Verwendung von vermutlich immunkompetenten Tieren hat keine der beiden

gewählten Inokulationsrouten eine klinische Erkrankung ausgelöst. Auch die Ergeb-

nisse der Reisolation ermöglichen keinen Rückschluss darauf, welche Infektions-

methode geeigneter ist. Beide Formen setzten voraus, dass der Erreger zur Erzeu-

gung klinischer Symptome die Barrieren des oberen Respirationstraktes (Tonsillen,

Schleimhautepithel) überwindet. Bei der Durchführung einer intraperitonealen Infek-

tion, wie sie für die Referenzstämme durch Kielstein et al. durchgeführt wurde, wird

diese Barriere umgangen (KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON 1992). Der Vergleich

der Ergebnisse von Pathogenitätsstudien verschiedener Stämme wird durch den

Einsatz so unterschiedlicher Inokulationsrouten erschwert. So wurde der Referenz-

E Diskussion 120

stamm von Serotyp 10 aus der Nasenhöhle eines gesunden Schweines isoliert, wur-

de jedoch nach intraperitonealer Verabreichung als hochvirulent eingestuft

(KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON 1992). Der in dieser Studie eingesetzte Be-

lastungsstamm, Referenzstamm von Serotyp 12, wurde aus der Lunge eines an

Polyserositis erkrankten Tieres isoliert und zeigte sich in der Studie von Kielstein et

al. nach intraperitonealer Verabreichung ebenfalls hochvirulent. Bislang sind keine

anderen Studien bekannt, in welcher das Virulenzpotenzial dieses Referenzstammes

über die nasale oder orale Infektionsroute überprüft wurde. Zur Ermittlung des

tatsächlichen Virulenzpotenzials von verschiedenen Stämmen sind weitere Patho-

genitätsstudien am Versuchstier notwendig.

Die Voraussetzung für Virulenzstudien an H. parasuis ist eine zuverlässige Erzeu-

gung der Glässcherschen Erkrankung in Versuchstieren, um eine abweichende Viru-

lenz in verschiedenen Stämmen beurteilen zu können. Aufgrund der schlechten

Verfügbarkeit von SPF-Tieren, der geringen klinischen Symptome in Versuchen mit

überwiegend immunkompetenten Tieren und der daraus resultierenden schlechten

Vergleichbarkeit von Studien mit Tieren unterschiedlichen Immunstatus‘ müssen

alternative Tiermodelle in Betracht gezogen werden. Miniats et al. zeigten, dass sich

Gnotobioten grundsätzlich eignen, durch ihr schwach ausgeprägtes Immunsystem

jedoch auch häufig bereits vor Versuchsbeginn hohe Tierverluste mit sich bringen

(MINIATS et al. 1991). Ähnliches gilt für mittels Kaiserschnitt geborener Ferkel, die

kolostrumfrei aufgezogen werden (VAHLE et al. 1997). Eine mögliche Option stellen

Meerschweinchen dar, welche zwar nicht dem eigentlichen Wirtstier entsprechen,

jedoch ein der Glässerschen Krankheit sehr ähnliches Krankheitsbild entwickeln

(MOROZUMI et al. 1982) und deren Unterbringung und Versorgung im Vergleich zu

empfindlichen gnotobiotischen Tieren deutlich wirtschaftlicher ist. Erst bei Vorliegen

eines etablierten Infektionsmodells können verschiedene Inokulationsrouten aussa-

gekräftig miteinander verglichen werden.

F Zusammenfassung 121

F Zusammenfassung

Sack, Meike: Identifizierung neuer virulenzassoziierter Faktoren von

Haemophilus parasuis und Entwicklung einer Multiplex-PCR

H. parasuis ist als Erreger der Glässerschen Krankheit für hohe wirtschaftliche Ver-

luste im Bereich der Schweinefleischproduktion verantwortlich. Die Virulenzfaktoren

des Erregers sind noch weitestgehend unbekannt und eine Aussage über das Viru-

lenzpotenzial eines Stammes ist bislang nicht möglich.

Zur Identifizierung möglicher virulenzassoziierter Gene wurden die Genome der

Referenzstämme von Serotyp 5 (Stamm Nagasaki, virulent) und 11 (avirulent) per

Repräsentativer Differenzanalyse verglichen. Es wurden fünf Serotyp 5 spezifische

Gene identifiziert, sie kodieren für ein putatives Hämolysin und seine Transport-

einheit, HhdBA, zwei putative Phagenproteine sowie ein möglicherweise eisenab-

hängiges Rezeptorprotein der äußeren Membran, CirA. Mit den überwiegend in viru-

lenten Stämmen vorkommenden Genen hhdA, hhdB und cirA wurde eine Multiplex-

PCR entwickelt, die die gleichzeitige Überprüfung auf das Vorkommen der drei Gene

ermöglicht. In einer Untersuchung von 214 Feldstämmen waren ca. 33 % positiv für

die Gene hhdA und cirA, hhdB wurde jedoch nur in wenigen Stämmen nach-

gewiesen. Zur Beurteilung der Rolle dieser Gene in der Virulenz sind weitere Unter-

suchungen notwendig.

Vergleiche der Proteinexpression (Ganzzelllysate) und die Analyse einzelner Pro-

teine mittels Massenspektrometrie ergaben, dass sämtliche untersuchten Stämme

ein Protein der äußeren Membran (OMP P2) exprimieren, dessen Masse zwischen

32 und 42 kDa schwankt. Ein Zusammenhang zwischen Proteingröße und Virulenz

eines Isolates konnte nicht beobachtet werden. Die unterschiedlich virulenten Refe-

renzstämme 3, 6, 9 und 10 sowie zwei invasive Feldstämme exprimieren ein Protein

von >200 kDa, welches nicht identifiziert werden konnte.

F Zusammenfassung 122

In einem Infektionsversuch mit dem Referenzstamm von Serotyp 12 entwickelte von

12 serologisch negativen Ferkeln nur eines klinische Symptome, aus den Läsionen

wurde jedoch Mycoplasma hyorhinis nachgewiesen. Der Belastungsstamm wies

genetisch hohe Ähnlichkeiten mit einem bereits vor der Infektion in allen Tieren

nachgewiesen Stamm auf, so dass sie vermutlich protektive maternale Antikörper

besaßen, die mittels ELISA nicht detektiert wurden.

In dieser Studie wurden fünf neue putative virulenzassoziierte Gene von H. parasuis

identifiziert. Ihre Funktion und Rolle in der Virulenz des Erregers muss nachfolgend

durch eine funktionelle Charakterisierung untersucht werden.

G Summary 123

G Summary

Sack, Meike: Identification of new virulence associated factors of

Haemophilus parasuis and development of a multiplex-PCR

H. parasuis is the etiological agent of Glasser’s disease and is responsible for high

economic losses in the production of pork. Very little is known to date about virulence

factors of H. parasuis and a prediction about the potential ability of a strain to cause

disease is currently not possible.

