UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS

INSTITUTO DE PATOLOGÍA ANIMAL

IDENTIFICACIÓN DEL VIRUS DE LA NECROSIS PANCREÁTICA INFECCIOSA POR RT – PCR EN TIEMPO REAL

Memoria de Título presentada como parte de los requisitos para optar al TÍTULO DE MÉDICO VETERINARIO.

DANIELA VIVIANA CÁRCAMO PÉREZ

VALDIVIA – CHILE

2009

PROFESOR PATROCINANTE Dr. Alex Romero Z.

Nombre Firma PROFESOR COLABORADOR Dr. Ricardo Enríquez S.

Nombre Firma PROFESORES CALIFICADORES Dr. Jorge Ulloa H.

Nombre Firma

Dr. Ricardo Enríquez S.

Nombre Firma

FECHA DE APROBACIÓN: 20 de Enero de 2009

Con amor a Luis, mi padre

ÍNDICE Capítulo Página 1. RESUMEN……………………………………………………………..........1 2. SUMMARY.....................................................................................................2 3. INTRODUCCIÓN...........................................................................................3 4. MATERIAL Y MÉTODOS............................................................................14 5. RESULTADOS...............................................................................................20 6. DISCUSIÓN....................................................................................................33 7. BIBLIOGRAFÍA.............................................................................................38 8. AGRADECIMIENTOS...................................................................................43

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1. RESUMEN

El virus de la necrosis pancreática infecciosa, IPNV, es el agente etiológico de una enfermedad altamente contagiosa que afecta principalmente a salmónidos jóvenes. La enfermedad tiene un impacto considerable en la industria salmonera, al provocar una elevada mortalidad de alevines. Por este motivo, la identificación correcta y oportuna de su agente causal es determinante para establecer las estrategias de prevención y control de esta patología.

Clásicamente, el virus IPN ha sido detectado y cuantificado a través del efecto citopático que origina en líneas celulares de peces. En la actualidad, es posible detectar la particular viral por la técnica de RT-PCR, amplificando una secuencia específica del RNA genómico del virus.

En este estudio se determinó la capacidad para identificar el IPNV, a través de dos metodologías de RT-PCR en tiempo real. Se utilizaron muestras de tejidos de peces con signología clínica de IPN que además ocasionaron efecto citopático en cultivo celular, estas muestras fueron confirmadas como positivas para el virus a través de RT-PCR tradicional. Al utilizar el método de RT-PCR en tiempo real que se realiza en un solo tubo, el virus fue identificado sólo en 2 de 14 muestras positivas por cultivo celular. Al contrario, el método en dos tubos pudo identificar al virus en la totalidad de las muestras, lo que revela la mayor capacidad de detección de éste para la identificación de IPNV.

Asimismo, utilizando RT-PCR en tiempo real en dos pasos se pudo identificar tres de los serotipos de IPNV, Ab, Sp y VR-299, sugiriendo la idoneidad del sistema para detectar los serotipos Sp y VR-299 del virus, predominantes en la industria salmonera nacional.

Palabras clave: RT-PCR en tiempo real, IPNV.

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2. SUMMARY IDENTIFICATION OF INFECTIOUS PANCREATIC NECROSIS VI RUS BY REAL-

TIME RT-PCR

Infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) is the etiological agent of a disease which causes high mortality rates in young salmonid fish, affecting significantly the salmon culture. For this reason, the fast identification of the agent is fundamental for the implementation of strategies for the prevention and control of the disease.

Classically, the IPN virus is detected and quantified by its characteristic cytopathic

effect (CPE) observed in continuous cell lines from teleost fishes. However, the viral particle can be detected by amplification of the specific sequences of its genomic RNA by RT-PCR.

In this study, one and two steps real time RT-PCR methods were analyzed for viral

identification in tissue samples from fishes confirmed as positives for the virus in fish cell culture and RT-PCR. The utilization of the one step RT-PCR method identified the fourteen only two positive samples. However, the two steps method identified the total number of positive samples, showing greater capacity of this method for the IPNV identification.

In addition, the two steps method identified three serotypes the IPNV, Ab, Sp and

VR299, suggesting the capacity of this technique for detect serotypes Sp and VR-299 presents in Chile. Key words: Real time PCR, IPNV.

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3. INTRODUCCIÓN 3.1. NECROSIS PANCREATICA INFECCIOSA 3.1.1. Agente causal

Esta enfermedad es causada por el Virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa (IPNV), descrito en Chile en el año 1998 (Fernández 2005).

El virus de la necrosis pancreática infecciosa, miembro del género Aquabirnaviridae,

es el virus prototipo de la familia Birnaviridae (Ortega y Enríquez 2007). La familia contiene tres géneros: género Aquabirnavirus de peces (tipo especie, IPNV y “yellowtail ascites virus”), género Avibirnavirus de aves (tipo especie, virus de la enfermedad infecciosa de la bursa, IBDV), y género Entomobirnavirus de insectos (tipo especie, virus X de Drosophila, DXV). Hasta ahora, no se han reconocido agentes patógenos del mismo género en humanos y mamíferos (Rodriguez y col 2003). 3.1.2. Especies afectadas El IPNV afecta principalmente a salmónidos, pero también a otras especies de peces. De hecho, se ha aislado de moluscos y crustáceos de agua dulce y salada en varias regiones del mundo (Ortega y Enríquez 2007).

3.1.3. Distribución geográfica La Necrosis Pancreática Infecciosa es la enfermedad de etiología viral de peces de mayor distribución mundial (OIE 2005); reconocida como la de mayor impacto en el cultivo de salmónidos en la Unión Europea y Noruega (Roberts y Pearson 2005, Smail y col 2006) y otros países importantes en el cultivo de salmónidos (Roberts y Pearson 2005). A su vez, Oceanía es la única región considerada libre de esta enfermedad (OIE 2005). El IPNV fue aislado por primera vez en el año 1957 desde trucha de arroyo (Salvelinus fontinalis) en Norteamérica (Wolf 1988). En Chile el virus esta ampliamente distribuido en las diferentes zonas donde se realiza cultivo de salmones. El primer registro de IPNV se realizó en el año 1984 en trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss), cultivada en el lago Llanquihue, décima región. Posteriormente, se registraron numerosos diagnósticos llevados a cabo por diferentes laboratorios y que comprometían a distintas empresas; sin embargo, fue sólo hasta noviembre de 1998 en que se publica y “oficializa” la presencia de IPNV en Chile por parte del SERNAP (Fernández 2005). 3.1.4. Signos clínicos, lesiones macroscópicas y microscópicas La enfermedad se caracteriza por cambios en el comportamiento y por extensas lesiones internas e histopatológicas. Los cambios de comportamiento incluyen anorexia y nado errático con rotaciones en su eje longitudinal y en forma de espiral intercalado con ataxia. Los peces afectados muestran variados signos externos de la enfermedad, tales como

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oscurecimiento de la piel, distensión abdominal (Fig. 1), leve o moderada exoftalmia, branquias pálidas y, en ocasiones, hemorragias en la zona ventral y aletas (Rodriguez y col 2003). Los signos típicos de la enfermedad tienen las características de una enteritis catarral aguda (Rodriguez y col 2003). Al examen de necropsia, el lumen de estómago e intestino se encuentran desprovistos de alimento, pero contienen en forma característica, un mucus lechoso y cohesivo patognomónico. En algunos peces infectados, los ciegos pilóricos y el tejido graso anterior presentan petequias y la cavidad corporal contiene fluido ascítico. El bazo, corazón, hígado y riñón a menudo están aumentados de tamaño, anormalmente pálidos y se observa hemorragia petequial por toda la masa visceral (Rodriguez y col 2003). Microscópicamente se puede observar necrosis de coagulación focal en páncreas, riñón, hígado e intestino, glomerulonefritis exudativa, congestión del intersticio renal, nefrosis con degeneración hialina en gota, oclusión de túbulos e inflamación de células mucosas del tracto digestivo (Aquatic Health Chile S.A. 2004). Durante la enfermedad clínica, la mortalidad es inversamente proporcional a la edad de los animales afectados (Wolf 1988). El cuadro clínico más característico se presenta en trucha arco iris, trucha de arroyo, trucha café (Salmo trutta), salmón del Atlántico (Salmo salar) y varias especies de salmón del Pacífico (Oncorhynchus spp.) menores a las 1.500 Unidades Térmicas Acumuladas (UTA) (Ortega y Enríquez 2007). Por otra parte, se han descrito algunos casos donde se ha observado una disminución de la mortalidad cuando la temperatura del agua se eleva por encima de los 16 °C (Aquatic Health Chile S.A. 2004).

