HAPLOİD BİTKİ ÜRETİMİ

Doç.Dr. Yıldız AKA KAÇAR

Somatik hücrelerindeki kromozom sayısı, ait olduklarıbitki türünün gamet hücrelerinde bulunan kromozomsayısı kadar olan bitkilere haploid bitkilerdenmektedir.

Haploidler, her bir lokustaki allelerden sadece bir seriyiiçermekte ve bu özellikleri ile ıslah çalışmalarındaiçermekte ve bu özellikleri ile ıslah çalışmalarındaönemli yer tutmaktadırlar.

Haploid bitkilerin kromozom sayılarının katlanmasısayesinde %100 homozigot saf hatlar eldeedilebilmektedir.

� Haploid bitkilerin elde edilmesinde kullanılan başlangıçmateryalleri gametlerdir.

� Esas olarak, haploidlerin elde edilebilmesi için ikiyöntem bulunmaktadır;

- ya erkek gametten ya da- dişi gametten in vitro koşullarda bitki oluşumunu

sağlanabilmektedir.

ERKEK GAMETTEN HAPLOİD BİTKİ ELDE ETME (ANDROGENESİS)In vitro kültüre alınan genç anterlerden haploidlerin

başarıyla oluşturulması ilk kez 1964 yılında Daturastramonium bitkisinde Guha ve Maheshwaritarafından gerçekleştirilmiştir.

1967 yılında Bourgin ve Nitsch’in tütün bitkisinde anter1967 yılında Bourgin ve Nitsch’in tütün bitkisinde anterkültür yoluyla haploid embriyolar elde etmesindensonra, özellikle ekonomik önemi fazla olan tahıllar,sebzeler ve şeker pancarı başta olmak üzeregünümüze değin pek çok bitki türünde anter kültürüyoluyla haploid eldesi üzerinde çalışmalar yapılmış ve25 familyaya ait 200 bitki türünde in vitroandrogenesis tekniğinden başarılı sonuçlar eldeedilmiştir.

ANTER KÜLTÜRÜNÜN YAPıLıŞı

Henüz olgunlaşmamış ve içerisinde birinci polenmitozu aşamasına gelmiş tek çekirdeklimikrosporları bulunduran anterler, anter kültürüiçin uygun başlangıç materyalidir.

Belirlenen aşamadaki anterleri bulunduran çiçekBelirlenen aşamadaki anterleri bulunduran çiçektomurcukları, yüzeysel dezenfeksiyon işleminetabi tutulduktan sonra steril koşullardatomurcukların içerisinden çıkartılan anterler,önceden hazırlanmış ve otoklavlanarak sterilizehale getirilmiş besin ortamlarının üzerineyerleştirilmektedir.

Çoğunlukla petri kutularına, agarla katılaştırılmışbesin ortamlarına yerleştirilen anterlerin dikimişlemi tamamlandıktan sonra petri kutularınınkenarları bir film şeritle kapatılarak herhangi birenfeksiyona karşı, dış ortamdaki atmosferle olanilişki kesilmektedir.ilişki kesilmektedir.

Petri kutuları içerisindeki anterler inkübasyon içindeğişik koşullara alınabilmekte, tütün gibi anterkültürüne son derece olumlu yanıt verenbitkilerde 24-28oC sıcaklıkta ve fotoperiyodikbir düzende aydınlatılan bir iklim dolabındayapılan inkübasyon yeterli olmaktadır.

� Androgenesis direkt ve indirekt androgenesis olmak üzereikiye ayrılmaktadır.

� Kültürün 40. gününden sonra anterlerin içerisindenembriyolar çıkarak gözle görülebilir aşamaya ulaşmaktadır.Buna direkt androgenesis adı verilmektedir.

� Bunun dışında, bazı türlerde önce kallus oluşmakta, dahasonra kallustan organogenesis veya embriyogenesis yoluylahaploid bitkiler oluşabilmektedir.

� Bu ikinci oluşum yoluna indirekt androgenesis denilmektedir.

ANDROGENESISI ETKILEYEN FAKTÖRLER

Anter kültüründen elde edilen başarı, yani elde edilenhaploid embriyo sayısı birçok faktörün etkisi altındabulunmaktadır.

Bu faktörlerin bir bölümü, anterlerin alındığı donörBu faktörlerin bir bölümü, anterlerin alındığı donörbitkiden kaynaklanmakta olup diğer bir bölümü deanter kültürü tekniğinin uygulanması sırasındakikoşullarla ilişkilidir.

GENOTIP

� Anter kültüründe başarı, çok büyük bir orandaanterlerin alındığı bitkilerin genotipine bağlıdır.

