gram posit y negativ
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Universidad Nacional del Callao
Facultad de Ingeniería Química
Curso: Laboratorio de Microbiología
Profesora: Ing. Sonia Herrera
Integrantes:
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2014
Identificación de Bacterias
Identificación de BacteriasI. OBJETIVO:
Identificar bacterias Gram positivas y Gram negativas.
II. FUNDAMENTO TEÓRICO:
TINCION DE GRAM
La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en
microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su
nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se
utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder
realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose
Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram
negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo.
Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de
las bacterias Gram positivas y Gram negativas.
La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de
peptidoglucano, además de dos clases de ácidos teicoicos: Anclado en la cara interna de
la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el ácido lipo-teicoico, y
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más en la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglucano
(también conocido como mureína).
Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se
encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a
la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a
una membrana exterior por lipo-proteínas. La membrana exterior está hecha de
proteína, fosfolípido y lipo-polisacárido.
Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas
diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material
que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en
mucha mayor proporción que las Gram negativas.
La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la
membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por
ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es
demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se
formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración
azul-violácea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más
resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del
solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que
impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la
coloración azul-violácea.
BACTERIA GRAM NEGATIVA
En microbiología, se denominan bacterias Gram negativas a aquellas bacterias que no se
tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram, y lo hacen de un color rosado
tenue: de ahí el nombre de "Gram-negativas" o también "gran negativas".
Esta característica está íntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular, por lo
que refleja un tipo natural de organización bacteriana. Son uno de los principales grupos
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de bacterias y cuando se tratan como taxón se utiliza también el nombre de Negi-
bacteria. Las restantes son las bacterias Gram positivas.
Las bacterias Gram-negativas presentan dos membranas lipídicas entre las que se localiza
una fina pared celular de peptidoglicano, mientras que las bacterias Gram-positivas
presentan sólo una membrana lipídica y la pared de peptiglicano es mucho más gruesa.
Al ser la pared fina, no retiene el colorante durante la tinción de Gram.
Muchas especies de bacterias Gram-negativas causan enfermedades. Los cocos Gram-
negativos causan la gonorrea (Neisseriagonorrhoeae), meningitis (Neisseriameningitidis)
y síntomas respiratorios (Moraxellacatarrhalis), entre otros. Los bacilos Gram-negativos
incluyen un gran número de especies. Algunos de ellos causan principalmente
enfermedades respiratorias (Haemophilusinfluenzae, Klebsiellapneumoniae ,
Legionellapneumophila, Pseudomonasaeruginosa), enfermedades urinarias
(Escherichiacoli, Proteusmirabilis, Enterobactercloacae, Serratiamarcescens) y
enfermedades gastrointestinales (Helicobacter pylori, Salmonella enteritidis, Salmonella
typhi). Otros están asociadas a infecciones nosocomiales (Acinetobacterbaumanii).
Estructura
La envoltura celular de las bacterias Gram-negativas está compuesta por una membrana
citoplasmática (membrana interna), una pared celular delgada de peptidoglicano, que
rodea a la anterior, y una membrana externa que recubre la pared celular de estas
bacterias.[] Entre la membrana citoplasmática interna y la membrana externa se localiza
el espacio periplásmico relleno de una sustancia denominada periplasma, la cual
contiene enzimas importantes para la nutrición en estas bacterias.
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La membrana externa contiene diversas proteínas, siendo una de ellas las porinas o
canales proteicos que permiten el paso de ciertas sustancias. También presenta unas
estructuras llamadas lipo-polisacáridos (LPS), formadas por tres regiones: el polisacárido
O (antígeno O), una estructura polisacárida central (KDO) y el lípido A (endotoxina).
BACTERIA GRAM POSITIVA
En microbiología, se denominan bacterias Gram positivas a aquellas bacterias que se
tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram: de aquí el nombre de "Gram-
positivas" o también "gran positivas".[] Esta característica está íntimamente ligada a la
estructura de la envoltura celular por lo que refleja un tipo natural de organización
bacteriana. Son uno de los principales grupos de bacterias, y cuando se tratan como
taxón se utiliza también el nombre de Posi-bacteria.[] Las restantes son las bacterias Gram
negativas.
La envoltura celular de las bacterias Gram-positivas comprende la membrana
citoplasmática y una pared celular compuesta por una gruesa capa de peptidoglicano,
que rodea a la anterior. La pared celular se une a la membrana citoplasmática mediante
moléculas de ácido lipo-teicoico. La capa de peptidoglicano confiere una gran resistencia
a estas bacterias y es la responsable de retener el tinte durante la tinción de Gram. A
diferencia de las Gram-negativas, las Gram-positivas no presentan una segunda
membrana lipídica externa a la pared celular y esta pared es mucho más gruesa.[]
Incluyen especies tanto móviles (vía flagelos) como inmóviles con forma de bacilo
(Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Lactobacillus, Listeria) o coco (Staphylococcus,
Streptococcus); con gruesas paredes celulares o sin ellas (Mycoplasma). Algunas especies
son fotosintéticas, pero la mayoría son heterótrofas. Muchas de estas bacterias forman
endosporas en condiciones desfavorables.[] Realmente, no todas las bacterias del grupo
son Gram-positivas (no se tiñen por la aplicación de ese método), pero se incluyen aquí
por su similitud molecular con otras bacterias Gram-positivas.