Figura 1. Signos externos de la Necrosis Pancreática Infecciosa. Alevín de trucha de 2 g a 7 g con signología de IPN, mostrando distensión abdominal.

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3.1.5. Patogénesis Una vez que el virus ingresa al organismo del pez ocurre un periodo de viremia no detectable y aproximadamente al cuarto día post-infección (pi) se observan áreas de necrosis en el páncreas exocrino y otros órganos (Reno 1999); no obstante, la distribución viral puede ser variable en los diversos órganos, lo que puede estar asociado al distinto nivel de tropismo que presenten diferentes aislados del virus (Eléouet y col 2001). 3.1.6. Transmisión El IPNV se puede transmitir de forma horizontal, penetrando a través de las branquias y la boca, o también pasando por los poros sensoriales del sistema de la línea lateral (Wolf 1988, Novoa y col 1995). La transmisión vertical se ha comprobado en trucha arco iris y trucha café y en otras especies se han observado casos asociados a ovas o fluidos sexuales infectados, que probablemente correspondan a falsa infección vertical por contaminación externa de la ova (Reno 1999). Es necesario conocer el mecanismo de transmisión del IPNV entre peces hospedadores para prevenir la enfermedad y reducir la diseminación del virus en el ambiente acuícola. Existe evidencia que el modo de transmisión dentro de un centro de cultivo puede ser una combinación de transmisión vertical y horizontal (Rodriguez y col 2003). La principal fuente de IPNV son, tanto grupos de peces infectados, como sobrevivientes que se convirtieron en portadores y transmiten el virus. Los peces portadores pueden transmitir la enfermedad a otras poblaciones susceptibles, incluyendo su propia descendencia. Más aún, el IPNV puede ingresar con facilidad en las etapas de alevinaje, mediante ovas contaminadas con el virus (Rodriguez y col 2003). Respecto de otro tipo de vectores, aves y mamíferos predadores pueden transportar y excretar IPNV viables. Asimismo, el abastecimiento de agua de un criadero puede albergar peces e invertebrados silvestres que sean portadores del virus (Rodriguez y col 2003). 3.1.7. Prevención y control El control de las enfermedades infecciosas es muy importante para el desarrollo productivo de la industria acuícola. En cultivo de salmónidos, donde los peces son criados bajo condiciones intensivas, el desarrollo de medidas de control para las enfermedades virales tiene un rol fundamental en el aumento de la producción de peces. En particular, el control de éstas se realiza por varios medios, incluyendo medidas zoosanitarias e higiénicas, reproducción selectiva y vacunación (Rodriguez y col 2003). El uso de vacunas ha sido una estrategia de prevención cada vez más utilizada en el control del IPNV. Las vacunas están diseñadas para proteger en los últimos estadios del ciclo de agua dulce y post-transferencia a agua de mar, evitando brotes en los smolts recién transferidos y disminuyendo el impacto económico de los brotes en el mar. El Programa Sanitario General de Reproductores incluye al IPNV dentro de los agentes que deben ser considerados en los chequeos que se realizan en machos y hembras

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reproductores. En caso de existir positividad, los gametos provenientes de padres positivos son eliminados por personal del laboratorio que realizó los análisis (Aquatic Health Chile S.A. 2004). En la actualidad no se dispone de alternativas quimioterapeuticas autorizadas para el control de infecciones por IPNV en peces y es probable que el costo de estos compuestos haga imposible su uso en la práctica acuícola (Rodriguez y col 2003). 3.2. VIRUS DE LA NECROSIS PANCREÁTICA INFECCIOSA (IPNV) 3.2.1. Morfología y propiedades biofísicas Los viriones no presentan envoltura, son icosaédricos con perfiles isométricos hexagonales característicos y un diámetro promedio de 60 nm (55 nm a 75 nm) (Fig. 2). La cápside consta de 180 subunidades estructurales agrupadas en 132 capsómeros ubicados en la superficie del virión (Ozel y Gelderblom 1985). Asimismo, el virión tiene un coeficiente de sedimentación de 435 S y una densidad boyante en CsCl de 1,33 g/ml y la cápside vacía 1,29 g/ml (Dobos y Rowe 1977). La masa molecular de la partícula es 55 x 106 Da y la masa total estimada de las proteínas de la cápside es 50,2 x 106 Da. La diferencia de 4,8 x 106 Da está dada por el RNA, el cual constituye un 8,7% del peso de la partícula (Wolf 1988). El IPNV es estable en ácido, éter, cloroformo y glicerol y es relativamente estable al calor. El virus puede permanecer almacenado a 4 °C por 4 meses, pero por un tiempo mayor debe ser mantenido a -20 °C o menos. Por mucho, este es el virus de peces más estable a salinidades de 0% a 40%, y es liofilizado fácilmente en presencia de leche descremada, lactosa, o lactoalbúmina hidrolizada (Mortensen y col 1998).

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A BA B

Figura 2. Morfología del virus IPN. A) Micrografía electrónica de la partícula viral. Barra blanca, 100 nm. B) Icosaedro representando la morfología de la partícula viral de IPNV. 3.2.2. Genoma viral El genoma de la partícula viral madura consiste de dos segmentos (A y B) de RNA de doble hebra, contenidos dentro de una cápside icosaédrica (Fig. 3). El segmento A presenta dos marcos de lectura abiertos (ORF [open reading frame]). El ORF mayor codifica una poliproteína (pp) precursora de 106 kDa que es cotraduccionalmente escindida por la proteasa viral (VP4) para generar las proteínas mayores de la cápside: pre-VP2 (pVP2), VP3 y la propia VP4 (Duncan y col 1987). Durante la maduración viral, la pVP2 de 62 kDa es escindida a VP2 (54 kDa) (Villanueva y col 2004, Santi y col 2005), que en esta forma es la principal proteína de la cápside viral a la cual son dirigidos los anticuerpos neutralizantes tipo específicos, actuando a su vez como la proteína de unión a las células (Granzow y col 1999). VP3 es una proteína interna de la cápside y es actor fundamental del ensamblaje de la partícula viral; su extremo C-terminal, rico en aminoácidos básicos, se une al RNA viral formando una estructura core de ribonucleoproteínas. El ORF menor del segmento A, se encuentra solapando parcialmente el extremo 5’ del ORF mayor. Este ORF codifica una proteína no estructural de 17 kDa, rica en arginina conocida como VP5 (Santi y col 2005). Esta proteína de función poco clara es detectada solo en células infectadas, pero no en virus purificado y es sintetizada en pequeña cantidad en la fase inicial de la replicación viral. El segmento B del IPNV, codifica sólo una proteína de 94 kDa conocida como VP1, que en el virión se encuentra tanto en forma de polipéptido libre o covalentemente unida al extremo 5’ de ambos segmentos del RNA genómico (VPg) (Santi y col 2005). VP1 actúa como una RNA polimerasa dependiente de RNA, con función de partidor y polimerasa para la

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transcripción o síntesis de mRNA y para la replicación, participando también en el ensamblaje de la partícula viral (Ortega y Enríquez 2007).

A

B

60 nm

VP2

VP3VPg

VP1

ppVP4VP5 (17 kDa)

A

B

60 nm

VP2

VP3VPg

VP1

ppVP4VP5 (17 kDa)

A

B

60 nm

VP2

VP3VPg

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ppVP4VP5 (17 kDa)

A

B

60 nm

VP2

VP3VPg

VP1

ppVP4VP5 (17 kDa)

Figura 3. Representación esquemática de la ubicación de las proteínas y el genoma en la partícula del virus IPNV . Se observan los dos segmentos de RNA de doble hebra marcados como A y B; la proteína VP2 formando la parte externa de la cápside; VP3 formando la parte interna; VP1 en forma libre dentro de la partícula viral y en forma de VPg en el extremo 5’ de cada una de las hebras de RNA. La poliproteína (pp), VP4 y VP5 de 17 kDa aparecen fuera de la partícula viral. 3.3. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO Los brotes de la enfermedad pueden causar pérdidas importantes a la industria de la acuicultura porque mientras las enfermedades virales continúen siendo intratables, el control seguirá estando basado en la prevención. Un diagnóstico temprano combinado con estudios epizoóticos proporciona una herramienta para el control de las enfermedades virales, evitando el movimiento de peces infectados entre centros de cultivo, áreas de un país, y entre países. Aunque los signos clínicos característicos de las enfermedades son, con frecuencia, útiles en el reconocimiento de cualquier enfermedad viral de peces, en algunos casos, estos signos y la patología de muchas de estas enfermedades son muy similares (particularmente IPNV e IHNV). Por lo tanto, el aislamiento e identificación precisa del virus deberían confirmar el diagnóstico preliminar.

