extractos naturales calendula officinalis echinacea

CUAUTITLÁN IZCALLI, EDO. DE MÉXICO, 2013

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE

Q U Í M I C O F A R M A C É U T I C O B I Ó L O G O

P R E S E N T A :

DANIEL LEY OROZCO

Evaluación de la estabilidad de un producto a base de tres

extractos naturales: Calendula officinalis, Echinacea

purpurea e Hippocratea excelsa, el cual presenta actividad

antibacteriana

ASESOR: Q.F.B. VICTOR HUGO ABREGO REYES

UNAM – Dirección General de Bibliotecas

Tesis Digitales

Restricciones de uso

DERECHOS RESERVADOS ©

PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL

Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México).

El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor.

FACULTAD DE ESTUDIOS S{n'F.RIOKES CUAUTITLÁN UN HlAD DE ADMINISTRACiÓN ESCOLAR

I.lEl'ARTAl'I'lENTO DE EXÁMENES PROFESIONALES U.N. /l..o<.·

ASUNTO:~~~"TORIO

DRA. SIJEl\11 ROI.lIÚG UEZ RO;"\IO J)lRECTORA DE LA FES CUAUTlTLÁN PRESENTE

ATN: L.A. ARACF.U

J,~r;.< ,:::¡?:;~~

Con base en el Art. 28 del Reglamento de Examenes Profesionales nos p'-·nnitim<J~ comunicar a usted que re visamos la: TESIS

F:'-aluadótl de la es tabilidad de un producto a base de tres fxlmctus naturales: Calendula omtinalis. Eehin~eea 11Ur¡lll r~a e lIi!lllOcra tea excelsa, el cual presenla Hcti.·idad antibacteriana.

Que presenla el p.1,amc: Con nÚmero de euellla: ,oc,,]T", "' , de: Oufmico f:umacélllico Riólot:o

Con~iderondo que dicho lrebajo reúne los requisitos necesario., paro ser disculido en el EXAMEN PROfESIONAL com:~pondi<:nle, otorgarnos n<J",~lro VOTO APROBATORIO.

ATENTAMENTF. " 1'OR MlltAZA HABLARA EL rspÍluTu" Cuautillán Izealli, Méx. a 14 de noviembre de 2012.

PRon::SOIU~S QUF: INTEGRAN EL .fiJRAno

NOMHRE FIRMA

PRESIDENTE Q. Mario Arturo Morales Delgado

VOCAL ,ák:t'3::. 1. ,Q

QFB. Elia GrdD3dos Enriqucz ........ t.:.. ~----------------

SECRF.T ARIO e,

1 er SU 1'l. Io:NT lo:

QrB. Victor [Iugo Abrego Re}'.:s

------------------~~,'~'~/~;-~,/ QFB. Brigida del Carmen Camacho Enrique~ ..02 ~ .. ~ 2do SUPLENTE QFH. Guadalupc Hemándcz; Torres

NOTA: lo , "ood3l~, 'upl~",,, ... ,jn obH/:,oo, 3 P""""''" ~ d .. Y he .. dol E ....... n Pm!e,l<)nal (.rt. 12 H~A,lpm

FACULTAD DE: ESTUDIOS SUPERIOKES CUAUTITLÁN UN HlAD DE AD1\uNLSTRACIÓN ESCOLAR

I)EI'ARTAiI'lENTO DE EXÁMENES PROFESIONALES U.N. /l.,Ol.. ·

ASUNTO:~~_TORIO

DRA. SIlEMIKOllfÚG UEZ RO;"\IO I)IRECTORA DE LA FES CUAUTITLÁN PRESENTE

ATN: L.A. ARACr.U

J,~r;.< ,::: ¡?:~~~::

Con b3.'ie en el Art. 28 del Reglamento de Exámenes Profesionales nos p"nnilirnos romunicll' " uSlcd que r~"isamu~ la: TESIS

r., ·~lu~dón de la ~s l a l'¡lidad de un pruduclQ a bas~ de Irl"S u lr,¡clu! Dalural c~ : Calendul:¡ offitinalis. Echinacca )Iuqlllrfa e lIi!lllOcralea cnrlsa, el cual presenh¡ HCli"ida d anlibacleriana.

Que presentn el pn.<;nnlc:

Cono"'"'''''''d'' '''''''' ' ,oc,,]T" .. ,], .. de: O u fmico Farmacé"lico Bióloco

Considerando que dicho 1mbnjo rellOe los req\lisitos neeesario.<; para ser disculido en el EXAMEN PROFESIONAL <:um:~pondi<:nle . ,"Iorgarnus nUt;~lru VOTO APROBATORIO.

ATENTAMENTF. " 1'01{ MI ¡tAZA HABLARA EL ESl'Í1UTU" Cuaulillán lzcalli, Méx. a 14 de noviembre de 2012.

PI{O"'ESOI{~~S Q UEI NTEC,RAN EL .mRAI)O

NOMHRE FIRMA

l'RE SIDE NTE

VOCAL

Q. Mario MUro Morales Delgado '(/""''':«'3::',1. .a

QFB. Elia Granados Enriqucz ...... ~ ~----------------

SECRETARIO e,

1 cr SU I'L. Io: NT lo:

QI'I3. Victor [Iugo Abrego Re}'.:s

------------------------~~~';¿~;;;; QFB. Brigida del Carmen Camneho Enrique~ ..6' .... ' ~M -'----'----- ----'-----=

2do SUl'LENTE QFH. GuadHlupc Hcmándcz TQrres

NOTA: lo. "oo<lll~, '"I*n"" ~"jn o~I~.6",. P"'''"''''" ol d .. V "" .. dol f .. _ n Pm!e,lonal (. n. 12 HfIA,!pm

AGRADECIMIENTOS

A mi familia que me apoya incondicionalmente y que siempre

está presente en los buenos y malos momentos de la vida.

A mis asesores quienes me dieron la oportunidad de realizar

este trabajo, por su apoyo y paciencia:

M.V.Z. GERARDO CRUZ JIMÉNEZ

Q.F.B. VICTOR HUGO ABREGO REYES

DR. ENRIQUE ANGELES ANGUIANO

A todos mis compañeros y sobre todo a mis amigos con

quienes tuve la oportunidad de convivir durante la carrera.

Especialmente a:

Eva Cristina Morales, Alexandra Aguilar, Yazmin G. Gálvez,

Roció Loeza, Zhaila Santana, Erik Mendoza, Adam Valle

(pollo), Viviana Cervantes, Abigail Garcés, Salvador Centeno,

Elizabeth A. Tinajero, Valeria Vilchis, Marcos A. Rodríguez,

Raúl Ortega, Guillermo Lucas, Brenda Rodríguez Islas, A.

Cristina López, Viridiana López, Liliana Antonio, Silvia

Garduño, Lizbeth Pérez, Obed Morales, Bianca Rodríguez,

Clara Domínguez, Vicente Benítez, Mónica Basset, Jenny

Carranza, Yahell Venegas, Jazmín Álvarez, María José,

Gabriela Rivera Garcia.

http://www.facebook.com/vicente.benitezflores?fref=pb

“El talento depende de la inspiración, pero el

esfuerzo depende de cada uno.”

http://www.frasesmotivacion.net/frase/689

http://www.frasesmotivacion.net/frase/689

ÍNDICE

I. INTRODUCCIÓN ............................................................................................... - 17 -

II. OBJETIVOS ...................................................................................................... - 12 -

III. GENERALIDADES ............................................................................................ - 15 -

1.0 CALENDULA ................................................................................................... - 16 -

1.2 HABITAT. ..................................................................................................... - 17 -

1.3 PARTE UTILIZADA. ..................................................................................... - 17 -

1.4 COMPOSICIÓN QUÍMICA. .......................................................................... - 17 -

1.5 ACCIONES FARMACOLÓGICAS ................................................................ - 18 -

1.6 CONTRAINDICACIONES E INTERACCIONES ........................................... - 19 -

2.0 CANCERINA ................................................................................................... - 20 -

2.1 DESCRIPCIÒN BOTÀNICA. ........................................................................ - 21 -

2.3 HABITAT. ..................................................................................................... - 21 -

2.4 PARTE UTILIZADA. ..................................................................................... - 21 -

2.5 COMPOSICIÓNQUIMICA. ........................................................................... - 22 -

2.6 ACCIONES FARMACOLOGICAS. ............................................................... - 22 -

3.0 EQUINÁCEA ................................................................................................... - 24 -

3.1 DESCRIPCIÓN BOTÁNICA. ........................................................................ - 24 -

3.2 HABITAT. ..................................................................................................... - 25 -

3.3 PARTE UTILIZADA. ..................................................................................... - 25 -

3.4 COMPOSICIÓN QUIMICA. ......................................................................... - 25 -

3.5 ACCIONES FARMACOLOGICAS. ............................................................... - 26 -

3.6 CONTRAINDICACIONES E INTERACCIONES ........................................... - 26 -

4.0 ELECTROFORESIS CAPILAR ........................................................................ - 27 -

4.1 FUNDAMENTOS DE ELECTROFORESIS CAPILAR .................................. - 27 -

4.2 INSTRUMENTACIÓN PARA LA ELECTROFORESIS CAPILAR ................. - 30 -

4.3 LA INTRODUCCIÓN DE LA MUESTRA....................................................... - 34 -

4.4 EL BÚFER ................................................................................................... - 34 -

4.5 ELECTROFORESIS CAPILAR DE ZONA (ECZ) ......................................... - 35 -

5.0 ESPECTROFOTOMETRÍA .............................................................................. - 37 -

5.1 FUNDAMENTOS ......................................................................................... - 37 -

5.2 INSTRUMENTACIÓN DEL ESPECTROFOTÓMETRO UV-VISIBLE ........... - 42 -

5.3 OBTENCIÓN DE UN ESPECTRO DE ABSORCIÓN ................................... - 43 -

5.4 CURVAS DE CALIBRACIÓN ....................................................................... - 44 -

6.0 POLIFENOLES ................................................................................................ - 45 -

6.1 CUANTIFICACIÓN DE POLIFENOLES ....................................................... - 46 -

6.2 CUANTIFICACIÓN FLAVONOIDES. ............................................................ - 48 -

7.0 BACTERIAS. ................................................................................................... - 49 -

7.1 BACTERIAS GRAM POSITIVAS ................................................................. - 49 -

7.2 BACTERIAS GRAM NEGATIVAS ................................................................ - 50 -

7.3 Enterococcus faecalis. ................................................................................. - 52 -

7.4 Staphylococcus aureus. ............................................................................... - 52 -

7.5 Escherichia coli ............................................................................................ - 52 -

7.6 Pseudomonas aeruginosa ............................................................................ - 52 -

IV. EQUIPO, MATERIALY REACTIVOS ............................................................. - 53 -

MATERIAL ............................................................................................................ - 54 -

EQUIPO ................................................................................................................ - 54 -

REACTIVOS .......................................................................................................... - 55 -

V. METODOLOGÍA ............................................................................................ - 56 -

1.0 PREPARACIÓN DE LOS EXTRACTOS .......................................................... - 58 -

1.2 PREPARACIÓN DEL PRODUCTO. ................................................................ - 58 -

2.0 METODOLOGÍA PARA ELECTROFORESIS CAPILAR .................................. - 59 -

3.0 METODOLOGÍA PARA ESPECTROFOTOMETRÍA UV-VIS ........................... - 59 -

4.0 METODOLOGÍA PARA LA PRUEBA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA ........... - 61 -

VI. RESULTADOS y ANÁLISIS .......................................................................... - 64 -

VII. CONCLUSIONES........................................................................................... - 86 -

ANEXO I FORMULAS PARA EL ANÁLISIS ESTADÍSTICO ..................................... - 88 -

ANEXO 2 VALIDACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN DE POLIFENOLES ..... - 89 -

ANEXO 3 ANALISIS ESTADISTICO DE Calendula officinalis. .................................. - 97 -

ANEXO 4 AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS .............................. - 98 -

ANEXO 4 GLOSARIO ............................................................................................. - 103 -

VIII. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................ - 107 -

SIMBOLOS Y ABREVIATURAS

ANOVA Análisis de Varianza

Coeficiente de absortividad molar

C.V. Coeficiente de variación

S Desviación estándar

DAD Detector de arreglo de diodos

EC Electroforesis capilar

ECZ Electroforesis capilar de zona

FEO Flujo electroosmótico

g Gramos

IR Infrarrojo

kV Kilovoltios

Longitud de onda

x Media

g Microgramos

L Microlitros

m Micrometros

mL Mililitros

mm

f

O

Milímetros Movilidad electroforética Movilidad electrosmótica

nm Nanómetros

P

tm

Probabilidad Tiempo de migración

S2 Varianza

9

I. INTRODUCCIÓN

FESC-UNAM INTRODUCCION

10

El interés en el estudio de plantas medicinales como fuente de compuestos

farmacológicos ha aumentado por todo el mundo y hay una necesidad de estudiar

las características de la flora medicinal para validar su uso en la Medicina

Tradicional y que esto permita a la Industria Farmacéutica el desarrollo de nuevos

productos más efectivos y menos peligrosos.

Por lo tanto es importante implementar nuevos tratamientos aprovechando la

riqueza natural del país, ya que se cuenta con muchas plantas que han sido

utilizadas desde años y que tienen diversos efectos en padecimientos así como en

infecciones.

La utilización de plantas medicinales como terapia alternativa y/o complementaria

tiene muchos beneficios pues es accesible, ya que tiene muy bajo costo, y se cree

no produce efectos secundarios o acciones contrarias a las deseadas, tiene una

amplia distribución geográfica y cuenta con una gran variedad de especies.

Debido a que las plantas poseen una gran diversidad de constituyentes químicos,

es de interés su estudio debido a que han mostrado distintas actividades

biológicas, como la antibacteriana que es atribuida a la presencia de metabolitos

secundarios, por lo que en el presente trabajo se llevó a cabo la cuantificación de

flavonoides y polifenoles totales por espectrofotometría UV-Visible y se contrasto

con pruebas de actividad antibacteriana que se realizaron de manera paralela para

así determinar si el producto es estable a través del tiempo en las condiciones en

que se almacena, y si conserva su actividad antibacteriana.

El producto consiste en dosis únicas 100 mL contenidas en frascos ámbar que

fueron cerrados y engargolados en condiciones de esterilidad, se mantuvieron a

temperatura ambiente durante el transcurso del estudio, los resultaron confirmaron

que el producto conserva su actividad antibacteriana en las condiciones en que se

almacenó.

FESC-UNAM INTRODUCCION

11

El producto está hecho con tres extractos naturales Calendula officinalis,

Echinacea purpurea e Hippocratea excelsa, el cual un estudio anterior demostró

tener efecto antibacteriano siendo utilizado en el tratamiento de metritis en vacas.

La metritis postparto es una enfermedad severa que afecta negativamente la

producción de leche y la reproducción, y pone a la vaca en riesgo de desarrollar

numerosos desórdenes metabólicos que potencialmente comprometen su vida. La

metritis es definida como una inflamación de las paredes musculares del útero y

del endometrio.

El útero postparto es un buen medio para el crecimiento bacteriano, ya que es

templado, lleno de líquido y contiene una cantidad variable de tejidos necróticos.

En un inicio de la infección se puede aislar un gran número de microorganismos

pero el principal es Actinomyces pyogenes o bacilo de la necrosis quien puede

originar formas graves de la metritis (Tovar, 1999).

Se han cultivado una gran variedad de bacterias del útero de vacas postparto

como: Escherichia coli, Pasteurella spp, Arcanobacterium pyogenes, Haemophilus

somnus, Fusobacterium necrophorum, Pseudomonas aeruginosa, Prevotella

melaninogenicus, Clostridium spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp. Y

Manheimia hemolít

12

II. OBJETIVOS

FESC-UNAM OBJETIVOS

13

OBJETIVO GENERAL

Determinar el perfil electroforético de los extractos etanólicos de Calendula

officinalis, Echinacea purpurea e Hippocratea excelsa, mediante la técnica

de electroforesis capilar, para ser empleados como método de

identificación.

Determinar la estabilidad de un producto hecho con tres extractos naturales

(Calendula officinalis, Echinacea purpurea e Hippocratea excelsa),

utilizando espectrofotometría y pruebas bacteriológicas para probar si este

conserva su efecto antibacteriano con respecto del tiempo en que se

preparó.

FESC-UNAM OBJETIVOS

14

OBJETIVOS PARTICULARES

Obtener los extractos de Calendula officinalis, Echinacea purpurea e

Hippocratea excelsa con etanol al 70% para su análisis en electroforesis

capilar y la preparación del producto.

Obtener los electroferogramas de los extractos de Calendula officinalis,

Echinacea purpurea e Hippocratea excelsa por electroforesis capilar a pH

9.12 para establecer una forma de identificación de estas especies

vegetales.

Caracterización de las cepas bacterianas Escherichia coli, Streptococcus

faecalis, Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa por medio de

pruebas bioquímicas primarias, secundarias y especiales para determinar la

estabilidad de la actividad antibacteriana del producto en función del tiempo

almacenado, contra las cepas previamente mencionadas.

Preparar una curva de calibración para cuantificar los polifenoles y

flavonoides en el producto, mediante el método de Folín Ciocalteu y cloruro

de aluminio respectivamente.

Observar los cambios físicos que el producto pueda presentar en función

del tiempo, almacenado en los frascos ámbar.

15

III. GENERALIDADES

FESC-UNAM GENERALIDADES

1.0 CALENDULA

NOMBRE CIENTÍFICO: Calendula officinalis.

IMAGEN 1: Flor de Calendula officinalis.

Nombres populares: Calendula, maravilla, virreina, clavel de muerto, marquesita.

