LP nr.6Cercetarea in domeniul medicamentului. Modele experimentale in cercetarea farmacologica.

Farmacologia implica:

Descoperirea unor noi medicamente,

Investigarea felului in care acestea actioneaza

Precum si utilizarea diferitelor medicamente pentru a proba mecanismele unor afectiuni. Astfel, in farmacologie sunt utilizate cele mai fundamentale aspecte ale cercetarii de baza prin folosirea unor culturi de celule (ex. celulele transfectate cu receptorii unor mediatori implicai n analgezie, linii celulare exprimnd fiziologic situsuri receptoare, ovule de Xenopus transfectate temporar cu receptori (n special canale ionice),

fragmente de tesuturi/organe izolate (ex. ileonul de cobai pentru legarea de receptorii B2, sau CB1, omogenatele de creier de porc bogate n situsuri pentru neurokinine/substan P, analiza liganzilor k opioizi pe preparate de cerebel de cobai, testul de blocare a enkefalinazei din rinichii de obolan, studii electrofiziologice directe ale potenialelor de aciune spinale pe mduva izolat de la obolanii nou-nscui), modele animale(ex. modele animale pentru testarea sigurantei, modele animale pentru probarea unor medicamente in cercetarea mecanismelor unei afectiuni, modele animale in care sunt provocate afectiuni si sunt cercetate efectele unor noi medicamente, etc. ) si

translatia informatiilor obtinute de la acestea la investigarea clinica.

Recomandarea FDA in ce priveste folosirea modelelor animale:

U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Biologics Evaluation and Research (CBER) July 1997, ICH.Clear FDA Guidelines, June 18th, 2007: .recommend you conduct pre-clinical testing, where appropriate and feasible, in an environment that simulates actual Clinical conditions. !Clinical conditions seldom refer to healthy persons!

Exemple ale unor astfel de sisteme folosite in cercetarea farmacologica:Sistemul de celule adipoase 3T3-L1: este un sistem de baza folosit in cercetarea farmacologica; utilizat pentru intelegerea mecanismelor de actiune ale unor noi medicamente precum si in studii legate de diabet, obezitate si alte afectiuni asociate acestora.

Cum functioneaza:

aceasta linie celulara provenita de la soareci de tip Swiss este o linie fibroblastica ce se diferentiaza rapid intr-un fenotip de adipocit cand celulele sunt tratate timp de 48h cu un mediu specific ce contine si dexametazon (D), metilizobutilxantina si insulina.

Dupa ce este indusa diferentierea, celulele sunt cultivate si cresterea lor este masurata cu ajutorul unor metode speciale de tip proliferation-assay. Daca este testata actiunea unor medicamente sunt folosite diferite tipuri de masuratori: ex. Daca medicamentul/molecula are efect asupra proliferarii acestor celule se efectueaza asa numitul proliferation assayprin care se masoara proliferarea celulelor in diferite faze ale cresterii (cell-growth)

ex. daca medicamentul/molecula are efect citotoxic asupra acestor celule se efectueaza asa numitul cytotoxicity assaysi se verifica ce cantitate de LDH a fost eliberata sau nu de aceste celule,

ex. Daca medicamentul/molecula are efect asupra adipogenezei se calculeaza nivelul de trigliceride acumulate de aceste celule (daca reduce sau nu nivelul de trigliceride produs de acestea), ex. Daca medicamentul/molecula are efect lipolitic se masoara nivelul de glicerol eliberat de aceste celule.

Modele specifice unor afeciuniProvocarea artificial a diabetului

la obolani prin intoxicaia cu streptozotocin, astfel se poate studia neuropatia diabetic i influenarea ei medicamentoas.

Modelul animal de administrare a amfetaminei pentru studierea schizofrenieiAcesta a fost unul dintre primele modele de schizofrenie care au implicat folosirea unui medicament care a crescut eliberarea de dopamina increier. Acest model consta in injectarea sobolanilor cu amfetamina.

Care este explicatia logica pentru acest model?

Amfetamina induce o psihoza care este similara cu schizofrenia de tip paranoid

Amfetamina elibereaza dopamina in terminatiile nervoase presinaptice

Psihoza indusa de amfetamina este similara schizofreniei paranoide aparuta in mod natural; aceasta hipereactivitatea dopaminergica poate fi responsabila de schizofrenia ce apare in mod natural. Ce se intampla la animal? Injectand animalele cu amfetamina (de obicei sobolani) se produce o crestere a locomotiei si aparitia/cresterea asa numitlui comportament de tip stereotipicadica:

Repetearea unui comportament

Invariabilitatea repetarii )adica acest comportament este acelasi de fiecare data cand apare)

Este lipsit aparent de scop.