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La microscopía electrónica era la única alternativa de diagnóstico hasta el desarrollo de la técnica de cultivo celular, donde es posible visualizar la multiplicación del virus. De hecho, el IPNV fue el primer virus de peces en ser cultivado in vitro, utilizando células de tejidos de trucha (Wolf y col 1960). Desde entonces, el procedimiento diagnóstico más confiable y aceptable para las enfermedades virales de peces es todavía el aislamiento del agente infeccioso causante en cultivo de tejidos, seguido por la confirmación serológica. Se han divulgado varios otros métodos diagnósticos para IPNV, incluyendo la técnica de inmunofluorescencia e inmunocitoquímica, la prueba de coaglutinación, el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA [enzyme-linked immunosorbent assay]), inmunoblots y Western blots. Más recientemente, se han desarrollado y aplicado al diagnóstico de virus de peces, pruebas moleculares para la detección de ácidos nucleicos usando para ello la reacción en cadena de la polimerasa (Rodriguez y col 2003). 3.4. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR El concepto de técnicas moleculares de diagnóstico está generalmente asociado con técnicas basadas en DNA, principalmente hibridación de ácido nucleico y la reacción en cadena de la polimerasa, que a su vez fueron las primeras usadas para el diagnóstico de virus de peces (Christie y col 1988, Rodak y col 1988). Sin embargo, también deben ser consideradas otras técnicas que involucran la detección y la caracterización del genoma o de polipéptidos virales. 3.5. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) La reacción en cadena de la polimerasa (Fig. 4) es una poderosa técnica utilizada para amplificar regiones específicas del DNA (PCR) o RNA (RT-PCR) que se encuentran entre dos regiones de secuencia conocida. Esta técnica utiliza dos oligonucleótidos como partidores que abarcan la secuencia de interés del ácido nucleico y una polimerasa termoestable que permite el aumento exponencial de la cantidad de ácido nucleico mediante ciclos repetidos de síntesis (Winton 1991). Los ciclos constan de las siguientes etapas; denaturación, que implica la separación de la doble hélice en dos hebras; alineamiento, en el cual los partidores oligonucleótidos se alinean a cada hebra y extensión, donde ocurre la síntesis enzimática de una hebra complementaria comenzando en el extremo 3’ del partidor unido. Si los ciclos se producen un número “n” y suponiendo que el número de copias de DNA de duplica en cada ciclo, se obtiene una cantidad de DNA de 2n, por lo que la amplificación se realiza en forma exponencial. Aunque esta técnica aún no se utiliza con propósitos de diagnóstico en virología de peces, el uso de RT-PCR para detectar birnavirus en cultivos de células infectadas está en aumento (Alonso y col 1999, Blake y col 1995, López-Lastra y col 1994, Pryde y col 1993). Varios autores han demostrado que la RT-PCR es un método de diagnóstico rápido, confiable, sensible y conveniente (Novoa y col 1995, Rodriguez y col 2001, Wang y col 1997, Williams y col 1999).

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Figura 4. Diagrama esquemático representando una reacción de PCR. 1. Denaturación; 2. Alineamiento; 3. Extensión. La mayor parte de los análisis de PCR descritos se han desarrollado para detectar el gen VP2 del IPNV, pues es la proteína principal de la cápside y probablemente es el mejor blanco para la amplificación y detección. La selección de partidores específicos ha sido posible, a medida que se ha determinado la secuencia nucleotídica del segmento genómico A para la cepa Jasper del IPNV (Duncan y Dobos 1986), la cepa Sp (Shivappa y col 2004), y la cepa N1 (Havarstein y col 1990). La secuencia del segmento B también fue establecida para las cepas Jasper y Sp (Duncan y col 1991). Varios investigadores han usado la técnica de PCR tanto para identificar virus aislados a partir de cultivo celular como para confirmar la etiología de aislados identificados por análisis de neutralización (Alonso y col 1999, Jung y col 1999, Rodríguez y col 1997). Más aún; McAllister y col. (1991) demostraron el uso potencial de un solo análisis de RT-PCR para la detección simultánea de diversos virus de peces (IPNV, VHSV e IHNV).

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La técnica de PCR ha demostrado ser un procedimiento prometedor para el diagnóstico del IPNV y de otros virus de peces. Este sistema muestra al menos la misma sensibilidad que el aislamiento en cultivo celular, y se requiere menor tiempo para el diagnóstico en un estudio. La PCR puede ser aplicada para la identificación de un virus previamente aislado o incluso para monocapas infectadas antes de la visualización de efecto citopático (CPE). También puede aplicarse para detectar el virus directamente en tejidos de peces infectados. Por otra parte, la PCR puede localizar el virus incluso en concentraciones bajo el límite de detección del cultivo celular y asegura que el virus será detectado aunque las células susceptibles no estén disponibles o cuando el tamaño de la muestra es muy pequeño para cultivo de células (Dopazo y Barja 2002). Sin embargo, varios estudios han establecido que los resultados positivos de la PCR no pueden ser aceptados como diagnóstico concluyente en base a las siguientes razones: (i) no asegura detectar la presencia de virus infecciosos, debido a que también puede que detecte ácidos nucleicos desnudos no infectivos (Alonso y col 1999); (ii) lo anterior adquiere mayor relevancia cuando se considera la posibilidad de vacunación previa contra IPNV (Leong y Fryer 1993); (iii) y en lo que respecta a la aplicación de una política de salud de peces, las técnicas de diagnóstico molecular con DNA o RNA deben considerarse en el contexto de la epizootiología de la enfermedad infecciosa, como una herramienta para determinar la causalidad de la enfermedad (Bernoth 1999). 3.6. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA EN TIEMPO REAL En la PCR en tiempo real, los procesos de amplificación y detección del producto de PCR se producen de manera simultánea en el mismo tubo, sin la necesidad de analizar los productos de PCR generados en electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida. Este sistema puede monitorear “en tiempo real” la obtención del producto de PCR originado a través de la fluorescencia emitida por éste. De esta manera, con la detección de la fluorescencia se puede medir durante la amplificación la cantidad de DNA sintetizado en cada momento, ya que la emisión de fluorescencia producida en la reacción es proporcional a la cantidad de DNA formado. Esto permite conocer y registrar en todo momento la cinética de la reacción de amplificación (Costa 2004). La cinética de la técnica de PCR obedece a la siguiente curva de amplificación, donde se distinguen cuatro etapas principales (Fig. 5).

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Fase de meseta

Fase exponencial

Fase exponencial temprana

Fase lineal

Fase de meseta

Fase exponencial

Fase exponencial temprana

Fase lineal

Figura 5. Cinética de amplificación de una reacción en tiempo real. La curva de amplificación de la PCR grafica la emisión de fluorescencia en cada ciclo de la reacción. La curva se divide en fases lineal, exponencial temprana, exponencial, y de meseta. Este gráfico se generó con el programa LightCycler 4.0 (Roche). La capacidad del producto de PCR para emitir fluorescencia está dada por su unión a fluoróforos que aumentan notablemente la emisión de fluorescencia cuando se unen a DNA de doble hélice. El más empleado en PCR en tiempo real es el SYBR Green I. El incremento de DNA en cada ciclo se refleja en un aumento proporcional de la fluorescencia emitida, esta información se refleja gráficamente en curvas de cinética de la reacción para cada una de las muestras y controles. Este sistema de detección tiene la ventaja de que la optimización de las condiciones de la reacción es muy fácil y además, es más barato que las sondas específicas. El principal inconveniente de los agentes intercalantes es su baja especificidad, debido a que se unen de manera indistinta a productos generados inespecíficamente o a dímeros de partidores. Para mejorar la especificidad se deben emplear condiciones de reacción óptimas y una selección cuidadosa de los partidores para disminuir el riesgo de formación de dímeros. Por

