helicobacter pylori igg - radim.comradim.com/userfiles/file/metodiche/inglese/k5hpg.pdf ·...

M114 – Rev.11 – 04/2008 – Pag. 1/ 24

HELICOBACTER PYLORI IgG

EIA WELL

REF K5HPG

Italiano p. 3 English p. 12

96

K5HPG –Helicobacter Pilori IgG EIA WELL M114 – Rev.11 – 04/2008 – Pag. 2/ 24

REAGENTI DEL KIT - KIT REAGENTS Reag. Quant..

MTP 1 x 96 Pronti per l'uso, Ready for use

WASH 1 x 50 mL Conc.

DIL 1 x 20 mL Conc.

NEG 1 x 2 mL Pronto per l'uso Ready for use

CAL 1 x 2.5 mL3 x 1.5 mL

Pronto per l'uso Ready for use

CONJ 1 x 14 mL Pronto per l'uso Ready for use

TMB 2 x 15 mL Pronto per l'uso Ready for use

STOP 1 x 14 mL Pronto per l'uso Ready for use

"Le Istruzioni per l'uso tradotte nelle altre lingue di interesse sono consultabili sul sito Internet all'indirizzo www.radim.com". “The instructions for use available in the other languages of interest can be viewed on our website www.radim.com". “Οι οδηγίες χρήσης μεταφρασμένες στις άλλες ενδιαφερόμενες γλώσσες όπως επίσης στην ηλεκτρονική διεύθυνση www.radim.com".

“In den anderen Sprachen von Interesse ist die Bedienungsanleitung kann auf der Website unter der Adresse www.radim.com konsultiertwerden”. "Le mode d’emploi dans les autres langues intéressées est consultable sur le site Internet à l'adresse www.radim.com”. “Las instrucciones de uso traducidas en los otros idiomas de interés se pueden consultar en nuestro sitio Internet www.radim.com”. "As instruções de uso traduzidas nos outros idiomas de interesse podem ser consultadas no nosso site Internet, ao endereço www.radim.com."


DOSAGGIO IMMUNOENZIMATICO PER LA DETERMINAZIONE QUANTITATIVA E/O QUALITATIVA DEGLI ANTICORPI IgG ANTI-H.PYLORI NEL SIERO O PLASMA UMANO.

PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO 1. APPLICAZIONI CLINICHE Helicobacter pylori (precedentemente denominato Campylobacter pyloridis e successivamente Campylobacter pylori) è un batterio gram-negativo, di 0.5- 5 µm di lunghezza e 0.2-0.5 µm di larghezza, tipicamente incurvato, spiraliforme, a singola o a multipla “esse”, presenta una vivacissima motilità dall'andatura caratteristica, che permette la sua individuazione nei preparati a fresco. Venne per la prima volta isolato da Warren e Marshall da campioni bioptici prelevati da pazienti affetti da gastrite cronica attiva, da allora numerosi altri ricercatori hanno confermato la stretta associazione di questo batterio con la patologia gastroduodenale. E' infatti ormai chiaro, che l'Helicobacter pylori è l'agente eziologico principale della gastrite di tipo B (gastrite antrale cronica attiva) di cui sembra essere un fattore scatenante o forse aggravante (a tal proposito ancora il dibattito è aperto). Di sicuro, si hanno dati che depongono a favore di un ruolo dominante dell'Helicobacter pylori nella recidiva dell'ulcera duodenale. L'accresciuto interesse per la batteriologia nella patologia gastrica ha portato ad un notevole impulso degli studi in questo settore e dati sempre maggiori si accumulano sul ruolo fondamentale dell'Helicobacter pylori nella gastrite cronica attiva, nell'ulcera gastrica e nell'ulcera duodenale e della sua stretta correlazione con lesioni gastriche; inoltre sono stati riportati dati che depongono per una stretta relazione tra eradicazione del microrganismo e guarigione completa della gastrite. La diagnosi di gastrite cronica attiva si basa in genere su numerosi dati quali: l'anamnesi del paziente, il reperto radiologico e endoscopico e dati di laboratorio. Helicobacter pylori viene isolato in coltura ed esaminato al microscopio dopo opportuna colorazione oppure viene evidenziato tramite il test dell'ureasi; queste tecniche presentano comunque entrambi tempi lunghi di esecuzione ed una sensibilità e specificità tuttora da dimostrare. La disponibilità di metodologie immunoenzimatiche (ELISA) per la determinazione di anticorpi specifici verso Helicobacter pylori ha in gran parte ovviato a tali problemi, permettendo di avere un quadro sierologico in tempi brevi tramite metodi semplici ed altamente specifici senza ricorrere all'uso di tecniche invasive. Diversi studi sono stati condotti sulla presenza di anticorpi diretti contro Helicobacter pylori e patologia gastrica ad esso associata e si è potuto dimostrare una significativa correlazione tra livello sierico di anticorpi (IgG) e reperto istologico, nonché una notevole corrispondenza tra aumenti nel titolo delle immunoglobuline e gastrite acuta. Il test sierologico per Helicobacter pylori può essere utilizzato quale screening rapido per popolazioni molto estese di pazienti ed ancor più per la diagnosi precoce di infezione da Helicobacter pylori, dal momento che la risposta immunitaria può spesso precedere la manifestazione clinica della malattia. Da un punto di vista