To identify putative virulence-associated genes the genomes of the reference strains

of serotypes 5 (strain Nagasaki, virulent) and 11 (nonvirulent) were compared by

Representational difference analysis. Five genes specific for serotype 5 were identi-

fied, coding for a putative hemolysin and its export system, HhdBA, two phage pro-

teins and a likely iron-responsive regulated receptor protein of the outer membrane,

CirA. Since they are mainly present in virulent reference strains, the genes hhdA,

hhdB and cirA were used to develop a multiplex PCR which makes it possible to

check strains simultaneously for the presence of those three genes. Testing of 214

field strains gave a positive result in 33 % of the isolates for hhdA and cirA, whereas

hhdB was detected only in a few strains. To evaluate the function of those genes in

virulence further investigations are necessary.

Comparison of protein expression of whole-cell lysates and the analysis of single

proteins by mass spectrometry revealed a protein of the outer membrane (OMP P2)

for every investigated strain which varied in mass from 32 to 42 kDa. No correlation

between mass and virulence was observed. Reference strains 3, 6, 9 and 10 and two

field strains isolated systemically express a protein of >200 kDa which could not be

identified.

In a challenge experiment with the reference strain of serotype 12, only one out of 12

serologically negative piglets developed clinical symptoms, however, Mycoplasma

G Summary 124

hyorhinis was reisolated. The strain used for challenge showed a high genetic simi-

larity to an isolate which was shown to be present in the animals before starting the

infection trial, indicating that protective maternal antibodies which were not detected

by ELISA might have been present in the piglets during the curse of infection.

In this study five new putativly virulence associated genes of H. parasuis were identi-

fied. The function and role of which in virulence of H. parasuis has to be analysed by

functional characterization.

H Literaturverzeichnis 125

H Literaturverzeichnis

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I Anhang 137

I Anhang

1 Verbrauchsmittel und Chemikalien

Tab. 7 Eingesetzte Verbrauchsmittel

Eutha® 77, Injektionslösung Essex Tierarznei, München, Deutschland

Glasperlen Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Millipore-Wasser® Merck/VWR International GmbH, Hannover, Deutschland bzw. Millipore, Schwalbach, Deutschland

Mikrotiterplatten, 96-well Tissue Culture Plate 96-Well, Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutschland

Mineralöl Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland

Nylonmembran Roti®-Nylon plus, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

PCR-Gefäß 8-tube strip 0,2 ml, Bioplastics, Landgraaf, Niederlande

Pipettenspitzen Starlab, Ahrensburg, Deutschland

PPLO-Agar® Becton, Dickinson and Company, Heidelberg, Deutschland

Reagiergefäß 1,5 ml Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutschland

Röhre 13 ml Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutschland

Röhre 50 ml Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutschland

Röntgenfilm Kodak, Bio Max X-Rar®-Film, Stuttgart, Deutschland

Stresnil®, Injektionslösung Janssen-Cilag GmbH, Neuss, Deutschland

Ursotamin® Serum-Werk-Bernburg, Bernburg, Deutschland

Columbia-Agar® Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Deutschland

Orange G® AppliChem GmbH, Darmstadt, Deutschland

Blutagar Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Deutschland

Gassner-Agar Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Deutschland

Trockentupfer Wattestäbchen, Neo Lab®, Heidelberg, Deutschland

Feuchttupfer (Amies-Medium) Meus S.r.l., Piove di Sacco, Italien und

I Anhang 138

Medical Wire & Equipment, Corsham, England

Radiografiestift Glow Writer®, Diversified Biotech, Boston, USA

Tab. 8 Eingesetzte Chemikalien

[α-32P]-dCTP 3000Ci/mmol 10mCi/ml Lead, 250 µCi, PerkinElmer, Köln, Deutschland

Acetonitril Merck, VWR International GmbH, Hannover, Deutschland

ACHC (α-Cyano-4-Hydroxy-Cynnamic-Säure)

Bruker Daltonics, Billerica, USA

Acrylamid Acrylamide Bis® (30 % [w/v]), SERVA, Heidelberg, Deutschland

Agar Agar Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Agarose SERVA® Agarose SERVA, SERVA, Heidelberg, Deutschland

Ameisensäure Merck, VWR International GmbH, Hannover, Deutschland

APS Ammoniumperoxidsulfat (98 %), Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Bacto® Tryptone Becton, Dickinson and Company, Heidelberg, Deutschland

Borsäure (99, 5 %) Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

BSA (Fraktion V) Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

BSA, acetyliert NEW ENGLAND BIOLABS® Inc., Frankfurt, Deutschland

Calciumchlorid Merck, VWR International GmbH, Hannover, Deutschland

Chloroform/Trichlormethan Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Coomassie-Brilliantblau R250 Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide (99 %), Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland

Cystein Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland

dNTPs Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

DTT (1,4-Dithiothreitol) Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

I Anhang 139

EDTA EDTA Dinatrium Dihydrat (Titrierkomplex III), Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Essigsäure (100 %) Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Ethanol 96 % unvergällt Elch-Apotheke, Hannover, Deutschland

Ethanol 96 % vergällt Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Ethidiumbromid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland

Ficoll 400 Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden

Fleischextrakt Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Deutschland

Glucose Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Glycerin Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Hefeextrakt Yeast Extract, Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Deutschland

Iodacetamid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland

IPTG Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Isoamyl Merck, VWR International GmbH, Hannover, Deutschland

L-Cystinhydrochlorid- Monohydrat Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Magnesiumchlorid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland

MOPS Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

NaCl (99, 8 %) Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

NAD SERVA, Heidelberg, Deutschland

NaOH Natriumhydroxid (99 %), Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Pepton Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Deutschland

Phenol Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Polyvinylpyrrolidon Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Rubidiumchlorid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland

Saccharose Merck, VWR International GmbH, Hannover, Deutschland

Salzsäure 37 % Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

SDS Pellets (99 %) Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

I Anhang 140

TEMED (99 %) Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Trifluorsäure Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Tri-Natriumcitrat-Dihydrat Merck, VWR International GmbH, Hannover, Deutschland

TRIS TRIS Ultra Qualität (99, 9 %), Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Bacitracin SERVA, Heidelberg, Deutschland

Lincomycin Upjohn Laboratories, Val de Reuil, Frankreich

Kristallviolett Merck, VWR International GmbH, Hannover, Deutschland

Methanol Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Bromphenolblau Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland

Mercaptoethanol Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland

I Anhang 141

Tab. 9 Eingesetzte Enzyme

GoTaq® Hot Start Promega, Mannheim, Deutschland

GoTaq® Flexi DNA Polymerase Promega, Mannheim, Deutschland

Klenow-Fragment T4-DNA Polymerase®, NEW ENGLAND BIOLABS Inc., Frankfurt, Deutschland

Ligase T4 DNA Ligase®, NEW ENGLAND BIOLABS® Inc., Frankfurt, Deutschland

Lysozym Lysozym® aus Hühnereiweiß (kristallisiert und lyophyllisiert), Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Proteinase K Proteinase K®, lyophilisiert, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Restriktionsenzyme und ihre Puffer NEW ENGLAND BIOLABS® Inc., Frankfurt, Deutschland