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esta razón para discriminar si las curvas de amplificación positivas corresponden a productos específicos, la mayoría de los equipos para PCR en tiempo real tienen la posibilidad de determinar la temperatura de fusión o Tm de los fragmentos amplificados (Tm = Temperatura de Melting, que corresponde a la temperatura a la que el 50% del DNA de la molécula está denaturada). Un fragmento específico de amplificación, tiene una Tm característica, que depende de su longitud y de la composición de sus bases. Lo anterior se obtiene graficando la derivada de la fluorescencia con respecto a la temperatura –dF/dT frente a la temperatura (Costa 2004). Clásicamente la técnica de RT-PCR se utiliza para confirmar el diagnóstico de la Necrosis Pancreática Infecciosa, a partir del aislamiento viral en cultivo celular, pero nuestro estudio intentó detectar el IPNV directamente en tejidos de peces que presentaban signología clínica y comparar estos resultados con los obtenidos en cultivo de células. Como la mayoría de los virus, el IPNV sufre mutaciones que originan variaciones genéticas, es necesario comprobar la eficacia de las técnicas de diagnóstico molecular frente a cambios de este tipo. En el caso de la PCR es fundamental verificar que los componentes de la reacción permitan una correcta identificación de los distintos tipos del virus, por este motivo uno de nuestros objetivos fue demostrar que los partidores proporcionados por Roche eran capaces de reconocer el genoma viral en muestras de campo y de los serotipos de IPNV. A partir de los antecedentes antes mencionados, se propone la siguiente hipótesis de trabajo: 3.7. HIPÓTESIS Es posible detectar IPNV mediante RT-PCR en tiempo real en muestras de tejidos de peces salmónidos. 3.7.1. Objetivo general Evaluar la capacidad de la técnica de RT-PCR en tiempo real para detectar la presencia del IPNV en muestras de tejidos de peces salmónidos con signología clínica de IPN.

3.7.2. Objetivos específicos 3.7.2.1.Comparar el diagnóstico del IPNV en peces salmónidos mediante RT-PCR en tiempo

real y por cultivo celular. 3.7.2.2.Comparar la capacidad de detección de los métodos de RT-PCR en uno y dos pasos. 3.7.2.3.Determinar la capacidad de la técnica para identificar los serotipos Ab, Sp y VR 299 de

IPNV.

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4. MATERIAL Y MÉTODOS 4.1. MATERIAL 4.1.1. Muestras Se utilizaron 20 muestras de sobrenadante de macerado de órganos de peces, de preferencia riñón y bazo correspondientes a distintos casos clínicos enviados al Laboratorio de Biotecnología y Patología Acuática de la Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Austral de Chile. En cada caso, los peces fueron examinados mediante necropsia donde se observaron las principales lesiones macroscópicas de la enfermedad. La presencia del virus en las muestras se determinó inoculando el sobrenadante de un macerado de órganos y la posterior visualización del efecto citopático en la línea celular CHSE-214 según los protocolos de rutina del Laboratorio de Biotecnología y Patología Acuática. La Tabla 1 muestra un resumen de la especie, procedencia y efecto citopático de las muestras utilizadas en este estudio. Tabla 1: Muestra, especie, región de procedencia, cuerpo de agua e identificación de efecto citopático de las muestras de peces utilizadas en este estudio.

Muestra Especie Región Cuerpo de agua Efecto citopático 02/07 Trucha Décima Estuario Positivo 03/07 Trucha Décima Estuario Positivo 07/07 Salmón Atlántico (S/I) Agua dulce Negativo 11/07 Salmón Atlántico (S/I) (S/I) Positivo 12/07 Trucha (S/I) Estuario Positivo 15/07 Salmón Atlántico Novena Agua dulce Negativo 17/07 Trucha Décima Estuario Negativo 20/07 Salmón Atlántico Novena Agua dulce Positivo 24/07 Trucha Décima Estuario Negativo 36/07 Salmón Atlántico Décima Estuario Positivo 49/07 Salmón Atlántico Décima Estuario Positivo 51/07 Salmón Atlántico Décima Estuario Negativo 55/07 Salmón Atlántico Metropolitana Agua dulce Negativo 62/07 Salmón Atlántico Décima Estuario Positivo 66/07 Salmón Atlántico Décima Estuario Positivo 69/07 Salmón Atlántico Décima Estuario Positivo 72/07 Salmón Atlántico Décima Estuario Positivo 88/07 Salmón Coho Décima Río Positivo 89/07 Salmón Coho Décima Río Positivo 90/07 Salmón Atlántico Décima Río Positivo

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4.1.2. RNA viral El RNA viral se extrajo a partir de las muestras de macerado de órganos con el kit QIAamp Viral RNA Mini Spin, siguiendo las instrucciones de QIAGEN Alemania. 4.1.3. Control positivo de RNA de IPNV El control positivo se obtuvo mediante la realización de una RT-PCR tradicional de una muestra positiva a IPNV y posterior purificación del producto de PCR desde el gel de agarosa. 4.1.4. Otros controles de RNA Se obtuvo el RNA de células CHSE-214, de sobrenadante de cultivo de células CHSE-214 y sobrenadante de macerado de órganos de peces sanos, con el fin de detectar posibles hibridaciones cruzadas de los partidores con secuencias presentes en estas muestras y evitar la presencia de falsos positivos. 4.1.5. Partidores Se utilizaron los partidores IPNScF e IPNScR desarrollados por Roche y descritos en el manual de detección de IPN-v Screening SybrGreen I. Estos partidores amplifican una región específica del gen VP2 del virus, correspondiente a una zona altamente conservada para los nueve serotipos descritos a la fecha. 4.1.6. Kit de PCR en tiempo real Para la identificación del virus se utilizaron 2 kit comerciales de Roche. El LightCycler® RNA amplification Kit SYBR Green I fue suministrado por Roche y permite la transcripción reversa de las hebras de RNA en cDNA y la posterior amplificación del fragmento específico en un solo tubo de reacción, utilizando los partidores IPNScF e IPNScR. Por su parte, el kit LightCycler® Fast Start DNA Master SYBR Green I, permite sólo la realización de la reacción de PCR. La reacción de transcripción reversa se realiza en un paso anterior, mediante la técnica tradicional. 4.2. MÉTODOS 4.2.1. Obtención de las muestras Una vez realizada la necropsia, los órganos como riñón, bazo e hígado fueron macerados en un mortero a una dilución 1:10 con medio de cultivo MEM (Medio Esencial Mínimo, Invitrogen). Una vez obtenido el sobrenadante, una fracción fue utilizada para el diagnostico del virus en cultivo celular y la otra fracción para extracción de RNA. 4.2.2. Diagnóstico de IPNV por cultivo de células Para la detección del virus en líneas celulares, el macerado obtenido fue filtrado en filtro de 0,2 µm e inoculado en la línea celular CHSE-214 hasta la aparición de efecto citopático de acuerdo a los procedimientos de rutina llevados s cabo en el laboratorio de Biotecnología y Patología Acuática.

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4.2.3. Extracción de RNA El RNA fue extraído desde los sobrenadantes de los macerados de órganos, utilizando el kit QIAamp Viral RNA Mini Spin mediante el siguiente protocolo: En un tubo de microcentrífuga, se mezclaron 140 µl de macerado y 560 de Buffer AVL conteniendo el “Carrier RNA” utilizando un agitador “vortex”. Posteriormente se incubaron a temperatura ambiente (15 °C a 25 °C) por 10 min. Luego de este tiempo se agregó 560 µl de etanol absoluto y se mezcló por inversión durante 15 seg. Luego, 630 µl de esta mezcla se aplicó sobre una columna “QIAamp spin column” (en un tubo de recolección de 2 ml) y luego se centrifugó a 8.000 rpm por 1 min. El RNA contenido en la columna se lavó con 500 µl de Buffer AW1 y se centrifugó a 8.000 rpm por 1 min para luego se agregó 500 µl de Buffer AW2 y se centrifugó a 13.000 rpm por 3 min. Finalmente el RNA se eluyó de la columna con 60 µl de agua libre de nucleasas y se incubó a 70 °C por 1 min, para después centrifugar a 8.000 rpm por 1 min. El RNA viral obtenido se almacenó a -70 ºC hasta su utilización. 4.2.4. RT-PCR en tiempo real para la detección de IPNV Para tal efecto se utilizaron los kit, LightCycler® RNA Amplification SYBR Green I y LightCycler® Fast Start DNA Master SYBR Green I.