� Şimdiye dek çalışılmış olan tüm bitki türlerinde; aynıkültür koşulları altında, anter yanıtları bakımındankültür koşulları altında, anter yanıtları bakımındangenotipler arasında büyük farklılıklar bulunmuştur.

Herhangi bir genotipten yüksek oranda haploid embriyoelde etmek için;

� her genotip için kültür koşullarını optimize etmek ve� anter kültüründe embriyo oluşturma başarısı yüksekgenotiplerle embriyo oluşturma kapasitesi düşük olangenotiplerle embriyo oluşturma kapasitesi düşük olangenotipleri melezlemek gerekmektedir.

DONÖR BITKININ YETIŞME KOŞULLARı

Donör bitkinin genotipi son derece elverişli olsabile, mikrosporlardan in vitro koşullarda haploidembriyo uyartımını başarabilmek, bu bitkilerinyetiştirildiği koşullara da bağlıdır.

Bitkilerin yetiştirildiği dönemdeki sıcaklık, ışıkyoğunluğu ve günlük ışıklanma süresi, havadakiCO2 konsantrasyonu, bitkinin beslenme koşullarıbaşta olmak üzere tüm çevresel faktörler, obitkilerden alınan anterlerden elde edilecekbaşarı üzerinde etkili olabilmektedir.

ANTERLERIN GELIŞME DÖNEMI

Çoğu bitki türünün anter kültürlerinde en iyi sonuçlar,tek çekirdekli mikrospor döneminin erken veya geçaşamasındaki mikrosporları içeren anterlerdenalınmaktadır.

Mikrosporlar içerisinde nişasta depolanmaya başladıktanMikrosporlar içerisinde nişasta depolanmaya başladıktansonra, gelişmeyi sporofitik yöne kaydırmak ve haploidembriyo elde etmek için yapılacak uyarılar etkiliolamamaktadır.

Mikrospor gelişme aşamasını belirlemek için kullanılanyöntemler;

o ezme preparasyon tekniği ve asetokarmin ile hızlı boyama

o flouresans mikroskobu ve preparat hazırlanmasında bunauygun merkürik asit, DAPI gibi boyaların kullanılmasıuygun merkürik asit, DAPI gibi boyaların kullanılması

o parafine gömerek kesit alma ve bunun ardından preparatlarıhematoksilin veya metilen mavisi gibi değişik boyalarlaboyama

ANTERLERE YAPıLAN ÖN UYGULAMALAR

Anter kültüründe en etkili ön uygulama, tomurcuklarayapılan soğuk şoklarıdır.

4-10oC’ler arasında, 72 saat ile 4 haftaya kadar tutulantomurcuklar; arpa, patates, mısır, buğday ve biber gibibazı türlerde polen rejenerasyonu bakımından olumlubazı türlerde polen rejenerasyonu bakımından olumluyanıtlar vermiştir.

Anter kültürlerde soğuk uygulamasının etkimekanizması;

� Nişasta birikiminin bloke edilmesi

� Tek çekirdekli mikrospor döneminde tutuklanan� Tek çekirdekli mikrospor döneminde tutuklananmikrospor sayısının artırılması

� Anter duvarının yaşlanmasının geciktirilmesi ve ABAgibi bazı engelleyici maddelerin etkisinin azaltılması

BESIN ORTAMıNıN BILEŞIMI VE YAPıSı

� Anter kültüründe genel olarak ilk aşamada gametofitikdokuları sporofitik gelişmeye dönüştürme yönündeuyaracak oksinler gerekli iken; bitkiciğe dönüşümaşamasında sitokininlerin varlığına gereksinim duyulur.

� Temel besin ortamı olarak, anter kültüründe en fazlaMurashige ve Skoog, White ve Nitsch ortamlarıkullanılmaktadır.

� Karbon kaynağı olarak anter kültürlerinde büyük birçoğunlukla sakkaroz kullanılmaktadır.

� Besin ortamına özellikle kültürün ilk günlerinde ilaveedilen yüksek şeker dozları (%6-12), anter kültüründenhaploidlerin elde edilmesinde olumlu etki yapmaktadır.

� Besin ortamına katılan serin, glutamin gibiaminoasitler, AgNO3 gibi etilen biyosentezini inhibeedici maddeler veya aktif kömür gibi katkı maddeleride anter kültüründen elde edilecek başarıyı artırmayönünde kullanılan çeşitli kimyasal maddeler arasındayer almaktadır.yönünde kullanılan çeşitli kimyasal maddeler arasındayer almaktadır.

İNKÜBASYON KOŞULLARı

� İnkübasyon sırasındaki ışık, ya da sıcaklık gibiçevresel koşullar anter kültüründen sağlanacak başarıüzerinde etki yapan diğer bir grup faktördür.