diagnostico, un alto livello sierico di anticorpi specifici contro Helicobacter pylori va interpretato come probabile presenza di una gastrite asintomatica di tipo B. 2. PRINCIPIO DEL METODO Il presente kit è basato sul metodo immunoenzimatico (ELISA) ed utilizza come marcatore enzimatico la perossidasi. Durante la prima incubazione, gli anticorpi anti-Helicobacter pylori della classe IgG eventualmente presenti nel siero in esame si legano all'antigene adeso alla superficie dei pozzetti. Tramite lavaggio viene eliminato il materiale non legato; in una successiva incubazione gli anticorpi anti-IgG umane, coniugati alla perossidasi, reagiscono con il complesso precedentemente formatosi. Dopo ulteriore lavaggio viene aggiunta tetrametilbenzidina (TMB) incolore che, reagendo con la perossidasi presente, produce un composto colorato. La reazione di sviluppo del colore è bloccata con l'aggiunta di H2SO4 e l'intensità del colore, misurata mediante spettrofotometro a 450 e a 405 nm, è direttamente proporzionale alla concentrazione di anticorpi IgG anti-Helicobacter presenti nei calibratori e nei campioni in esame. 3. REAGENTI CONTENUTI NEL KIT: PREPARAZIONE E STABILITA' − I reagenti sono sufficienti per 96 pozzetti. − Il kit deve essere conservato a 2-8°C. − La data di scadenza di ciascun reagente è indicata sulla rispettiva etichetta. − Una volta aperto il kit è stabile 2 mesi a 2-8°C. 3.1 Reagenti Specifici • MTP Micropiastra Sensibilizzata: 1 micropiastra da 96 pozzetti, divisibili

singolarmente, sensibilizzati con antigene Helicobacter purificato ed inattivato. I pozzetti non utilizzati devono essere conservati a 2-8°C nella bustina di plastica trasparente fornita, sigillata accuratamente.

• CAL Calibratori: 4 flaconi di IgG anti-H. pylori in matrice sierica, alle seguenti concentrazioni: 15, 30, 60 e 120 UR/mL. Conservante: NaN3 (<0.1%). Pronti per l'uso e colorati in rosso, eccetto il punto 15 UR/mL colorato in azzurro.

• CONJ Coniugato Enzimatico: 1 flacone (14 mL) di anticorpi monoclonali (topo) anti-IgG umane, coniugati con perossidasi di rafano (HRPO), in matrice sierica e stabilizzanti. Conservante: Neomicina. Pronto per l'uso e colorato in rosa.


3.2 Reagenti Comuni per i kit delle Linee To.R.C.H.–M.S.T., Malattie dell’infanzia, Patologia Gastroenterica e Morbo Celiaco

• WASH Soluzione di Lavaggio (concentrata): 1 flacone (50 mL) di PBS-Tween-20. Conservante: Mertiolato (<0.05%). Al momento dell'uso diluire la quantità necessaria 1:20 con H2O distillata. Nel caso siano presenti cristalli insoluti, risospenderli ponendo il flacone a 37°C per qualche minuto. Dopo diluizione il tampone di lavaggio è stabile 30 giorni a 2-8°C.

• DIL Diluente dei Campioni (concentrato): 1 flacone (20 mL) di matrice sierica e stabilizzanti, colorato in rosso. Conservante: NaN3 (<0.1%). Al momento dell'uso diluire 1:20 con la soluzione di lavaggio già diluita. Il diluente così preparato è stabile 30 giorni a 2-8°C.

• NEG Controllo Negativo: 1 flacone (2 mL) di matrice sierica non reattiva per IgG anti-H. pylori. Conservante: NaN3 (<0.1%). Pronto per l'uso e colorato in rosso. Il siero di controllo negativo deve essere utilizzato come: 1) controllo nel dosaggio qualitativo; 2) punto a concentrazione 0 UR/mL nel dosaggio quantitativo.

• TMB Cromogeno: 2 flaconi (15 mL) di Tetrametilbenzidina (TMB) in tampone citrato-fosfato, DMSO e H2O2. Pronto per l’uso.

• STOP Reagente Bloccante: 1 flacone (14 mL) di H2SO4 1N. Pronto per l'uso.

• CPA Copripiastra adesivo • Bustina di plastica trasparente con minigrip 4. MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO 4.1 Dosaggio Manuale − Micropipette automatiche a puntali intercambiabili a volume variabile. − Stufa termostatata a 37±2°C. − Cilindri graduati per la diluizione dei reattivi. − Pompa aspirante oppure apparecchiatura automatica per il lavaggio delle

micropiastre. − Spettrofotometro di precisione per micropiastre, con possibilità di misura in

assorbanza nell'intervallo 0-3.0 A ad una lunghezza d'onda di 450 e 405 nm. − Carta millimetrata. − H2O distillata.


4.2 Dosaggio Automatico − Il dispositivo può essere utilizzato con strumentazione automatica di kit ELISA

su micropiastra. − Si garantisce l’applicabilità su strumentazione RADIM e/o SEAC − Qualora si utilizzi strumentazione automatica di altri fornitori, è responsabilità

dell’utilizzatore assicurarsi che il kit sia stato opportunamente validato. 5. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Per ottenere risultati corretti e riproducibili, è necessario osservare le seguenti norme: − Non mescolare i reagenti specifici (vedi 3.1) di lotti differenti. − E’ possibile utilizzare reagenti comuni (vedi 3.2) di lotti differenti. − Non usare i reagenti dopo la data di scadenza. − Non esporre i reattivi e i campioni a calore intenso o a forti sorgenti di

inquinamento. − Usare vetreria perfettamente pulita ed esente da contaminazioni di ioni

metallici o sostanze ossidanti. − Usare acqua distillata o deionizzata, conservata in recipienti perfettamente

puliti. − Evitare accuratamente contaminazioni tra campioni; a tal fine è consigliabile

usare pipette con puntali monouso per ogni campione e per ogni reattivo. − Non modificare in alcun modo il Procedimento Operativo di esecuzione del

test. Eventuale non rispetto di: • sequenza e quantità nell’aggiunta dei reattivi • tempi e temperatura di incubazione

può dare luogo a risultati clinici errati. − Ricostituire gli eventuali reagenti liofili secondo le modalità descritte sulle

etichette. Eventuale utilizzo di reattivi o volumi non idonei, può provocare l’ottenimento di dati clinici non attendibili.

− In caso di procedura manuale è importante l’utilizzo di pipette calibrate e possedere un’adeguata manualità tecnica. In particolare è essenziale una buona precisione nella preparazione e dispensazione dei reattivi. E’ necessario un adeguato piano di manutenzione (pulizia e calibrazione) di tale strumentazione.