En una primera etapa se realizó la reacción de RT-PCR en tiempo real utilizando el kit

LightCycler® RNA Amplification SYBR Green I, descrito en el Manual IPN-v Screening SybrGreen I. El kit está diseñado para 96 reacciones con un volumen final de 20 µl cada una. En la tabla 2 se describen los componentes para cada reacción y los volúmenes utilizados. Tabla 2. Componentes y volúmenes utilizados en la reacción de RT-PCR tiempo real.

Reactivo Volumen (µl) Tubo 4 H2O 4,0 Tubo 2 Mix de Reacción SYBR Green I 5x 4,0 Tubo 5 Solución de Resolución 4,0 Tubo 3 Solución de MgCl2 (25mM) 1,6 Partidor IPNScF (20µM) 0,5 Partidor IPNScR (20µM) 0,5 Tubo 1 Mix de Enzima 0,4 RNA viral 5,0 Volumen Total por Reacción 20,0

La reacción de PCR se lleva a cabo siguiendo las condiciones que se describen a continuación:

En el caso de la muestra de RNA viral, éstas se denaturaron previamente junto con los

partidores y el agua por 5 min a 95 ºC. Asimismo, se utilizaron controles negativos donde se reemplazó la muestra de RNA por 5 µl de agua libre de nucleasas.

17

La siguiente tabla resume los pasos del programa utilizado en el termociclador.

Tabla 3. Resumen de la programación de la reacción de RT-PCR tiempo real. Tiempo T° Rampla T° Modo Adquisición Ciclos TRANSCRIPCIÓN REVERSA

10 min 37 °C 20 °/seg none none 1

Denaturación 5 min 95 °C 20 °/seg none none 1 AMPLIFICACÍON quantification 45 Denaturación 10 seg 95 °C 20 °/seg none Annealing 5 seg 60 °C 20 °/seg none Extensión 10 seg 72 °C 2 °/seg none Adquisición 1 seg 82 °C 20 °/seg single “MELTING” melting curve 1 0 seg 95 °C 20 °/seg none 10 seg 65 °C 20 °/seg none 0 seg 95 °C 0,1 °/seg continuos ENFRIAMIENTO 30 seg 40 °C 20 °/seg none none 1

RT-PCR en tiempo real utilizando el kit LightCycler® Fast Start DNA Master SYBR

Green I. En este caso, la transcripción reversa y la amplificación por PCR se realizan en procesos separados. En la tabla 4 se detallan los componentes y volúmenes para la reacción de transcripción reversa: Tabla 4. Componentes y volúmenes utilizados en la reacción de transcripción reversa.

Reactivo Volumen (µl) Buffer RT 5X (Promega) 4,0 Transcriptasa Reversa 200 U/µl (promega) 1,0 Inhibidor RNAsa 40 U/µl (promega) 0,5 DNTPs (100 mM c/u) 2,0 H2O 6,5 IPNScF (20µM) 0,5 IPNScR (20µM) 0,5

RNA templado 5,0 Volumen total 20,0

Para las muestras de RNA viral, éstas se denaturaron previamente junto con los partidores, DNTPs y el agua por 5 min a 95 ºC. La reacción de transcripción reversa se llevó a cabo por un tiempo de 60 min a 42 ºCy luego se denaturó la enzima por 2 min a 94 ºC.

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El kit LightCycler® Fast Start DNA Master SYBR Green I está diseñado para 96 reacciones con un volumen final de 20 µl. En la tabla 5 se describen los componentes para cada reacción y los volúmenes utilizados. Tabla 5. Componentes y volúmenes utilizados en la reacción de PCR en tiempo real.

Reactivo Volumen (µl) Tubo 3 H2O 8,8 Tubo 2 Solución de MgCl2 (25mM) 3,2 Partidor IPNScF (20µM) 1,0 Partidor IPNScR (20µM) 1,0 Tubo 1 Mix de Reacción conc. 10x 2,0 DNA templado 4,0 Volumen total 20,0

Asimismo, se utilizaron controles negativos donde se reemplazó la muestra de cDNA por 5 µl de agua libre de nucleasas. La siguiente tabla resume los pasos del programa utilizado en el termociclador.

Tabla 6. Resumen de la programación de la reacción de RT-PCR tiempo real.

Tiempo T° Rampla T° Modo Adquisición Ciclos

PREINCUBACIÓN 10 min 95 °C 20 °/seg none none 1 CUANTIFICACIÓN quantification 40 10 seg 95 °C 20 °/seg none 5 seg 60 °C 20 °/seg none 10 seg 72 °C 20 °/seg single “MELTING” melting curve 1 0 seg 95 °C 20 °/seg none 10 seg 65 °C 20 °/seg none 0 seg 95 °C 0,1 °/seg continuos ENFRIAMIENTO 30 seg 40 °C 20 °/seg none none 1

4.2.5. Electroforesis del producto de PCR En cada caso, una vez finalizada la reacción de PCR en tiempo real, los productos de PCR obtenidos fueron analizados por electroforesis en un gel de agarosa al 1,5%, conteniendo bromuro de etidio. Para el proceso, se utilizó una cámara SUB-CELL GT® y fuente de poder POWER-PAC 200® de BIO-RAD. Luego de correr el gel durante 30 min a una corriente de 70 mA, las muestras se observaron un el transluminador de luz ultravioleta TFX-20.M® (VILBER LOURMAT) y se obtuvo una imagen con el software Kodak Digital Science 1D® (Kodak), evidenciando la presencia de un producto de 200 pb aproximadamente.

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Una vez obtenido y analizado el producto de PCR específico en el gel de agarosa, se procedió a aislarlo del gel para ser utilizado como control positivo en las reacciones de PCR en tiempo real. Para tal efecto se utilizó el kit Gel Extraction de OMEGA bio-tek siguiendo el procedimiento descrito por el proveedor. 4.2.6. Análisis de datos Los datos obtenidos en cada reacción fueron analizados cualitativamente con el programa LightCycler 4.0, a partir del cual se obtuvieron las curvas y las temperaturas de “melting” para cada reacción. En el caso del producto específico de IPNV, este tiene una temperatura de “melting” de 83 °C ± 2 °C (Roche, Manual IPN-v Screening SybrGreen I).

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5. RESULTADOS 5.1. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS BIOLÓGICAS En este estudio se utilizaron peces con signología clínica de IPN enviados al laboratorio. Estos peces presentaron algunos signos clínicos típicos de la infección con IPNV, principalmente exoftalmia, abultamiento abdominal y hallazgos de necropsia tales como ascitis, hígado pálido, enteritis catarral (Fig. 6), petequias a nivel de ciegos pilóricos y grasa abdominal (Fig. 7), entre otros.

Figura 6. Salmón Atlántico (Salmo salar) presentando signología clínica de IPN. La flecha negra indica palidez hepática, la flecha roja indica enteritis catarral y la flecha amarilla indica el fluido ascítico presente en la cavidad abdominal.

21

Figura 7. Salmón Atlántico (Salmo salar) presentando signología clínica de IPN. Las flechas señalan petequias a nivel de ciegos pilóricos y grasa perivisceral. La presencia del virus se confirmó mediante la inoculación de un macerado de riñón y bazo de estos peces en la línea celular CHSE-214. En cada caso se observo un efecto citopático provocado por IPNV, caracterizado por la interrupción de la monocapa celular y la presencia de células redondas en suspensión (Fig. 8).

Figura 8. Efecto citopático en células CHSE-214 ocasionado por IPNV. Se observa en la flecha negra células normales en monocapa y la flecha amarilla indica el efecto citopático en la monocapa celular causado por la infección con el virus (aumento de 400x aprox.).

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5.2. PCR EN TIEMPO REAL PARA LA IDENTIFICACIÓN DEL VIRUS IPN 5.2.1. Amplificación de un fragmento específico de IPNV por RT-PCR tradicional En una primera etapa se procedió a determinar la eficacia de los partidores IPNScF e IPNScR, para amplificar una región específica del gen VP2 del IPNV en una muestra positiva en cultivo celular mediante una reacción de RT-PCR tradicional. La figura 9 muestra el análisis electroforético en un gel de agarosa al 1,5% de los productos de PCR obtenidos. En los carriles 3 y 4 se observa el producto de PCR de aproximadamente 200 pb que se corresponde con el tamaño esperado para el producto de PCR específico descrito por Roche.

pb 1 2 3 4

200

pb 1 2 3 4

500400300200

100

pb 1 2 3 4

200

pb 1 2 3 4

500400300200

100

Figura 9. Análisis electroforético en un gel de agarosa al 1,5% de los productos de PCR específicos de IPNV. Carril 1: estándar de tamaño molecular de DNA 100 pb; Carril 2: control negativo; Carril 3: muestra positiva 11/07; Carril 4: muestra positiva 12/07.