RNAse Ribonuclease®, salzfrei, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Taq-Polymerase Taq DNA Polymerase®, recombinant, Gibco Invitrogen Corporation, Karlsruhe, Deutschland

Trypsin, Sequencing grade Promega, Mannheim, Deutschland

Antarctic Phosphatase® NEW ENGLAND BIOLABS® Inc., Frankfurt, Deutschland

Turbo DNAse® Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland

Reverse Transkriptase SuperscriptII®; Gibco Invitrogen Corporation, Karlsruhe, Deutschland

Tab. 10 Molekulargewichtsstandards

DNA:

2-Log Ladder® NEW ENGLAND BIOLABS® Inc., Frankfurt, Deutschland

100 bp ladder® Diagonal GmbH & Co KG, Münster, Deutschland

Proteine:

Pageruler® Proteinmarker prestained/ unstained

Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland

CalMix1® und CalMix2® Applied Biosystems, Forster City, USA

I Anhang 142

2 Lösungen und Puffer

Tab. 11 Medien

LB-Medium (LURIA-BERTANI-Medium): Bacto-Trypton 10 g Hefeextrakt 5 g NaCl 5 g Aqua dest. ad 1000 ml

LB-Agar: LB-Flüssigmedium, Zugabe von 1,5 % Agar (w/v)

PPLO-Agar: 35 g/l PPLO®-Agar Aqua dest. ad 1000 ml

Kochblut-Agar: 39 g Columbia-Agar® 2 g Agar 100 ml Schafsblut 10 mg NAD 4 ml Aqua dest.

Columbia-Schafsblut-Agar: 39 g Columbia-Agar® 1 g Agar 50 ml Rinderblut 400 µg Bacitracin 4 µg Lincomycin 4 µg Kristallviolett 700 mg NAD

Schweineblut-Agar 1000ml Aqua dest. 5 g NaCl 10 g Pepton 10 g Fleischextrakt 1,5 ml NaOH (4 %) 12,5 g Agar 70 ml Schweineblut

BHI-Medium: 37 g/l BHI®-Agar Aqua dest. ad 1000 ml

Ersatz-Isovitalex (EIVX): 0,5 g L-Cystin-dihydrochloride in 400 ml Aqua dest. lösen mit 5 M NaOH den pH-Wert auf 9,4 einstellen 13 g Cystein 50 g Glucose mit 5 M NaOH den pH-Wert auf 6-7 einstellen 0,5 g NAD Aqua dest. ad 500 ml

I Anhang 143

Tab. 12 Präparation chromosomaler DNA

TEN-Puffer: 100 µl Lysozym (100 mg/ml) 50 µl Tris 1M (pH 8,0) 2 µl EDTA 0,5 M (pH 8,0) 25 µl NaCl 4M 823 µl Aqua dest.

CTAB: 4,1 g NaCl 10 g CTAB Aqua dest ad 100 ml

Tab. 13 Agarosegel-Elektrophorese

10 x TBE–Puffer: 108 g Tris 55 g Borsäure 6,72 g EDTA Aqua dest. ad 1000 ml

Laufpuffer: 2 mg/ml Orange G® 30 % Glycerin

Tab. 14 Acrylamidgelelektrophorese

18 %iges TBE-Acrylamidgel: 6 ml 30 %igem Acrylamid 1 ml 10 x TBE-Puffer 1 ml Aqua dest 10 µl TEMED 100 µl APS (10 %)

Tab. 15 Koloniegel

Lysepuffer: 2 g Saccharose 0,4 ml 5 M NaOH 0,4 ml 3 M KCl 0,2 ml 0,5 M EDTA 0,25 ml 20 % SDS 1 ml 1% Bromphenolblau

I Anhang 144

Tab. 16 Herstellung chemokompetenter Zellen

TFB-1: 0,29 g (30 mM) Kalium-Acetat 1,21 g (100 mM) Rubidiumchlorid 0,11 g (10 mM) CaCl2 0,99 g (50 mM) MnCl2

30,0 ml Glycerin, 50 %ig (v/v), pH 5,8 Aqua dest. ad 100 ml

TFB-2: 0.21 g (10 mM) MOPS 0,83 g (75 mM) CaCl2

0,12 g (10 mM) RbCl 30,0 ml Glycerin, 50 %ig (v/v), pH 6,5) Aqua dest. ad 100 ml

Tab. 17 Herstellung einer Gensonde

OLB:

Lösung O:

Lösung A:

Lösung B:

Lösung C:

OLB:

0.625 ml 2 M Tris-HCl pH 8.0 0.125 ml 1 M MgCl2

0.250 ml Aqua dest. 1 ml Lösung O

18 µl 2-Mercaptoethanol 5 µl d___TP 5 µl d___TP 5 µl d___TP (je 100 mM in 3 mM Tris-HCl, 0,2 mM EDTA, pH 7)

2 M Hepes, pH 6.6 mit 4 M NaOH einstellen

Hexadeoxyribonucleotides (90 OD units/ml = 4,5 mg/ml in TE)

100 Teile Lösung A 250 Teile Lösung B 150 Teile Lösung C

Stopplösung:

20µM NaCl 20mM Tris-HCl (pH 7,5) 2 mM EDTA 0,25 % SDS 1 µM des unmarkierten Nukleotids, das zur Markierung eingesetzt wurde

I Anhang 145

Tab. 18 Southern Hybridisierung

50 x Denhardt's Lösung: 5 g Ficoll 5 g Polyvinylpyrrolidon 5 g BSA (Fraktion V)

20 x SSC: 175,3 g NaCl (3 M) 88,2 g Tri-Natriumcitrat (0,3 M) Aqua dest. ad 800 ml den pH-Wert mit Zitronensäure auf 7,0 einstellen Aqua dest. ad 1000 ml

Hybridisierungspuffer: 6 ml 20 x SSC 0.4 ml 0.5 M EDTA 2 ml 50 x Denhardt's Lösung 0.5 ml 20 % SDS Aqua dest. ad 20 ml

Tab. 19 SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-Page)

Spaltpuffer (2x): 1,5 ml 0,5 M Tris (pH 6,8) 6 ml 10 % SDS 3 ml 50 % Glycerin 10 µl 1 % Bromphenolblau 1 ml 2- Mercaptoethanol

Färbelösung mit Methanol: 1,25 g Coomassie ® Brillantblau R 250 225 ml Methanol 50 ml Eisessig 225 ml Aqua dest.

Entfärber mit Methanol: 300 ml Methanol 100 ml Eisessig 600 ml Aqua dest.