− Assicurarsi che la pompa di aspirazione oppure l’apparecchiatura automatica per il lavaggio delle micropiastre sia perfettamente funzionante. Un lavaggio non accurato delle micropiastre può dare luogo a misclassificazione dei campioni. E’ necessario un adeguato piano di manutenzione di tale strumentazione.

− Assicurarsi che lo spettrofotometro per micropiastre sia perfettamente funzionante. L’utilizzo di uno spettrofotometro non calibrato o con filtri non puliti, può comportare un errore nella lettura dei campioni, con conseguente possibile misclassificazione degli stessi. E’ necessario un adeguato piano di manutenzione (pulizia e calibrazione) di tale strumentazione.


− Assicurarsi che la stufa termostatata (se necessaria) sia perfettamente funzionante. L’incubazione a temperature diverse da 37±2°C può dare luogo a perdita di sensibilità e/o a denaturazione biologica dei materiali (reattivi e/o campioni). E’ necessario un adeguato piano di manutenzione di tale strumentazione e un controllo periodico della temperatura registrata.

− Assicurarsi che l’agitatore per micropiastre (se necessario) sia perfettamente funzionante. L’agitazione in condizione diverse dall’atteso può dare luogo a misclassificazione dei campioni . E’ necessario un adeguato piano di manutenzione di tale strumentazione.

− Assicurarsi che la strumentazione utilizzata per la conservazione dei campioni e/o del dispositivo sia perfettamente funzionante. La conservazione a temperature diverse dall’atteso, può dare luogo a denaturazione biologica dei materiali (reattivi e/o campioni). E’ necessario un adeguato piano di manutenzione di tale strumentazione e un controllo periodico della temperatura registrata.

− Utilizzare un adeguato metodo per la corretta identificazione dei campioni. Possibili conseguenze possono essere sia la perdita di specificità del dispositivo che risultati analitici errati.

Per evitare contaminazioni personali ed ambientali, è necessario osservare le seguenti norme di sicurezza: − Utilizzare guanti monouso durante la manipolazione di materiale

potenzialmente infetto e durante il dosaggio. − Non pipettare i reagenti con la bocca. − Non fumare, mangiare, bere o applicare cosmetici durante l'esecuzione del

dosaggio. − Le soluzioni di Cromogeno e Reagente Bloccante vanno manipolate con

cautela. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi e le mucose. In caso di incidente lavare abbondantemente con acqua.

− I materiali di origine umana utilizzati nella preparazione del presente kit sono stati saggiati per la presenza di HBsAg, anti-HIV e anti-HCV e sono risultati ripetutamente negativi. Comunque nessun test attualmente disponibile garantisce l'assenza degli agenti virali responsabili della sindrome da immunodeficienza acquisita, dell'epatite B ed epatite C. Tutti i reagenti contenenti materiale biologico e tutti i campioni di siero umano devono essere considerati potenzialmente infettivi.

− Evitare la produzione di schizzi e la formazione di aerosol; qualora ciò si verificasse ripulire accuratamente con ipoclorito di sodio ad una concentrazione del 3%. Il mezzo adoperato per la pulizia deve essere trattato come residuo potenzialmente infetto ed eliminato secondo le modalità opportune.

− La sodio azide contenuta come conservante in alcuni reagenti, può reagire con il piombo ed il rame delle tubature formando azidi di metallo altamente esplosive. Per evitare l formazione e l'accumulo di tali composti far scorrere abbondante acqua sui reagenti eliminati.


− Ai sensi del D.L. italiano n. 22 del 05.02.97, che fa riferimento alle direttive CEE (91/156/CEE, 91/689/CEE, 94/62/CEE) tutti i rifiuti provenienti da lavorazioni manuali e/o in automatico sono classificati rifiuti speciali pericolosi con codice di classificazione CER 180103; devono quindi essere eliminati affidandoli a ditte autorizzate al ritiro ed allo smaltimento.

6. RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Il dosaggio può essere effettuato su siero o plasma umano. Campioni moderatamente lipemici non influenzano i risultati del dosaggio; campioni fortemente lipemici o emolizzati possono alterare i risultati. La presenza di filamenti di fibrina può interferire nel dosaggio; assicurarsi pertanto che i campioni siano perfettamente limpidi prima di dosarli. I campioni possono essere conservati per un periodo non superiore ad una settimana se correttamente mantenuti a 2-8°C, a-20°C per tempi più lunghi. Si consiglia di non congelare e scongelare ripetutamente i campioni. Prima dell'uso, diluire i campioni 1:300 con il Diluente dei Campioni precedentemente preparato (es. 10 µL di campione + 2990 µL di diluente). 7. PROCEDIMENTO OPERATIVO * − Attendere che i reagenti ed i campioni raggiungano la temperatura ambiente. − Agitare i campioni per inversione prima dell'uso. 7.1 Preparare i pozzetti per: Bianco, Siero di Controllo o Calibratori e Campioni. 7.2 Dispensare 100 µL di Siero di Controllo o Calibratori e Campioni

precedentemente diluiti, nei rispettivi pozzetti. N.B.: i Calibratori ed il Siero di Controllo non devono essere diluiti.

7.3 Dispensare 100 µL di Diluente Campioni diluito nel pozzetto del Bianco. 7.4 Incubare per 60±5 minuti a 37±2°C, coprendo la micropiastra con il

copripiastra adesivo fornito nel kit. 7.5 Effettuare 3 lavaggi con un volume di 350 µL per pozzetto, impiegando la

Soluzione di Lavaggio diluita. Aspirare accuratamente il liquido da tutti i pozzetti.