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5.2.2. Amplificación de un fragmento específico de IPNV por RT-PCR en tiempo real Se verificó la funcionalidad de los partidores realizando la RT-PCR en tiempo real utilizando el kit de LightCycler® RNA Amplification SYBR Green I. En la figura 10 se muestra el análisis de las curvas de “melting”, donde se observa la presencia de un peak para el control positivo (fragmento de PCR purificado), a los 83,1 °C y 83,7 °C para la muestra 12/07, lo que se encuentra dentro del rango esperado para la temperatura de “melting” del producto específico de 83 °C ± 2 °C, descrito en el manual IPN-v Screening SybrGreen I (Roche). Cabe destacar que la curva de “melting” para en control negativo de células CHSE-214 originó una Tm de 75,3 ºC. La figura 11, muestra el análisis electroforético en un gel de agarosa al 1,5% de los productos de PCR en tiempo real originados. En los carriles 2 y 3 se observa la banda esperada para el producto de PCR de una muestra positiva (12/07) y el control positivo respectivamente y en el carril 4 su ausencia para las células CHSE-214 utilizadas como control negativo. La figura 12, muestra el análisis de las curvas de “melting” que incluyen células CHSE-214, un control positivo y agua libre de nucleasas. En el caso del control positivo (fragmento de PCR purificado) este presentó una Tm de 82,8 °C y 75,7 ºC para CHSE-214. Se puede observar además que el tubo conteniendo sólo agua no originó producto de PCR y por lo tanto no se observa una curva de “melting”. La figura 13 muestra un gel de agarosa al 1,5%, donde se observan los productos de PCR originados anteriormente. En el carril 3 (control positivo), nuevamente aparece el fragmento esperado mientras en los carriles 2 y 4 que comprenden los controles negativos éste no se presenta.

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75,3°C

83,1°C

83,7°C

75,3°C

83,1°C

83,7°C

Figura 10. Análisis de las curvas de “melting” de la RT-PCR en tiempo real para IPNV. Cada peak indica la temperatura de “melting” de las muestras utilizadas. Curva azul: células CHSE-214; Curva verde: control positivo (fragmento purificado); Curva roja: muestra positiva 12/07.

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500400300

200

100

pb 1 2 3 4

500400300

200

100

pb 1 2 3 4

Figura 11. Análisis electroforético en un gel de agarosa al 1,5% de los productos de PCR específicos de IPNV. Carril 1: estándar de tamaño molecular de DNA 100 pb. Carril 2: muestra positiva 12/07; Carril 3: control positivo (fragmento purificado); Carril 4: células CHSE-214.

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75,7°C82,8°C

75,7°C82,8°C

Figura 12. Análisis de las curvas de “melting” de la RT-PCR en tiempo real para IPNV. Curva azul: células CHSE-214; Curva verde: control positivo (fragmento purificado); Curva roja: agua.

27

500400300

200

100

pb 1 2 3 4

500400300

200

100

pb 1 2 3 4

Figura 13. Análisis electroforético en un gel de agarosa al 1,5% de los productos de PCR específicos de IPNV. Carril 1: estándar de tamaño molecular de DNA 100 pb; Carril 2: células CHSE-214; Carril 3: control positivo (fragmento purificado); Carril 4: agua.

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5.3. IDENTIFICACIÓN DE IPNV MEDIANTE DOS MÉTODOS DE RT-P CR EN TIEMPO REAL EN MUESTRAS DE TEJIDOS DE PECES SALMÓNI DOS Como se mencionó en Métodos, la identificación de IPNV en tejidos de peces salmónidos con signología clínica de IPN y positivos en cultivo celular se realizó utilizando dos kit; LightCycler® RNA Amplification SYBR Green I (RT-PCR en un misma reacción) y Fast Start DNA Master SYBR Green I (RT y PCR en reacciones distintas). La tabla 7 muestra los resultados en la detección del IPNV, mediante ambas metodologías. Se puede observar que al utilizar el sistema RT-PCR en un misma reacción, sólo en 2 de las 14 muestras positivas en cultivo celular fue posible detectar el virus. Al contrario, utilizando el sistema donde las reacciones de RT y PCR se realizan en forma separada, se pudieron observar los mismos resultados respecto del cultivo celular. Sin embargo, es posible advertir además un aumento de la Tm del producto de amplificación en todas las muestras (de 83 ºC a 87 ºC aprox.). Cabe destacar que las muestras negativas para IPNV al cultivo celular también lo fueron utilizando RT-PCR en tiempo real. En la figura 14 se muestran los productos de amplificación por RT-PCR en tiempo real con el kit de RNA Amplification SYBR Green I de 7 muestras. Se puede observar los productos de amplificación de las muestras 12/07 y 36/07, no detectándose el mismo resultados en el resto de las muestras. En la figura 15 se observan los productos de amplificación por PCR en tiempo real con el kit Fast Start DNA Master SYBR Green I de 14 muestras positivas en cultivo celular. Se puede apreciar que, a excepción de la muestra 72/07, en todos los carriles está presente el producto de PCR específico para el virus.

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Tabla 7. Detección de IPNV mediante cultivo celular y dos metodologías de RT-PCR en tiempo real.

RT-PCR en tiempo real (RT-PCR misma reacción)

RT-PCR en tiempo real (RT y PCR dos reacciones)

Muestra Efecto citopático

Resultado Tm (°C) Resultado Tm (°C) 02/07 positivo negativo positivo 87,8 03/07 positivo negativo positivo 87,1 07/07 negativo negativo negativo 11/07 positivo negativo positivo 87,6 12/07 positivo positivo 83,1 positivo 87,4 15/07 negativo negativo negativo 17/07 negativo negativo negativo 20/07 positivo negativo positivo 87,3 24/07 negativo negativo negativo 36/07 positivo positivo 83,2 positivo 86,9 49/07 positivo negativo positivo 87,1 51/07 negativo negativo negativo 55/07 negativo negativo negativo 62/07 positivo negativo positivo 87,0 66/07 positivo negativo positivo 87,4 69/07 positivo negativo positivo 87,3 72/07 positivo negativo positivo 87,0 88/07 positivo negativo positivo 88,5 89/07 positivo negativo positivo 88,0 90/07 positivo negativo positivo 87,5

30

pb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

500400

300

200

100

pb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

500400

300

200

100

Figura 14. Análisis electroforético en un gel de agarosa al 1,5% de los productos de PCR específicos de IPNV obtenidos usando el kit de RT-PCR en tiempo real en un tubo. Carril 1: estándar de tamaño molecular de DNA 50 pb, Carril 2: control positivo (fragmento purificado); Carril 3: muestra 02/07; Carril 4: muestra 03/07; Carril 5: muestra 11/07; Carril 6: muestra 12/07; Carril 7: muestra 20/07; Carril 8: muestra 36/07; Carril 9: muestra 49/07; Carril 10: muestra 17/07.

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400300200

100

500

pb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

400300200

100

500

pb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Figura 15. Análisis electroforético en un gel de agarosa al 1,5% de los productos de PCR específicos de IPNV obtenidos usando el kit de RT-PCR en tiempo real en dos tubos. Carril 1: estándar de tamaño molecular de DNA 100 pb, carril 2: control negativo; Carril 3: muestra 02/07; Carril 4: muestra 03/07; Carril 5: muestra 11/07; Carril 6: muestra 12/07; Carril 7: muestra 20/07; Carril 8: muestra 36/07; Carril 9: muestra 49/07; Carril 10: muestra 62/07; Carril 11: muestra 66/07; Carril 12: muestra 69/07; Carril 13: muestra 72/07; Carril 14: muestra 88/07; Carril 15: muestra 89/07; Carril 16: muestra 90/07; Carril 17: control positivo (fragmento purificado); Carril 18: estándar de tamaño molecular de DNA 100 pb.

32

5.4. DETECCIÓN LOS SEROTIPOS Ab, Sp Y VR-299 DEL IPNV Para comprobar si el aumento de la Tm del producto de PCR específico de IPNV se debía probablemente al cambio de las condiciones experimentales del kit Fast Start DNA Master SYBR Green I, se procedió a aplicar este kit en muestras correspondientes a 3 de los serotipos de IPNV. La tabla 8 muestra los resultados de la detección de los serotipos Ab, Sp y VR-299 de IPNV y muestras de células CHSE-214, sobrenadante de células CHSE-214 y tejidos de peces sin IPNV. Se puede observar en cada caso la correspondencia de los resultados entre RT-PCR en tiempo real y el efecto citopático en cultivo de células. Cabe destacar que, si bien la Tm aumentó al usar el kit en dos pasos, ésta se mantuvo en el mismo rango para el control positivo y los tres serotipos analizados. Tabla 8. Detección de IPNV en controles y muestras de los serotipos Ab, Sp y VR-299.