Coomassie-Blau-Färbung ohne Methanol: 25 % Isopropanol 10 % Essigsäure 0,05 % Coomassie ® Brillantblau R 250

Entfärber ohne Methanol 10 % Essigsäure

Polyacrylamidgel, Trenngel: 4,68 Aqua dest. 3,0 ml 1,5 M Tris-Puffer (pH 8,8) 120 µl SDS (10 %) 12 µl TEMED 4,56 ml Acrylamid (30 %) 120 µl APS (10 %)

Polyacrylamidgel, Sammelgel: 3,66 Aqua dest. 1,5 ml 0,5 M Tris-Puffer (pH 6,8) 60 µl SDS (10 %) 12 µl TEMED

I Anhang 146

0,78 ml Acrylamid (30 %) 60 µl APS (10 %)

10 x SDS Laufpuffer 259 mM Tris 2 M Glycin 1% (w/v) SDS

I Anhang 147

3 Eingesetzte Stämme

Tab. 20 Angaben zu den Referenzstämmen 1-15

Stamm Serovar Referenzstamm Diagnose/Isolationsort Quelle

H. parasuis

1 nr. 4 gesund/Nase

(KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON 1992)

2 SW140 gesund/Nase

3 SW114 gesund/Nase

4 SW124 gesund/Nase

5 Nagasaki Septikämie/Meningen

6 131 gesund/Nase

7 174 gesund/Nase

8 C5 unbekannt

9 D74 unbekannt

10 H555 gesund/Nase

11 H465 Pneumonie/Trachea

12 H425 Polyserositis/Lunge

13 84-17975 unbekannt/Lunge

14 84-22113 unbekannt/Gelenk

15 84-15995 Pneumonie/Lunge

Tab. 21 Angaben zu den 16 Feldisolaten aus pneumonischen Lungen

Stamm Feldstamm Isolationsort Quelle

H. parasuis

1. B0033 2. B0335 3. B0352 4. B0569 5. B0366 6. B0577 7. B0578 8. B0611 9. B0612 10. B0621 11. B0659 12. B0684 13. B0696 14. B0735 15. B1009 16. B1040

Lunge Dr. Mumme

I Anhang 148

Tab. 22 Angaben zu den zehn systemisch isolierten Feldisolaten

Stamm Feldstamm Isolation Quelle

H. parasuis

1. Maas 1 2. Maas 2 3. Maas 3

Meningen

Diagnostische Abteilung des Instituts für Mikrobiologie

4. Baums1 Gelenk Dr. Baums, Institut für Mikrobiologie

5. B1035 6. B321 7. B360 8. H5392 9. B1018

Meningen Meningen Meningen Perikard Meningen

Dr. Mumme

10. HPS-Perikard Perikard Diagnostische Abteilung des Instituts für Mikrobiologie

Tab. 23 Angaben zu den zwölf nasal isolierten Feldisolaten


H. parasuis 1-12 Nasentupfer diese Arbeit

Tab. 24 Angaben zu den 214 Feldisolaten verschiedener Lokalisationen


H. parasuis 1-214 Verschiedene Lokalisationen

Dr. Mumme

Tab. 25 Teststämme zur Spezifitätsprüfung der in der Multiplex-PCR eingesetzten Primerpaare

Stamm Quelle

Candida albicans Feldisolate der diagnostischen Abteilung des Instituts für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Mucor ssp.

Escherichia coli DH5- α (RALEIGH et al. 1989)

Klebsiella pneumoniae

Feldstämme der diagnostischen Abteilung des Instituts für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Bordetella bronchiseptica

Pasteurella multocida

Histophilus somni

A. minor

A. indolicus

A. suis

A. porcinus

I Anhang 149

4 Tabellarische Zusammenfassung der Ergebnisse der PCR-Un-tersuchungen

Tab. 26 Zusammenfassung der PCR-Untersuchungen der Referenzstämme 1-15

Serotyp/Gen hhdA* Spezies-

nachweis* hhdB* cirA*

phagen-assoz. Gene*

1 - + - - - 2 - + - - + 3 - + - - - 4 - + - - - 5 + + + + + 6 - + - - - 7 - + - - - 8 - + - - - 9 - + - - - 10 - + - - - 11 - + - - - 12 + + + + + 13 + + + + - 14 + + + + + 15 + + + + +

*Verwendete Primer: oMP_A1 und 2 (hhdA), oMP_B1 und 2 (hhdB), oMP_CirA1 und 2 (cirA), Hps-f und -r (Speziesnachweis), oPhage13_1 und 2 (phagenassoziierte Gene)

I Anhang 150

Tab. 27 Zusammenfassung der PCR-Untersuchungen der Feldisolate aus pneu-monischen Lungen

Bezeichnung RFLP-PCR*

hhdA* Spezies-nach -weis*

hhdB* cirA* phagen-assoz. Gene*

1 B0033 n. d. + + - - - 2 B0335 n. d. - + - - - 3 B0352 n. d. + + + + + 4 B0569 n. d. + + - + - 5 B0366 n. d. + + + + - 6 B0577 n. d. - + - + - 7 B0578 n. d. - + - - - 8 B0611 n. d. + + - + + 9 B0612 n. d. - + - - - 10 B0621 n. d. - + - - - 11 B0659 n. d. - + - - - 12 B0684 n. d. + + - + - 13 B0696 n. d. + + - + + 14 B0735 n. d. - + - - - 15 B1009 n. d. - + - - - 16 B1040 n. d. - + - - -

*Verwendete Primer: oMP_A1 und 2 (hhdA), oMP_B1 und 2 (hhdB), oMP_CirA1 und 2 (cirA), Hps-f und -r (Speziesnachweis), tbpB33 und 55 (RFLP-PCR), oPhage13_1 und 2 (phagenassoziierte Gene)

Tab. 28 Zusammenfassung der PCR-Untersuchungen der Feldisolate aus syste-mischen Läsionen




1 Maas 1 n. d. + + - + - 2 Maas 2 n. d. - + - - - 3 Maas 3 n. d. - + - - - 4 Baums 1 n. d. - + - - - 5 B1035 n. d. + + - + - 6 B321 n. d. - + - - + 7 B360 n. d. + + - + - 8 H5392 n. d. + + - + - 9 B1018 n. d. - + - - + 10 Perikard n. d. + + - + -


I Anhang 151

Tab. 29 Zusammenfassung der PCR-Untersuchungen der nasal isolierten Feld-isolate




Nasal 1 neu - + - - - Nasal 2 neu - + - (+) - Nasal 3 neu - + - (+) - Nasal 4 neu - + - (+) - Nasal 5 neu - + - - - Nasal 6 wie 12 + + + + + Nasal 7 wie 12 + + + + + Nasal 8 wie 12 + + + + +

Nasal 9 kein

Produkt - + - (+) -

Nasal 10 wie 12 + + + + + Nasal 11 wie 12 + + + (+) + Nasal 12 wie 12 + + + (+) +


I Anhang 152

Tab. 30 Zusammenfassung der PCR-Untersuchungen der Feldstämme verschie-dener Isolationsorte

Lfd.-Nr.

Klon Nr. (Platte, Ort)

RFLP-PCR*



1 A, A3 n. d. - + - - n. d. 2 A, A5 n. d. - + - - n. d. 3 A, A6 n. d. - + - - n. d. 4 A, A8 n. d. + + - + n. d. 5 A, A9 n. d. + + - + n. d. 6 A, A11 n. d. + + - + n. d. 7 A, A12 n. d. + + - + n. d. 8 A, B2 n. d. + + - + n. d. 9 A, B4 n. d. + + - + n. d. 10 A, B5 n. d. + + - + n. d.