7.6 Dispensare 100 µL di Coniugato Enzimatico in tutti i pozzetti. 7.7 Incubare per 30±2 minuti a 37±2°C, coprendo la micropiastra con il

copripiastra adesivo fornito nel kit. 7.8 Lavare i pozzetti come al punto 7.5. 7.9 Dispensare 100 µL di Cromogeno in tutti i pozzetti. 7.10 Incubare per 10 minuti a 37±2°C o 15 minuti a temperatura ambiente

(18-25°C), al riparo dalla luce. 7.11 Dispensare 100 µL di Reagente Bloccante in tutti i pozzetti.


7.12 Leggere la densità ottica delle soluzioni a 450 nm in uno spettrofotometro preferibilmente bicromatico con lunghezza d'onda di riferimento a 620 nm (azzerando lo strumento con il Bianco). Nel caso di estinzione in overflow, utilizzare la lettura spettrofotometrica a 405 nm. La lettura deve essere effettuata entro 15 minuti dal termine del dosaggio.

* Qualora si utilizzasse nel procedimento operativo uno strumento automatico per micropiastre RADIM e/o SEAC, far riferimento al relativo manuale. 8. SCHEMA DEL DOSAGGIO: vedi p. 22 9. CALCOLO DEI RISULTATI * 9.1 Dosaggio Qualitativo Considerare la densità ottica di ciascun controllo negativo e calibratore Cut-off (15 UR/mL: valore soglia). Confrontando la densità ottica dei campioni con la densità ottica del calibratore Cut-off si determina la reattività o non reattività verso gli anticorpi IgG anti-H. pylori. I campioni con valori di densità ottica inferiori a quello relativo al calibratore 15 UR/mL (calibratore Cut-off) sono da considerare non reattivi per gli anticorpi IgG anti-H. pylori. Campioni con valori di densità ottica superiori al calibratore Cut-off sono da considerare reattivi per gli anticorpi IgG anti-H. pylori. I campioni con valori di densità ottica compresi tra il calibratore Cut-off ± 10% sono da considerare di incerta interpretazione e devono pertanto essere ridosati. 9.2 Dosaggio Quantitativo Il controllo negativo è da considerare il primo punto dalla curva di calibrazione con valore 0 UR/mL di IgG anti-H. pylori e pertanto facente parte della curva stessa. Disegnare la curva su carta millimetrata, riportando sull'asse delle ascisse le concentrazioni dei calibratori e su quello delle ordinate l'assorbanza ottenuta per ciascun calibratore. Interpolando sulla curva di calibrazione le assorbanze relative a ciascun campione, si otterranno le corrispondenti concentrazioni di IgG anti-H. pylori, espresse in UR/mL. − I campioni con valori di IgG inferiori a 15 UR/mL sono da considerare non

reattivi per gli anticorpi IgG anti-H. pylori. − Campioni con valori di IgG superiori a 30 UR/mL sono da considerare reattivi

per gli anticorpi IgG anti-H. pylori. − I campioni con valori di IgG compresi tra 15 UR/mL e 30 UR/mL sono da

considerarsi debolmente reattivi. * Nel caso si utilizzi uno strumento automatico per micropiastre RADIM e/o SEAC, la lettura spettrofotometrica è eseguita automaticamente a 3 lunghezze d'onda: 450, 405 e 620 nm, permettendo l'ampliamento del range di lettura.


9.3 Esempio di Calcolo I valori sotto riportati debbono essere considerati unicamente un esempio e non devono essere utilizzati in luogo dei dati sperimentali. Descrizione Assorbanza 450 nm IgG anti-H. pylori Calibratore 0 UR/mL 0.010 Calibratore 15 UR/mL 0.600 Calibratore 30 UR/mL 1.100 Calibratore 60 UR/mL 1.750 Calibratore 120 UR/mL 2.250 Campione 1.830 70 UR/mL N.B.: Controllo Negativo = Calibratore 0 UR/mL. Interpolando sulla curva di calibrazione, il campione dosato risulta avere un titolo di IgG anti-H. pylori di 70 UR/mL. 9.4 Criteri di Accettazione Prima di procedere al calcolo dei risultati verificare che le assorbanze dei controlli rispettino i seguenti valori: Descrizione Valore atteso Controllo Negativo < 0.100 OD Cal 120 UR/mL / OD Cal 15 UR/mL > 2,3 OD Cal 15 UR/mL / OD Cal 0 UR/mL > 1.94 Se i valori ottenuti non rispecchiano quelli attesi, è necessario ripetere il dosaggio. 9.5 Interpretazione dei Risultati − I campioni non reattivi sono da considerare negativi per gli anticorpi IgG anti-

H. pylori. − I campioni reattivi e/o debolmente reattivi sono da considerare positivi per gli

anticorpi IgG anti-H. pylori. Successivi prelievi dello stesso paziente possono essere comparati tra loro solo se inseriti nello stesso dosaggio; in questo caso un aumento del 60% della densità ottica del secondo campione può essere considerato come significativo di una infezione recente od in atto. Un elevato titolo di IgG anti Helicobacter pylori può deporre in favore di una infezione recente od in atto, un risultato positivo del test, infatti, può confermare l'ipotesi di gastrite o ulcera duodenale precedentemente emessa su dati clinici. Inoltre, il dosaggio delle IgG specifiche permette un rapido ed efficace monitoraggio della terapia farmacologica intrapresa. Un declino del livello di anticorpi anti IgG, infatti, si può notare durante il trattamento e l'eradicazione del microrganismo.