1.1 DESCRIPCIÓN BOTÁNICA.

Planta aromática anual, que pertenece a la familia de las Asteráceas (Compuestas),

caracterizada por presentar una altura cercana al medio metro, tallos rectos y

ramificados; hojas lanceoladas, pilosas por ambas caras, de 5 a 15cm de largo y

márgenes dentados; capítulo grande de 3 a 7cm de diámetro conformado por flores

lígulares de color amarillo rojizo, brillantes y dispuestas en filas simples o dobles; y

también por flores tubulares centrales (IMAGEN 1). Las flores hacen su aparición

durante gran parte del año. El fruto es un aquenio espinoso, curvado.


- 17 -

1.2 HABITAT.

La calendula es originaria de la región mediterránea y se encuentra ampliamente

distribuida en todo el mundo como planta ornamental. Por lo general es cultivada en

zonas de clima templado, hay escasos ejemplares silvestres y toleran todo tipo de

suelos, preferentemente arcillosos (Alonso, 2004).

1.3 PARTE UTILIZADA.

Está constituida por las inflorescencias o capítulos enteros. También se utilizan los

flósculos aislados y en mucho menor medida se emplean las hojas (Alonso, 2004).

1.4 COMPOSICIÓN QUÍMICA.

Aceite esencial: Presenta una concentración variable hasta 0.12% en las flores

linguladas y hasta un 4% en el receptáculo. Es abundante en mono y sesquiterpenos

oxigenados: carvona, geranulacetona, cariofilencetona, mentona, isomentona,

γ-terpineno, y -cadineno, α-muroleno, cariofileno, α y β-ionona, 5,6-epoxi-β-ionona,

pedunculatina, dihidro-actinidiolido.

Saponósidos: Derivados del ácido oceánico: calendulósidos A, B, C, D, D2, F, G y H.

Carotenoides:: α, β y γ-caroteno, violaxantina, rubixantina, citroxantina, flavocromo,

galenina, luteína, licopeno, valenciaxantina, auroxantina, microxantina, 5,6-

epoxicaroteno, β-zeacaroteno, mutatoxantina y luteína epoxida.. Los carotenoides son

compuestos relativamente estables, siendo solubles en grasas e insolubles en agua.

Flavonoides: En las flores linguladas hasta 0.88% y en el receptáculo hasta 0.33%.

Los flavonoides presentes son: isorhamnetin -3- glucósido, isorhamnetina, heterósidos,

rutósidos, quercetina glucósido, calendoflavosido, narcisina, isoquercetina y quercetina.

Alcoholes triterpénicos: arnadiol, faradiol, α y β-amirina, derivados del ácido

lauricomiristico, palmítico y margárico, lupeol, ψ-taraxasterol, taraxasterol, faradiol-3-

éster del ácido palmítico, calenduladiol.


- 18 -

Entre otros principios activos están: cumarinas, scopoletina, umbeliferona y esculetina,

esteroles, polisacáridos como pectina y hemicelulosa.

1.5 ACCIONES FARMACOLÓGICAS

Anti-inflamatoria: Debido a la inhibición de la lipooxigenasa (flavonoides) y a sus

antioxidantes y captadores de radicales libres (flavonoides y triterpenos).

Antiséptica y Cicatrizante: Al potenciar la epitelización y regeneración de la piel

dañada, estimulando la síntesis de glucoproteínas, nucleoproteínas y colágeno durante

el periodo de regeneración tisular.

Acción antimicrobiana: Experimentos in vitro con extractos de las flores de calendula,

muestran una actividad bactericida respecto a Staphylococcus aureus, antifúngica y

virucida contra los virus de la influenza y el virus del herpes simple. Los polisacáridos

aislados, poseen una actividad estimulante de la granulación y los terpenos oxigenados,

son activos contra Trichomonas (antiparasitario). Los extractos orgánicos de las flores

de calendula, han demostrado ser inhibidores del virus de inmunodeficiencia humana

tipo 1 (Centeno, 2004).

Antiespasmódica: Combate los espasmos, las contracciones o convulsiones.

Acción emenagogo: Como regulador del período menstrual y calmante de los dolores

propios.

Emoliente: Suaviza, tonifica e hidrata la piel, cada vez son más los productos

cosméticos que incluyen la calendula entre sus componentes.

Callicida: Provoca la desaparición de verrugas víricas de la piel, debido a su contenido

en ácido acetil-salicílico.

Colerética: Estimulante de la actividad hepática, especialmente de la secreción biliar.

Tomada en infusión resulta indicada en casos de congestión o insuficiencia hepática.

Antiulcerosa: Cicatriza úlceras de estómago y duodeno. También resulta eficaz en

gastritis, gastroenteritis y vómitos.


- 19 -

1.6 CONTRAINDICACIONES E INTERACCIONES

Hipersensibilidad a la Calendula o a otras especies de la familia de las compuestas.

No se debe tomar durante el embarazo ya que puede tener consecuencias el feto. No

se recomienda la ingestión durante la lactancia debido a la ausencia de datos que lo

avalen. También en aplicaciones tópicas (externas) se deberá actuar con la necesaria

cautela. No se han descrito interacciones con otros medicamentos.


- 20 -

2.0 CANCERINA

NOMBRE CIENTIFICO: Hippocratea excelsa.

IMAGEN 2:Bejuco leñoso de Hippocratea excelsa.

Nombres populares: La planta que popularmente se le conoce en el país como

cancerina también tiene los nombres comunes “mata piojo”, “miseg-bat” (Oaxaca),

“barajillo”, “ixcate”, “ixcate rojo”, “acpatle”, “temecaixcapajtle”, “mapiojos” (Guerrero y

Puebla) “hierba del piojo”, “piojo” “zipche” (Chiapas) y palo de reguilete (Yucatán).El

nombre náhuatl temecaixcatl se deriva de temecatl- bejuco e ixcatl- algodón

(Grupos de Terapeutas y Campesinas de Copalillo y Temalac, Guerrero, 2000).

Su nombre científico es Hippocratea excelsa Kunth, su sinónimo es

Hemiangiumexcelsum (Kunth) A.C. Sm. Pertenece a la familia Hippocrateaceae

(García J. A., 2009).


- 21 -

2.1 DESCRIPCIÒN BOTÀNICA.

La cancerina está constituida por la corteza de la raíz desecada de la especie

Hippocratea excelsa, la corteza de raíz tiene un color café rojizo o rosáceo con

abundantes manchas grisáceas y textura ligeramente fibrosa (Frenk, 2001).

Se trata de un bejuco leñoso, delgado, de hasta 17m de altura. Su tallo es de 10cm de

diámetro con ramas pecioladas, la corteza es de color café rojizo, sus hojas miden de 6

a 12cm, son oblongo elípticas, pecioladas, redondeadas en el ápice (IMAGEN 2). Sus

flores son blancas de sépalos dentados, sus frutos son elípticos y capsulares de unos

6cm (Lara y Márquez, 1996).

2.3 HABITAT.

La especie Hippocratea excelsa (Hipocrateaceae) es originaria de América Central y en

México se encuentra en los Estados de Durango, Estado de México, Guerrero, Oaxaca,

Chiapas y Yucatán.


Se emplea principalmente la corteza de la raíz, aunque también se ha reportado

actividad antiartrítica donde la parte estudiada es toda la planta (Lara y Márquez, 1996).

IMAGEN 3: Corteza de la raíz de Hippocratea excelsa.


- 22 -

2.5 COMPOSICIÓNQUIMICA.

Compuestos triterpenoides: Canofilol, canofilal, ácido canofílico,friedelina, celastrol,

excelsina, pristimerina, tingenona.

Alcaloides: Hipocrateína I y II, emarginatina A, mayteína, hipocrateína III.

Esteroles: Principalmente β-sitosterol.

Flavonoides: Rutina

2.6 ACCIONES FARMACOLOGICAS.

Se emplea para curar la diarrea y el vómito en los niños. En algunas comunidades se

utiliza para matar piojos y otros ectoparásitos del hombre. También se utiliza la corteza

machacada para problemas de la piel. En el estado de Morelos se utiliza para problema

de úlceras gástricas, problemas del riñón y golpes.

La mayoría de los usos medicinales atribuidos a la cancerina,

farmacológicamente no se han demostrado. Sin embargo, existen algunos estudios

experimentales que demuestran los resultados siguientes: la corteza de la raíz posee

un efecto citoprotector en úlceras de ratas; sustancias como el sitosterol-3-O-β-

glucosido, β-sitosterol y (−) epicatequina fueron aislados de las fracciones activas y

demostraron una actividad gastroprotectora importante (93.4, 85.7 y 72.1% de

gastroprotección, respectivamente).

El Primesterina III es conocido como un inhibidor de la actividad antimicrobiana,

propiedad que puede ser relevante, ya que la bacteria Helicobacter pylori está

señalada como una causa de la gastritis crónica y úlcera gástrica.


No se conocen


- 23 -

TABLA No. 1: Reportes sobre usos medicinales de Hippocratea excelsa (García J. A., 2009)

USOS INSTITUCIÓN AUTOR

Úlceras gástricas, padecimientos renales,

afecciones de la piel, amenorrea y algunas

infecciones uterinas.

Instituto de Ecología

Pátzcuaro, Michoacán

Villa et al,

1998.

Heridas, úlceras en la piel, úlceras del duodeno,

estómago y otras; inflamación de matriz, ovarios y

riñones; cualquier malestar canceroso, cáncer de

los fumadores

Instituto Nacional de

Antropología e Historia

Hersch, 1999.

Heridas, infecciones diversas y de tipo vaginal Universidad Autónoma

de

Morelos

Hersch et al, 2000.

Parásitos intestinales, parásitos en la piel (ácaros),

purgativo, antiséptico y desinfectante; tos, gastritis,

úlceras gástricas, antiinflamatorio, agente

cicatrizante, afecciones ginecológica, cáncer y

tratamiento de cáncer.

Instituto de Química,

UNAM

Reyes et al, 2003.

Ulceras gástricas y actividad antiinflamatoria Escuela Superior de

Ingeniería Química e

Industrias extractivas,

I.P.N

Mata et al, 1990.

Ulceras gástricas (la fracción butanólica de la

corteza de la raíz de cancerina posee un efecto

citroprotector).

Universidad Autónoma

Chapingo

Nariñan et al, 2002

Infecciones, parasitósis externas, piel y tejido

subcutáneo o capilar (semillas en pasta tópica).

Instituto de Biología,

UNAM

Soto y Sousa, 1995.

Gastritis, úlcera duodenal, cicatrizante,

citoprotectora gástrica y duodenal (Fórmulas

herbolarias del Programa de Plantas Medicinales).

Departamento de

Fitotecnia de la

Universidad Autónoma

Chapingo

Castañeda, 2005.

Úlcera gástrica, amenorrea, enfermedades renales

cáncer de piel y bronquitis.

Instituto de Química,

UNAM

Romo, 2006.


- 24 -

3.0 EQUINÁCEA

NOMBRE CIENTIFICO: Echinacea purpurea.

IMAGEN 4: Flor de Echinacea purpurea.

Nombres populares: equinácea (español), (portugués), purple coneflower (ingles),

echlnacea (francés), echinace (italiano), sonnenhut (alemán)

3.1 DESCRIPCIÓN BOTÁNICA.

Hierba perenne perteneciente a la familia de las Asteráceas (Compuestas)

caracterizada por presentar una altura máxima cercana al medio metro, raíz

axonomorfa, tallo delgado, velloso y hueco; hojas ásperas, lanceoladas o lineares,

enteras, entre 7,5 y 20cm de largo, e inflorescencia solitaria sobre un pedúnculo

terminal conformado por flósculos radiales de 3cm de largo, color malva, blanco o

púrpura (IMAGEN 4). Hacen su aparición desde mediados de verano hasta principios

de otoño (Alonso, 2004).


- 25 -

3.2 HABITAT.

Es originaria del centro y sur de Estados Unidos, crece en lugares secos, praderas y

bosques en forma silvestre. Las flores que se cultivan en jardines pueden presentar

tonalidad color malva (E. angustifolia), púrpura (E. purpurea) y blancas (E. pallida).


Toda la planta, las raíces fueron consideradas, por un tiempo la parte más activa de la

planta, ésta se recolectan en otoño, cuando la planta ha dado semillas. La echinacea

necesita entre 3 y 4 años de su siembra para que sus raíces sean lo suficientemente

grandes como para aprovecharlas medicinalmente. De las partes aéreas también

pueden obtenerse principios activos útiles, la droga vegetal presenta olor suave y

aromático.

3.4 COMPOSICIÓN QUIMICA.

Alcamidas: En la raíz fueron identificadas cerca de 20, representadas principalmente

por isobutilamidas. Estas se pueden localizar también en las partes aéreas.

Glucósidos del ácido fenilcarbónico: Entre ellos destaca el equinacósido (0,3 a

1,3%), conformado por glucosa, rhamnosa, ácido cafeico y benzocatequin-etil-alcohol.

El equinacósido es un éster que deriva del ácido cafeico.

Resina (1,9%): Conteniendo ácidos grasos (oleico, linolénico, cerotínico y palmítico) y

fitoesteroles.

Aceite esencial (0,05-1,5%): Contenido en la parte aérea y compuesto por

1,8pentadecadieno (44%), 1-pentadeceno, humuleno, borneol, germacreno D,

cariofileno, cariofileno epóxido, echinolona, etc.

Mucopolisacáridos: Son moléculas de alto peso molecular.


- 26 -

3.5 ACCIONES FARMACOLOGICAS.

Inmunomoduladora inmunoestimulante: Los mucopolisacáridos de alto peso

molecular situados en la raíz han demostrado poseer un efecto inmunoestimulante

inespecífico demostrado a varios niveles; aumento en la producción de leucocitos y

linfoquinas, aumento en la tasa de properdina, elevación de la producción de interferón,

inhibición de la hialuronidasa y aumento de la capacidad de fagocitosis por parte de los

macrófagos (Alonso, 2004).

Antiinflamatoria

La acción antiflamatoria de la Echinacea viene referida desde 1950, donde se ponen de

manifiesto sus excelentes resultados en la cura de pacientes afectados de artritis

crónica. En 1957 se demuestra que el extracto de Echinacea reduce aproximadamente

un 22% la inflamación articular, comparable al efecto de la cortisona (Jiménez, 2009).

Antimicrobiana: Aumenta la fagocitosis de virus y bacterias. Aumenta la liberación de

radicales de oxígeno por los macrófagos, los cuales están destinados a destruir

determinadas estructuras como ADN, ARN, proteínas, lípidos, etc., que son elementos

estructurales de los microorganismos. Ejerce una actividad virustática que puede

atribuirse a un efecto tipo interferón (Redondo, 2000).


Debido a su capacidad estimulante de los procesos autoinmunes, la Echinacea no

debe emplearse en las personas que padezcan enfermedades sistémicas graves

como tuberculosis, leucemia, enfermedades del colágeno, esclerosis en placas y otras

similares. Pueden presentarse reacciones alérgicas especialmente en las personas

sensibles a los alérgenos del girasol (familia Asteraceae). No se recomienda su uso en

un tiempo que exceda de ocho semanas (Jiménez, 2009).


- 27 -

4.0 ELECTROFORESIS CAPILAR La electroforesis es un método de separación basado en las diferencias en la velocidad

de migración de especies cargadas en un campo eléctrico aplicado. Esta técnica de

separación para muestras de gran tamaño fue desarrollada inicialmente por el Químico

sueco Arene Teselius en la década de 1930 para el estudio de las proteínas en suero;

obtuvo el premio Nobel de 1948 por su trabajo.

Una ventaja particular de la electroforesis es su capacidad única para separar,

macromoléculas cargadas que son de interés para bioquímicos, biólogos y químicos

clínicos. Durante muchos años ha sido el método más poderoso para la separación de

proteínas (enzimas, hormonas, anticuerpos) y ácidos nucleicos (ADN y ARN), para lo

cual ofrece una resolución sin igual (Skoog, 2005).

El mecanismo de separación de la electroforesis capilar (EC) es el mismo que el de la

electroforesis convencional. La EC consiste en introducir en un capilar una mezcla de

especies (cargadas o neutras), que se separan en función de su movilidad

electroforética bajo la influencia de un campo eléctrico (Castillo R. R., 2002).

4.1 FUNDAMENTOS DE ELECTROFORESIS CAPILAR

Muchas moléculas importantes poseen grupos ionizables y pueden tenerse en solución

en forma de especies con carga eléctrica, ya sea como cationes (+) o como aniones (-).

Además las moléculas que poseen cargas similares suelen tener distintas relaciones

carga/masa. En conjunto, estas diferencias constituyen base suficiente para una

migración diferencial, cuando los iones en disolución se someten a un campo eléctrico.

Los cationes se trasladan hacia el cátodo (-) y los aniones hacia el ánodo (+) a

velocidades que dependen del equilibrio entre la fuerza impulsora del campo eléctrico

sobre los iones cargados de la muestra y las fuerzas de retardo entre las moléculas que

migran y el medio circundante, que son principalmente fuerzas de fricción

electrostáticas (IMAGEN 5).


- 28 -

IMAGEN 5: Proceso de separación electroforética(Castillo R. R., 2002).

La corriente se mantiene por todo el circuito ya que los electrodos, están sumergidos en

viales que contienen búfer. Durante la separación en los electrodos se producen iones

hidroxilo e hidrógeno en el cátodo, mientras que en el ánodo se forman iones oxígeno e

hidrógeno (Castillo R. R., 2002).

4.1.1 Movilidad electroforética

La separación electroforética está basada en las diferencias de velocidad de los

analitos en presencia de un campo eléctrico. La velocidad de un analito, cuando ningún

flujo electroosmótico está presente puede ser dada por la ecuación 1:

_______ (1)

Dónde: es la velocidad del analito, µ es la movilidad electroforética y E es el campo

eléctrico, que es una simple función de la aplicación del voltaje y la longitud del capilar

(voltios/cm). La movilidad electroforética depende de la especie iónica, del tamaño, de

la carga, de la temperatura, de la concentración y de la naturaleza del analito.