11 B, A1 n. d. - + - - n. d. 12 B, A2 n. d. - + - - n. d. 13 B, A3 n. d. - + - - n. d. 14 B, A4 n. d. - + - - n. d. 15 B, A5 n. d. - + - - n. d. 16 B, A6 n. d. + + - + n. d. 17 B, A7 n. d. + + - + n. d. 18 B, A8 n. d. + + - + n. d. 19 B, A9 n. d. - + - - n. d. 20 B, A10 n. d. - + - - n. d.

21 B, A11 n. d. + + - + n. d. 22 B, A12 n. d. - + - - n. d. 23 B, B1 n. d. - + - - n. d. 24 B, B2 n. d. - + - - n. d. 25 B, B3 n. d. - + - - n. d. 26 B, B4 n. d. - + - - n. d. 27 B, B5 n. d. - + - - n. d. 28 B, B6 n. d. - + - - n. d. 29 B, B7 n. d. - + - - n. d. 30 B, B8 n. d. - + - - n. d.

31 B, B9 n. d. - + - - n. d. 32 B, B10 n. d. - + - - n. d. 33 B, B11 n. d. - + - - n. d. 34 B, B12 n. d. - + - - n. d. 35 B, C1 n. d. - + - - n. d. 36 B, C2 n. d. - + - - n. d. 37 B, C3 n. d. - + - - n. d. 38 B, C5 n. d. - + - - n. d. 39 B, C6 n. d. - + - - n. d. 40 B, C7 n. d. - + - - n. d.

41 B, C8 n. d. - + - - n. d. 42 B, C9 n. d. - + - - n. d. 43 B, C10 n. d. - + - - n. d. 44 B, C11 n. d. - + - - n. d. 45 B, C12 n. d. - + - - n. d. 46 B, D1 n. d. - + - - n. d. 47 B, D2 n. d. - + - - n. d. 48 B, D3 n. d. - + - - n. d. 49 B, D4 n. d. - + - - n. d. 50 B, D5 n. d. - + - - n. d.

I Anhang 153

Lfd.-Nr.


RFLP-PCR*



51 B, D6 n. d. + + - + n. d. 52 B, D7 n. d. - + - - n. d. 53 B, D8 n. d. + + - + n. d. 54 B, D9 n. d. + + - + n. d. 55 B, D10 n. d. + + + + n. d. 56 B, D12 n. d. - + - - n. d. 57 B, E1 n. d. + + - + n. d. 58 B, E2 n. d. + + - + n. d. 59 B, E3 n. d. - + - - n. d. 60 B, E4 n. d. - + - - n. d.

61 B, E7 n. d. - + - - n. d. 62 B, E8 n. d. - + - - n. d. 63 B, E9 n. d. - + - - n. d. 64 B, E10 n. d. + + - + n. d. 65 B, E12 n. d. - + - - n. d. 66 B, F1 n. d. - + - - n. d. 67 B, F2 n. d. - + - - n. d. 68 B, F3 n. d. - + - - n. d. 69 C, A1 n. d. - + - - n. d. 70 C, A2 n. d. + + - + n. d.

71 C, A4 n. d. - + - - n. d. 72 C, A5 n. d. - + - - n. d. 73 C, A6 n. d. - + - - n. d. 74 C, A7 n. d. - + - - n. d. 75 C, A8 n. d. + + + + n. d. 76 C, A9 n. d. - + - - n. d. 77 C, A10 n. d. - + - - n. d. 78 C, A11 n. d. + + + + n. d. 79 C, A12 n. d. - + - - n. d. 80 C, B3 n. d. - + - - n. d.

81 C, B4 n. d. + + - + n. d. 82 C, B5 n. d. + + - + n. d. 83 C, B6 n. d. - + - - n. d. 84 C, B8 n. d. - + - - n. d. 85 C, B9 n. d. + + + + n. d. 86 C, B10 n. d. - + - - n. d. 87 C, B11 n. d. - + - - n. d. 88 C, B12 n. d. - + - - n. d. 89 C, C2 n. d. - + - - n. d. 90 C, C3 n. d. + + - + n. d.

91 C, C4 n. d. - + - - n. d. 92 C, C5 n. d. - + - - n. d. 93 C, C6 n. d. + + - + n. d. 94 C, C7 n. d. - + - - n. d. 95 C, C8 n. d. - + - - n. d. 96 C, C9 n. d. + + - + n. d. 97 C, C11 n. d. - + - - n. d. 98 C, C12 n. d. + + - + n. d. 99 C, D1 n. d. - + - - n. d. 100 C, D2 n. d. - + - - n. d.

101 C, D3 n. d. - + - - n. d. 102 C, D4 n. d. - + - - n. d. 103 C, D5 n. d. + + + + n. d.

I Anhang 154

Lfd.-Nr.


RFLP-PCR*



104 C, D7 n. d. - + - - n. d. 105 C, D8 n. d. - + - - n. d. 106 C, D9 n. d. - + - - n. d. 107 C, D10 n. d. - + - - n. d. 108 C, D11 n. d. - + - - n. d. 109 C, D12 n. d. + + - + n. d. 110 C, E1 n. d. - + - - n. d.

111 C, E2 n. d. + + - + n. d. 112 C, E3 n. d. - + - - n. d. 113 C, E4 n. d. - + - - n. d. 114 C, E5 n. d. - + - - n. d. 115 C, E7 n. d. + + - + n. d. 116 C, E8 n. d. - + - - n. d. 117 C, E9 n. d. - + - - n. d. 118 C, E10 n. d. - + - - n. d. 119 C, E11 n. d. - + - - n. d. 120 C, F1 n. d. + + - + n. d.

121 C, F8 n. d. + + - + n. d. 122 C, F9 n. d. + + - + n. d. 123 C, F11 n. d. + + - + n. d. 124 C, G4 n. d. - + - - n. d. 125 C, G5 n. d. - + - - n. d. 126 C, G6 n. d. - + - - n. d. 127 C, G7 n. d. - + - - n. d. 128 C, G8 n. d. - + - - n. d. 129 C, G9 n. d. - + - - n. d. 130 C, G12 n. d. - + - + n. d.

131 C, H1 n. d. - + - - n. d. 132 C, H2 n. d. + + - + n. d. 133 C, H3 n. d. + + - + n. d. 134 C, H4 n. d. - + - - n. d. 135 C, H5 n. d. + + - + n. d. 136 C, H6 n. d. - + - - n. d. 137 C, H8 n. d. - + - - n. d. 138 C, H9 n. d. + + - + n. d. 139 D, A1 n. d. - + - - n. d. 140 D, A2 n. d. - + - - n. d.