10. CARATTERISTICHE METODOLOGICHE 10.1 Specificità Diagnostica La specificità diagnostica del metodo è stata valutata su un campione rappresentativo di soggetti non immuni da infezione di H. pylori, risultando pari a 96.2%. 10.2 Sensibilità Diagnostica La sensibilità diagnostica del metodo è stata valutata su un campione rappresentativo di soggetti con infezione pregressa di H. pylori, risultando pari a 95.8%. 10.3 Precisione La precisione é stata valutata misurando la ripetibilità e la riproducibilità (variabilità intra-saggio ed inter-saggio) su 3 sieri a differenti concentrazioni di IgG anti-H. pylori. Ripetibilità (Intra-saggio)

Siero Media ± D.S. C.V. Replicati (UR/mL) % n.

a 7.8 ± 0.44 5.6 12 b 45.9 ± 2.06 4.5 12 c 97.7 ± 2.87 2.9 12

Riproducibilità (Inter-saggio)

Siero Media ± D.S. C.V. Dosaggi (UR/mL) % n.

a 47.8 ± 4.5 9.4 10 b 86.06 ± 7.7 9.0 10 c 126.05 ± 11.7 9.3 10

11. LIMITI DEL DOSAGGIO Il test deve essere considerato soltanto come test di screening. La diagnosi di gastrite e di ulcera peptica deve essere convalidata da valutazioni cliniche specifiche ed ulteriori prove diagnostiche. Un tempestivo intervento in caso di malattia in atto, permette di ridurre notevolmente i rischi che ne conseguono. 12. LEGENDA SIMBOLI: vedi p. 20


ENZYME IMMUNOASSAY FOR QUANTITATIVE AND/OR QUALITATIVE DETERMINATION OF ANTI-H.PYLORI IgG IN HUMAN SERUM OR PLASMA.

FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE ONLY 1. CLINICAL APPLICATIONS The genus Campylobacter comprises Gram negative bacteria 0.5-5 µm long and 0.2-0.5 µm in diameter. These bacteria have a typical curved, spiral single or multiple “S” shape. They are highly motile with a characteristic movement making them easy to identify in fresh preparations. Helicobacter pylori (previously called Campylobacter pyloridis and successively Campylobacter pylori) was initially isolated by Warren and Marshall from biopsy samples taken from patients suffering from active chronic gastritis. Subsequently many other authors have confirmed the close association between this bacterium and gastroduodenal pathologies. In fact it is now clear that Helicobacter pylori is the principal etiologic agent in type B gastritis (chronic active antral gastritis) a pathology for which it appears to be the triggering and perhaps aggravating factor (debate continues on this point). Undoubtedly data are available which substantiate the predominant role of Helicobacter pylori in recurrent duodenal ulcer. Growing interest in bacteric involvement in gastric pathology has led to a remarkable step forward in studies in this field. Increasing data are being accumulated regarding the fundamental role of Helicobacter pylori in active chronic gastritis, in gastric ulcer and in duodenal ulcer and its close correlation with gastric lesions. Data have also been reported in support of a close correlation between eradication of the microorganism and complete cure of gastritis. A diagnosis of chronic active gastritis is usually based on numerous data such as: patient's case history, radiologic and endoscopic findings and laboratory analyses. Helicobacter is isolated in culture medium and examined by microscopy after staining or is detected by urease test. Both these techniques are lengthy to implement and their sensitivity and specificity have yet to be demonstrated. The availability of enzyme immunoassay techniques (ELISA) for the detection of antibodies specific to Helicobacter pylori has substantially resolved these problems, ensuring a serological monitoring in a very short space of time using simple, highly specific technology without recourse to invasive techniques. Various studies have been carried out on the presence of antibodies against Helicobacter pylori and associated gastric pathology. A significant correlation has been demonstrated between antibody (IgG) serum levels and histological findings, together with a marked tie-in between increases in immunoglobulin titers and acute gastritis. The serum test for Helicobacter pylori can be utilized as a rapid screening process for large populations of patients and is highly indicated in the early diagnosis of Helicobacter infection as the immune response can often precede clinical manifestations of the disease. From a diagnostic point of view, a high serum level of specific antibodies against Helicobacter pylori must be interpreted as an indication of type B asymptomatic gastritis.


2. PRINCIPLE OF THE ASSAY This kit is based upon an enzyme immunoassay method (ELISA), where horseradish peroxidase is used as enzyme conjugate. During the first incubation, the sample anti-H. Pylori IgG antibodies, if any, are bound to the H. Pylori-antigen coated wells. A wash cycle eliminates all unbound material. In the incubation that follows, a second antibody (anti-human IgG conjugated with horseradish peroxidase) will bind to the H. Pylori-antigen-antibody complex. After a further wash cycle a colorless Chromogen solution (tetramethylbenzidine, TMB) in a substrate-buffer is added to the wells, where it yields a colored compound, by reacting with the peroxidase enzyme. Color development will be stopped by adding H2SO4. The color intensity, measured in a spectrophotometer at 450 and at 405 nm, will thus be directly proportional to the anti-H. Pylori IgG antibody concentration in calibrators and samples. 3. REAGENTS PROVIDED WITH THE KIT: PREPARATION AND STABILITY − The reagents are sufficient for 96 wells. − Store the kit at 2-8°C. − The expiry date of each reagent is shown on the vial label. − Once opened, the kit is stable at 2-8°C for 2 months. 3.1 Specific Reagents • MTP Coated Microplate: 1 microplate for 96 breakable wells, coated with

purified and inactivated H. Pylori. Keep unused wells at 2-8°C in the provided plastic bag and accurately sealed.

• CAL Calibrators: 4 vials of anti-H. Pylori IgG in serum matrix, at the following concentrations: 15, 30, 60 and 120 UR/mL. Preservative: NaN3 (<0.1%). Ready for use and red-colored, except for the 15 UR/mL calibrator which is blue-colored.

• CONJ Enzyme Conjugate: mouse monoclonal anti-human IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRPO) in serum matrix with stabilizers. Preservative: Neomycin. Ready for use and pink-colored.

3.2 Common Reagents for kits of the following Lines: To.R.C.H.–S.T.D.,

Child Disease, Gastroenteric Disease and Celiac Disease • WASH Washing Solution (concentrated): 1 vial (50 mL) of PBS-Tween

20. Preservative: Thimerosal (<0.05%). Just before use, dilute the needed amount 1:20 with distilled H2O. In case of undissolved crystals, re-suspend the solution by placing the vial at 37°C for a few minutes. Store the diluted Washing Solution for 30 days at 2-8°C.