Diagrama de mai jos arata un grafic al sterotipiilor functie de doza de amfetamina administrata:

Pe axa ox: este reprezentata doza de amfetamina Pe axa oy este trecut scorul mediu de stereotipii.Acest model animal este acum un binecunoscut test de screening pentru noi medicamente antipsihotice.In ce fel?

Se examineaza abilitatea acestora de a antagoniza efectele amfetaminei asupra comportamentului animalelor.

Ex. Demonstrarea efectului clorpromazinei in acest tip de model: Clorporomazina este injectata prima si va ocupa situsurile receptoriale postsinaptice. Apoi este injectata amfetamina. Amfetamina va cauza eliberarea dopaminei din terminatiile nervoase presinaptice insa, aceasta nu va avea unde sa se lege deoarece structurile receptoriale sunt blocate de clorpromazina. Astfel, dopamina nu va genera un potential de actiune si comportamentul de tip stereotipnu mai este activat. Dopamina eliberata in fanta sinaptica va fi fie distrusa de enzimele din fanta fie reabsorbita in neuronul presinaptic.Modele de algeziometrie in vivo la animale1. Modele de hipernocicepie: Sunt cel mai frecvent utilizate reconstituind, n funcie de stimulul folosit dureri traumatice, operatorii, organice, arsuri. Se realizeaz prin administrarea de stimuli dozai animalului de experien i urmrirea comportamenului su, determinnd stimulul-prag care declaneaz manifestri considerate aprioric, reprezentativ pentru un comportament de aprare. Se poate urmri apoi influenarea medicamenoas a intensitii stimului-prag. Deficiena principal a acestui model, este simplitatea lui, liniaritatea banal dintre cauz i efect care nu are ntotdeauna corespondent clinic, dealtfel acesta este i motivul care a determinat introducerea unor noi paradigme experimentale n algeziologie.2. Modele de inflamaie i nocicepie (Randall-Selitto): Provocarea inflamaiei, este nsoit de un sindrom de hipersensibilizare la stimuli dureroi care are echivalent n multe afeciuni umane cu component inflamatorie: artrit, infecii, boli autoimune. Se folosesc ca ageni proinflamatori: adjuvantul Freund (o emulsie de micobacterii omorte, care sunt antigene majore pentru sistemul imunitar, declannd sindroame autoimune, inclusiv artrita reumatic), caolinul administrat intraplantar, carrageenanul administrat pe aceai cale, bradikinina i PGE2, interleukinele, drojdia de bere i chiar peletele de vat implantate subepidermic, care produc modificri locale de tip granulom.

3. Modele de durere neuropatic: Patologia dureroas neurologic uman se poate reconstitui la animal, mai ales pe cale chirurgical. Astfel, des utilizate sunt: -metoda Bennett (ligaturarea strns a nervului sciatic, are dezavantajul afectrii mecanice a nervului, uneori pn la axotomie),-metoda Seltzer (ligatura relaxat a nervului sciatic, mai puin invalidant dect prima metod), - modelul Chung (ligaturarea unei rdcini a nervului sciatic, n patologia uman i corespunde compresia radicular, permite studiul modificrilor patologice din ganglionii senzitivi)4. Modele de durere visceral: ncearcrile de reconstituire a particularitile nocicepiei viscerale, fie pe cale mecanic (introducerea unui balon cateterizat, prin gastrotomie, n duodenul obolanului i aplicarea unei distensii controlate), sau chimic (injectatre intraperitoneal de compui iritani i urmrirea comportamentului) este util pentru testarea eficacitii medicamentelor analgezice folosite n: ulcer, pancreatite, colite, dureri postoperatorii. Cel mai cunoscut este testul contorsiunilor (writhing), n care se injecteaz intraperitoneal o soluie de acid acetic la oarece urmrindu-se numrul de contorsiuni (sau alte manifestri comportamentale ce indic suferina) pe care acesta le execut ntr-un interval de timp.5. Modele de durere n condiii de stres: Este cunoscut efectul de potenare a analgeziei, n testele hipernociceptive obinuite, prin confruntarea anterioar a animalului cu o situaie stresant (notul n ap rece). Explicaia acestui fenomen ar fi eliberarea de endorfine n creierul animalului stresat, care vor avea ulterior efecte favorabile n testul nociceptiv. Prezint importan mai ales pentru cazurile ce implic sistemul opioid.6. Modele in algeziologie clasificate functie de natura stimulilor durerosi: a. Stimuli mecanici:

- Testul "tail-clip"(Haffner), n care se aplic stimuli mecanici (compresia cu o pens, sau chiar ultrasunete) la baza cozii la oarece i se urmrete timpul de laten al reaciei de aprare (mucarea pensei).