141 D, A4 n. d. + + - + n. d. 142 D, A6 n. d. + + - + n. d. 143 E, A1 n. d. + + - + n. d. 144 E, A2 n. d. - + - - n. d. 145 E, A3 n. d. + + - + n. d. 146 E, A4 n. d. + + - + n. d. 147 E, A5 n. d. - + - - n. d. 148 E, A6 n. d. - + - - n. d. 149 E, A7 n. d. - + - - n. d. 150 E, A8 n. d. + + - + n. d.

151 E, A9 n. d. - + - - n. d. 152 E, A10 n. d. - + - - n. d. 153 E, A11 n. d. + + + + n. d. 154 E, A12 n. d. - + - - n. d. 155 E, B1 n. d. + + - + n. d. 156 E, B2 n. d. + + - + n. d.

I Anhang 155

Lfd.-Nr.


RFLP-PCR*



157 E, B3 n. d. - + - - n. d. 158 E, B4 n. d. - + - - n. d. 159 E, B6 n. d. + + - + n. d. 160 E, B7 n. d. - + - (+) n. d.

161 E, B8 n. d. + + - + n. d. 162 E, B9 n. d. + + - + n. d. 163 E, B10 n. d. + + - + n. d. 164 E, B11 n. d. - + - - n. d. 165 E, B12 n. d. - + - - n. d. 166 E, C1 n. d. - + - - n. d. 167 E, C2 n. d. - + - - n. d. 168 E, C3 n. d. + + - + n. d. 169 E, C4 n. d. - + - - n. d. 170 E, C5 n. d. - + - - n. d.

171 E, C6 n. d. + + - + n. d. 172 E, C7 n. d. - + - - n. d. 173 E, C8 n. d. - + - - n. d. 174 E, C9 n. d. - + - - n. d. 175 E, C11 n. d. - + - - n. d. 176 E, D1 n. d. + + - + n. d. 177 E, D2 n. d. + + - + n. d. 178 E, D3 n. d. + + + + n. d. 179 E, D4 n. d. + + - + n. d. 180 E, D5 n. d. - + - - n. d.

181 E, D6 n. d. + + - + n. d. 182 E, D7 n. d. - + - - n. d. 183 E, D8 n. d. - + - - n. d. 184 E, D10 n. d. - + - - n. d. 185 E, D11 n. d. - + - - n. d. 186 E, D12 n. d. - + - - n. d. 187 E, E1 n. d. - + - - n. d. 188 E, E2 n. d. - + - - n. d. 189 E, E3 n. d. - + - - n. d. 190 E, E4 n. d. - + - - n. d.

191 E, E5 n. d. - + - - n. d. 192 E, E6 n. d. + + + + n. d. 193 E, E9 n. d. - + - - n. d. 194 E, E10 n. d. - + - - n. d. 195 E, E11 n. d. - + - - n. d. 196 E, E12 n. d. + + + + n. d. 197 E, F1 n. d. + + - + n. d. 198 E, F2 n. d. - + - - n. d. 199 E, F3 n. d. + + - + n. d. 200 E, F4 n. d. - + - - n. d.

201 E, F5 n. d. + + + + n. d. 202 E, F6 n. d. - + - - n. d. 203 E, F7 n. d. + + - + n. d. 204 E, F8 n. d. - + - - n. d. 205 E, F9 n. d. + + - + n. d. 206 E, F10 n. d. + + - + n. d. 207 E, F11 n. d. + + - + n. d. 208 E, F12 n. d. - + - - n. d. 209 E, G1 n. d. + + - + n. d.

I Anhang 156

Lfd.-Nr.


RFLP-PCR*



210 E, G2 n. d. - + - - n. d.

211 E, G3 n. d. - + - - n. d. 212 E, G4 n. d. - + - - n. d. 213 E, G5 n. d. - + - - n. d. 214 E, G8 n. d. + + - + n. d.


Tab. 31 Zusammenfassung der PCR-Untersuchungen der Reisolate des Infek-tionsversuchs

Probennummer RFLP-PCR*



1 wie 12 + + - + + 2 wie 12 + + + + - 3** wie 12 + + + + - 4** wie 12 + + + + - 5 wie 12 + + + + - 6 wie 12 + + + + + 7** wie 12 + + + + - 8 wie 12 + + + + + 9 wie 12 + + + + + 10 wie 12 + - + + +

11 wie 12 + + + + + 12 wie 12 + + + + - 13 wie 12 + + + + - 14 neu - + - - - 15 wie 12 + + + + + 16 wie 12 + + + + - 17 wie 12 + + + + - 18 wie 12 + + + + - 19 wie 12 + + + + + 20 neu - + - - -

21 wie 12 + + + + - 22 wie 12 + - + + + 23 wie 12 + - + + + 24 wie 12 + + + + + 25 wie 12 + + + + + 26 wie 12 + + + + - 27 wie 12 + + + + - 28 wie 12 + + + + - 29 wie 12 + + + + - 30 wie 12 + + + + -

31 wie 12 + + + + - 32 wie 12 + + + + - 33 wie 12 + + + + - 34 wie 12 + - - + -

I Anhang 157

Probennummer RFLP-PCR*



35 neu - + - - - 36** wie 12 + - + + - 37** wie 12 + + + + - 38** wie 12 + + + + - 39 neu - + - - -

40** kein Produkt

- + - - -

41 wie 12 + + + + + 42 wie 12 + + + + - 43 wie 12 + + + + + 44 wie 12 + + + + + 45 wie 12 + + + + + 46 wie 12 + + + + - 47 neu - + - - - 48 neu - + - - - 49 wie 12 + + + + + 50 wie 12 + + + + +

51 wie 12 + + + + - 52 wie 12 + + + + + 53 wie 12 + + + + + 54 wie 12 + + + + + 55 wie 12 + + + + - 56 wie 12 + + + + + 57 wie 12 + + + + - 58 wie 12 + + + + -

*Verwendete Primer: oMP_A1 und 2 (hhdA), oMP_B1 und 2 (hhdB), oMP_CirA1 und 2 (cirA), Hps-f und -r (Speziesnachweis), tbpB33 und 55 (RFLP-PCR), oPhage13_1 und 2 (phagenassoziierte Gene) **von systemischen Läsionen isoliert

I Anhang 158

5 Ergebnisse der massenspektrometrischen Untersuchungen

Tab. 32 Mittels Q-TOF untersuchte Proben mit einer Übereinstimmung zum OMP P2 von H. parasuis

Probe Anzahl der übereinstimmenden Peptide zum OMP P2 (ZP_02477753)

18 2 2, 4, 8, 11, 12, 21 je 3 14, 15 je 4 17 5 1, 5, 20 je 6 6, 16 je 7 19 9

Tab. 33 Aminosäuresequenz des OPM P2 (ZP_02477753) von H. parasuis, übereinstimmende Peptide aus der Tabelle sind unterstrichen.