_______ (2)


- 29 -

De la ecuación 2 es evidente que especies o analitos cargados y pequeños tienen alta

movilidad, mientras que especies cargadas con gran peso molecular muestran baja

movilidad.

Dónde:

µ es la movilidad electroforética del analito, q es la carga del analito, η es la viscosidad

de la solución y r el radio molecular (Castillo R. M., 2010).

4.1.2 Flujo electroosmótico

Una característica única de la electroforesis capilar es el flujo electroosmótico. Cuando

se aplica alto voltaje a través de un tubo capilar de sílice fundida que contiene una

disolución tampón, se genera habitualmente un flujo electroosmótico en el que el

disolvente migra hacia el cátodo.

La velocidad de migración puede ser considerable. Como se muestra en la IMAGEN 6,

la causa del flujo electroosmótico es la doble capa eléctrica que se desarrolla en la

interface sílice/disolución. A valores de pH mayores de 3, la pared interna de un capilar

de sílice se carga negativamente a causa de la ionización de los grupos sílanol de la

superficie (Si-OH). Los cationes del tampón se congregan en una doble capa eléctrica

adyacente a la superficie negativa del capilar de sílice. Los cationes de la parte exterior

difusa de la doble capa son atraídos hacia el catado o electrodo negativo. Dado que

estos cationes están solvatados, arrastran consigo el grueso del disolvente.

IMAGEN 6: Grupos sílanol en la pared del capilar de sílice fundida en función al pH.


- 30 -

La velocidad del flujo electroosmótico suele ser mayor que las velocidades de migración

electroforéticas de los iones individuales y aun cuando los analitos migran según sus

cargas dentro del capilar, la velocidad de flujo electroosmótico generalmente es

suficiente para arrastrar todas las especies positivas, neutras e incluso negativas, hacia

el mismo extremo del capilar, de manera que todas pueden ser detectadas a su paso

por un punto en común (Skoog, 2005).

IMAGEN 7: Migración de cationes, aniones y analitos neutros dentro de un capilar debido a sus

movilidades electroforéticas y el flujo electroosmótico (Galicia, 2006).

4.2 INSTRUMENTACIÓN PARA LA ELECTROFORESIS CAPILAR

Como muestra la IMAGEN 8, la instrumentación para la electroforesis capilar es

sencilla. En el caso más usual, se coloca un capilar de sílice fundida relleno de una

disolución tampón, con un diámetro interior de 10 a 100 µm y de 40 a 100 cm de largo,

uniendo dos depósitos de disolución búfer, que contienen también electrodos de platino

(Skoog, 2005).

Los capilares se sujetan normalmente de un cartucho de plástico que alinea los

extremos del capilar en los viales del búfer y los electrodos. Debido a la gran longitud

de los capilares estos se enrollan en círculos en un soporte en la parte superior del

cartucho (Chavez, 2009). La introducción de la muestra se realiza reemplazando uno de

los viales con buffer por un vial que contiene la muestra (disuelta en agua o en buffer) y

luego aplicando por unos segundos una presión externa con ayuda de una bomba

(inyección hidrodinámica), o bien un campo eléctrico (inyección electrocinética). Hecho

lo anterior, se aplica el campo eléctrico para llevar a cabo la separación (Abrego, 2006).


- 31 -

En el extremo del capilar se encuentra un sistema que registra una propiedad física de

los analitos (detector) que llegan a él. La representación de la propiedad físico-química

medida generalmente en absorbancia en función del tiempo de migración es lo que se

le denomina electroferograma. La señal del detector es registrada por un ordenador

que, con un software apropiado, es capaz de representar dicha señal en función del

tiempo para generar el electroferograma (Chavez, 2009).

La detección se realiza con un detector UV-VIS, arreglo de diodos o fluorescencia, o

fuera del capilar con detectores como índice de refracción, conductimetría,

amperometría, e inclusive espectrometría de masas(Abrego, 2006).

4.2.1 Partes básicas en un sistema de EC. (IMAGEN 8)

Dos Electrodos (ánodo y cátodo).

Fuente de poder.

Depósito (viales) en donde se colocan los electrodos respectivamente.

Capilar (compartimiento donde se lleva a cabo la separación).

Sistema de enfriamiento del capilar (típicamente en la forma de

convección de aire forzado o de líquido).

Sistema de introducción de muestra.

Un detector.

IMAGEN 8: Sistema general de electroforesis capilar EC.


- 32 -

4.2.2 El capilar

Puede ser de distinta naturaleza: vidrio, sílice fundida o teflón. Recientemente también

otros materiales tales como el polipropileno, y el nylon han sido utilizados. Comúnmente

se utilizan aquellos hechos de sílice fundida porque esta posee una excelente

transparencia a la radiación ultravioleta (UV) y visible (VIS). Además son químicamente

y eléctricamente inertes y baratos. Los capilares de sílice fundida están normalmente

recubiertos por un polímero, generalmente poliamida, la cual facilita su manipulación

dándoles flexibilidad.

Los tubos capilares de sílice fundida son usados principalmente por:

Flexibilidad

Alta conductividad (grupos silanol)

Transparencia espectral en el UV-VIS

Posibilidad de modificación de superficie externa

4.2.3 Sistema de detección

Existe una amplia variedad de detectores que se pueden utilizar en electroforesis

capilar (CE), los más comunes son:

TABLA No. 2: Detectores para electroforesis capilar (Skoog, 2005).

Tipo de detector Límite de detección* moles detectados

1.- Espectrofotometría

Absorción

Fluorescencia

Lentes térmicas

Raman

Quimioluminiscencia

1-1000 1-0.01

10 1000

1-0.0001

2.-Electroquímico

Conductividad 100

3.-Potenciometría 1 4.-Amperometría 0.1


- 33 -

Detectores de UV-Vis: se mide la intensidad de la luz que pasa a través del capilar

en una pequeña zona en la que se ha eliminado el revestimiento opaco (IMAGEN 9). El

capilar intercepta el trayecto óptico procedente desde la fuente al fotomultiplicador. De

esta manera se evita todo tipo de volumen muerto(Rojas, 2008). La lectura de UV

puede ser directa (cuando los electrolitos son transparentes y los analitos absorben la

energía electromagnética) o indirecta (cuando los electrolitos absorben energía

electromagnética y los analitos presentan características transparentes)(Galicia, 2006).

IMAGEN 9: La celda o ventana de detección se obtiene en el capilar al eliminar una parte

pequeña de recubrimiento del capilar, cuya distancia es considerada para determinar la

longitud efectiva del capilar para la separación y medición de los componentes.

Detectores de arreglo de diodos DAD.

La utilización de un detector de diodos en línea (DAD) en lugar de la detección por

única o múltiple longitud de onda tiene muchas ventajas. La luz de la lámpara de

deuterio es enfocada en el capilar por medio de un sistema de lentes y al pasar por el

capilar es difractada hacia un detector de diodos en línea, cada uno mide un cierto

intervalo de longitudes de onda. Las ventajas son: la visualización del espectro UV-

Visible en todo momento del análisis, obtención del electroferograma a cualquier

longitud de onda en una sola inyección, determinación del máximo de absorbancia para

todos los analitos, e identificación de compuestos y pureza del pico (Perez, 2010).


- 34 -

4.3 LA INTRODUCCIÓN DE LA MUESTRA

Los sistemas de inyección comúnmente empleados en los instrumentos comerciales de

EC para transportar las muestras desde el contenedor hacia el detector incluyen los

modos de inyección hidrodinámica y electrocinética (también conocida como

electromigración).

4.3.1 Inyección hidrodinámica

También llamada inyección neumática, se realiza mediante diferencia de presión, por

bombeo o bien por vacío, es decir, forzando la introducción de la muestra al capilar.

Este sistema es confiable y no selectivo. Con un control preciso de la presión y el

tiempo de inyección se pueden obtener inyecciones altamente reproducibles

4.3.2 Inyección Electrocinética o Electromigración.

Este tipo de inyección se realiza mediante un campo eléctrico aplicado entre el

contenedor de la muestra y el reservorio de salida del electrolito, el cual causa que los

componentes de la muestra migren dentro del capilar. Esta inyección es selectiva y muy

recomendable para bajar los límites de detección de algunos analitos, aunque es

importante citar que podría alterar la composición de la muestra, razón por la cual se

recomienda que para cada inyección se emplee un vial con muestra fresca (Galicia,

2006).

4.4 EL BÚFER

La sensibilidad del flujo electroosmótico (FEO), a pH requiere el uso de un búfer que

pueda mantener un pH constante. Los sistemas efectivos de búfer tienen un rango de

dos unidades de pH aproximadamente centradas alrededor del valor de pKa. Un búfer

para ser utilizado en EC debe poseer las siguientes características:

Buena capacidad de amortiguación en el rango seleccionado

Baja movilidad para minimizar la generación de corriente

Baja absorbancia a la longitud de onda de detección (cuando aplique)


- 35 -

TABLA No. 3: Clasificación de algunos de los sistemas búfer más utilizados en EC.

Químicos Biológicos:

Citrato (rango de pH 2.08-5.74)

Acetato (rango de pH 3.76-5.76)

Fosfato (rango de pH 8.14-10.14)

Borato (rango de pH 8.14-10.14)

ACES Ácido Etanosulfónico-2-[N-morfolino]

PIPES Ácido de Piperazina-N,N¨-bis-

[Etanosulfónico]

HEPES Ácido [N-2-hidroxietilpiperazina-N´-2-

Etanosulfónico]

TRIS Tris(hidroximetil)amino-metano

4.5 ELECTROFORESIS CAPILAR DE ZONA (ECZ)

Es una de las técnicas más importantes y más utilizada debido, probablemente a su

simplicidad y elevado poder de separación. Está basada en la separación de los

analitos según la relación carga/tamaño(Abrego, 2006).

La ECZ es la forma más simple de EC principalmente porque el capilar es llenado sólo

con un electrolito soporte y la migración de los analitos se da en zonas discretas y a

diferentes velocidades.

La separación de mezclas con analitos, aniónicos y catiónicos es posible debido a la

influencia del flujo electroosmótico (FEO). Los analitos neutros no migran por sí solos,

pero coeluyen en presencia del FEO (Castillo R. M., 2010). La separación de

compuestos aniónicos son arrastrados hacia el detector colocado en el cátodo

(polaridad directa). En el caso contrario, por ejemplo aniones de dimensiones reducidas

y muy cargados es necesario cambiar la polaridad del vial de entrada y del vial de

salida (trabajar con voltajes “negativos”) de tal manera que estos aniones son

detectados en el ánodo (polaridad inversa) (Perez, 2010).


- 36 -

IMAGEN 10: Representa la forma en que se lleva la separación en la Electroforesis Capilar de Zona.

a. El capilar se llena con el búfer y se introduce la muestra (analitos A y B) b. Los analitos A y B se separan con base en su distinta movilidad electroforética, al

aplicarse una diferencia de potencial eléctrico c. Los analitos A y B se han separado en zonas discretas d. Es el comienzo e. representan el perfil de concentración a lo largo del capilar: f. Durante el proceso de separación


- 37 -

5.0 ESPECTROFOTOMETRÍA La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la

concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben

las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende

de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipo de medidas se emplea un

espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que

pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma.

5.1 FUNDAMENTOS

El fundamento de la espectroscopía se debe a la capacidad de las moléculas para

absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV-visible. Las

longitudes de onda de las radiaciones que una molécula puede absorber y la eficiencia

con la que se absorben dependen de la estructura atómica y de las condiciones del

medio (pH, temperatura, fuerza iónica, constante dieléctrica), por lo que dicha técnica

constituye un valioso instrumento para la determinación y caracterización de

biomoléculas.

La espectroscopía de absorción, está relacionada con el hecho de que una sustancia

absorbe la luz, provocando que los electrones “salten” de un nivel de energía a otro

mayor(Arenas, 2004). Cuando la luz (considerada como energía) es absorbida por una

molécula se origina un salto desde un estado energético basal o fundamental, E1, a un

estado de mayor energía (estado excitado), E2 y sólo se absorberá la energía que

permita el salto al estado excitado. Cada molécula tiene una serie de estados excitados

(o bandas) que la distingue del resto de moléculas. Como consecuencia, la absorción

que a distintas longitudes de onda presenta una molécula -esto es, su espectro de

absorción- constituye una señal de identidad de la misma. Por último, la molécula en

forma excitada libera la energía absorbida hasta el estado energético fundamental

(Abril, 2012).


- 38 -

IMAGEN11: Diagrama de niveles de energía luminosa hace que la molécula pase desde un

estado fundamental (E1) a otro excitado (E2). Posteriormente la molécula relaja su energía

mediante distintos mecanismos (vibración, rotación, etc.)

En espectroscopia el término luz no sólo se aplica a la forma visible de radiación

electromagnética, sino también a las formas UV e IR, que son invisibles. En

espectrofotometría de absorbancia se utilizan las regiones del ultravioleta (UV cercano,

de 195-400 nm) y el visible (400-780 nm).

IMAGEN 12: Espectro electromagnético

Los compuestos con dobles enlaces aislados, triples enlaces, enlaces peptídicos,

sistemas aromáticos, grupos carbonilos y otros heteroátomos tienen su máxima

absorbancia en la región UV, por lo que ésta es muy importante para la determinación

cualitativa y cuantitativa de compuestos orgánicos. Diversos factores como pH,

concentración de sal y el disolvente, alteran la carga de las moléculas, provocan

desplazamientos de los espectros UV.


- 39 -

En la región visible apreciamos el color visible de una solución y que corresponde a las

longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. El color que absorbe es el

complementario del color que transmite. Por tanto, para realizar mediciones de

absorción es necesario utilizar la longitud de onda en la que absorbe luz la solución

coloreada.

Tabla No. 4: Comparación de la longitud de onda con el color observado y el que absorbe.

Longitud de onda λ Color que absorbe Color que se refleja o

ve

390-435 Violeta Amarillo verdoso

435-490 Azul Amarillo

490-580 Verde Rojo

580-595 Amarillo Azul

595-650 Naranja Azul verdoso

650-780 Rojo Verde azulado

5.1.1 Proceso de absorción

La ley de absorción, también llamada ley de Lambert Beer o simplemente ley Beer,

indica cuantitativamente la forma en que el grado de atenuación depende de la

concentración de las moléculas absorbentes y de la longitud del trayecto en la que

ocurre la absorción. Cuando la luz atraviesa un medio que contiene un analito

absorbente, disminuye su intensidad como consecuencia de la excitación del analito.

Cuanto más largo sea el medio por el que pasa la luz (longitud del trayecto de la luz),

en el caso de una solución del analito de concentración dada, existirán más moléculas o

átomos absorbentes en el trayecto y, por tanto, mayor será la atenuación.

Además, para una longitud del trayecto dada de la luz, cuanto mayor sea la

concentración de los átomos o moléculas absorbentes, tanto mayor será la atenuación

(Skoog, 2005).


- 40 -

5.1.2 Transmitancia

La Transmitancia T de la solución es la fracción de la radiación incidente que se

transmite en la solución.

T= P/P0

Po [=] Es la intensidad de la radiación del haz en fotones que incide sobre la celda.

P [=] Es la intensidad de la radiación del haz que abandona la celda (P ≤ P0)

Es frecuente que se exprese como porcentaje; denominado porcentaje de

transmitancia.

%T= (P/P0)*100

5.1.3 Absorbancia

La absorbancia A de una solución se relaciona con la transmitancia de manera

logarítmica.

A= -log T = log P0/P

Se reduce la transmitancia a medida que aumenta la absorbancia de la disolución.

5.1.4 Ley de Beer

La absorbancia es directamente proporcional a la concentración de la especie

absorbente c y a la longitud de trayecto b del medio de absorción, como se expresa.

A= log P0/P = abc

Aquí, a es la constante de proporcionalidad llamada absortividad. Dado que la

absorbancia es una cantidad sin unidades la absortividad debe tener unidades que

eliminen a las de b y c. Por ejemplo, si c tiene como unidades gL-1, y b tiene cm, la

absortividad posee las unidades Lg-1cm-1.


- 41 -

Cuando se expresa la concentración con moles por litro, y b en centímetros, la

constante de proporcionalidad se llama absortividad molar y recibe el símbolo especial

ε, así;

A= εbc

A [=] Es la absorbancia; definida como la cantidad de radiación que absorbe una

solución y es una magnitud adimensional.

ε [=] Constante de proporcionalidad (absortividad)

b[=] Longitud interna de la celda 1cm.

c [=] Concentración de las especies absorbentes.

5.1.5 Medición

Ya que la solución que se estudia debe contenerse en algún tipo de recipiente (celda o

cubeta), en las paredes de la celda son posibles pérdidas por reflexión y dispersión,

como lo muestra la IMAGEN13 y pueden ser considerables. Por ejemplo, casi el 8.5%

de un haz de luz amarilla se pierde por reflexión a su paso por una celda de vidrio. La

luz también puede dispersarse en todas las direcciones desde la superficie de

moléculas o partículas grandes (como el polvo) en el disolvente y causar la atenuación

adicional del haz a su paso por la solución.

IMAGEN 13: Posibles pérdidas por reflexión

La compensación de estos efectos requiere comparar la energía de un haz que se

transmite por una celda que contiene la solución del analito con la energía de un haz

que cruce una celda idéntica que solo contiene el disolvente o blanco.


- 42 -

Así, se obtiene una absorbancia experimental, que se aproxima mucho a la absorbancia

verdadera de la solución es decir:

A= log P0/P = log P solvente/P solución

Los términos P yP0 se refieren a la energía de un haz que ha cruzado celdas que

contienen el blanco (solvente) y el analito, respectivamente (Skoog, 2005).