� Başlangıçta anterler genellikle karanlıkta ve 20 ila30oC’ler arasında kültüre alınmaktadır. Kültürünilerleyen aşamalarında düşük ışık yoğunluğu (2000 lux)ilerleyen aşamalarında düşük ışık yoğunluğu (2000 lux)ve değişik günlük ışıklanma sürelerinde bekletilenanterlerde embriyo oluşumu gerçekleştikten sonra;rejenere olan bitkicikler daha yüksek ışık yoğunluğuna(3000-10000 lux) sahip koşullara aktarılmaktadır.

� Bazı bitki türlerine ait anter kültürlerindeinkübasyonun ilk günlerinde yüksek sıcaklıkuygulamaları, embriyo oluşumu üzerinde çok olumluetki yapmaktadır.

DİŞİ GAMETTEN HAPLOİDİ UYARTIMI (GYNOGENESİS VE PARTHENOGENESİS)

Ovül ve Ovaryum Kültürleri� Döllenmemiş yumurtalığın ya da yumurta hücrelerininkültüre alınmasıyla haploid embriyo ve bitki oluşumuna‘ovaryum’ veya ‘ovül kültürleri’ adı verilmektedir.‘ovaryum’ veya ‘ovül kültürleri’ adı verilmektedir.

EKSIK VEYA YETERSIZ POLENLERLE TOZLAMA

� Partenogenetik embriyo oluşumunu uyarmak üzerekullanılacak eksik veya yetersiz polenleri elde etmekiçin, değişik kimyasal maddeler ile radyoaktif ışınuygulamalarından yararlanılmaktadır.

� Ayrıca, uzak akrabalar arası melezlemeler,tozlamaların geciktirilmesi, sıcaklık şokları datozlamaların geciktirilmesi, sıcaklık şokları dauygulanan diğer tekniklerdir.

� Polenlere yapılan bu uygulamalar sayesinde polengeneratif çekirdeği inaktif hale geçirilmekte, bununlabirlikte çimlenme yeteneğini koruyan polenler dişiciktepesi üzerinde çimlendiklerinde oluşturduklarıuyartım sonucunda, partenogenetik olarak haploidembriyolar meydana gelmektedir.

HAPLOİD BİTKİLERDE KROMOZOM KATLAMA� Haploid bitkilerin kromozom setlerinin katlanması ve % 100

homozigot safhatların hızla geliştirilmesi, haploiditekniğinin esasını oluşturmaktadır.

� Kromozom katlanması pratikte çoğunlukla kimyasal maddeuygulamalarıyla gerçekleştirilmektedir.uygulamalarıyla gerçekleştirilmektedir.

� Günümüzde kromozom katlaması için bitki ıslahçılarıtarafından en yaygın kullanılan kimyasal madde, kolhisindir.

� Kolhisin, uygulandığı dokuların hücrelerinde mitozbölünmenin metafaz safhasında iğ ipliklerinin oluşumunuengeller ve dolayısı ile replikasyona uğramış kromozomlarınkutuplara çekilmesini önleyerek, kromozom sayısının ikikatına çıkmasını sağlar.

PLOİDİ BELİRLEME

� Fenotipik Gözlemler: Bitkilerin kromozom sayısıarttıkça, bitkinin tüm organlarında bir irileşmemeydana gelmekte; buna karşılık haploid bitkilerin eldeedilmesi halinde bitkinin organları tam olarak oluştuğuhalde diploidlere göre daha küçük olmaktadır.halde diploidlere göre daha küçük olmaktadır.

� Kromozom Sayımları: Bitkilerin genellikle kökuçlarında yapılan kromozom sayımları, güvenirliliği enfazla olan yöntemdir. Sağlıklı ve güçlü bir gelişmegösteren taze kök uçlarından alınan örnekler,kromozom sayımları için en uygun materyaldir.

� Flow Sitometri: hücrelerin tek tek flouresansdedektörden geçerken emdiklerin ışının analizinedayanan bir yöntemdir.

� Her bitki türü için yöntemin optimize edilmegereksinimi, bu yöntemin dezavantajlarından birigereksinimi, bu yöntemin dezavantajlarından biriolsa da; miksoploid hücrelerin varlığının ortayaçıkartılması, bir kişinin günde 100’den fazlabitkide analiz yapabilme olanağını sunması gibiavantajları vardır.

� Stomatal İncelemeler: Değişik bitki türlerindestomaların iriliği, dolayısıyla birim alanda bulunanstoma sayısı ile ploidi düzeyi arasında güvenilir ilişkilersaptanmıştır.

� Örneğin kereviz, tütün, brüksel lahanası, havuç,karpuz, kavun, hıyar, biber ve kabakta haploidbitkilerin stomalarının diploidlerine göre daha küçükkarpuz, kavun, hıyar, biber ve kabakta haploidbitkilerin stomalarının diploidlerine göre daha küçükolduğu, dolayısıyla birim alanda daha fazla stomabulunduğu saptanmıştır.

