Nouveaux tests globaux de l’hémostase:

génération de thrombine, thromboélastogramme, microparticules

ARL 16/03/06

Nouveaux tests globaux de l’hémostase

• Mesure de la génération de thrombine dans le plasma pauvre en plaquettes (PPP) et le plasma riche en plaquettes (PRP)

• Thromboélastogramme: étudie le sang total

• Mesure des microparticules procoagulantes dans le sang

Pourquoi des nouveaux testsen hémostase ?

• Les tests d’exploration de l’hémostase que nous utilisons ont une performance limitéeet un caractère statique.

• La thrombomoduline et les autres partenaires du pool vasculaire sont absentsde ces tests.

• Nous avons besoin de tests plus proches de la réalité physiologique.

La réalité physiologique

K.G. Mann et al. BCMD 2006

hémostase primaire (plaquettes)

hémostase secondaire (coagulation)

CAILLOT

Formation du caillot

hémostase tertiaire(fibrinolyse)

Lésion de l’endothélium

Sous-endothélium

1. Adhésion plaquettaire

2. Activation plaquettaire

3. Agrégation plaquettaire

Hémostase primaireHémostase primaire

Lésion de l’endothélium

Sous-endothélium

Coagulation Fibrinogène FibrineThrombine

Hémostase secondaireHémostase secondaire

Fibrinogène

Fibrine

Prothrombine

Thrombine

F X

F Xa

Facteur tissulaireF VIIa

Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI)

TFPI/FXa

Initiation de la coagulationInitiation de la coagulation

Clou plaquettaire primaire

Fibrine liée à la thrombine

Amplification de la coagulationAmplification de la coagulation

Activation de plus de plaquettes

F X

F Xa

ThrombineProthrombine

F XaF Va

Complexe prothrombinase

Complexe tenase

F VIIIaF IXa

Antithrombine

Génération de plus de fibrine

F V et F VIII

FIXa

Membrane plaquettaire

FVIIIa

F XIII

F XIIIa

Stabilisation du caillot

Voie de la protéine C

thrombomoduline

PC

Va

V

X

prothrombine

Xa

VIIIaIXa

thrombine

VIII

APC

PS

activation

inhibition

Les complexes procoagulants et anticoagulants vitamine K dépendants et

leurs régulateurs

K.G. Mann et al. BCMD 2006

Cascade de la coagulation

Mesure de la génération de thrombine

• initialement développé en 1953

• renouveau important car: automatisation de sa technique et informatisation des résultats

• mime les mécanismes de coagulation physiologiques

Thrombogram-Thrombinoscope

Comparaison avec les tests de coagulation classiques

• Les temps de coagulation:-temps ou taux de prothrombine, TP-temps de thromboplastine partielle activée, aPTT

sont utilisés en routine pour pour évaluer la coagulation de manière globale

• MAIS, ces tests ne mesurent pas la génération de thrombine, car au moment ou la caillot est formé, seulement 3% de la prothrombine est activée

La mesure de la génération de thrombine

• Méthode de base ancienne et établie dans le domaine de la recherche sur la coagulation,

• décrit toutes les phases du processus de génération de thrombine

• Thrombogram-Thrombinoscope (Hemker):méthode automatisée utilisant un substrat chromogène (usage d’un Fluoroscan de Thermo®)

• CEPENDANT: une standardisation des conditions pré-analytiques et de la méthode est nécessaire avant son introduction en routine

La mesure de la génération de thrombine

• On peut utiliser du PPP et du PRP• Intérêt dans l’investigation d’une diathèse

hémorragique• MAIS AUSSI dans les états

hypercoagulables• Utile aussi pour évaluer les troubles de la

fonction plaquettaire

MAIS les conditions pré-analytiquesdoivent être standardisées

Le vide peut créer une activation des plaquettes et une diminution de la sensibilité à la protéine C activée

Changements visibles immédiatement après la prise de sang, variabilité entre les donneurs

V. Régnault et al. Thrombosis Research 2004, 114:539-545

0

50

100

150

200

thro

mbi

ne(n

M)

temps (min)temps (min)00 1010 2020

Xalibrelibre

Phase d’initiationPhase d’initiation

/ FTFTVIIaPhase de neutralisation

Phase de neutralisation

[[activation des plaquettes, du FVIII et du FVactivation des plaquettes, du FVIII et du FVPREMIÈRES TRACESDE THROMBINE

Formation du caillotFormation du caillot

Phas

e de

pro

paga

tion

Phas

e de

pro

paga

tion

PROTHROMBINASE

TENASEIXa+VIIIa+ PS

Activation du TAFI* en TAFIa* Thrombine Activatable Fibrinolysis Inhibitor

L’activation du TAFI en TAFIa rend le caillot plus résistant à sa dissolution (fibrinolyse).