-Testul compresiei labei: la obolan sau cobai, folosind pense cu care se aplic o presiunecontrolat.b.Stimuli termici:

- Testul plcii nclzite (hot-plate) este un test tipic pentru determinarea nivelului bazal al nocicepiei i const n plasarea roztoarelor (oareci) pe o plac nclzit la 52-550C, urmrind timpul de laten pn la apariia reaciei de aprare (lingerea labelor posterioare sau srituri). Este un test edificator pentru efecte analgezice centrale, deoarece presupune rspunsuri comportamentale complexe aflate sub control cerebral.

-Testul de retragere al cozii (tail-flick) const n determinarea timpului necesar apariiei reaciei de aprare la aplicarea unui fascicol de lumin intens la baza cozii la oareci. Testul a fost adaptat i pentru alte zone ale corpului (ureche, suprafaa plantar). Este sugestiv pentru aciunea analgezicelor spinale, rspunsul fiind n acest caz coordonat de la nivel medular.

- Testul imersiei folosete roztoare, a cror coad este introdus ntr-un lichid nclzit (ap la 550C), urmrindu-se timpul n care acestea i retrag coada.c. Stimulii electrici:

-Testul electrostimulrii: prin intermediul unor electrozi plasai la baza cozii roztoarelor se aplic un curent dozat i se msoar latena rspunsului reflex. -Testul grilajului (podolometrie): n acest caz curentul trece printr-un grilaj aflat la baza cutii n care se gsete un obolan, determinnd reacii reflexe de salt, a cror laten este cuantificat.

-Testul electrostimulrii pulpei dentare: se aplic la iepuri, cini, sau obolani prin intermediul unor electrozi implantai chirurgical i urmrete apariia reaciilor nociceptive (muctur, retragerea capului).

-Testul electrostimulrii progresive: se folosete de maimue condiionate pentru a opri un stimul electric neplcut. Se urmrete durata n care apare reaci a reflex, la aplicarea unor cureni cu o intensitate ascendent.d. Stimulii chimici: Astfel de stimuli se folosesc i n modele inflamatorii (PGE2,bradikinin), ct i n cele viscerale (acid acetic, hidrochinon).

Un test mai aparte este testul cu formalin, care const n injectarea plantar la oarece a unei soluii 5-10% de formaldehid; apoi se urmresc animalele timp de 1 or i se acord un scor comportamental complex , n funcie de apariia unor manifestri de tipul ridicrii labelor, linsului, mucturii, sriturilor. Se consider c acest test este edificator att pentru efectele analgezice periferice, ct i pentru cele centrale. Nude mice folositi pentru cercetarea tumorala/transplantSorecii de tip nude sunt astfel denumiti deoarece sunt lipsiti de blana. Ei sunt de fapt un tip special de soarcei modificati genetic astfel incat sistemul lor imun este inactiv, incapabil sa produca celule T mature; sunt lipsiti de timus. Cod: 088 (HOMOZiGOT)

Datorita imunodeficientei acest tip de soricei nu pot rejecta nici allograft-urile si nici xeno-grafturile.

Ex. 6 xenograft-uri diferite de pielece nu au fost respinse in nude mice: A.Uman-piele dupa 60 zile.

B.Pisica- piele la 51 zile. C.Pui (bird) la 32 zile; D.Chameleon (reptile) la 41 zile.

E.Reptila la 28 zile.

F.Broasca la 40 zile.

Soriceii de tip nude sunt folositi ca modele animale pentru cercetarea cancerelor umane. Exista unele limitari ale acestui model totusi:

S-a constatat ca ratele de metastazare de la xenografturi subcutanate sau intramusculare au fost mici sau inexistente chiar daca proveneau de la tumori cu rata mare de metastazare la pacientii de la care au fost prelevate. Ce urmareste cercetarea preclinica a sigurantei?

Identificarea dozei initiale sigure precum si a schemelor ulterioare de escaladare a dozei, Identificarea unor potentiale organe tinta pentru toxicitate, si, daca este posibil determinarea daca aceasta toxicitate este reversibila sau nu,

Identificarea parametrilor de siguranta pentru monitorizarea clinica ulterioara.

Concluzii: De ce modele animale?

1. ..experiments conducted under highly standardized conditions (eg., on normal animals) may reveal local truths with little external validity (to patients with disease).S Helene Richter, Joseph P Garner & Hanno Wrbel, 2009. 2. Use of animal models with disease in Safety PharmacologyorYou dont give drugs to normal people!Care animal este cel mai bun surogat pentru ranslatia informatiilor in investigarea clinica? 3. house mouse (Mus musculus)

Brown rat (Rattus norvegicus)

Canis lupus familiaris

Macaca mulatta

Sus scrofa

Alternative animal models

-zebrafish

-drosofila

-cenorabitis