• DIL Sample Diluent (concentrated): 1 vial (20 mL) of serum matrix and stabilizers, red-colored. Preservative: NaN3 (<0.1%). Just before use, dilute 1:20 with the previously diluted Washing Solution. Store the diluted Sample Diluent for 30days at 2-8°C.


• NEG Negative Control: 1 vial (2 mL) of serum matrix with non-reactive for anti-H. Pylori IgG. Preservative: NaN3 (<0.1%). Ready for use and red-colored. The negative control serum must be used as: 1) control in the qualitative assay, and 2) calibrator point at concentration 0 UR/mL in the quantitative assay.

• TMB Chromogen: 2 vials (15 mL) of Tetramethylbenzidine (TMB) with citrate-phosphate buffer, DMSO and H2O2. Ready for use.

• STOP Blocking Reagent: 1 vial (14 mL) of 1N H2SO4. Ready for use. • CPA Adhesive plate sealers • Plastic bag 4. MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED 4.1 Manual Test − Adjustable, automatic micropipettes with disposable tips. − Dry Heater, adjustable at 37±2°C. − Graduated cylinders for reagent dilution. − Aspiration pump or automated well washing device. − Microplate spectrophotometer capable of measuring absorbances within a 0-

3.0 A interval at 450 nm and 405 nm. − Millimetric graph paper. − Distilled H2O. 4.2 Automatic Test − This test can be used with automatic instrument for ELISA kits on microplate. − We guarantee its applications on RADIM and/or SEAC automatic instruments. − While using a non RADIM or SEAC automatic instrument for microplate, it is

under end user responsibility, to make sure that it was appropriately tested for ELISA kits.

5. WARNINGS AND PRECAUTIONS In order to obtain correct and reproducible results, the following rules must be observed: − Do not mix specific reagents (see 3.1) from different lots. − It is possible to mix common reagents (see 3.2) from different lots. − Do not use reagents beyond their expiry date. − Do not store or leave reagents and samples at high temperatures or areas of

possible contamination. − Use thoroughly clean glassware, free from metal ion contamination or oxidizing

substances. − Use distilled or deionized water, stored in perfectly clean containers. − Carefully avoid any contamination among samples; for this purpose,

disposable tips should be used for each sample and reagent. − Do not modify in any way the "Assay Procedure". If you not respect:


• exact incubation times and quantities adding the reagents • incubation times and temperature

may cause incorrect clinical results. − Reconstitute lyophilized reagents, if present, as described on the relative

labels. Any deviation in reagent use or wrong volumes, may affect the reliability of results obtained.

− In case of manual procedure, it is important to use calibrated pipettes and have appropriate technical manuals. Primary importance is a good precision preparing and dispensing the reagents. Ensure that all the equipment used is in perfect working order, has been correctly calibrated and is regularly maintained.

− Ensure that the aspiration pump or automated well washing device is in perfect working order. Inadequate rinsing of wells may cause an incorrect samples classifications. Ensure that all the equipment used is in perfect working order.

− Ensure that the microplate spectrophotometer is in perfect working order. The use of a not calibrated spectrophotometer or not clean filters may cause a wrong reading samples with consequent incorrect samples classifications. Ensure that all the equipment used is in perfect working order.

− Ensure that the dry heater (if necessary) is in perfect working order. The incubation temperature different from 37±2°C may cause a sensitivity losses and/or biological denaturation (samples and/or reagents). Ensure that the equipment used is in perfect working order and periodically check the recorded temperature.

− Ensure that the microplate shaker (if necessary) is in perfect working order. Incorrect agitation may cause wrong samples classifications. Ensure that the equipment used is in perfect working order.

− Ensure that all the equipment used for samples storage and/or the system is in perfect working order. The storage at different suggested temperature may cause biological material denaturation (samples and/or reagents). Ensure that the equipment used is in perfect working order and periodically check the recorded temperature.

− Utilise a suitable method for the correct identification of patient samples. Incorrect identification may cause a specificity losses of the system and wrong clinical results.

In order to avoid personal and environmental contamination, the following precautions must be observed: − Use disposable gloves while handling potentially infectious material and while

performing the assay. − Do not pipette reagents by mouth. − Do not smoke, eat, drink or apply cosmetics during the assay. − Chromogen and Blocking Reagent should be handled with care. Avoid contact

with skin, eyes and mucous membranes. In case of accident rinse thoroughly with running water.

− All material of human origin used for the preparation of this kit tested negative for HBsAg, anti-HIV and anti-HCV. Since no test at present can guarantee


complete absence of these viruses, all samples and reagents containing biological material used for the assay must be considered potentially infectious.

− Avoid splashing and aerosol formation; in such cases, carefully wash with a 3% sodium hypochlorite solution. Any such cleaning material must be treated as potentially infectious and disposed of accordingly.

− Some reagents contain sodium azide as preservative; to prevent build-up of explosive metal azides in lead and copper plumbing, reagents should be discarded by flushing the drain with large amounts of water.

− According to Italian decree D.L. no. 22 dated 05.02.97, in compliance with EEC directives (91/156/EEC, 91/689/EEC, 94/62/EEC), all waste products originating from either manual and/or automated processing are classified as hazardous special waste material (European classification code180103). As such, they must be eliminated by delegating to special enterprises, qualified for waste collection and disposal.

6. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION The assay can be performed in serum or plasma samples. Moderately lipemic samples do not influence the results; highly lipemic or hemolyzed samples may affect the results. The presence of fibrin filaments could interfere with the assay; make sure that samples are always perfectly clear before testing. Keep samples properly stored at 2-8°C for 1 week; for longer periods it is advisable to freeze samples at -20°C. Repeated freezing and thawing of samples should be avoided. Before use, dilute samples 1:300 with diluted Sample Diluent (see REAGENTS). Example: 10 µL sample + 2990 µL diluent. 7. ASSAY PROCEDURE * − Allow reagents and samples to warm up at room temperature. − Mix samples by inversion before use. 7.1 Prepare the wells for: Blank, Controls or Calibrators and Samples. 7.2 Pipette 100 µL of Controls or Calibrators and diluted Samples into the

corresponding wells. Note: Controls and Calibrators must not be diluted.