HAPLOİDLERİN SAĞLADIĞI AVANTAJLAR1. Haploidleri kullanmanın en başta gelen avantajı, tam

bir homozigotiyi çok kısa bir sürede elde etmeolanağını sunmasıdır. Dihaploid hatlarınkullanılmasıyla genetik ve ıslah çalışmalarını yapmakkolaylaşmakta ve sonuca daha çabukulaşılabilmektedir.

2. Resesif genler, dominant genler tarafındanmaskelenemeyeceğinden, homozigot bireylerdegenetik açılımı izlemek daha basit bir işlem halinegelmektedir.

3. Homozigot bitkilerin üretimi özellikle dioik türlerdeve kendine uyuşmazlık sorunu bulunan bitkilerde zorolup anter kültürü, bu bakımdan büyük kolaylıksağlamaktadır.

4. Yabancı döllenen türlerde heterozigoti oranı çok yüksekolduğundan bunlarda homozigot hatların elde edilmesiiçin 10-12 generasyon boyunca kendilemeler yapmakgerekmekte; kendine döllenen türlerde bile aynı amaçla5-7 generasyon kendileme işlemine gereksinimduyulmaktadır.

5. F1 hibrit çeşitlerin geliştirilmesinde homozigot hatlararasında üstün kombinasyon yeteneği verenlerininbelirlenmesi yöntemi kullanıldığından, haploidinin hibritarasında üstün kombinasyon yeteneği verenlerininbelirlenmesi yöntemi kullanıldığından, haploidinin hibritçeşit ıslahında özel bir önemi bulunmaktadır.

6. Yonca ve patates gibi tetraploidlerin bulunduğu türlerdehaploidizasyon, diploid bitkilerin üretimindekullanılabilmektedir. Elde edilen diploidler ticari olarakilginç olabileceği gibi; bu yolla bazı tetraploidürünlerde; yabani türler ile kültür çeşitleri arasındadiploid seviyede melezleme yaparak kombinasyon yolunagidilmektedir.

7. Kombinasyon ıslahında da sonuca çok kısa süredeulaşmayı sağlayan haploidi sayesinde, F1kademesindeki melez bitkilerden haploid çekerek;farklı genotiplerde bulunan ve tek bir genotiptetoplanması arzu edilen özelliklere sahip bitkilerkazanmak mümkündür.

8. Haploidi, resesif mutasyonların açığa çıkartılması ve8. Haploidi, resesif mutasyonların açığa çıkartılması vebunlardan homozigot bireylerin elde edilmesini desağlayabildiği gibi; somatik hibridizasyon işleminindiploid protoplastlara göre daha kolay yapılabilmesineolanak tanımaktadır. Ayrıca iki haploid protoplastınbirleşmesinin sonucu “diploid” olacağından; protoplastkültürü kullanılarak yapılan somatik hibridizasyontekniğinin bilinen dezavantajlarının büyük bir kısmıböylece ortadan kalkacaktır.

9. Anter kültürünün tüm bitkilere genellenemeyecek,türlere özgü bazı avantajları da bulunmaktadır.Örneğin kuşkonmaz bitkisinde XY kromozom yapısınasahip erkek bitkilerden anter kültürü yoluyla DHhatlar elde edildiğinde XX ve YY kromozom yapısındabireyler oluşmaktadır. Böylece doğada oluşma olasılığıhatlar elde edildiğinde XX ve YY kromozom yapısındabireyler oluşmaktadır. Böylece doğada oluşma olasılığıbulunmayan YY kromozom yapısına sahip bitkiler, yada diğer bir deyişle süper erkek bitkiler eldeedilebilmektedir.

10. DH hatların güncel uygulamalarından biri de genharitalarının çıkartılmasında kullanımlarıdır. DHhatlardan oluşan bir populasyonda; heterozigotinedeniyle ortaya çıkan intermediyerekspresyonlara rastlanmaz. Bu nedenle defenotipik işaretleyicilerin (marker)tanımlanması çok daha etkin olabilmektedir. DHtanımlanması çok daha etkin olabilmektedir. DHhatlarda herhangi bir gen, ister bitki istersemarker seviyesinde olsun (genellikle RFLP ilebelirlenmektedir); 1:1 oranında açılacaktır. Budurum, özellikle poligenik olarak kontrol edilenbir karakterin haritası çıkartılıyorsa önemtaşımakta ve kolaylık sağlamaktadır.

SUNUMUN EKLENDIĞI SITELER

www.bahcebitkileri.org

www.bahcebitkileri.org/bitkibiyoteknolojisi