5.2 INSTRUMENTACIÓN DEL ESPECTROFOTÓMETRO UV-VISIBLE

La medición de absorbancia de la luz por las moléculas se realiza en unos aparatos

llamados espectrofotómetros. Aunque pueden variar en diseño, en especial con la

incorporación de ordenadores para el análisis de datos, todos los espectrofotómetros

constan, según se indica en la IMAGEN 14 de:

Una fuente de energía radiante: lámpara de deuterio y tungsteno.

Un monocromador para la selección de radiaciones de una determinada

longitud de onda: filtros, prismas, redes de difracción.

Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o

tubos) que contenga la muestra pueden ser de vidrio, cuarzo o plástico

transparente. Para medir en UV se deben usar las de cuarzo o sílice

fundido, porque el vidrio no transmite la radiación UV.

Un detector de luz y un amplificador convertidor de las señales luminosas

en señales eléctricas.

Un registrador o sistema de lectura de datos.


- 43 -

IMAGEN 14: Instrumentación espectrofotómetro UV-visible.

5.3 OBTENCIÓN DE UN ESPECTRO DE ABSORCIÓN

El espectro de absorción es una representación gráfica que indica cantidad de luz

absorbida (ε) a diferentes valores de λ. A partir de una solución diluida de un

compuesto, cuya absorbancia máxima entra dentro del rango de medida del

espectrofotómetro, se verá el valor de absorbancia a diferentes longitudes de onda

frente a un blanco que contenga el disolvente de la solución de la muestra a

caracterizar. A partir del espectro de absorción se obtendrá el valor de λ al que el

compuesto presenta la mayor absorbancia (λmax). Dicha λ se utilizará a la hora de

hacer determinaciones cualitativas y cuantitativas del compuesto. El espectro de

absorción de un cromóforo depende, fundamentalmente, de la estructura química de la

molécula.


- 44 -

No obstante, hay una gran cantidad de factores que originan variaciones en los valores

de λmax y εM, entre los que se incluye el pH, la polaridad del solvente o moléculas

vecinas y la orientación de los cromóforos vecinos; y cada uno afecta de forma

particular. Por ejemplo, variaciones originadas por cambios de pH son debidas al efecto

de éste sobre la ionización del compuesto(Abril, 2012).

5.4 CURVAS DE CALIBRACIÓN

Para obtener una curva de calibración de un compuesto se preparan soluciones de

diferentes concentraciones del mismo, determinándose para cada una de ellas el valor

de absorbancia a λmax. Estos valores de absorbancia se representan en el eje de

abscisas (eje de x) y los de concentración en el eje de ordenadas (eje de y). Se

observará que, a bajas concentraciones, el aumento de concentración se corresponde

con un incremento lineal en la absorbancia (zona de cumplimiento de la ley de Lambert-

Beer). A concentraciones altas la linealidad se pierde y se observa que la línea se

aplana, por lo que las medidas son poco fiables (Abril, 2012).

La representación de Lambert-Beer, A = εbc, nos permitirá calcular el valor del

coeficiente de absortividad molar, que corresponde a la pendiente de la recta.

Tipos

Pueden existir varias modalidades de curvas de calibración en general:

Directa

El analito genera o proporciona la respuesta analítica

Indirecta

El analito NO genera o proporciona la respuesta analítica por consiguiente habrá que

adicionar un reactivo para que exista una reacción en donde el reactivo o el producto

serán responsables de la respuesta analítica.


- 45 -

6.0 POLIFENOLES Los compuestos fenólicos son un grupo de compuestos orgánicos con uno o más

grupos hidroxilos en el anillo o anillos aromáticos. Pueden ser fenoles simples

hasta aquellos complejos conocidos como polifenoles.

Los fenoles simples son el resultado de la descarboxilación de ácidos fenólicos,

degradación térmica de lignina o de la actividad antimicrobiana. Solo algunos fenoles

son considerados con importancia en alimentos, como el ácido cafeico, ferúlico,

gálico y sus derivados, y los flavonoides y sus derivados. Los flavonoides son

pigmentos importantes en una gran variedad de frutos y vegetales.

Estos compuestos pueden ser clasificados como solubles en agua o en lípidos,

dependiendo en como ellos actúen primeramente en una fase acuosa o en una

región lipofílica en membranas celulares. Los compuestos fenólicos pueden contribuir

con el aroma y sabor, proporcionando amargura y acidez a algunos frutos, así

como el color de numerosos productos alimenticios de origen vegetal o animal.

Asimismo estos compuestos presentan actividad biológica como antimicrobianos,

antivirales, antiinflamatorios, antitumorales, anticancerígenos y antioxidantes

principalmente:

IMAGEN 15: Compuestos que presentan actividad biológica.


- 46 -

La afinidad por proteínas, junto con la complejación de metales necesarios para el

metabolismo celular, se ha relacionado con la actividad antimicrobiana inespecífica que

presentan algunos polifenoles.

6.1 CUANTIFICACIÓN DE POLIFENOLES

El método de Singleton y Rossi, es el método más utilizado para determinar los fenoles

totales. Se fundamenta en una reacción de oxidación reducción que es el mecanismo

básico; gracias al carácter reductor del reactivo de Folin Ciocalteu (Barceló, 1990).

El reactivo de Folin Ciocalteu es una mezcla de ácidos fosfotúngstico (fosfowolfrámico)

y fosfomolíbdico en medio básico, que se reducen al oxidar los compuestos

fenólicos, originando óxidos azules de wolframio y molibdeno. La coloración que se

produce, presenta una absorción máxima alrededor de los 750 nm, y es proporcional a

la concentración de compuestos fenólicos presentes en la muestra. Se cuantifica por

espectrofotometría en base a una recta patrón de ácido gálico (pirogalol). (Barceló,

1990) (Marinova, 2005) (Chuquimia, 2008) (Julián, 2009) (Díaz, 2009).

IMAGEN 26: Reacción entre polifenoles y el reactivo de Folin Ciocalteu. En el cual el Mo (VI) es reducido a Mo (V) con un e- donado por un antioxidante (Cervantes, 2011).


- 47 -

Los fenoles sólo se oxidan rápidamente en un medio suficientemente alcalino. Pero, en

estas condiciones, el reactivo oxidante y el pigmento azul son inestables. Por ello, el

reactivo debe encontrarse en exceso, para que, aún a pH alcalino, se conserve

inalterada al menos una fracción el tiempo necesario para reaccionar con todos los

fenolatos (Conde, 1994).

Los flavonoides son compuestos fenólicos abundantes en la naturaleza, producto

del metabolismo de las plantas. Estos metabolitos secundarios se encuentran

principalmente en las partes aéreas de estas, ya que necesitan la luz del sol para

sintetizarse. Por lo que estos compuestos se concentran en frutos, vegetales, semillas y

flores(Julián, 2009). Los flavonoides son compuestos de bajo peso molecular que

comparten un esqueleto común de difenilpiranos (C6-C3-C6), compuesto por dos anillos

de fenilos (A y B) ligados a través de un anillo C de pirano (heterocíclico).

Los átomos de carbono en los anillos C y A se numeran del 2 al 8, y los del anillo B

desde el 2' al 6' (IMAGEN 16).

IMAGEN 16: Flavonoides Estructura básica y tipos.


- 48 -

Dada su capacidad para capturar radicales libres y de crear complejos con iones

metálicos tienen una actividad antioxidante muy alta. La actividad de los flavonoides

como antioxidantes depende de las propiedades redox de sus grupos

hidroxifenólicos y de la relación estructural entre las diferentes partes de la estructura

química (Julián, 2009).

6.2 CUANTIFICACIÓN FLAVONOIDES.

Los flavonoides Totales se determinan de acuerdo al método descrito por Zhishen. Las

muestras son mezcladas con AlCl3 y NaNO2, formándose un complejo flavonoide-

aluminio de color rojo en medio alcalino (Julián, 2009), (Chuquimia, 2008) (Marinova,

2005).


- 49 -

7.0 BACTERIAS. Las bacterias son microorganismos unicelulares que presentan un tamaño entre 0,5 y 5

μm, por lo general y diversas formas incluyendo esferas (cocos), barras (bacilos) y

hélices (espirilos). Las bacterias son procariotas y, por lo tanto, a diferencia de las

células eucariotas (de animales, plantas, hongos, etc.), no tienen el núcleo definido ni

presentan, en general, orgánulos membranosos internos. Generalmente poseen una

pared celular compuesta de peptido glicano. Muchas bacterias disponen de flagelos o

de otros sistemas de desplazamiento.

Las bacterias pueden diferenciarse por su capacidad para retener un colorante básico

(violeta cristal) después de su fijación con yodo y decoloración con alcohol (Tinción de

Gram), se dividen en Gram (+) y Gram (-). Las Gram (+) conservan el colorante, a

causa de los ácidos teicoicos que contienen en sus paredes celulares, en tanto que las

Gram (-) se decoloran con el alcohol y después se colorean de rojo con safranina,

debido a que tienen una membrana externa adicional que contiene lipopolisacárido

(endotoxina). La forma de las bacterias al microscopio está determinada por la rigidez

de su pared celular.

7.1 BACTERIAS GRAM POSITIVAS

ESTRUCTURA BÁSICA

La estructura básica de las bacterias Gram (+) está constituida principalmente por una

capa gruesa de peptidoglicano (mureina) y dos clases de ácidos teicoicos. Ácido

Lipoteicoico que está en la superficie, empotrado en la capa de peptidoglicano y unido a

la membrana citoplásmica. Y ácido teicoico de la pared que está en la superficie y se

une sólo a la capa de peptidoglicano (IMAGEN 17).

http://es.wikipedia.org/wiki/Microorganismo

http://es.wikipedia.org/wiki/Unicelular

http://es.wikipedia.org/wiki/Micr%C3%B3metro_(unidad_de_longitud)

http://es.wikipedia.org/wiki/Procariota

http://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lulas

http://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lula_eucariota

http://es.wikipedia.org/wiki/Animales

http://es.wikipedia.org/wiki/Plantas

http://es.wikipedia.org/wiki/Hongos

http://es.wikipedia.org/wiki/N%C3%BAcleo_celular

http://es.wikipedia.org/wiki/Org%C3%A1nulos

http://es.wikipedia.org/wiki/Membrana_celular

http://es.wikipedia.org/wiki/Pared_celular

http://es.wikipedia.org/wiki/Peptidoglicano

http://es.wikipedia.org/wiki/Flagelo_bacteriano


- 50 -

Peptidoglicano (mucopéptido): Compuesta por moléculas alternadas de N-

acetilglucosamina, además tiene adherido a cada molécula de ac. muramico un

tetrapéptido formado por D y L aminoácidos.

Ácido teicoico: Polímeros de fosfatoglicerol y ribitol, se localizan en la capa

externa de la pared celular y algunos de estos atraviesan hasta llegar al

peptidoglicano.

IMAGEN 17: Estructura de las bacterias gram (+).

7.2 BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

Estructura básica

Tiene una capa delgada de peptidoglicano (mureina) unida a una membrana exterior

por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y

lipopolisacárido. En el lipopolisacárido, la porción de lípido está embebida en el

fosfolípido y el antígeno O está en la superficie. La pared de la célula tiene poros

llamado Porines para el transporte de substancias de peso molecular bajo.


- 51 -

Entre la membrana citoplásmica y la pared celular hay un espacio periplásmico con

enzimas hidrolíticas, enzimas inactivadoras de antibióticos y proteínas de transporte

(IMAGEN 18).

IMAGEN 18: Estructura de las bacterias gram (-).

Los bacilos Gram (-) normalmente son microorganismos que no forman esporas, las

estructura básica de la pared celular de estos bacilos son de gran importancia y son los

responsables de su patogenia.

Muchos microorganismos, como Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli pueden

presentan una cápsula formada por material polisacárido, que se denomina antígeno

capsular o también llamado antígeno K. A través de la capsula externa de los

organismos móviles penetra una estructura proteica denomina flagelo, portadora del

antígeno H. Estructuras superficiales llamadas fimbrias que sobresalen de la cápsula o

de la pared celular externa facilitan la adherencia a la mucosa de diferentes aparatos.


- 52 -

7.3 Enterococcus faecalis.

Son cocos Gram positivos, pertenecen al grupo D de la clasificación de Lancefield, con

tolerancia a la sal (NaCI 6.5%), dan un resultado positivo a la prueba de bilis esculina

por lo que se diferencia de otros estreptococos no enterococos. Produce infecciones

urinarias, abscesos pélvicos, peritonitis, infecciones de heridas, endocarditis. En el

ganado bovino se halla en el tracto intestinal, estiércol, ubres infectadas y equipo

contaminado.

7.4 Staphylococcus aureus.

Cocos Gram (+) agrupados en racimos, anaerobio facultativo, catalasa y coagulasa (+),

oxidasa (-), no es móvil, y no forma esporas. Su agar selectivo y diferencial es el medio

de sal y manitol (NaCl 7.5%) y por lo tanto son manitol (+), se encuentran en las

mucosas y en la piel de los animales y humanos(Cordero, 2005).

7.5 Escherichia coli

Pertenece a la familia Enterobacteriaceae, bacilo Gram (-), móvil, lactosa (+), catalasa

(+), oxidasa (-), anaerobio facultativo. Se identifica por IMViC, siendo Indol (+), MR (+),

VP (-) ycitratos (-); urea (-), KIA ácido/ácido y lisina (+).Son microorganismos

oportunistas, dado que son flora normal en el intestino(Cordero, 2005).

7.6 Pseudomonas aeruginosa

Pertenece a la familia Pseudomonadaceae y es un bacilo gran negativo aerobio estricto

con un flagelo polar. Produce catalasa y oxidasa, así como amoniaco a partir de la

arginina, y puede utilizar citrato como única fuente de carbono. Algunas cepas

presentan actividad hemolítica. Olor dulce o a masa de tortillas característico.

Crecen en medios desarrollados para enterobacterias, nutritivos y selectivos como agar

cetrimida (inhibidor de otras bacterias gram negativas y favorece la producción de

piocianina) y algunos caldos como asparagina, en un amplio rango de temperaturas que

van de 4 a 43ºC.

IV. EQUIPO, MATERIAL

Y REACTIVOS

FESC-UNAM EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS

- 54 -

MATERIAL

Matraz Erlenmeyer de 500mL

marca (PYREX)

Matraz aforado de 50mL (Pirex)



Matraz aforado ámbar de 10mL

(Pirex)

Vasos de precipitado de 50mL

Pipeta volumétrica de 1 y 10mL

Piseta

Barra magnética

Frascos ámbar

Membranas de 0,45µm,

diámetro: 2,5mm (Durapore®

PVDF)

Papel aluminio

Asa bacteriológica

Algodón

Gasa

Papel periódico

Espátulas

Membranas de filtración Millipore

de 0.4 μm

EQUIPO

Balanza analítica (Mettler AT200 Fact) precisión 0.1mg

pH-metro (Beckman Q 310)

Sonicador (Ultrasonic LC 304 Elma)

Micropipetas: 10-100µL, 100-1000µL y 1000-10,000 µL (Transferpette, Brand)

Capilar de sílice fundida de 60cm de largo, 50cm de largo efectivo, 145µm de

diámetro externo y 75µm de diámetro interno (BeckmanCoulter, Fullerton CA).

Equipo de electroforesis capilar (BeckmanCoulter P/ACE System MDQ

CapillaryElectrophoresis, Fullerton, CA).

Equipo de UV-Vis (Beckman DU 800)

Campana de flujo laminar

Autoclave (ALL AMERICAN Modelo 1925X)

Horno Pasteur Ríos S.A. Modelo HS-41

Estufa Bacteriológica Ríos Rocha S.A.

Microscopio óptico (OLYMPUS Modelo CHS)

Parrilla con agitador (NUOVA II StirPlate)

FESC-UNAM EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS

- 55 -

REACTIVOS

Ácido clorhídrico (Productos Químicos Monterrey)

Hidróxido de sodio (Productos Químicos Monterrey)

Solución amortiguadora estándar (BeckmanCoulterpH´s 4, 7 y 10)

Borato de sodio (J.T. Baker Xalostoc, México)

Refrigerantefluorinert™ FC-77

Agua desionizada

Metanol (grado técnico, purificado)

Agar cetrimida(BIOXON)

Caldo BHI(Infusión Cerebro Corazón)(MERK)

Agar agar

Agar cetrimida(BIOXON)

Agar Macconkey(BIOXON)

Agar Sales y manitol (DB)

Agar sangre (BIOXON)

BHI (Infusión Cerebro Corazón) (MERK)

EMB (Eosina Azul de Metileno) (MERK)

Pruebas bioquímica secundaria (Indol, Rojo de metilo, VoguesProskauer,

Citrato, Aminoácidos, Carbohidratos.) (BIOXON)

Aceite mineral

V. METODOLOGÍA

FESC-UNAM METODÓLOGIA

DIAGRAMA GENERAL DE TRABAJO

Preparación de los extractos

etanólicos de: Calendula officinalis,

Echinacea purpurea e Hippocratea

excelsa.

Esterilización por filtración con

membrana de 0.45 µm y prueba de

esterilidad en agar BHI para cada

extracto.

Obtención de los electroferogramas

de cada una de las plantas a pH 9.12

con búfer de boratos

Preparación del producto a base de

los extractos etanólicos y SSF

estéril

Pruebas de actividad

antibacteriana del extracto frente a

las cepas caracterizadas (ver

IMAGEN 19)

Cuantificación de Polifenoles y

flavonoides por espectrofotometría

en el producto. Observar siempre el

aspecto físico del producto. Evaluación de la estabilidad

Comparación del efecto

antibacteriano, concentración de

polifenoles y flavonoides con

respecto del tiempo.