7.3 Pipette 100 µL of diluted Sample Diluent into the Blank well. 7.4 Cover the microplate with adhesive sheet (supplied with the kit) and

incubate for 60±5 minutes at 37±2°C. 7.5 Wash the wells 3 times with 350 µL of diluted Washing Solution. Aspirate all

liquid from the wells. 7.6 Add 100 µL of Enzyme Conjugate into all wells. 7.7 Cover the microplate with adhesive sheet (supplied with the kit) and

incubate for 30±2 minutes at 37±2°C. 7.8 Wash the wells as described in point 7.5. 7.9 Pipette 100 µL of Chromogen into all wells.


7.10 Incubate the wells for 10 minutes at 37±2°C or 15 minutes at room temperature (18-25°C). Avoid direct light exposure.

7.11 Pipette 100 µL of Blocking Reagent into all wells. 7.12 Read the absorbance of the wells with a preferably bichromatic

spectrophotometer at 450 nm, with reference wavelength at 620 nm (setting the instrument at zero with the Blank well). In case of overflow absorbance values, read at 405 nm. Reading must be completed within 15 minutes from the end of the assay.

* While using for the procedure a RADIM and/or SEAC automatic instrument for microplates, refer to its relative manual. 8. ASSAY SCHEME: see p. 22 9. CALCULATION OF RESULTS* 9.1 Qualitative Assay The optical density of each negative control and cut-off calibrator (15 UR/mL threshold value) must be considered. The presence or absence of anti-H. Pylori IgG antibodies is defined by comparing the sample absorbance with the absorbance of the Cut-off Control (threshold value). Samples with optical density lower than the 15 UR/mL calibrator (cut-off calibrator) are to be considered non-reactive for anti-H. Pylori IgG antibodies. Samples with optical density higher than the cut-off calibrator are to be considered reactive for anti-H. Pylori IgG antibodies. Samples with absorbance values ranging within ± 10% of the cut-off calibrator are to be considered questionable and should be retested for confirmation. 9.2 Quantitative Assay The negative control is to be taken as the first point of the calibration curve, (value 0 UR/mL) and thus as part of the curve. Draw a calibration curve on linear graph paper, by plotting the calibrator concentrations (x-axis) against the absorbances obtained for each calibrator (y-axis). Corresponding anti-H. Pylori IgG concentrations in UR/mL are obtained by interpolating the absorbance of each sample on the calibration curve. − Samples with IgG values less than 15 UR/mL must be considered non-reactive

for anti-H. Pylori IgG antibodies. − Samples with IgG values higher than 30 UR/mL must be considered reactive

for anti-H. Pylori IgG antibodies. − Samples with IgG values between 15 UR/mL and 30 UR/mL must be

considered weakly reactive.


* While using a RADIM and/or SEAC automatic instrument for microplates, the spectrophotometric reading will be performed automatically at 3 different wavelengths: 450, 405 and 620 nm, thereby allowing a wider curve range. 9.3 Calculation Example The following values must be considered as an example and should not be used in place of experimental data. Description Absorbance 450 nm IgG anti-H. pylori Calibrator 0 UR/mL 0.010 Calibrator 15 UR/mL 0.600 Calibrator 30 UR/mL 1.100 Calibrator 60 UR/mL 1.750 Calibrator 120 UR/mL 2.250 Sample 1.830 70 UR/mL Note: Negative Control = Calibrator 0 UR/mL. By Interpolation on the calibration curve, the sample exhibits a titer of 70 UR/mL for anti-H. Pylori IgG. 9.4 Validation Criteria Before proceeding in calculating the results, make sure the control absorbances are included within the following expected values: Description Expected values Negative Control < 0.100 OD Cal 120 UR/mL / OD Cal 15 UR/mL > 2.3 OD Cal 15 UR/mL / OD Cal 0 UR/mL > 1.94 If the values obtained are not as expected, it will be necessary to repeat the assay. 9.5 Interpretation of Results − Non-reactive samples are to be considered negative for anti-H. Pylori IgG

antibodies. − Reactive and/or weakly reactive samples are to be considered positive for anti-

H. Pylori IgG antibodies. Subsequent blood-drawls of the same patient can be compared only if tested in the same assay. In this case, a 60% absorbance variation in the 2nd sample can be considered a significant indication of a recent or in progress infection. High anti-Helicobacter pylori IgG titers may point to a recent or in progress infection. In fact, a positive result may confirm the diagnosis of gastritis or duodenal ulcer, previously suspected by clinical data. In addition, IgG testing represents a rapid and effective tool for monitoring of drug therapy. A decrease in IgG levels may occur during treatment, with elimination of the microorganism. 10. PERFORMANCES OF THE ASSAY


10.1 Diagnostic Specificity The diagnostic specificity of the method was evaluated over a representative group of individuals with no immunity against H. Pylori infection. The result was 96.2%. 10.2 Diagnostic Sensitivity The diagnostic sensitivity of the method was evaluated over a representative group of individuals having undergone past H. Pylori infection. The result was 95.8%. 10.3 Precision Precision was evaluated determining the repeatability and the reproducibility of the assay (intra- and inter-assay variability), on 3 sera at different anti-H. Pylori IgG concentrations. Repeatability (Intra-assay)

Serum Mean ± S.D. C.V. Replicates (RU/mL) % no.

a 7.8 ± 0.44 5.6 12 b 45.9 ± 2.06 4.5 12 c 97.7 ± 2.87 2.9 12

Reproducibility (Inter-assay) Serum Mean ± S.D. C.V. Assays

(RU/mL) % no. a 47.8 ± 4.5 9.4 10 b 86.06 ± 7.7 9.0 10 c 126.05 ± 11.7 9.3 10

11. LIMITS OF THE ASSAY This test is only for screening purposes. Diagnosis of gastritis and peptic ulcer must be confirmed by clinical evaluation and further diagnostic testing. In case of illness, a rapid intervention will considerably reduce the risks. 12. SYMBOLS LEGEND: see p. 20