1 MKKTLVALAV AAFAASASAV TVYENEGTKV DFDGQLRLLL

41 EEQATKEKGQ SSTGGHTNLK NNGSRFGISI KHNINENLYG

81 FGRYETRLDS NSKNAAGWGD VKTKYAYVGL GGYGHEISFG

121 KQAVIGDSIG QAGFDKVYGV GTGGIKYSAN NTNKKGFDIL

161 TSDSDSAINY TYTGIEGLTL GANYNVANER DKKTGEVNVG

201 STKSGFGLGA KYTAKIAESQ SVTVAAGYTH DDYKSGSVNK

241 KDKDGVYFGL KYVNAPFTVA VDGGHGVEKT GNVKEKIDFV

281 RTGARFDVTP KSGVYGNYSY GTYKDKAYKA TAHQFMLGAD

321 YKLHKQVVTF VEGRLIKNKD SNNKKVTDQA LGVGLRVLW

I Anhang 159

Tab. 34 Probe 7: Aminosäuresequenz der größeren Untereinheit der Pseudo-uridin-Synthase B von H. parasuis (ZP_02477992), übereinstimmende Peptide sind unterstrichen.

1 MTTFRKPTAT KRSDSAKTLQ KPTQRNTRQE TQNRKPLVKK

41 SPKPTASIET ENKANDKIVG EKLQKILARA GQGSRREIEE

81 VIAAGRVSVD GKIATLGDRV QVSSSTKIRI DGNLVNLIPT

121 QKEICRVLMY YKPEGELCTR SDPEGRATVF DRLPRLTGSR

161 WIAVGRLDIN TSGLLLFTTD GELANRLMHP SREVEREYSV

201 RVFGEVNDAM IQRLRKGVQL EDGPANFKQI KAVGGTGINQ

241 WFDVTLTEGR NREVRRLWES QGIQVSRLIR IRYGNIKLEK

281 SLPRGGWEEM GLEQVNYLRE LVGLKPETET KVDVTKARRR

321 TSTRQIRKAV KQHTKYRKI

Tab. 35 Mittels Q-TOF-Massenspektrometrie ermittelte Peptidsequenzen aus Probe 7 (Referenzstamm 6)

Probe 7

APEAGTEAVPVFPGK GNAGAENAGSLAK

APEGATEAVPVFPGK GTPSGPVTPGK

APEQTEAVPVDVSK NGAGAENAGLSAK

APEQTEPVAVFPGK NGAGAENAGSLAK

APEQTEAVPVFPGK SAPSGPVTPGK AEPGSPHAGGNPK TAEPSASSMVPAK

ASPSGPVTPGK TGPSGPVTPGK

ATITLPEDK TPAPTDAVMGPR

DPFEAFAK TAPPTDAVMGPR

DVPGQGVQGPAASGGK TPAPTDAVETAR

EAPGSPGPAPNPK TAEFAGPESSPAK

EAPGSPPPAGNPK TAEPTGSSMVPAK

EAPGSPHAGGNPK TPAPTDAVMPGR

EAPGSPAPPGNPK TPAPNDTPGK

GNAGAENAGLSAK VATVSLPR

I Anhang 160

6 Tabellarische Zusammenfassung der Ergebnisse des Tierversuchs

Tab

. 36

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I Anhang 161

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I Anhang 162

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I Anhang 163

7 Tabellenverzeichnis

Tab. 1 Verwendete Primer .................................................................................. 40

Tab. 2 Ergebnisse der Homologiesuche spezifischer Sequenzen für Sero-typ 5 ......................................................................................................... 65

Tab. 3 Verteilung der spezifischen Sequenzen innerhalb der Referenz-stämme 1-15 ............................................................................................ 74

Tab. 4 Verteilung der spezifischen Sequenzen innerhalb der zwölf nasal isolierten Feldstämme.............................................................................. 74

Tab. 5 Verteilung der spezifischen Sequenzen innerhalb der 16 aus pneu-monischen Lungen isolierten Feldstämme .............................................. 74

Tab. 6 Verteilung der spezifischen Sequenzen innerhalb der zehn syste-misch isolierten Feldstämme ................................................................... 75

Tab. 7 Eingesetzte Verbrauchsmittel ................................................................ 137

Tab. 8 Eingesetzte Chemikalien ....................................................................... 138

Tab. 9 Eingesetzte Enzyme .............................................................................. 141

Tab. 10 Molekulargewichtsstandards ................................................................. 141

Tab. 11 Medien ................................................................................................... 142

Tab. 12 Präparation chromosomaler DNA .......................................................... 143

Tab. 13 Agarosegel-Elektrophorese ................................................................... 143

Tab. 14 Acrylamidgelelektrophorese .................................................................. 143

Tab. 15 Koloniegel .............................................................................................. 143

Tab. 16 Herstellung chemokompetenter Zellen .................................................. 144

Tab. 17 Herstellung einer Gensonde .................................................................. 144

Tab. 18 Southern Hybridisierung ........................................................................ 145

Tab. 19 SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-Page) ............................. 145

Tab. 20 Angaben zu den Referenzstämmen 1-15 .............................................. 147

Tab. 21 Angaben zu den 16 Feldisolaten aus pneumonischen Lungen ............. 147

Tab. 22 Angaben zu den zehn systemisch isolierten Feldisolaten ...................... 148

Tab. 23 Angaben zu den zwölf nasal isolierten Feldisolaten .............................. 148

Tab. 24 Angaben zu den 214 Feldisolaten verschiedener Lokalisationen .......... 148

Tab. 25 Teststämme zur Spezifitätsprüfung der in der Multiplex-PCR einge-setzten Primerpaare .............................................................................. 148

I Anhang 164

Tab. 26 Zusammenfassung der PCR-Untersuchungen der Referenzstämme .... 149

Tab. 27 Zusammenfassung der PCR-Untersuchungen der Feldisolate aus pneumonischen Lungen ........................................................................ 150

Tab. 28 Zusammenfassung der PCR-Untersuchungen der Feldisolate aus systemischen Läsionen ......................................................................... 150

Tab. 29 Zusammenfassung der PCR-Untersuchungen der nasal isolierten Feldisolate ............................................................................................. 151

Tab. 30 Zusammenfassung der PCR-Untersuchungen der Feldstämme ver-schiedener Isolationsorte ....................................................................... 152

Tab. 31 Zusammenfassung der PCR-Untersuchungen der Reisolate des Infektionsversuchs ................................................................................. 156

Tab. 32 Mittels Q-TOF untersuchte Proben mit einer Übereinstimmung zum OMP P2 von H. parasuis ....................................................................... 158

Tab. 33 Aminosäuresequenz des OPM P2 (ZP_02477753) von H. parasuis. .... 158

Tab. 34 Probe 7: Aminosäuresequenz der größeren Untereinheit der Pseu-douridin-Synthase B von H. parasuis (ZP_02477992) ........................... 159

Tab. 35 Mittels Q-TOF-Massenspektrometrie ermittelte Peptidsequenzen aus Probe 7 (Referenzstamm 6) ............................................................ 159

Tab. 36 Reisolate und PCR-Ergebnisse der Einzeltiere aus dem Infek-tionsversuch mit dem Referenzstamm von Serotyp 12 vor der Infek-tion ......................................................................................................... 160