- 58 -

1.0 PREPARACIÓN DE LOS EXTRACTOS

Se pesan 5g de la parte de la planta que se utiliza según sea el caso y se ponen en un

frasco ámbar con 500 mL de etanol al 70% y se deja reposar de 3 a 7 días agitando

frecuentemente (Montalvo, 2005). Los extractos etanólicos de las plantas se filtran por

gravedad con papel filtro para retirar la planta y después se realiza la esterilización por

filtración con una membrana 0.45 µm.

Partes utilizadas de las plantas para la preparación de los extractos:

Calendula officinalis – pétalos de la flor.

Cancerina (Hippocratea excelsa) – Corteza de raíz.

Equinacea purpurea - tallo y hojas

Para la esterilización por filtración se utiliza el filtro de bala previamente esterilizado y

membrana estéril 0.45µm en campana de flujo laminar, el filtrado se recibe en un frasco

ámbar estéril (Murillo, 2009.).

Prueba de esterilidad para los tres extractos. Con una punta estéril tomar unas gotas

del extracto de Calendula officinalis y colocarlos en una placa de agar BHI realizar con

el asa bacteriológica un sembrado masivo. Incubar durante 24-48 horas a 37 ºC y

observar si se presenta crecimiento (Jiménez, 2009).

Realizar este procedimiento con los extractos de Hippocratea excelsa y Echinacea

purpurea. Si alguno de las soluciones de trabajo presenta crecimiento microbiano se

debe de esterilizar nuevamente por filtración con membrana millipore de 0.22 μm

mejorando las condiciones de trabajo (Pérez, 2008).

1.2 PREPARACIÓN DEL PRODUCTO.

Se prepara SSF 0.9% y se esteriliza junto con el siguiente material en autoclave a 15lb

durante 15min: Matraz que contiene la SSF 0.9%, tapones y viales ámbar, probeta de

100mL, campana de vidrio y frasco repartidor. Después de la esterilización se trabaja

en la campana de flujo laminar previamente desinfectada con benzal 20 minutos antes

de trabajar.


- 59 -

En el frasco repartidor se vierte 850mL SSF y 50mL de extracto de cada planta. Se

llenan los frascos viales de aproximadamente 100 mL. Se tapan y se engargolan.

Para asegurar que las dosis estén estériles; se siembra de los viales en Agar BHI

abriendo el frasco y tomando con un asa redonda estéril porciones de líquido, se

incuban 24-48hrs a 37oC (Pérez, 2008).

2.0 METODOLOGÍA PARA ELECTROFORESIS CAPILAR

2.1 Preparación de muestras de los extracto etanólicos para electroforesis capilar

250μL del extracto etanólico + 800μL de buffer de boratos/sds pH 9.12, sonicar. Filtrar

cada muestra en membrana Durapore® de 0,45 μm y sonicar antes de introducirlas al

equipo.

2.2 Condiciones de análisis Inyección hidrodinámica (presión: 1.0 Psi, duración: 10,0s), separación (Voltaje: 30.0kV,

duración: 30 minutos polaridad: normal, detector: arreglo de diodos UV-VIS).

Las muestras se leen a una longitud de onda de 248 y 254nm.

3.0 METODOLOGÍA PARA ESPECTROFOTOMETRÍA UV-VIS

3.1 Polifenoles totales

Se realiza una curva de calibración (Ver TABLA No 8) para lo cual se utiliza una

solución estándar de pirogalol se toman volúmenes en intervalos de 0.05mL, se

agregan 0.2 mL de reactivo de Folin Ciocalteu y después se agrega 1mL de carbonato

de sodio al 5% llevándose a un aforo de 10mL. Los sistemas se dejan reposar 90

minutos para después leer a una longitud de 730nm.

Nota: El sistema más concentrado se emplea para determinar la longitud de onda óptima a la

cual se leen los sistemas de la curva de calibración indirecta, así como las muestras problema.


- 60 -

3.3 Preparación de muestras del producto para la determinación de polifenoles

Se toman 5 mL del producto (agitar previamente), 0.2 mL de reactivo de Folin Ciocalteu

y después se agrega 1mL de carbonato al 5% llevándose a un aforo de 10mL. Los

sistemas se dejan reposar 90min para después leer a una longitud de 730nm. Realizar

por triplicado.

Tabla No. 5: Sistemas de la curva de calibración indirecta de polifenoles.

Sistemas Blanco 1 2 3 4 5 6 7 Muestra

mLStd Pirogalol

0 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 5

mL Reactivo de Folin

0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

mL NaHCO3 5 %

1 1 1 1 1 1 1 1 1

mL Aforo 10 10

Una vez obtenidas las lecturas interpolar en la curva de calibración y tomar en cuenta

las diluciones para obtener la concentración de polifenoles en el producto.

3.4 Flavonoides totales

Se realiza una curva de calibración (TABLA No. 6), preparando una solución estándar

de Rutina (flavonoide) del cual se toman volúmenes de 0mL a 0.7mL en intervalos de

0.1mL se agregan 0.3mL de nitrito de sodio al 5% se deja reposar 6 minutos y después

se agregó 0.3mL de cloruro de aluminio al 10% se deja reposar 6 minutos y finalmente

se agrega NaOH 0.1M llevándose a un aforo de 10mL. Los sistemas se leen a una

longitud de 510nm. El sistema más concentrado se emplea para determinar la

longitud de onda óptima a la cual se leen los sistemas de la curva de

calibración indirecta, así como las muestras problema.


- 61 -

Preparación de muestras del producto para la determinación de flavonoides totales

Se toman 5mL del producto (agitar previamente) se agregan 0.3mL de nitrito de sodio al

5% se deja reposar 6 minutos y después se agregó 0.3mL de cloruro de aluminio al

10% se deja reposar 6 minutos y finalmente se agrega NaOH 0.1M llevándose a un

aforo de 10 mL los sistemas se leen a una longitud de 510nm.

TABLA No. 6: Sistemas para la curva de calibración indirecta de flavonoides.

Sistemas Blanco 1 2 3 4 5 6 7

mLStd Rutina 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

mL NaNO2(5%) 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3

mL AlCl3 10% 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3

mLNaOH 1M 2 2 2 2 2 2 2 2

mL Aforo 10

Una vez obtenidas las lecturas interpolar en la curva de calibración y tomar en cuenta

las diluciones para obtener la concentración de flavonoides en el producto.

4.0 METODOLOGÍA PARA LA PRUEBA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA

4.1 Preparación de medios de cultivo

Pesar la cantidad necesaria de acuerdo al marbete del medio y dependiendo de la

cantidad a preparar, calentar y agitar hasta disolver completamente esterilizar a 15lb,

121oC, 15minutos. Dejar enfriar a temperatura ambiente, servir en cajas Petri y esperar

hasta que los medios solidifiquen. Realizar prueba de esterilidad.


- 62 -

Recomendaciones:

Una vez esterilizados, los medios sólidos deben servirse en cajas de Petri a 45 ºC.

Los medios sólidos en pico de flauta (TSI, KIA, LIA, Citratos) se esterilizan en tubos

de tapón de rosca. Al terminar la esterilización, se deben mantener inclinados hasta

solidificación.

Los medios semisólidos y líquidos se esterilizan en tubos de tapón de rosca.

Cuando los medios estén solidificados o fríos, según sea el caso, se colocan en

refrigeración hasta su uso.

Al menos una de las cajas o tubos preparados de cada medio, debe someterse a

prueba de esterilidad incubándolos 24-48hrs a 37 0C.

4.2 Aislamiento e identificación de bacterias

Las cepas se toman de tubos de conservación y son inoculadas en agar BHI después

de 24hrs se observa la morfología colonial para verificar que no esté contaminadas. A

todas las cepas se les realiza la tinción de Gram, la prueba de Catalasa y Oxidasa para

verificar género, y para identificar las especies se realizan las pruebas bioquímicas

secundarias correspondientes. De ser necesario utilizar medios selectivos y

diferenciales para aislar e identificar las cepas*.

4.3 Prueba cualitativa de actividad antibacteriana

Muestra

Tomar 3 mL de muestra del producto poner en un tubo de rosca estéril e inocular con

cepa bacteriana hasta igualar al 0.5 del nefelómetro de Mac Farland. Incubar 12hrs a

370C, después tomar una asada e inocular en agar BHI 24hrs 370C. Leer y comparar

con el control de crecimiento (+) para determinar si tiene efecto bactericida o

bacteriostático.

NOTA: Las cepas de Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, y Pseudomonas

aeruginosa que se emplearon en el presente trabajo fueron proporcionadas por el laboratorio 10 de

Microbiología en la Unidad de Posgrado de la FESC-1 Cuautitlán.


- 63 -

IMAGEN 19: Metodóloga para la prueba cualitativa de actividad antibacteriana*.

Control de crecimiento (+)

Igualar al 0.5 del nefelómetro de Mac Farland en SSF. Incubar 12hrs a 370C, después

tomar una asada e inocular en agar BHI 24hrs 370C.

Control de crecimiento (-)

Tomar una asada o gota del producto e inocular en agar BHI 24hrs 370C.

*Nota: En cada una de las pruebas se realizó la prueba de esterilidad del medio de cultivo, con

el fin de observar que no existiera ningún tipo de contaminación que afectara el resultado.

64

VI. RESULTADOS y ANÁLISIS

FESC-UNAM RESULTADOS Y ANÁLISIS

La electroforesis capilar de zona se trata de una técnica analítica relativamente nueva

cuyo objetivo principal es separar entre sí, por acción de un campo eléctrico aplicado,

moléculas y/o macromoléculas, en general cargadas eléctricamente, que están

suspendidas en una solución electrolítica. Estos analitos se visualizan como picos que

aparecen a un determinado tiempo (que se designa como “de migración” o “de

detección”) en la pantalla de una PC que recibe la información desde el equipo

analizador.

Cada pico corresponde a un analito diferente y el área debajo de cada pico es una

medida de la concentración con que éste está presente en la mezcla que se estudia. El

conjunto de picos que se ve en la pantalla se llama electroferograma y, en principio, es

una valiosa información “empírica” desde el punto de vista químico analítico. En otras

palabras, el tiempo al cual se detecta un analito es característico del mismo bajo esas

condiciones de experimentación, lo cual resulta en una huella digital que servirá como

una forma de identificación y así evitar confusión con otro tipo de plantas muy

semejantes entre sí, que tengan propiedades farmacológicas y/o biológicas diferentes a

las deseadas.

Los resultados obtenidos fueron los siguientes Electroferogramas:

IMAGEN 20: Electroferograma de Echinacea purpurea a pH 9.12 lectura a 254 nm.


- 66 -

En la IMAGEN 20 se muestra el electroferograma de Echinacea purpurea donde solo se

observa el marcador de flujo electroosmótico con un tiempo de migración promedio de

4,7695 minutos y después de este no se obtuvo picos, por lo que a estas condiciones

no son identificables componentes en los extractos de Echinacea purpurea utilizados.

Es importante mencionar que el hecho de que no aparezcan picos en el

electroferograma, es una característica útil que podemos utilizar en la identificación de

la equinacea por este método, ya que otras plantas como las utilizadas en el presente

trabajo si presentan picos representativos de sus componentes a pH 9.12.

También es necesario someter la muestra a distintos pH para favorecer la disociación

de ciertos componentes que a pH 9.12 no es posible observar y que serían un

complemento para su identificación.

IMAGEN 21: Electroferograma de Hippocratea excelsa “Cancerina” a pH 9.12 lectura a 248 nm.


- 67 -

Cuando se tiene flujo electroosmótico (pH entre 4–12) y polaridad positiva, las especies

cargadas positivamente se mueven a lo largo del capilar con una velocidad que es

mayor que la del FEO, puesto que su movimiento se ve acelerado por la atracción de

sus cargas al electrodo negativo. Los analitos cargados negativamente se mueven más

lentamente y en contra del flujo electroosmótico debido a que son atraídos por el

electrodo positivo. Los analitos neutros se mueven a través del capilar con el FEO, por

lo general durante este movimiento no se produce separación entre las especies no

cargadas.

Los electroferogramas obtenidos con el extracto de Hippocratea excelsa muestran un

solo componente registrado después del flujo electroosmótico, por lo que se considera

como un compuesto aniónico.

La tabla 7 muestra una comparación de las movilidades electroforéticas del único

compuesto registrado en los electroferogramas de Hippocratea excelsa K., la

movilidad electroforética se recomienda en la literatura como un dato más adecuado

para poder hacer una comparación estadística.

TABLA No. 7: Movilidad electroforética de Hippocratea excelsa.

En base a la movilidad electroforética de cada pico se deduce que los

electroferogramas de Hippocratea excelsa obtenidos son muy semejantes entre sí, ya

que realizar los cálculos estadísticos muestra que los tiempos de migración son

precisos, al obtener un coeficiente de variación menor a 1.

No. Pico tm1 tm2 tm3 × f1 × f2 × f3 × f S C.V.

1 9,8566 9,8469 9,857 -1.171 -1.178 -1.171 -0,00725

4,571E-05 0,6299


- 68 -

Para observar si hay compuestos sobrepuestos en el único pico que se observa en el

electroferograma, se realizó una muestra más diluida 1/10, nuevamente se registró el

mismo pico de menor tamaño a un tiempo de migración similar IMAGEN 22 y 23.

IMAGEN 22: Electroferograma de Cancerina a pH 9.12 con una muestra diluida 1/10.

IMAGEN 23: Comparación de los Electroferogramas de Cancerina a pH 9.12 a diferente dilución.


- 69 -

Hippocratea excelsa K. es una planta a la que se le realizó su perfil electroforético con

anteriordad, para ello utilizaron las siguientes condiciones; voltaje de polaridad invertida

(-20 kV), con un tiempo de separación de 15 minutos, empleando buffer de boratos

20mM pH 9.35. Los resultados presentaron un único compuesto registrado antes del

flujo electroosmótico, por lo que se le consideró como aniónico.

IMAGEN 24: Perfil electroforético de Hippocratea excelsa K. polaridad invertida pH 9.35 empleando buffer de boratos (Cervantes, 2011).

El que se haya registrado solo un pico no indica que la planta contenga químicamente

un único componente, pero que en ambos estudios se confirma la presencia de un

componente anionico a un pH alrededor de 9 utilizando un buffer de boratos. Por lo que

ese compuesto es característico de los extractos de Hippocratea excelsa y puede ser

utilizado como característica principal de identificación de esta planta.


- 70 -

IMAGEN25: Electroferograma de Calendula officinalis L a pH 9.12 utilizando búfer de boratos lectura a 254nm.

En los electroferogramas de Calendula officinalis L. observamos que en ninguno de

ellos se encuentran compuestos catiónicos, ni tampoco neutros porque no se registran

compuestos antes del flujo electroosmótico al pH de trabajo. Se observa al inicio el

marcador de flujo electroosmótico y después 15 picos que corresponden a compuestos

que consideramos de naturaleza aniónica.

En la literatura están reportados compuestos catiónicos, neutros y aniónicos

encontrados en el extracto, a diferentes pH. Los trabajos reportados indican que los

compuestos aniónicos, es decir con carga negativa, los cuales se registran después del

flujo electroosmótico podrían ser principalmente ácidos fenólicos ya que se caracterizan

en tener en su estructura un grupo carboxilo y grupos hidroxilo, el pKa del ácido

carboxílico generalmente en este tipo de moléculas se encuentra entre los valores de 3

a 5, es decir que a pH 9 van a estar en su forma ionizada.

En el ANEXO 3 se encuentra la prueba de ANOVA hecha a los electroferogramas de

Calendula officinalis, esta se realizó para contrastar, si las medias muestréales no

difieren significativamente, utilizando un contraste F de una cola


- 71 -

El objetivo principal del presente trabajo fue determinar la estabilidad de un producto

hecho con una mezcla de tres extractos naturales (Calendula officinalis, Echinacea

purpurea e Hippocratea excelsa) el cual presenta actividad antibacteriana, para así

poder establecer un periodo en que permanece en condiciones aptas para su uso, es

decir un periodo de validez, en el que sus características se modifican solo dentro de

unos límites razonables lo cual permita utilizarlo. En cada evaluación se determino la

concentración de polifenoles y flavonoides presentes en el producto y se realizó de

manera paralela pruebas de actividad antibacteriana.

El producto se preparó en condiciones de esterilidad, utilizando frascos ámbar para su

almacenamiento debido a que la descomposición del producto puede darse más por

reacciones con agentes inertes del ambiente, como el agua, el oxígeno o la luz.

Para realizar la cuantificación de polifenoles se utilizó espectrofotometría en base a una

recta patrón de ácido gálico (pirogalol), para realizar la curva de calibración, se

determinó la longitud de onda óptima mediante un espectro de absorción desde la

región UV (200 nm) hasta la región Visible (800 nm).

GRAFICO No 1. Barrido espectrofotométrico del complejo Folín Ciocalteu– Pirogalol. La

longitud de onda óptima fue a los 730 nm que es donde se observa la máxima absorción.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

350 450 550 650 750 850

Ab

sorb

anci

a

Longitud de onda nm

Barrido para Polifenoles

Complejo Folin-Pirogalol


- 72 -

TABLA No. 8: Curva de calibración indirecta estándar para la cuantificación de polifenoles.