La célula bacteriana está rodeada por una envoltura que, observada al microscopio electrónico, se presenta como una capa gruesa y homogénea, denominada pared celular.
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Luego en sección (corte) se observa una estructura semejante a dos líneas paralelas separando una capa menos densa; esto corresponde a la membrana plasmática. Entre la membrana plasmática y la pared celular se encuentra el peri-plasma o espacio peri-plasmático. En el interior de la membrana plasmática se encuentra el citoplasma que está constituido por una disolución acuosa, el citosol, en el cual se encuentran ribosomas y otros agregados de macromoléculas, y en el centro se ubica la zona menos densa llamada nucleoide, que contiene una madeja de hebras difícil de resolver (distinguir) y cuyo principal componente es el ADN.
La pared externa de la envoltura celular de una bacteria Gram positiva tiene como base
química fundamental el peptidoglicano, que es un polímero de N-acetil-2-D-glucosamina,
unido en orientación ß-1,4 con N-acetil murámico, a éste se agregan por el grupo lactilo
cuatro o más aminoácidos. Esta molécula se polimeriza gran cantidad de veces, de modo
que se forma una malla especial, llamada sáculo de mureína. Dicho compuesto es de vital
importancia para conservar la forma y darle rigidez a la célula bacteriana (si este
compuesto no existiese, la célula reventaría debido a su gran potencial osmótico).
Las siguientes características están presentes generalmente en una bacteria Gram-
positiva:
Membrana citoplasmática.
Capa gruesa de peptidoglicano.
Ácidos teicoicos y lipo-teicoicos, que sirven como agentes quelantes y en ciertos
tipos de adherencia.
Polisacáridos de la cápsula.
Si algún flagelo está presente, este contiene dos anillos como soporte en oposición a los
cuatro que existen en bacterias Gram-negativas porque las bacterias Gram-positivas
tienen solamente una capa membranal.
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III. MATERIALES E INSTRUMENTOS:
- Mechero Bunsen
- Asa de siembra esterilizada
- Pipetas
- Lugol
- Lavado con acetona: agua (80) y acetona (20)
- Violeta
- Safranina
- Placas portaobjeto
- Agua destilada
IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:
Se usaron microorganismos de las siguientes muestras:
PREPARACION DE LA MUESTRA1. - Limpiar las placas portaobjetos , dejarlo secar, una vez seco pasarlo por el mechero 2 o 3 veces. 2.- Calentar el asa de inoculación hasta que este al rojo 3.- Tomar la porción de la muestra que se va a examinar por medio de un asa. 4.- Colocar la muestra sobre un portaobjetos limpio y sin grasa ***Como la muestra está en un medio sólido, colocar una gotita de agua destilada sobre el portaobjetos. 6.- Extender con el asa la gotita para obtener un frotis delgado y uniforme. Secar al aire. 7.- Calentar nuevamente el asa para esterilizarla.Laboratorio de Microbiología Página 6
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8.- Fijar con calor suave sobre la flama del mechero, pasándolo a través de la llama con la muestra hacia arriba, de tal forma que pueda tolerarlo sobre el dorso de la mano.
PASOS A SEGUIR EN LA TÉCNICA DE GRAM 1.- Preparar las placas con el microorganismo retirado de Manitol Salado y Mueller. 2.- Cubrir con cristal violeta (una gota) durante un minuto. 3.- Lavar los portaobjetos con una corriente suave de agua. 4.- Cubrir los frotis con yodo – lugol durante 1 minuto. 5.- Lavar como se indicó en el paso (4). 6.- Decolorar con acetona hasta que no escurra líquido azul. 7.- Lavar inmediatamente como se hizo en el paso (4). 8.- Cubrir el frotis con safranina durante 1 minuto.
V. RESULTADOS Y CONCLUSIONES:
Muestra Resultado Foto Conclusiones
Microorganismos obtenidos del
Manitol Salado y Mueller
Tinción de Gram color
azul
Debido a que las muestras
quedaron teñidas de color azul, podemos decir que son
bacterias Gram Positivas
VI. RECOMENDACIONES:
Se debe extraer una muestra pequeña y extenderla con mucho cuidado hasta
conseguir una capa fina.
Al sellar la muestra acercándola a la llama del mechero, evitar que se caliente
demasiado, para no afectar la estructura y forma normal de los
microorganismos.Laboratorio de Microbiología Página 7
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VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
http://frootlupiz.blogspot.com/2009/11/bacterias-gram-positivas-y-gram.html
http://media.axon.es/pdf/65248.pdf
http://es.slideshare.net/ms_cgabriel/identificacin-bacteriana-microbiologia-presentation
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