Tab. 37 Reisolate und PCR-Ergebnisse der Einzeltiere aus dem Infek-tionsversuch mit dem Referenzstamm von Serotyp 12 nach der Infektion ................................................................................................. 161

Tab. 38 Ergebnisse der PCR- und ELISA-Untersuchungen der Einzeltiere aus dem Infektionsversuch mit dem Referenzstamm von Serotyp 12 vor der Infektion, durchgeführt durch die IVD ........................................ 162

I Anhang 165

8 Abbildungsverzeichnis

Abb. 1 Schemazeichnung Repräsentative Differenzanalyse .............................. 47

Abb. 2 PCR des RDA-Ansatzes mit dem Primer RBgl24 .................................... 60

Abb. 3 PCR von 85 RDA-Klonen mit den Primern M13 forward und reverse ..... 61

Abb. 4 Southern Blot der 85 PCR-Produkte aus den RDA-Klonen mit M13-Primern .................................................................................................... 62

Abb. 5 Überprüfung auf das Vorkommen des Gens hhdA in den Referenz-stämmen 1-15. ......................................................................................... 68

Abb. 6 PCR-Überprüfung auf das Vorkommen des Gens hhdA in Feld-isolaten mit den Primern oMP_A1 und 2 (964 bp) ................................... 68

Abb. 7 Überprüfung auf das Vorkommen des Gens hhdB in den Referenz-stämmen 1-15. ......................................................................................... 69

Abb. 8 PCR-Überprüfung auf das Vorkommen des Gens hhdB in Feldiso-laten mit den Primern oMPB_1 und 2 (557 bp) ........................................ 69

Abb. 9 Überprüfung auf das Vorkommen des Gens cirA in den Referenz-stämmen 1-15. ......................................................................................... 71

Abb. 10 PCR-Überprüfung auf das Vorkommen des Gens cirA in Feldiso-laten mit den Primern oMPCirA_1 und 2 (135 bp) ................................... 71

Abb. 11 PCR-Überprüfung auf das Vorkommen der beiden phagenasso-ziierten Gene in den Referenzstämmen 1-15 mit den Primern oPhage13_1 und 2 (301 bp). ................................................................... 72

Abb. 12 PCR-Überprüfung auf das Vorkommen der beiden phagenasso-ziierten Gene in Feldisolaten mit den Primern oPhage13_1 und 2 (301 bp) ................................................................................................... 72

Abb. 13 RT-PCR mit Serotyp 5 (Stamm Nagasaki) .............................................. 73

Abb. 14 SDS-PAGE mit Ganzzelllysaten, Commassie gefärbt ............................. 77

Abb. 15 SDS-PAGE mit Ganzzelllysaten, Coomassie gefärbt .............................. 78

Abb. 16 Beispielhaftes Spektrum Gruppe 1 (Probe 6) .......................................... 79

Abb. 17 Beispielhaftes Spektrum Gruppe 2 (Probe 7) .......................................... 80

Abb. 18 Spektrum Probe 3 (ohne Ähnlichkeiten zu den Spektren anderer Proben) .................................................................................................... 80

Abb. 19 Spektrum Probe 15 (ohne Ähnlichkeiten zu den Spektren anderer Proben) .................................................................................................... 81

I Anhang 166

Abb. 20 PCR mit den Referenzstämmen 1-15 mit den Primern oPorin1 und 2 zur Überprüfung auf das Vorkommen der Gensequenz des OMP P2 Proteins von H. parasuis. ......................................................................... 82

Abb. 21 Beispielhaftes Spektrum der massenspektrometrischen Untersu-chung mittels Q-TOF (Probe 6) ............................................................... 83

Abb. 22 PCR zum Nachweis des DNA-Gehalts mittels universeller Primer (A) mit Eukaryoten (I) und Bakterien (II), bzw. Multiplex-PCR zur Spe-zifitätsuntersuchung der eingesetzten Primer (B), ................................... 85

Abb. 23 Multiplex-PCR mit chromosomaler DNA von Serotyp 5 (I) und der in-ternen Kontrolle (II) .................................................................................. 87

Abb. 24 Multiplex-PCR der Referenzstämme 1-15, im zweiten Ansatz (+) je-weils mit Zusatz von 1 µl Interner Kontrolle ............................................. 89

Abb. 25 Multiplex-PCR der Feldstämme zur Überprüfung auf das Vorhan-densein der postulierten Virulenzmarker hhdA, hhdB und cirA. ............... 92

Abb. 26 Vorkommen der identifizierten Gene hhdA, hhdB und cirA in den 214 Feldstämmen verschiedener Lokalisationen. ........................................... 94

Abb. 27 Ermittelte Kombinationen der putativen Virulenzmarker hhdA, hhdB und cirA in den 214 Feldisolaten unterschiedlicher Lokalisation. ............. 94

Abb. 28 Tier 11 nach der Infektion mit dem Referenzstamm von Serotyp 12 ....... 97

Abb. 29 RFLP-PCR mit den isolierten Feldstämmen der Versuchstiere ............. 100

Danksagung

Ich danke Prof. Dr. N. Baltes für die gute Betreuung, ihre ständig neuen Ideen, ihr

offenes Ohr, ihren Optimismus und das Rezept vom Kichererbsensalat,

ich danke meiner Gutachterin PD Dr. I. Hennig-Pauka für ihr Interesse an meiner

Arbeit,

ich danke Doris Höltig und Ines Flügge aus der Klinik für kleine Klauentiere für die

Durchführung der Probennahme und Infektion beim Tierversuch, Falk Büttner für den

„Kraftakt“ am Q-TOF und Jochen Meens fürs Probenaufreinigen,

ich danke „Joerch“ Merkel für seine hilfsbereite Art mir Spyware vom Rechner zu

entfernen und die kompliziertesten und simpelsten Computerfragen zu erklären

sowie für das oft so entscheidende Stück Schokolade,

ich danke dem restlichen Institut für Mikrobiologie für das Auftreiben von

Feldstämmen (insbesondere Ute Regul, Alexander Maas und Christoph Baums), die

tolle Arbeitsatmosphäre und eine schöne Zeit, insbesondere Halina für ihre ständige

Bereitschaft, mir ihr Gehirn zu leihen und die gute und stets angenehme

Zusammenarbeit, ich danke Herrn Dr. Mumme für die Bereitstellung der Sammlung

an Feldstämmen und Eva-Lotta Schneider für den Motivationsschub.

Meinen Eltern danke ich einfach nur so und meinem Opa danke ich für meine

Tierliebe.

Für meine persönlich Finanzierung danke ich dem Institut, der Bundeswehr und vor

allem Matthias, der mich all die Jahre, ohne zu jammern und stets bereitwillig

durchgefüttert hat! Letzterem habe ich noch wegen so vielem mehr zu danken -

hoffentlich verzeiht er mir eines Tages, dass er mir kein Programm zur Berechnung

von Gelbanden schreiben durfte…

identifizierung neuer virulenzassoziierter faktoren von ... fileidentifizierung neuer...

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