RT-PCR en tiempo real con DNA Controles Efecto citopático Resultado Tm (°C)

Células CHSE-214 sin infectar negativo negativo Sobrenadante de células CHSE-214 sin infectar

negativo negativo

Tejidos de peces sin IPNV negativo negativo Control positivo positivo positivo 87,5 IPNV Ab positivo positivo 87,1 IPNV Sp positivo positivo 87,5 IPNV VR-299 positivo positivo 87,7

33

6. DISCUSIÓN

El objetivo principal de este trabajo fue evaluar la capacidad de la técnica de RT-PCR en tiempo real para detectar la presencia del IPNV en muestras de tejidos de peces salmónidos con signología clínica de IPN, comparando nuestros resultados con los obtenidos por cultivo celular. Los peces utilizados en este estudio mostraron al examen de necropsia los signos característicos de la infección viral, como palidez hepática, presencia de petequias a nivel de los ciegos pilóricos y grasa viceral, fluido ascítico y enteritis catarral (Fig. 6 y 7). Asimismo, las muestras de macerado de estos órganos originaron efecto citopático en células CHSE-214, confirmando por RT-PCR la presencia del virus en estas células (Fig. 8). Como se mencionó anteriormente, el método tradicional para la detección de virus de peces se basa en el aislamiento del agente etiológico en líneas celulares sensibles y su posterior identificación mediante técnicas serológicas. Este método es altamente aceptado y actualmente aún se utiliza como control de otros métodos diagnósticos (Ganzhorn y Lapatra 1994, Wolf 1988). Sin embargo, aunque el cultivo de virus es ampliamente utilizado en la mayoría de los laboratorios de virología, es relativamente caro y consume tiempo. A pesar de ello, muchos laboratorios todavía consideran que es el método más sensible para el diagnóstico de los virus de peces, con un límite de detección teórico de una partícula viral. No obstante, la eficacia de este método, obviamente, depende de la susceptibilidad de la línea celular (Rodriguez y col 2003).

Rodríguez y col. (2001) evaluaron comparativamente seis métodos diagnósticos para la

detección de IPNV utilizando 83 aislados de campo, tres cepas de referencia y el ensayo de seroneutralización como método control. Los resultados obtenidos mostraron que solo la RT-PCR tuvo sensibilidad similar a la seroneutralización a los títulos infecciosos más bajos probados (1x101 TCID50/ml) y se aplicó con éxito para el diagnóstico de los 83 aislados de IPNV. A un título infeccioso viral de 1x102 TCID50/ml, el 80% de los IPNV probados fueron positivos mediante la prueba de citometría de flujo, mientras el ensayo de inmunofluorescencia mostró un porcentaje relativo de detección de 26,7% que aumentó a un 100% cuando se usó un título infeccioso de 1x103 TCID50/ml. Baja sensibilidad mostraron las técnicas de inmunoperoxidasa, inmunodot blot e ISPA, las cuales necesitaron títulos tan altos como 104, 105 y 107 TCID50/ml, respectivamente, para alcanzar un 100% de detección positiva. Los métodos más precisos, rápidos y sensibles para identificar IPNV fueron la RT-PCR y la citometría de flujo, los cuales pueden ser aplicados incluso para detectar peces portadores.

La pronta identificación del virus en un centro afectado por IPNV permite implementar

de forma inmediata medidas de control adecuadas para contener la infección. Para ello, se hace necesario contar con una técnica de diagnostico no sólo sensible, sino que también rápida y específica como la RT-PCR en tiempo real. En este estudio se comparó la capacidad de detección del cultivo celular y dos técnicas de RT-PCR en tiempo real (en uno y dos tubos) para la identificación del IPNV utilizando partidores descritos por Roche.

34

En una primera etapa se logró determinar la capacidad de estos partidores para amplificar el fragmento de PCR específico de aproximadamente 200 pares de bases para IPNV en dos muestras de peces infectados, utilizando para ello RT-PCR convencional (Fig. 9).

Al utilizar el kit RNA Amplification SYBR Green I, los partidores Roche originaron un

producto de PCR cuya curva de “melting” definió una Tm de 83.1 ºC y 83,7 ºC para un producto de PCR específico purificado y una muestra de macerado de órganos positiva respectivamente. A su vez no se observó un peak en la curva de “melting” a los 83 ºC para el control negativo correspondiente a células CHSE-214 (Fig. 10). Sin embargo, si se observa una curva con una Tm de 75,3 ºC, lo que correspondería a dímeros de partidores (Lebedev y col 2008). Al analizar estos productos en un gel de agarosa, se puede observar la presencia de estos dímeros en el carril correspondiente a este control (Fig. 11). Adicionalmente, se puede observar la ausencia de este peak que corresponde a dímeros de partidores en el tubo de reacción que contiene sólo agua (Fig. 12). Lo anterior demuestra la especificidad de los partidores utilizados, los que están dirigidos a una región altamente conservada del gen de la proteína VP2 del virus.

En este sentido, la obtención de partidores específicos para la identificación de

patógenos se basa en el análisis de regiones específicas y altamente conservadas dentro del genoma de una especie en particular. Blake y col. (1995) realizaron un estudio donde compararon cuatro pares de partidores dirigidos a los genes VP2 y a la región VP4-VP3. A partir de estos estudios se pudo determinar que sólo dos de estos partidores fueron capaces de amplificar un producto de PCR específico en los 9 serotipos descritos para IPNV. Específicamente los partidores que estaban dirigidos al extremo 3’ del gen VP2 y a la región intergénica VP4-VP3. Al contrario, los otros partidores presentaron resultados variables identificando sólo algunos de los serotipos utilizados. Estos resultados indican que estas dos secuencias de partidores son complementarias a regiones altamente conservadas y pueden ser utilizadas en ensayos de PCR para la identificación de diversos grupos de este virus.

La tabla 7 muestra la comparación de los resultados obtenidos en la detección de IPNV

utilizando tanto la metodología que realiza la RT-PCR en una misma reacción (kit RNA Amplification SYBR Green I) y el método realizando la RT y la PCR en dos reacciones separadas (kit Fast Start DNA Master SYBR Green I). Se puede observar en los resultados expuestos en la tabla, una ostensible pérdida de la capacidad de detección al utilizar la técnica de una reacción, donde sólo se identifico IPNV en 2 de las 14 muestras positivas para cultivo celular analizadas. Al contrario, se observó la detección del virus en la totalidad de las muestras anteriormente mencionadas al utilizar el kit Fast Start DNA Master SYBR Green I. Estos resultados concuerdan con investigaciones previas que establecen una sensibilidad menor de la técnica en un solo paso. En este sentido, si bien la PCR es una técnica confiable y precisa, pequeñas variaciones en los componentes de la reacción, las condiciones de temperatura en los ciclos y desapareamiento de los partidores durante las primeras etapas de la reacción pueden dar lugar a importantes cambios en la especificidad y sensibilidad de la técnica (Bustin 2000, Wu y col 1991).

35

En relación a lo mencionado anteriormente, ya sea usando la técnica en una o dos reacciones, la síntesis de cDNA puede afectar enormemente los resultados totales de la PCR en tiempo real. Si bien, el manual del kit RNA Amplification SYBR Green I no especifica la composición de las mezclas de reacción, tanto la enzima transcriptasa reversa y el ditiotreitol (DTT, presente en reacciones de transcripción reversa) son inhibidores de la PCR lo que podría afectar la cinética de la reacción en un solo paso o cuando están presentes en una reacción en dos pasos (Lekanne y col 2002, Liss 2002). Además muchas muestras que provienen de fuentes biológicas complejas, con frecuencia, contienen otros inhibidores de la PCR que podrían ingresar durante la preparación de la muestra de RNA (Tichopad y col 2004). La contaminación con inhibidores se puede evitar utilizando un protocolo de precipitación de cDNA (Liss 2002), mientras que el DTT puede ser excluido de la reacción (Gibson y col 1996). En este sentido, el kit de un paso utilizado no presentó problemas en amplificar el producto específico de IPNV a partir de muestras de RNA extraídas de cultivo de células CHSE-214 infectadas con el virus (datos no mostrados), sugiriendo la presencia de algún inhibidor en el RNA extraído de tejidos.