Sistema 1 2 3 4 5 6 7

Std Pirogalol ml 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4

Folin ml 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Carbonato 5% 1 1 1 1 1 1 1

Aforo 10ml 10 10 10 10 10 10 10

mg / 100 ml 0,2940 0,4410 0,5880 0,7350 0,8820 1,0290 1,1760

AbsCurva 1 0,3334 0,4947 0,6586 0,8629 1,0028 1,2023 1,3869

AbsCurva 2 0,3727 0,5569 0,6773 0,8489 1,0517 1,2357 1,3142

AbsCurva 3 0,2775 0,4826 0,6361 0,8282 0,9992 1,2029 1,4092

AbsCurva 4 0,3531 0,5339 0,7075 0,8990 1,0896 1,2837 1,4614

Abs Promedio 0,3342 0,5170 0,6699 0,8598 1,0358 1,2311 1,3929

Para poder utilizar el promedio de las absorbancias de las diferentes curvas de

calibración, como una única curva de calibración estándar, se realizó la prueba de

ANOVA a los coeficientes de absortividad molar de las diferentes curvas de calibración

realizadas de manera individual para comparar los datos obtenidos y determinar si

existe variación entre ellas, en donde se observó que no existe variación significativa

con una probabilidad de P= 0.05. (TABLA No. 9)

TABLA No 9: Análisis de varianza ANOVA de un factor realizada a los coeficientes de absortividad molar de las curvas de calibración indirecta de polifenoles (Ver anexo2, tabla 5). Donde se muestra que al ser la F calculada menor que en el valor crítico para F, no existe diferencia significativa entre los coeficientes absortividad de las diferentes curvas.

Origen de las variaciones

Suma de cuadrados

Grados de

libertad

Promedio de los

cuadrados

F Probabilidad

Valor crítico para F

Entre grupos 1880636,27

6 313439,3779 0,37939 0,8839 2,5727

Dentro de los grupos

17349692,6

21 826175,8396

Total 19230328,9

27


- 73 -

A la curva de calibración indirecta estándar se le realizó la regresión lineal y ajustó a la ecuación de la recta:

A = mx + b

Dónde:

A= absorbancia de la muestra

m= pendiente

x= concentración de analito expresada como [polifenoles expresados como mg/100m L de Pirogalol]

b= ordenada al origen

GRAFICO NO 2: Se puede observar la tendencia lineal de la curva de calibración indirecta de Pirogalol. Se obtuvo un coeficiente de correlación de 0.9996, el cual es muy cercano a 1, mostrando la relación que existe entre el aumento de la absorbancia y el incremento de la concentración de rutina, así mismo el coeficiente de determinación (r2) es cercano a 1, lo que indica el ajuste de los datos obtenidos al modelo lineal.

Los cálculos para determinar la ordenada al origen, concentraciones, desviación estándar y coeficiente de variación de la curva de calibración, se encuentran en el Anexo 2.

y = 1,2076x - 0,0246 R² = 0,9994

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

0,00 0,50 1,00 1,50

Ab

sorb

anci

a n

m

mg / 100 mL de Pirogalol

Polifenoles

Complejoazul


- 74 -

GRAFICO No. 3: Comparación entre las curvas de calibración realizadas con la curva de calibración estándar para polifenoles, en la cual se observa gráficamente que no hay diferencia significativa entre las curvas de calibración realizadas. (Ver prueba ANOVA).

Para realizar la cuantificación de los flavonoide se siguió la misma metodología que

para los polifenoles, se determinó la longitud de onda óptima mediante un espectro de

absorción desde la región UV (200 nm) hasta la región Visible (800 nm) GRAFICO 4.

Después se construyó una curva de calibración utilizando el promedio de las

absorbancias de las diferentes curvas de calibración realizadas, las cuales no

presentaron diferencia significativa con una probabilidad de P=0.05. (Ver anexo 3 para

análisis completo) al aplicar la prueba de ANOVA a los coeficientes de absortividad

molar de las diferentes curvas de calibración realizadas de manera individual (Anexo 2,

Tabla5). A la curva de calibración indirecta estándar se le realizó un análisis de

regresión lineal GRAFICO 5.

y = 1.2076x - 0,0246 R² = 0,9994

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40

Ab

sorb

anci

a n

m

mg / 100 mL de Pirogalol

Polifenoles

Curva 1

Curva 2

Curva 3

Curva 4

Curva estandar


- 75 -

GRAFICO No. 4: Barrido espectrofotométrico del complejo Rutina – AlCl3. La longitud de onda

óptima fue a los 530nm que es donde se observa la máxima absorción.

TABLA NO. 10: Curva de calibración indirecta estándar para la cuantificación de flavonoides.

Sistema 1 2 3 4 5 6 7 8 mL rutina 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

AlCl3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

NaNO2 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

Aforo 10 10 10 10 10 10 10 10

mg/100ml 1,41 2,82 4,23 5,64 7,05 8,46 9,87 11,28

Curva 1 0,1712 0,3243 0,4793 0,7050 0,8884 1,0529 1,2686 1,4451

Curva 2 0,1705 0,3149 0,4732 0,6581 0,8758 1,0586 1,2359 1,4265

Curva 3 0,1929 0,3435 0,5504 0,7311 0,9465 1,1191 1,2145 1,4353

Curva 4 0,1740 0,3203 0,5083 0,6648 0,8603 1,0501 1,2660 1,4265

Promedio 0,1771 0,3257 0,5028 0,6897 0,8927 1,0702 1,2462 1,4333

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850

Ab

sorb

anci

a

Longitud de onda nm

Flavonoides

Complejo Rojo

Blanco


- 76 -

TABLA No. 11: Análisis de varianza ANOVA de un factor realizada a los coeficientes de absortividad molar de las curvas de calibración indirecta de flavonoides (Ver anexo). Donde se muestra que al ser la F calculada menor que en el valor crítico para F no existe diferencia significativa entre los coeficientes absortividad de las diferentes curvas.

Origen de las

variaciones

Suma de cuadrados

Grados de

libertad

Promedio de los

cuadrados

F Probabilidad

Valor crítico para F

Entre grupos

96450,379 3 32150,1263 0,2958 0,82806438 2,9466


3042898,42

28 108674,944

Total 3139348,8 31

GRAFICO No. 5:curva de calibración indirecta de Rutina. Se obtuvo un coeficiente de correlación de 0.9995, el cual es muy cercano a 1, mostrando la relación que existe entre el aumento de la absorbancia y el incremento de la concentración de rutina, así mismo el coeficiente de determinación (r2) es cercano a 1, lo que indica el ajuste de los datos obtenidos al modelo lineal.

Los cálculos para determinar la ordenada al origen, concentraciones, desviación estándar y coeficiente de variación de la curva de calibración, se encuentran en el Anexo 2.

y = 0,1292x - 0,0275 R² = 0,9992

0,0000

0,2000

0,4000

0,6000

0,8000

1,0000

1,2000

1,4000

1,6000

0 2 4 6 8 10 12

Ab

s n

m

mg/100 mL de Rutina

Flavonoides

Complejo Rojo


- 77 -

GRAFICO No. 6: Comparación entre las curvas de calibración realizadas con la curva de calibración estándar para polifenoles, en la cual se observa gráficamente que no hay diferencia significativa entre las curvas de calibración realizadas. (Ver prueba ANOVA en ANEXO 3).

Antes de realizar la cuantificación de los polifenoles y flavonoides en el producto se

realizó la cuantificación de estos en los extractos de cada una de la plantas para saber

el aporte porcentual de polifenoles y flavonoides que presentan en el producto. Los

resultados se muestran en la siguiente tabla.

TABLA No. 12: Muestra la cuantificación de Polifenoles llevada a cabo a los extractos de

manera individual.

Cuantificación de polifenoles en los extractos de las plantas

Muestra Alícuota (ml) Aforo (mL)

Mg equivalentes a Pirogalol/100

ml extracto

PM g/mol

[M] eq a Pirogalol

Equinacea

1,0

10 1,843

126,11 0,000146

Calendula

1,0

10 6,073

126,11 0,000482

Cancerina

0,5

10 17,865

126,11 0,001417

y = 0,1292x - 0,0275 R² = 0,9992

0,0000

0,2000

0,4000

0,6000

0,8000

1,0000

1,2000

1,4000

1,6000

0 2 4 6 8 10 12

Ab

s n

m

mg/100 mL de Rutina

Flavonoides

Curva estandar

Curva 1

Curva 2

Curva 3

Curva 4


- 78 -

TABLA No. 13: Muestra la cuantificación de flavonoides llevada a cabo a los extractos de

manera individual.

Cuantificación de flavonoides en los extractos de las plantas

Muestra Alícuota (ml) Aforo (mL)

mg equivalentes a Rutina/100 ml

de extracto

PM g/mol

[M] eq a rutina

Equinacea

3,0

10

3,909

610,52 6,403E-05

Calendula

1,0

10

30,205

610,52 4,947E-04

Cancerina

0,5

10

70,309

610,52

0,0011516

Las tablas nos muestran la cuantificación de polifenoles y flavonoides llevada a cabo a

cada uno de los extractos utilizados, esto nos permitió hacer una estimación de la

proporción que aportan los extractos utilizados de dichos analitos, para ello se tomó en

cuenta que estos se mezclan en la misma proporción (5mL de cada extracto) es decir la

suma de sus concentraciones nos da el 100 % de aporte de los extractos. De esta

manera podemos observar que la Cancerina tiene la mayor concentración tanto de

polifenoles como de flavonoides y por tanto el mayor aporte (Gráfico 7).

Grafico No. 7: Aporte de polifenoles y flavonoides de los extractos en el producto.

7%

24%

69%

% Polifenoles aportado por los extractos al producto

Equinacea Calendula Cancerina

3,7438%

28,9253%

67,3309%

% Flavonoides aportado por los extractos al producto



- 79 -

En las tablas No 12 y 13 podemos observar la concentración expresada como mg/100

mL de Pirogalol y mg/100mL de Rutina para polifenoles y flavonoides respectivamente

en cada uno de los extractos, pero poder hacer una comparación entre las

concentraciones de dichos analitos en cada extracto se calculó sus concentraciones

expresadas en Molaridad, de tal manera que esto nos permitió ver si dentro de estos

polifenoles cuantificados existían flavonoides en las plantas dado que los flavonoides

son polifenoles. De esta manera podemos observar que de los polifenoles que presenta

la equinacea el 43% son flavonoides, que la Calendula solo contiene flavonoides y que

la Cancerina presenta una gran cantidad de polifenoles de los cuales el 81 % de ellos

son flavonoides. Esto es importante debido a que la actividad antibacteriana que

presentan estos extractos, en los diferentes estudios se menciona es debido a la

presencia de flavonoides.

GRAFICO No. 8 Comparación de la concentración de polifenoles con respecto a la

concentración de flavonoides en cada extracto.

0,00000

0,00020

0,00040

0,00060

0,00080

0,00100

0,00120

0,00140

0,00160


Mo

lari

dad

Comparacion de [M] Polifenoles y Flavonoides


- 80 -

IMAGEN 26: A la derecha se muestra la coloración verde-azul

característica para la cuantificación de polifenoles por el

método de Folín Ciocalteu, sistemas más concentrados dan

una coloración azul intenso casi negro. A la izquierda el color

rojo característica para la cuantificación de flavonoides

utilizando el método de Zhishen, Debe respetarse los tiempos

de incubación para que reaccionen todos los flavonoides, una

mala incubación da una coloración rojo pálido, precipitados o

nulo color.

Grafico No. 9 Cuantificación de polifenoles respecto al tiempo expresado como mg/100mL de

Pirogalol.


- 81 -

El grafico no. 9, muestra las concentraciones estimadas de polifenoles totales del

producto, y como se puede observar en la tabla no. 14 , no hay variacion significativa de

la cantidad de polifenoles con respecto a la media de las concentraciones, lo cual se

demuestra con el analisis de varianza ANOVA realizado a dichas concentraciones, lo

que indica que los polifenoles se mantienen estables, por un período de tiempo

prolongado, y con ello la actividad biológica que depende de los polifenoles se

mantendrá constante, al ser proporcional. El resultado que se reporta es el promedio

de las mediciones realizadas en cada analisis a lo largo de 8 meses, realizadas bajo

las mismas condiciones de análisis.

TABLA No.14: Análisis de varianza para las concentraciones de polifenoles.

Grafico No. 10: Cuantificación de flavonoides respecto al tiempo expresado como mg/100 mL

de Rutina.

ANÁLISIS DE VARIANZA

Origen de las

variaciones

Suma de cuadrados

Grados de

libertad

Promedio de los

cuadrados

F Probabilidad Valor crítico para F

Entre grupos

0,12686454 15 0,00845764 1,06666667 0,44808814 2,35222276


0,12686454 16 0,00792903

Total 0,25372907 31


- 82 -

La TABLA 15 , muestra las concentraciones estimadas de flavonoides totales del

Producto, y como se puede observar en la Grafica 3, no hay variación significativa de la

cantidad de flavonoides con respecto a la media de las concentraciones, lo cual se

demuestra con el análisis de varianza ANOVA realizado a dichas concentraciones, lo

que indica que los polifenoles se mantienen estables, por un período de tiempo

prolongado, el resultado que se reporta es el promedio de tres mediciones por fecha

durante 8 meses, realizadas bajo las mismas condiciones de análisis.

TABLA No. 15: Análisis de varianza para las concentraciones de flavonoides respecto al tiempo

Grafico No. 11 Comparación de la concentración M entre polifenoles y flavonoides respecto al

tiempo.

Análisis de varianza flavonoides

Origen de las

variaciones

Suma de cuadrados

Grados de

libertad

Promedio de los

cuadrados


Entre grupos

1,21918 15 0,08127903 1,0666 0,44808814 2,3522


1,21918 16 0,07619909

Total 2,4383 31

3E-05

4E-05

5E-05

6E-05

7E-05

8E-05

9E-05

0,0001

MO

LAR

IDA

D

[M] Polifenoles y Flavonoides vs Tiempo

Polifenoles[M]

Flavonoides [M]


- 83 -

En el grafico No. 11 Observamos la comparación respecto al tiempo de la

concentración de los polifenoles y flavonoides en él se observa que la concentración de

los polifenoles siempre fue mayor a la de los flavonoides es decir en los extractos

existen otros compuestos que pueden ser polifenoles diferentes de los flavonoides y

que también se conservan durante un tiempo prolongado. También se observa que la

variación de los flavonoides es menor en las mediciones realizadas que la de los

polifenoles.

Con las pruebas de ANOVA realizadas se demuestra estadísticamente que ambos son

estables y que la actividad biológica que depende de estos compuestos debe de

permanecer durante el lapso de tiempo en se realizó el estudio, para ello de forma

paralela se realizaron pruebas de la actividad antibacteriana los cuales respaldan estos

resultados. (Ver tabla No. 16)

Para realizar las pruebas de actividad antibacteriana se trabajó con 4 cepas a las que

se les realizó sus pruebas bioquímicas más características, que se muestran en las

tablas en el anexo No. 4.

En la tabla No.16 se muestra que los resultados obtenidos de las pruebas de actividad

antibacteriana que se realizaron respecto del tiempo en que duro el estudio coinciden

con la estabilidad mostrada en las concentraciones de polifenoles y flavonoide es decir,

el producto que se utilizó mostro actividad bactericida, la cual nunca desapareció en las

condiciones en que se almaceno el producto.

Cabe mencionar que no se probó si el producto o cada uno de los extractos

presentaban o no actividad antibacteriana esto ya había sido probado con anterioridad

en los estudios realizados en el laboratorio 10 de microbiología donde se comprobó su

efecto antibacteriano.


- 84 -

TABLA No. 16: Tabla General de resultados: se observa la concentración de polifenoles y

flavonoide en [M] y así como las pruebas de actividad antibacteriana y apariencia.

Fecha 7 de abril

13 de abril

20 de abril

27 de abril

2 de mayo

16 de mayo

2 de junio

29 de junio

Polifenoles [M]

9,36E-05 8,69E-05

8,87E-05 7,84E-05

6,61E-05

6,15E-05

6,95E-05

6,70E-05

Flavonoides [M] 6,32E-05

6,33E-05 6,33E-05

6,33E-05

6,27E-05

5,83E-05

5,81E-05 5,88E-05

*Actividad Antibacteriana

E coli (-) (-) (-) (-) (-) (-) bs (-)

S.fecalis (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

S .aureus (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) P. auroginosa (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

**Cambio en la

apariencia

(-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

***Cambio de olor

(-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

Fecha 10 de agosto

1 de Sep.

6 de octubre

1 de Nov.

17 de Nov.

30 de Nov.

7 de Dic.

15 de Dic.

Polifenoles M

8,14E-05 6,52E-05

7,10E-05 7,2E-05 6,186E-05

6,27E-05

6,01E-05

7,63E-05

Flavonoides M 6,36E-05

5,36E-05 6,12E-05

5,60E-05

5,47E-05

4,92E-05

3,77E-05

4,63E-05

*Actividad Antibacteriana

E coli (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

S. faecalis (-) bs (-) (-) (-) (-) (-) (-)

S .aureus (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) P. aeruginosa (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

Cambio de apariencia

(-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

Cambio de olor

(-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

*Pruebas de antibacteriana (+) Crecimiento bacteriano, (-) Sin crecimiento, Bs Efecto bacteriostático. ** (+) Se observaron cambios en la apariencia del producto, (-) Sin cambio *** (+) El olor cambio, (-) Conservo su olor característico.


- 85 -

La apariencia del producto tampoco sufrió cambio alguno, el producto se mostró

siempre como un líquido amarillo claro ligeramente opaco de olor característico

agradable al olfato, siempre y cuando el frasco contenedor se encuentre protegido de la

luz, cerrado y a temperatura ambiente.

Este producto es de dosificación única por lo que una vez abierto se utiliza por

completo. Una vez expuestos al oxígeno y a la luz los extractos tienen una degradación

muy rápida, y presentan asentamientos y a lo largo de un tiempo pueden presentar

turbidez, que es signo de contaminación microbiana.

VII. CONCLUSIONES

FESC-UNAM CONCLUSIONES

Se determinaron los perfiles electroforéticos de los extractos etanólicos de Calendula

officinalis, Echinacea purpurea e Hippocratea excelsa, mediante la técnica de

electroforesis capilar, empleada como método de identificación de especies vegetales

en donde trabajando a las mismas condiciones los electroferogramas de extractos de

una misma planta de diferente procedencia, dan un trazo característico.