Grigoris T. Gerotziafas, Meyer M. Samama 2004

Génération de thrombine après activation de la voie dufacteur tissulaire dans un plasma riche en plaquettes

(D ’après C. Hemker et K. Mann)

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thro

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M)

temps (min)temps (min)00 1010 2020

Grigoris T. Gerotziafas, Meyer M. Samama 2004

+ FT (5 pM)+ FT (5 pM)

Temps de latence

CmaxTmaxTemps de latenceCmaxTmaxETP*

3,5± 1 min200 ± 30 nM9 ± 2 min1500 ± 100 nMxmin

Valeurs normales

Endogenous Thrombin Potential: « Man hours» of thrombin activity (Hemker 1993)ETP

Temps correspondant aux TP ou aPTT

Génération de thrombine après activation de la voie dufacteur tissulaire dans un plasma riche en plaquettes

(D ’après C. Hemker et K. Mann)

Déficits en facteurs de la coagulation, déficits plaquettairesPourquoi des hémorragies ?

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thro

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M)

temps (min)temps (min)00 1010 2020

FT (10FT (10--25pM)25pM)

Phas

e de

pro

paga

tion

Phas

e de

pro

paga

tion

NN

Phase de stabilisation

Phase de stabilisation

initiationinitiationcaillot N. hémophiles

def. plaquettaires

caillot lâche(déficits)

Effet des contraceptifs oraux sur la génération de thrombine

K.G. Mann et al. BCMD 2006

Influence d’un inhibiteur du facteur Xa sur la génération de thrombine

K.G. Mann et al. BCMD 2006

Phénotype d’un déficit constitutionnel en antithrombine

CONTROL Déficit en antithrombine

V. Régnault et al. Thrombosis Research 2004, 114:539-545

Phénotype d’un déficit constitutionnel en protéine C

CONTROL Déficit en protéine C

Thromboéleastogramme (Haemoscope®)

Thromboélastogramme (1)

• Développé en 1948• Utilisé comme outil de recherche depuis• Plus récemment: guide pour décider de

l’administration des transfusions durant la transplantation hépatique et la chirurgie cardiaque

Thromboélastogramme (2)• donne une impression globale de la coagulation,• nous fournit des données sur le caillot après le

début de la formation de fibrine,• reflète l’interaction entre les plaquettes, la

cascade de la coagulation et la fibrinolyse,• mesure aussi la fermeté du caillot,• TEG standard et TEG modifié par une héparinase

(inactive l’héparine).

Thromboéleastogramme

Mesure des microparticules procoagulantes dans le sang

Que sont les microparticules du sang ?

• Observées pour la première fois dans le sang en 1967 par P. Wolf : « poussière de plaquettes »

• 1988-1991: génération des microparticules durant l’activation plaquettaire (P.S. Sims et S.J. Shattil)

• Ces microparticules plaquettaires sont procoagulantes: lient le facteur Va et soutiennent l’activité prothrombinase ainsi que la liaison du facteur VIII

Depuis, des centaines d’études ont étépubliées sur les microparticules du sang…

• La plupart du temps, les microparticules sont mesurées par cytométrie de flux

• Même si la plupart des microparticules sont issues des plaquettes sanguines, certaines dérivent des cellules endothéliales, des leucocytes, des cellules musculaires lisses ou des érythrocytes, par exemple

• Leur distribution et leur nombre peut varier dans le sang en fonction des conditions physiologiques et pathologiques

Les microparticules procoagulantes

• Dérivées des plaquettes, des cellules endothéliales et des leucocytes

• Les microparticules plaquettaires riches en phosphatidylsérine fournissent une surface procoagulante pour la génération de thrombine

• Les microparticules endothéliales pourraient être associées à certains états hypercoagulables

• Peuvent aussi être issues des cellules tumorales

Facteur tissulaire circulant (contenu dans les microparticules)

N. Mackman, BCMD 2006

Définition d’une microparticule du sang et limite des méthodes de

mesure habituelles• diamètre < 1 µm (200-800 nm)• vu sa taille, elle se confond avec le bruit de fond

électronique lorsqu’elle est comptée par cytométrie de flux

• La cytométrie de flux par la méthode du « light scattering » ne peut pas déterminer la taille d’une particule quand la taille de cette particule est du même ordre de grandeur que la longueur d’onde du laser utilisé (488 nm)

Mesure des microparticules sanguines dans le cancer avancé: cytométrie de

flux avec impédance

• Cytomètre de flux: NPE Systems Quanta• Utilise l’impédance pour mesurer la taille de la

microparticule• Marquage des particules avec un anticorps anti-

facteur tissulaire, de façon à quantifier les microparticules procoagulantes

• Échantillons de plasma de sujets normaux et de patients avec un cancer de stade avancé.

Etude préliminaire

• Microparticules positives pour le facteur tissulaire: présentes dans 1/3 patients avec un cancer avancé

• Nombre: 11’000 – 1’600’000 particules par microlitre

• Taille: 332 - 501 nm• Rôle probable de ces microparticules dans les

complications thromboemboliques du cancer

B. Furie et al., BCMD 2006