El ensayo de RT-PCR se ha estado utilizando recientemente en la detección de

Aquabirnavirus, principalmente en experimentos realizados con tejido infectado de salmón Atlántico para la identificación de IPNV; de hecho, Noruega, Taiwán, Virginia, España y Chile ya han utilizado esta técnica como método de diagnostico (Blake y col 1995, López-Lastra y col 1994, Taksdal y col 2001, Way-Shyan y col 1997). En la actualidad, en México esta técnica de identificación de IPNV se está estandarizando, puesto que los experimentos que se han realizado a la fecha demuestran que su sensibilidad no ha sido mayor a la del cultivo celular (Salgado 2006).

Este estudio también permitió establecer la capacidad de la técnica de RT-PCR en

tiempo real en dos pasos para identificar el virus IPN tanto en peces de diversas especies, en este caso trucha, salmón del Atlántico y salmón Coho (Oncorhynchus kisutch), así como de diferente procedencia (distintas regiones y cuerpos de agua).

Hoy en día se advierte un creciente interés en el estudio de técnicas moleculares

sensibles y específicas como la RT-PCR en tiempo real. Esta técnica, permite un reconocimiento inmediato del agente patógeno de enfermedades como la IPN en las instalaciones acuícolas y de este modo establecer de manera oportuna las medidas sanitarias correspondientes para el manejo de grupos infectados. De esta manera, Robert y col. (2008), realizaron una investigación donde utilizaron RT-PCR en tiempo real para la detección de IPNV en muestras de distintos tejidos, con el objetivo de establecer la presencia del virus en peces portadores asintomáticos. A partir de estos estudios, se determinó la cantidad de virus presente en aleta pectoral, bazo y riñón. Los resultados mostraron que el virus podía ser detectado incluso a las 24 h post-desafío, sugiriendo que el IPNV podía replicarse tanto en aleta pectoral como en bazo y riñón, detectándose en todos los casos una carga viral similar en un mismo pez. Esto demostró la utilidad de muestras provenientes de peces vivos, en este caso aleta pectoral, para la detección temprana de IPNV.

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Si bien, en nuestro, estudio RT-PCR en tiempo real consiguió identificar IPNV en la totalidad de las muestras, la Tm del producto obtenido con el kit FastStart DNA Master SYBR Green I varió de 83 °C a 87 ºC, a pesar de que se utilizaron los mismos partidores en ambas ocasiones. La Tm de una doble hebra de ácido nucleico se modifica por tres factores principales; la composición de bases, la longitud de la doble hebra y la fuerza iónica de la solución. Debido a que en este estudio se trabajó amplificando siempre la misma región específica del gen VP2 presente en los nueve serotipos descritos, las dos primeras opciones mencionadas no explicarían el cambio de la Tm, por lo cual la variación estaría relacionada a un cambio en la fuerza iónica de la solución, cambio determinado por diferencias en la composición de las mezclas de reacción de ambos kit para RT-PCR y PCR en tiempo real. Dentro de los componentes de la mezcla de reacción se encuentran el buffer que mantiene un pH óptimo y las sales que proporcionan la fuerza iónica adecuada para una máxima actividad de la enzima. Puesto que el kit RNA Amplification SYBR Green I incluye una mezcla de enzimas que permite efectuar tanto el proceso de transcripción reversa y amplificación del segmento blanco en un tubo único, requiere condiciones específicas para una correcta actividad de la mezcla enzimática. Al contrario, el kit en dos pasos cuya mezcla de reacción sólo debe ofrecer las condiciones apropiadas para el funcionamiento de la DNA polimerasa. Esto determina la diferencia en la composición de ambas mezclas de reacción, lo cual respondería el cambio en la Tm del producto obtenido.

En relación a la RT-PCR en tiempo real, un factor fundamental para la utilización de

esta técnica es una adecuada interpretación de la curva de “melting”. Esta curva se obtiene posterior a la PCR gracias al monitoreo constante de la fluorescencia de las muestras mientras la temperatura aumenta. El propósito del análisis de la curva de “melting” es determinar la temperatura de “melting” (Tm) característica de un DNA blanco, proporcionando información útil para la identificación del producto, identificación de productos no deseados (dímeros de partidor) y detección de mutaciones.

Finalmente se estableció la utilidad de la técnica de RT-PCR en tiempo real para la

detección de las diferentes cepas de IPNV (Ab, Sp, VR-299) con los partidores proporcionados por Roche, esto efectuando la transcripción reversa y la PCR en dos reacciones distintas (kit Fast Start DNA Master SYBR Green I). Se puede apreciar en la tabla 8 que todos los serotipos fueron reconocidos por los partidores, originando el producto de PCR específico con una Tm de 87,5 ºC; del mismo modo, este valor de Tm se observó en el control positivo, demostrando la identidad del producto amplificado en las muestras descritas en la tabla 1. Asimismo, se pudo observar la ausencia de producto específico en muestras control como células, sobrenadante de células y tejido de peces sanos. En este sentido, cabe destacar que en nuestro país existen reportes de la presencia de los serotipos Sp y VR-299 de IPNV (McAllister y Reyes 1984, Espinoza y col 1985, Fernández 2005). El diagnóstico de IPNV es frecuente en la salmonicultura chilena; sin embargo, es escasa la descripción de las características de las diversos aislados de campo. Datos no publicados refieren que a partir del año 2000, el 100% de los aislados de IPNV obtenidos de la décima y undécima región, corresponden al serotipo Sp (Fernández 2005). El hecho que los partidores utilizados en este estudio permitieran obtener el producto específico de PCR a partir de los serotipos SP y VR-

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299, sugiere que éstos son capaces de identificar la gran mayoría de los aislados de campo predominantes en Chile. La utilidad de la técnica de RT-PCR en tiempo real para la detección rápida y eficaz de aislados de campo y de los serotipos SP, VR-299 y Ab del virus de la necrosis pancreática infecciosa, aporta un mecanismo diagnóstico rápido que permite un mayor control a nivel sanitario, evitando así, las graves pérdidas económicas sufridas por la industria acuícola a causa de enfermedades de etiología viral como IPN. Futuros estudios permitirán establecer la sensibilidad de esta técnica y aplicar protocolos cuantitativos de manera de poder determinar la carga viral en distintas muestras y relacionarlas con la patogenia del virus, estado portador, índice de replicación viral y título viral en líneas celulares. 6.1. CONCLUSIONES

Los partidores utilizados en este estudio fueron capaces de identificar el virus utilizando RT-PCR tradicional y las dos metodologías de RT-PCR en tiempo real empleadas.

Las técnicas de RT-PCR en tiempo real en uno y dos pasos muestran diferencias en su capacidad para detectar el virus IPN en muestras de tejidos de peces infectados. La capacidad de detección fue mayor para el método que separa el proceso de transcripción reversa de la amplificación del cDNA por PCR.

La técnica de RT-PCR en tiempo real con el kit Fast Start DNA Master SYBR Green I identificó la totalidad de las muestras al igual que el aislamiento a partir de cultivo celular, técnica oficialmente aceptada para el diagnóstico de la enfermedad.

Los partidores, el protocolo y el equipo utilizado para RT-PCR en tiempo real permitieron la detección de los tres serotipos estudiados, Ab, Sp y VR-299, siendo Sp y VR-299 los serotipos predominantes en la industria salmonera nacional.

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8. AGRADECIMIENTOS

Quisiera expresar mi agradecimiento especialmente a mis padres por su constante esfuerzo y preocupación, a mi hermano por su apoyo incondicional y a mis tías Magaly y Enriqueta por su cariño; a Dino y Ámbar, que han sido mi principal motivación para estudiar esta carrera. Quiero agradecer además a mis amigas, compañeros de carrera y a mis compañeros de laboratorio que siempre me alentaron a seguir adelante.

Muchas gracias al Dr. Alex Romero por su dedicación, sus enseñanzas y su continuo

apoyo durante todo este tiempo. Quisiera agradecer también al Dr. Ricardo Enríquez, a la Sra. Mónica Monrás, la Srta.

Vania Quinteros y a todos quienes trabajan en el Laboratorio de Biotecnología y Patología Acuática por su disponibilidad y colaboración en el desarrollo de este trabajo.