Se estimó el contenido de polifenoles totales presentes en un producto fitoquímico por

espectroscopia UV-Vis, mediante una curva de calibración indirecta utilizando el

Pirogalol como estándar, observando que la cantidad de polifenoles totales no difiere

significativamente con respecto al tiempo.

Se estimó el contenido de flavonoides totales presentes en un producto fitoquímico por

espectroscopia UV-Vis, mediante una curva de calibración indirecta utilizando el

flavonoide Rutina como estándar, observando que la cantidad de flavonoides totales no

varía significativamente con respecto al tiempo.

El producto conserva su actividad antibacteriana contra las cepas utilizadas con un

efecto bactericida en las condiciones en que se almacenó.

Dicho lo anterior y considerando que en las condiciones de almacenamiento No

presento cambios en su apariencia y olor, se concluye que el producto es estable y

conserva su actividad antibacteriana (in vitro), en un período de ocho meses tiempo que

duro esta evaluación.

- 88 -

ANEXO I FORMULAS PARA EL ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LAS CURVAS DE CALIBRACIÓN INDIRECTAS DE POLIFENOLES Y FLAVONOIDES

La media, de las medias viene dado por:

Desviación estándar, s, de n medias viene dada por:

Varianza: el cuadrado de la desviación estandar,

Coeficiente de variación:

Variacion dentro de muestras:

Variación entre muestras:

Donde Número total de medidas

Suma de las medidas en la ésima muestra

Suma de todas las medidas, gran total

Grados de libertad:

El estadístico del contraste es Cuadrado medio entre muestras/ Cuadrado medio

dentro de muestras y el valor crítico es: .

- 89 -

ANEXO 2 VALIDACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN INDIRECTA DE POLIFENOLES CON ESTÁNDAR DE PIROGALOL

TABLA 1. CURVA DE CALIBRACIÓN INDIRECTA DE PIROGALOL 1

SISTEMA 1 2 3 4 5 6 7

mg /100 ml 0,294 0,441 0,588 0,735 0,882 1,029 1,176

1 0,3499 0,5104 0,6604 0,8081 0,9290 1,1601 1,3032

2 0,2986 0,4773 0,6535 0,9192 1,0364 1,2430 1,4765

3 0,3516 0,4963 0,6618 0,8614 1,0430 1,2037 1,3810

0,3334 0,4947 0,6586 0,8629 1,0028 1,2023 1,3869

TABLA 2. CURVA DE CALIBRACIÓN INDIRECTA DE PIROGALOL 2.

SISTEMA 1 2 3 4 5 6 7

mg /100 ml 0,3728 0,5572 0,6774 0,8488 1,0517 1,2357 1,3141

1 0,3727 0,5569 0,6773 0,8489 1,0516 1,2357 1,3144

2 0,3726 0,5565 0,6771 0,8490 1,0519 1,2357 1,3141

3 0,3727 0,5569 0,6773 0,8489 1,0517 1,2357 1,3142

0,3728 0,5572 0,6774 0,8488 1,0517 1,2357 1,3141

y = 1,0758x + 0,0266 R² = 0,9954

0

0,5

1

1,5

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4

Ab

sorb

anci

a

mg/100 mL

Grafica 1. Curva de calibración de Pirogalol No. 1

- 90 -


SISTEMA 1 2 3 4 5 6 7

mg /100 ml 0,3728 0,5572 0,6774 0,8488 1,0517 1,2357 1,3141

1 0,2776 0,483 0,6355 0,828 0,9992 1,2027 1,4092

2 0,2775 0,4825 0,6359 0,8282 0,9992 1,2029 1,4092

3 0,2773 0,4824 0,6369 0,8284 0,9992 1,2031 1,4092

0,2775 0,4826 0,6361 0,8282 0,9992 1,2029 1,4092

y = 1,2631x - 0,0947 R² = 0,9986

0,00

0,50

1,00

1,50

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4

Ab

sorb

anci

a

mg/100 mL

Grafico 3. Curva de calibración indirecta de Pirogalol No. 3

y = 1,1071x + 0,0517 R² = 0,9928 0,00

0,50

1,00

1,50

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4

Ab

sorb

anci

a

mg/100 mL

Grafica 2. Curva de calibración de Pirogalol No. 2

- 91 -


SISTEMA 1 2 3 4 5 6 7

mg /100 ml 0,3728 0,5572 0,6774 0,8488 1,0517 1,2357 1,3141

1 0,2776 0,483 0,6355 0,828 0,9992 1,2027 1,4092

2 0,2775 0,4825 0,6359 0,8282 0,9992 1,2029 1,4092

3 0,2773 0,4824 0,6369 0,8284 0,9992 1,2031 1,4092

0,2775 0,4826 0,6361 0,8282 0,9992 1,2029 1,4092

PRUEBA DE ANOVA

Si la hipótesis nula es correcta, la estimación de varianzas ( ), no debería diferir

significativamente. Si es incorrecta la estimación entre muestras de será mayor que

la estimación dentro de las muestras, debido a la variación entre muestras.

Para contrastar si la estimación entre muestras es significativamente más grande se

utiliza un contraste F de una cola, en donde el valor crítico de F es mayor que F

calculado, se cumple la hipótesis nula, es decir las medias muestrales no difieren

significativamente.

y = 1x + 0,0001 R² = 1

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6

Ab

sorb

anci

a

mg/100 mL

Grafico 4. Curva de calibración indirecta de Pirogalol No. 4

- 92 -

ANOVA REALIZADA A LOS COEFICIENTES DE ABSORTIVIDAD MOLAR DE CADA

UNA DE LAS CURVAS DE PIROGALOL.

TABLA 5. COEFICIENTE DE ABSORTIVIDAD MOLAR DE LAS DIFERENTES

CURVAS DE CALIBRACIÓN INDIRECTAS DE PIROGALOL.

Sistema 1 2 3 4 5 6 7

E Curva 1 14300,092 14145,672 14124,225 14805,486 14338,062 14734,621 14872,616

E Curva 2 15986,802 15924,366 14525,527 14565,276 15037,879 15144,230 14093,007

E Curva 3 11901,810 13801,562 13642,614 14210,109 14286,747 14742,247 15111,753

E Curva 4 15146,068 15267,603 15174,665 15424,883 15578,827 15732,498 15671,884

TABLA 6. ANOVA DE LOS COEFICIENTES DE ABSORTIVIDAD MOLAR DE LAS

CURVAS DE CALIBRACIÓN INDIRECTAS DE PIROGALOL


Origen de las

variaciones

Suma de cuadrados

Grados de

libertad

Promedio de los

cuadrados


Entre grupos 96450,37898 3 32150,1263 0,2958 0,8280 2,9466

Dentro de los grupos 3042898,423 28 108674,944

Total 3139348,802 31

RESUMEN

Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza

Curva 1 7 5,94146667 0,84878095 0,14427883

Curva 2 7 6,05736667 0,8653381 0,12447935

Curva 3 7 5,8357 0,83367143 0,16110308

Curva 4 7 6,32823333 0,90403333 0,16140466

- 93 -

VALIDACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN INDIRECTA DE FLAVONOIDES CON

ESTÁNDAR DE RUTINA.

TABLA 1. CURVA DE CALIBRACIÓN INDIRECTA DE RUTINA 1

SISTEMA 1 2 3 4 5 6 7 8

mg /100 ml 1,41 2,82 4,23 5,64 7,05 8,46 9,87 11,28

1 0,1729 0,3101 0,4833 0,6679 0,8664 0,9994 1,2567 1,4261

2 0,1729 0,3384 0,4752 0,7421 0,9104 1,1063 1,2805 1,4641

3 0,1694 0,3101 0,4833 0,6679 0,8664 0,9994 1,2567 1,4261

0,1717 0,3195 0,4806 0,6926 0,8811 1,0350 1,2646 1,4388

TABLA 2. CURVA DE CALIBRACIÓN INDIRECTA DE RUTINA 2.

SISTEMA 1 2 3 4 5 6 7 8

mg /100 ml 1,41 2,82 4,23 5,64 7,05 8,46 9,87 11,28

1 0,1719 0,3151 0,4637 0,6581 0,8142 1,0189 1,2115 1,4068

2 0,1690 0,3149 0,4827 0,6687 0,9373 1,0983 1,2359 1,4265

3 0,1705 0,3147 0,4732 0,6474 0,8758 1,0586 1,2602 1,4462

0,1705 0,3149 0,4732 0,6634 0,8758 1,0586 1,2359 1,4265

y = 0,1283x - 0,0346 R² = 0,9987

0

0,5

1

1,5

0 2 4 6 8 10 12

Ab

sorb

anci

a

mg/100 mL

Grafico 5. Curva de calibracion de Rutina No. 1

- 94 -


SISTEMA 1 2 3 4 5 6 7 8

mg /100 ml 1,41 2,82 4,23 5,64 7,05 8,46 9,87 11,28

1 0,1738 0,3194 0,5078 0,6645 0,8597 1,0501 1,2669 1,4250

2 0,1737 0,3198 0,5080 0,6646 0,8600 1,0501 1,2679 1,4288

3 0,1736 0,3190 0,5076 0,6643 0,8594 1,0501 1,2688 1,4325

0,1737 0,3149 0,5078 0,6646 0,8597 1,0501 1,2359 1,4288

y = 0,1297x - 0,0458 R² = 0,9981

0,00

0,50

1,00

1,50

0 2 4 6 8 10 12

Ab

sorb

anci

a

mg/100 mL


y = 0,1284x - 0,0355 R² = 0,9986

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

0 2 4 6 8 10 12

Ab

sorb

anci

a

mg/100 mL


- 95 -


SISTEMA 1 2 3 4 5 6 7 8

mg /100 ml 1,41 2,82 4,23 5,64 7,05 8,46 9,87 11,28

1 0,17395 0,3203 0,508 0,6649 0,8599 1,0503 1,2671 1,4068 2 0,1741 0,32025 0,50825 0,6647 0,8606 1,0499 1,2649 1,4462 3 0,1738 0,3202 0,5085 0,6648 0,86025 1,0501 1,266 1,4265

0,1740 0,3149 0,5083 0,6648 0,8603 1,0501 1,2359 1,4265

TABLA 5. COEFICIENTE DE ABSORTIVIDAD MOLAR DE LAS DIFERENTES

CURVAS DE CALIBRACIÓN INDIRECTAS DE RUTINA.

RESUMEN


Curva 1 8 8 59939,03812 7492,379765

Curva 2 8 8 58739,45704 7342,432131

Curva 3 8 8 59557,51553 7444,689441

Curva 4 8 8 59576,70553 7447,088192

y = 0,1283x - 0,0346 R² = 0,9987

0,00

0,50

1,00

1,50

0 2 4 6 8 10 12

Ab

sorb

anci

a

mg/100 mL


- 96 -

TABLA 6. ANOVA DE LOS COEFICIENTES DE ABSORTIVIDAD MOLAR DE LAS

CURVAS DE CALIBRACIÓN INDIRECTAS DE RUTINA.


Origen de las

variaciones

Suma de cuadrados

Grados de

libertad

Promedio de los

cuadrados


Entre grupos 96450,37898 3 32150,1263 0,2958 0,8280 2,9466

Dentro de los grupos 3042898,423 28 108674,944

Total 3139348,802 31

- 97 -

ANEXO 3 ANALISIS ESTADISTICO DE Calendula officinalis.

TABLA 7. EXTRACTO ETANÓLICO DE Calendula officinalis l.

RESUMEN


Columna 1 14 -0,00133233 -9,5166E-05 2,1099E-09

Columna 2 14 -0,00132868 -9,4906E-05 2,0671E-09

Columna 3 14 -0,00133539 -9,5385E-05 2,1064E-09

ANOVA DE MOVILIDAD ELECTROFORÉTICA DE Calendula officinalis L.

Origen de las variaciones

Suma de cuadrados

Grados de

libertad

Promedio de los cuadrados


Entre grupos 1,6126E-12 2 8,0628E-13 0,0003849

0,99961512

3,23809614 Dentro de los

grupos 8,1684E-08 39 2,0945E-09

Total 8,1686E-08 41

No. Pico

tm1 seg.

tm 2 seg.

tm3 seg.

× f1

m2/v*seg

× f2

m2/v*seg

× f3

m2/v*seg

× FEO

× f

m2/v*seg

C.V.

%

1

4.924 4.954 4.942

4.94

2

5.192 5.188 5.169 -1,048E-05 -9,105E-06 -9,626E-06

-9,738E-06

9.0766

3

5.326 5.371 5.367 -1,533E-05 -1,567E-05 -1,676E-05

-1,592E-05

2.1928

4

7.121 7.154 7.154 -6,266E-05 -6,208E-05 -6,330E-05

-6,268E-05

0.5012

5

7.529 7.529 7.567 -7,027E-05 -6,904E-05 -7,093E-05

-7,008E-05

0.9881

6

7.850 7.879 7.800 -7,570E-05 -7,494E-05 -7,488E-05

-7,517E-05

1.0386

7

8.017 8.805 8.025 -7,835E-05 -8,829E-05 -7,848E-05

-8,170E-05

7.2648

8

9.829 9.838 9.908 -1,013E-04 -1,002E-04 -1,022E-04

-1,012E-04

0.6712

9

10.658 10.638 10.617 -1,093E-04 -1,079E-04 -1,089E-04

-1,087E-04

0.6824

10

10.758 10.746 10.771 -1,101E-04 -1,088E-04 -1,102E-04

-1,097E-04

0.6094

11

11.396 11.417 11.475 -1,153E-04 -1,143E-04 -1,159E-04

-1,152E-04

0.5061

12

14.758 14.733 14.921 -1,353E-04 -1,340E-04 -1,361E-04

-1,351E-04

0.5758

13

15.950 15.950 15.946 -1,404E-04 -1,392E-04 -1,404E-04

-1,400E-04

0.4439

14

17.500 17.502 17.503 -1,459E-04 -1,447E-04 -1,460E-04

-1,455E-04

0.4235

15

24.221 24.221 24.200 -1,618E-04 -1,606E-04 -1,618E-04

-1,614E-04

0.3859

- 98 -

ANEXO 4 AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS

A las 4 cepas se les realizó la tinción de Gram, la prueba de Catalasa y Oxidasa para

verificar género y para identificar las especies se realizaron las pruebas bioquímicas

secundarias más características, que se muestran en las tablas que a continuación se

presentan.

Escherichia coli

TABLA 8. Identificación de Escherichia coli.

IMAGEN 1. Crecimiento de Escherichia coli en agar EMB donde se aprecia el brillo

verde metálico característico de esta bacteria

PRUEBA RESULTADO

Tinción Gram. Bacilos Gram. negativos

Oxidasa -

Catalasa +

O/F F

MR +

VP -

Citratos -

KIA Amarillo/ amarillo=ácida/ácida: fermentadora de glucosa

LIA +

SIM (+) Indol

MIO Indol(+), descarboxilación amina (+), motilidad (+)

- 99 -

Staphylococcus aureus TABLA 9. Identificación de Staphylococcus aureus.

PRUEBA RESULTADO

Tinción Gram. Cocos Gram positivos agrupados en racimos.

Catalasa +

Oxidasa -

Coagulasa +

Manitol +

IMAGEN NO 2. Manitol positivo en agar sales y manitol

- 100 -

Streptococcus faecalis / Enterococcus faecalis

TABLA10. Identificación de S. faecalis.

PRUEBA RESULTADO

Tinción Gram. Cocos Gram positivos

Catalasa -

Oxidasa -

NaCl +

Bilis esculina +

IMAGEN No 3 Izquierda crecimiento de S. faecalis en agar BHI, derecha prueba de bílis

esculina (+)

- 101 -

Pseudomonas aeruginosa

TABLA. 11resultados de P. aeruginosa

IMAGEN No 4 Crecimiento de P. aeruginosa en agar Muller Hinton. Fluoresceína (+)

Prueba bioquímicas P. aeruginosa

catalasa +

oxidasa +

Motilidad 37ºC +

OF glucosa O

Reducción de nitrato +

Índol -

Citrato de Simmons +

Urea V-

Rojo de metilo -

Vogues Proskauer -

Descarboxilación de ornitina -

Acido a partir de lactosa -

KIA Alcalino/Alcalino

Gelatina +

- 102 -

IMAGEN 5 DE IZQUIERDA A DERECHA OF= OXIDATIVO, KIA= ALC / ALC, MIO= (-)

ORNITINA, GELATINA= (+) HIDRÓLISIS, CITRATOS= (+)

- 103 -

ANEXO 4 GLOSARIO

Aquenio: es un tipo de fruto seco producido por numerosas especies de plantas.

Aceites esenciales: son mezclas de varias sustancias químicas biosintetizadas por las

plantas, que dan el aroma característico a algunas flores, árboles, frutos, hierbas,

especias, semillas y a ciertos extractos de origen animal (almizcle, civeta, ámbar gris).

Se trata de productos químicos intensamente aromáticos, no grasos (por lo que no se

enrancian), volátiles por naturaleza (se evaporan rápidamente) y livianos (poco densos).

Son insolubles en agua, levemente solubles en vinagre, y solubles en alcohol, grasas,

ceras y aceites vegetales. Se oxidan por exposición al aire. Se han extraído más de 150

tipos, cada uno con su aroma propio y virtudes curativas únicas. Proceden de plantas

tan comunes como el perejil y tan exquisitas como el jazmín.