SIMBOLI, SYMBOLS, SYMBOLES, SÍMBOLOS, SÍMBOLOS, SYMBOLE, ΣΥΜΒΟΛΑ, SYMBOLIT, SYMBOLER

EN 980 - EDMA

REF Codice di riferimento o di ordine / reference or order code / Référence ou

numéro de commande / referencia o número de pedido / referência ou número da encomenda / Referenz oder Bestellnummer / κωδικός προϊόντος ή παραγγελίας / Refarans veye sipariş numarsı / referenční nebo objednací číslo

LOT Lotto / lot / Lot / lote / lote / charge / παρτίδα / parti / šarže

Data di scadenza / expiry date / date d’expiration / Fecha de caducidad / Data de vencimento / Verfallsdatum / Ηµεροµηνία λήξης / Son kullanma targhi / datum expirace

IVD Per uso diagnostico in-vitro / For in-vitro diagnostic use / Pour diagnostic in-vitro / Para uso diagnóstico In-vitro / aplicação do diagnóstico In-vitro / Für den Gebrauch in der IN-VITRO-DIAGNOSTIK / για in vitro διαγνωστική χρήση / in –vitro diagnostik kullanım / pro použití in-vitro

Marcatura CE secondo le direttive IVD 98/79/CE / CE marking according to IVD guidelines 98/79/EC / marquage CE conforme aux directives IVD 98/79/EC / marcado CE según directiva de IVD 98/79/CE / marcação-CE segundo a directriz-IVD 98/79/CE / CE-Markierung bei Erfüllung der IVD Richtlinie 98/79/EG / Σηµανση CE βάσει κοινοτικής οδηγίας IVD 98/79/EC / 98/79/EC IVD tüzüğüne göre CE işareti / CE označení dle IVD 98/79/EU

Conservare a 2-8°C / keep at 2-8°C / conserver à 2-8°C / Conservar a 2-8°C / conservar a 2-8°C / Lagerung bei 2-8°C / φύλαξη στους 2-8°C / 2-8°C da saklayınız / skladovat při 2-8°C

Fabbricante / Manufacturer / Fabriquant / produzido por / Fabricante / produkt der / κατασκευάζεται από / tarafından üretilmiştir / výrobce

Rischio biologico / Biohazard / Risque Biologique / Riesgo Biológico / Risco Biológico / Bιολογικός κίνδυνος / Riziko tehlike biyolojik/ Biologicky nebezpečné

Consultare la metodica operativa / consult instructions for use / consulter le mode opératoire / consultar las instrucciones de uso / consultar as instruções de uso / Schauen Sie die Arbeitsanleitung an / συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης / kullanımda başvurulacak bilgiler / Sledujte návod k použití

Sufficiente per 96 test / sufficient for 96 tests / suffisant pour 96 déterminations / suficiente para 96 determinaciones / Componentes para 96 testes / genügend für 96 Tests / επαρκεί για 96 τεστ / 96 test için

96


yeterli / dostačující pro 96 testů

RDATE Data di Riferimento / Reference date / Date de référence / Fecha de referencia / Data de refêrencia / Referenzdatum / ημερομηνία βαθμονόμησης / Referans Targhi / referenční datum

RCNS Ricostituire con / reconstitute with / reconstituer avec / reconstituir con / reconstituir com / rekonstituiren mit / ανασυστάται με / ile karıştırma / rekonstituovat

H2O Acqua distillata o deionizzata / deionized or distilled water / eau deionisée ou distillée / agua destilada o desionizada / água destilada ou deionizada / Deionisiertes oder Destilliertes Wasser / απιονισμένο -απεσταγμένο νερό / deiyonize veya distile su / deionizovaná nebo destilovaná voda


8. SCHEMA DEL DOSAGGIO - ASSAY SCHEME Prediluizione del campione, Sample predilution: 1/300

Pozzetti, Wells

Bianco, Blank

CAL NEG

Campioni, Samples

Reag. CAL NEG

----- 100 µL -----

Campioni, Samples ----- ----- 100 µL DIL 100 µL ----- -----

− Incubare, Incubate: 37±2°C, 60±5 min. − Aspirare e Lavare, Aspirate and Wash: 3 x 350 µL.

CONJ 100 µL 100 µL 100 µL

− Incubare, Incubate: 37±2°C, 30±2 min. − Aspirare e lavare, Aspirate and wash: 3 x 350 µL.

TMB 100 µL 100 µL 100 µL

− Incubare, Incubate: 37±2°C, 10'; o, or T.A. / R.T. 15'

STOP 100 µL 100 µL 100 µL

− Leggere, Read: 450-405 nm.


BIBLIOGRAFIA - REFERENCES 1 - Goodwin C.S. et al. Campylobacter pyloridis, gastritis and peptic ulceration.

J. Clin. Pathol. 1986;39: 353-356. 2 - Marshall B.J. et al. Pyloric Campylobacter infection and gastroduodenal

disease. Med. J. Aust. 1985; 142: 439-444. 3 - Rauws, G.N.J. Tytgat "Guarigione dell'ulcera duodenale associate

all'eliminazione dell'Helicobacter pylori". The Lancet (ed. It.) vol. 7 n.8, 413-414 (1990).

RADIM S.p.A. - Via del Mare, 125 - 00040 Pomezia (Roma) Italia

Tel.: +39 06 91.249.1 - Fax: +39 06 91.249.443 National Order Entry: +39 06 91.249.702 Export Department: +39 06 91.249.701 Customer Care: +39 06 91.249.700 [email protected] - www.radim.com

helicobacter pylori igg - radim.comradim.com/userfiles/file/metodiche/inglese/k5hpg.pdf ·...

Documents