Alcaloides: (de álcali, carbonatos de alcalinos, y -oide, parecido a, en forma de),

metabolitos secundarios de las plantas sintetizados, generalmente, a partir

de aminoácidos, que tienen en común su hidrosolubilidad a pH ácido y su solubilidad en

solventes orgánicos a pH alcalino. Los alcaloides verdaderos derivan de un aminoácido,

son por lo tanto nitrogenados. Todos los que presentan el grupo

funcional amina o imina son básicos. La mayoría de los alcaloides poseen acción

fisiológica intensa en los animales aún a bajas dosis con efectos psicoactivos, por lo

que son muy usados en medicina para tratar problemas de la mente y calmar el dolor.

Ejemplos conocidos son la cocaína, la morfina, la atropina, la colchicina,

la quinina, cafeína, la estricnina y la nicotina.

Alcamidas: son compuestos que se encuentran en los animales regulando importantes

rutas de señalización y recientemente en plantas donde regulan la ramificación de la

raíz y las respuestas de defensa. En las bacterias también se han encontrado

compuestos con estructura química similar a las alcamidas conocidas como Nacil-

homoserina lactonas, las cuáles regulan la densidad poblacional.

Alérgeno: es una sustancia que puede inducir una reacción de hipersensibilidad

(alérgica) en personas susceptibles, que han estado en contacto previamente con él.

http://es.wikipedia.org/wiki/Fruto

http://es.wikipedia.org/wiki/Monocotiled%C3%B3neas

http://es.wikipedia.org/wiki/Almizcle

http://es.wikipedia.org/wiki/Civeta

http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81mbar_gris

http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81lcali

http://es.wikipedia.org/wiki/Alcalino

http://es.wikipedia.org/wiki/Metabolitos_secundarios_de_las_plantas

http://es.wikipedia.org/wiki/Amino%C3%A1cidos

http://es.wikipedia.org/wiki/Amina

http://es.wikipedia.org/wiki/Imina

http://es.wikipedia.org/wiki/Base_(qu%C3%ADmica)

http://es.wikipedia.org/wiki/Psicoactivos

http://es.wikipedia.org/wiki/Mente

http://es.wikipedia.org/wiki/Coca%C3%ADna

http://es.wikipedia.org/wiki/Morfina

http://es.wikipedia.org/wiki/Atropina

http://es.wikipedia.org/wiki/Colchicina

http://es.wikipedia.org/wiki/Quinina

http://es.wikipedia.org/wiki/Cafe%C3%ADna

http://es.wikipedia.org/wiki/Estricnina

http://es.wikipedia.org/wiki/Nicotina

- 104 -

Esta reacción de hipersensibilidad involucra el reconocimiento del alérgeno como

sustancia "extraña" y ajena al organismo en el primer contacto.

Axonomorfo: Dícese de la raíz cuyo eje principal está engrosado y los ejes

secundarios están poco desarrollados con respecto al principal.

Bejuco: son término aplicado a varias plantas trepadoras parecidas a las parras que se

encuentran en Centroamérica, Suramérica, eIndias Occidentales, que son reconocidas

por sus poderes curativos.

Buffer: tampón, solución amortiguadora o solución reguladora es la mezcla en

concentraciones relativamente elevadas de un ácido débil y su base conjugada, es

decir, sales hidrolíticamente activas. Tienen la propiedad de mantener estable el pH de

una disolución frente a la adición de cantidades relativamente pequeñas de ácidos o

bases fuertes.

Carotenoides: son pigmentos orgánicos del grupo de los isoprenoides que se

encuentran de forma natural en plantas y otros organismos fotosintéticos como algas,

algunas clases de hongos y bacterias.

Carvona: es un terpeno presente en muchos aceites esenciales.

Citoprotector: grupo de fármacos que tienen la capacidad de proteger la mucosa del

tracto gastro intestinal de la acción del entorno ácido y enzimas digestivas. También

reciben el nombre de protectores de la mucosa. Se utilizan en esquemas

medicamentosas para tratar las úlceras del tracto intestinal superior y para erradicar

Helicobacter pylori.

Coeficiente de variación: en estadística, permite comparar la dispersión entre dos

poblaciones distintas e incluso, comparar la variación producto de dos variables

diferentes (que pueden provenir de una misma población).

Curva de calibración: es un método de química analítica empleado para medir

la concentración de una sustancia en una muestra por comparación con una serie de

elementos de concentración conocida. Se basa en la existencia de una relación en

principio lineal entre un carácter medible (por ejemplo la absorbancia en los enfoques

de espectrofotometría) y la variable a determinar (la concentración).

http://es.wikipedia.org/wiki/Trepadora

http://es.wikipedia.org/wiki/Centroam%C3%A9rica

http://es.wikipedia.org/wiki/Suram%C3%A9rica

http://es.wikipedia.org/wiki/Indias_Occidentales

http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_d%C3%A9bil

http://es.wikipedia.org/wiki/Base_conjugada

http://es.wikipedia.org/wiki/Sal_(qu%C3%ADmica)

http://es.wikipedia.org/wiki/Hidr%C3%B3lisis

http://es.wikipedia.org/wiki/PH

http://es.wikipedia.org/wiki/Disoluci%C3%B3n

http://es.wikipedia.org/wiki/Qu%C3%ADmica_anal%C3%ADtica

http://es.wikipedia.org/wiki/Concentraci%C3%B3n

http://es.wikipedia.org/wiki/Absorbancia

http://es.wikipedia.org/wiki/Espectrofotometr%C3%ADa

- 105 -

Estabilidad: que mantiene el equilibrio, no cambia o permanece en el mismo lugar

durante mucho tiempo.

Esteroles: son esteroides con 27 a 29 átomos de carbono. Su estructura química

deriva del ciclopentanoperhidrofenantreno o esterano, una molécula de 17 carbonos

formada por tres anillos hexagonales y uno pentagonal. En los esteroles, se añade una

cadena lateral de 8 o más átomos de carbono en el carbono 17 y un grupo alcohol o

hidroxilo (-OH) en el carbono 3. Estas sustancias se encuentran en abundancia en los

organismos vivos, sobre todo en animales y en algunas algas rojas. Son solubles en los

disolventes orgánicos, y poseen un elevado punto de fusión.

Glicósidos heterósidos: Son sustancias no reductoras que por hidrólisis ácida o

enzimática dan uno o más azúcares y un componente no azucarado llamado aglicona o

genina. Desempeñan funciones muy importantes en los seres vivos y una gran cantidad

de los glicósidos que producen las plantas se emplean como medicamentos.

Hojas pilosas: Tallos cubiertos de gruesas espinas.

Lígula: es un apéndice membranoso ubicado en la línea que une la lámina o limbo

foliar con la vaina en la familia de las gramíneas. Las lígulas pueden ser membranosas,

pubescentes o pilosas, o estar ausentes.

Lanceolado: Se aplica a la hoja de una planta que tiene forma de punta de lanza: el

ciruelo y el laurel tienen las hojas lanceoladas.

Molaridad: la concentración molar, es una medida de la concentración de un soluto en

una disolución, o de alguna especie molecular, ionica, o atómica que se encuentra en

un volumen dado.

Mucopolisacáridos: son cadenas largas de moléculas de azúcar que se encuentran a

lo largo de todo el cuerpo, a menudo en las mucosidades y en el líquido alrededor de

las articulaciones.

Oblongo: Más largo que ancho.

Pedúnculo: la ramita o rabillo que sostiene una inflorescencia o un fruto tras su

fecundación. Posee la estructura de un tallo y es responsable de la sustentación y

conducción de savia a las flores.

http://es.wikipedia.org/wiki/Limbo_foliar

http://es.wikipedia.org/wiki/Vaina

http://es.wikipedia.org/wiki/Poaceae

http://es.wikipedia.org/wiki/Inflorescencia

http://es.wikipedia.org/wiki/Fruto

http://es.wikipedia.org/wiki/Savia

http://es.wikipedia.org/wiki/Flor

- 106 -

Pirogalol: es una sustancia sólida, blancuzca, que se disuelve en agua dando

soluciones incoloras, tiene usos en la industria farmacéutica como patrón para

determinar el contenido de fenoles de diversos analitos mediante el reactivo de Folin

Ciocalteu; los resultados se anotan como equivalentes de ácido gálico.

Resina: es una secreción orgánica que producen muchas plantas, particularmente los

árboles del tipo conífera. Es muy valorada por sus propiedades químicas y sus usos

asociados, como por ejemplo la producción de barnices, adhesivos y aditivos

alimenticios. También es un constituyente habitual de perfumes o incienso.

Ruta graveolens: comúnmente llamada ruda es una especie de la familia Rutaceae,

nativa del sur de Europa. Se suele cultivar como planta ornamental de jardín, en

especial por sus hojas azuladas y por su tolerancia a suelos secos y al calor. También

se cultiva como hierba medicinal y condimento.

Rutina (flavonoide): también llamada rutósido, quercetin-3-rutinósido y soforina, es un

glucósido flavonoide encontrado en algunas plantas.2 Se ha encontrado este

compuesto en los pecíolos de las especies de los géneros Rheum y Asparagus, y

también en algunas frutas, en especial cítricos. Su nombre proviene de Ruta

graveolens, una planta que también contiene rutina.

Saponósidos o saponinas: son heterósidos muy extendidos en el reino vegetal.

Principalmente se caracterizan porque en contacto con el agua producen una espuma

persistente, propiedad que se ha utilizado ampliamente en muchas partes del mundo.

Además, las saponinas tienen la capacidad de aumentar la permeabilidad de las

paredes celulares y destruir los hematíes por hemolisis.

Terpenos o isoprenoides: son una vasta y diversa clase de compuestos orgánicos

derivados del isopreno (o 2-metil-1,3-butadieno), un hidrocarburo de 5 átomos de

carbono. El nombre deriva, de los primeros miembros de esta clase que fueron

derivados del aguarrás ("turpentine" en inglés, "terpentin" en alemán).

VIII. BIBLIOGRAFÍA

1. Abrego, R. V. (2006). "Aplicaciones de la electroforesis capilar para la determinacion de compuestos químicos a partir de diferentes matrices". Teis de Licenciatura Q.F.B. Cuautitlan Izcalli, Edo. México: UNAM.

2. Abril, D. N. (2012). Espectrofometría: Espectros de absorción y cuantificación

colorimétrica de biomoléculas. Obtenido de http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol-mol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETR%C3%8DA.pdf

3. Alonso, J. (2004). Tratado de fitofármacos y nutracéuticos. Rosario Argentina:

Corpus libros.

4. Álvarez de Luna, F. (2006). Sensibilidad a los antimicrobianos de Enterococcus faecalis aislados de pacientes en la provincia de Córdoba (España). Obtenido de http://www.seq.es/seq/0214-3429/19/2/m_causse.pdf

5. Arenas, S. I. (2004). Espectrofotometrìa de Absorciòn. Obtenido de

http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/espectrometria_de_absorcion.pdf

6. Barceló, J. G. (1990). Técnicas analiticas para vinos. Obtenido de http://shop.gabsystem.com/data/descargas/Taules%20I-XV.pdf

7. Brooks Geo, B. J. ( 2002). Microbiología médica de Jawets, Melnick y Adelberg.

México DF : Manual Moderno.

8. Castillo, R. M. (2010). "Desarrollo de métodos analíticos para el control de calidad de leches usando electroforesis capilar". Tesis para optar por el grado de Maestra en Ciencias. Cuautitlán Izcalli, Edo. México: UNAM.

9. Castillo, R. R. ( 2002). Fundamentos sobre electroforesis capilar. México:

Universidad Nacional Autónoma de México.

10. Centeno, M. L. (2004). "Plantas medicinales españolas. Calendula officinalis L. (Asteraceae)". Medicina Naturista, 2004; N.º 5, 257-261.

11. Cervantes, R. V. (2011). Perfil electroforético y cuantificación de polifenoles de extractos etanólicos de Calendula officinalis L. E Hippocratea excelsa K.. Tesis Q.F.B. Cuautitlan Izcalli, Edo. de Mex: UNAM.

12. Chaves, O. E. (2009). "Estudio preliminar de extractos de caléndula officinalis por

electroforesis capilar". Cuautitlan Izcalli, Edo. México: UNAM.

13. Chuquimia, F. A. (2008). Determinación de la capacidad antioxidante y la cuantificación de compuestos fenólicos y flavonóidicos de cuatro especies vegetales de la región andina de Bolivia. Obtenido de http://www.revistasbolivianas.org.bo/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0250-54602008000100011&lng=pt&nrm=iso

- 109 -

14. Conde, A. C. (1994). Contribución al conocimiento de la composicion polifenolica de madera, corteza y hojas de eucalyptus camaldulensis, e. globulus y e. rudis TESIS DOCTORAL que, para optar al grado de Doctor en Ciencias Químicas. Obtenido de http://eprints.ucm.es/tesis/19911996/X/0/X0021401.pdf

15. Cordero, S. A. (2005). Reto Microbiologico de extractos de Calendula officinalis

con bacterias aisladas de metritis y mastitis bovina. Tesis Q.F.B. Cuautitlán Izcalli, Edo. Mex.: UNAM.

16. Díaz, F. J. (2009). Optimización de extracción y análisis de la capacidad

antioxidante de la piel de kiwi. Catalunya: Universitat Politècnica de Catalunya.

17. Frenk, M. J. (2001). Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos. México DF: Secretaria de salud.

18. Galicia, A. K. (2006). "Caracterizacíon geoquímica de lantánidos y sus

implicaciones en sistemas geoenegéticos". Tesis Maestria en Ingeniería. Temixco, Mor: UNAM.

19. García, B. J. (1990). Técnicas analiticas para vinos . Vilafranca del Panedés:

Panedés Edicions S.A.

20. García, J. A. (2009). Manejo social de la Cancerina (Hippocratea), planta medicinal de la selva baja caducifolia en la cuenca del rio Papagayo, Guerrero, México.Tesis presentada como requisito parcial para obtener el grado de Doctora en Ciencias. Montecillo, Texcoco, Edo. de México: Institución de Enseñanza e Investigación en Ciencias Agricolas.

21. Garrido, F. D. (2008). Propiedades antioxidantes y funcionales de cinco algas

chilenas sobre la calidad de pasta de salmón. Memoria para optar al titulo deIngeniero en Alimentos. Santiago, Chile: Universidad de Chile.

22. Jiménez, V. L. (2009). “Elaboración de una forma farmacéutica (óvulo) a base del

extracto de Caléndula officinalis, Echinacea purpurea e Hippocratea excelsa para el tratamiento de infecciones cervico vaginales humanas”. Tesis QFB. Cuautitlán Izcalli, edo México: UNAM.

23. Julián, L. A. (2009). Propiedades físicas y químicas de tres variedades de frutos

de Annona diversifolia. HuajapandeLeón, Oaxaca: Universidad Tecnológica de la Mixteca.

24. Koneman Elmer, S. A. (2001). Diagnostico microbiológico: Texto y atlas a color. 5a ed. Madrid España: Médica Panamericana.

25. Lara, O., & Márquez, A. (1996). Plantas medicinales de México: composición

usos y actividad biológica. México DF.: UNAM.

- 110 -

26. Laura, P. P. (2010). Determinación de las constantes de acidez de los compuestos LQM: 344, 345 Y 351 por electroforesis capilar y espectrofotometrúa UV-VIS. Tesis Licenciatura Q.F.B. . Cuautitlan Izcalli Edo. México: UNAM.

27. Marinova, D. (2005). Total Phenolics and total Flavonoids. Obtenido de

http://www.uctm.edu/journal/j2005-3/Marinova.pdf

28. Montalvo, P. L. (2005). Efecto inhibitorio de extracto de caléndula officinalis en bacterias aisladas de casos de mastitis bovina de la cuenca lechera de Tizayuca, Hidalgo”. Cuautitlan, Edo de México: UNAM.

29. Murillo, S. A. (2009.). Evaluación de la actividad antimicrobiana del extracto de

Stirax benzoin Dryander (Benjuí) en 10 bacterias que comunmente se asocian en infecciones de heridas humanas. Tesis Licenciatura Q.F.B. Cuautitlan izcalli, Edo. México: UNAM.

30. Pérez, A. Y. (2008). “Determinación del efecto inhibitorio de tres extractos

naturales: caléndula officinalis, echinacea purpúrea e hippocratea excelsa, (solos y combinados) en bacterias aisladas de casos de mastitis bovina.” Tesis Licenciatura Q.F.B. Cuautitlan Izcalli, Edo de México: UNAM.

31. Perez, P. A. (2010). Determinación de las constantes de acidez de los

compuestos LQM: 344, 345 Y 351 por electroforesis capilar y espectrofotometrúa UV-VIS. Tesis Licenciatura Q.F.B. Cuautitlan Izcalli Edo. México: UNAM.

32. Ramírez, A. A. (2009). Estudio de las propiedades bioactivas de hongos

comestibles para el diseño de productos cárnicos funcionales.Tesis doctoral . Madrid, España: Universidad Autónoma de Madrid.

33. Redondo, M. L. (2000). "La equinácea purpúrea: Una alternativa real para

estimular el sistema inmunológico específico". Obtenido de http://www.fitoterapia.net/revista/pdf/RDF1_1_EQUINACEA.pdf

34. Rojas, C. M. (2008). “Desarrollo de un método analítico por electroforesis capilar

para la determinación de bromhexina y ampicilina en cápsulas”. Tesis Licenciatura Q.F.B. Cuautitán Izcalli Edo. México: UNAM.

35. Skoog, D. W. (2005). Química analítica. México D.F.: Editorial Thomson. 8ª Ed.

36. Tovar, B. N. (1999). "Uso del extracto vegetal de péalos de Caléndula officinalis

en el tratamiento de metritis cróica purulenta en el ganado Holstein Friesian". Tesis para obtener el titulo de Medico Veterinario Zootecnista. Cuautitlán Izcalli, Edo. de Méx.: UNAM.

extractos naturales calendula officinalis echinacea

Documents