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Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA PRÉ-CLÍNICA DO EXTRATO
HIDROALCOÓLICO DE Calendula officinalis L.
Erick José Ramo da Silva
RECIFE 2004
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
Erick José Ramo da Silva
AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA PRÉ-CLÍNICA DO EXTRATO
HIDROALCOÓLICO DE Calendula officinalis L.
R2
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas doCentro de Ciências da Saúde daUniversidade Federal de Pernambuco, comorequisito parcial para obtenção do grau deMestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Almir GonçalvesWanderley
ECIFE 004
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
Reitor
Amaro Henrique Pessoa Lins
Vice-Reitor
Gilson Edmar Gonçalves e Silva
Pró-Reitor para Assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação
Celso Pinto de Melo
Diretor do Centro de Ciências da Saúde
José Thadeu Pinheiro
Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas
Silvana Cabral Maggi
Vice-Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas
Antônio Rodolfo de Faria
Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas
Miracy Muniz de Albuquerque
Vice-Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas
Pedro José Rolim Neto
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
Dedico este trabalho aos meus pais, Raminho e Fátima, minha irmã Kika, minha tia Evalda, minhas avós Maria e Maria (in memorian) e a minha namorada Lelê. Obrigado por tudo!
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AGRADECIMENTOS A Deus. Aos meus pais, Severino Ramo da Silva e Maria de Fátima Ramo da Silva, pelo apoio, investimento, incentivo e compreensão durante toda minha vida. À minha irmã Érika Ramo (kika). À minha tia Evalda Teodózio pelo carinho e apoio que sempre me deu. A minhas avós Maria José Siqueira (in memorian) e Maria Alves da Silva pelos ensinamentos e gestos de carinho. Ao meu professor, orientador e grande amigo Almir Gonçalves Wanderley pela oportunidade, confiança, orientação, incentivo e presença constante. Ao meu Amor Leilyane Conceição de Souza Coelho (Lelê) pelo apoio e carinho fundamentais para a conclusão desse trabalho, bem como seus familiares. A todos os meus familiares pelo apoio e incentivo. A Gustavo Santiago Dimech e Eduardo da Silva Gonçalves pelos conhecimentos transmitidos com boa vontade e pela nossa amizade. A João Henrique Costa-Silva, Irla Maria Vidal de Sousa, Karla Emanuelle Ferreira, Mariana Maria Azevedo de Lyra, Cristiano Ribeiro Lima e Rejane Ferreira da Silva pelo enorme auxílio na elaboração do trabalho e companheirismo no dia-a-dia do Laboratório de Farmacologia e Toxicologia Pré-clinica de Produtos Bioativos. A Marcelo de Albuquerque pela ajuda incondicional em uma etapa crítica do trabalho.
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Aos professores Parviz Afiatpour, Simone Sette, Liriane Evêncio e Maria do Carmo Fraga pela orientação e apoio na realização do trabalho. A todos os professores e amigos do Departamento de Ciências Farmacêuticas da UFPE. Aos amigos do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Aos professores e técnicos do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFPE. A Iguacy Duque e Levi Rodrigues pelo valioso apoio administrativo. Aos meus amigos do Colégio de Aplicação Érico, Hugo, Fernando, Gabriel, Marcelo, Marco Antonio, Olga, Osias, Sandra, Taciana, Tiago, Viviane e Yuri, os quais estiveram presentes em todos os momentos importantes da minha vida nesses últimos 12 anos, por me mostrarem o verdadeiro significado da palavra “amizade”. Aos amigos Ádley Antonini, Bráulio César, Cristiano Sampaio, José Walkirdes, Luciano Thiesen e Lamatine Soares. Aos amigos da Farmácia do Hospital Geral do Recife por terem me acolhido calorosamente e pelos ensinamentos transmitidos. A Ron Martinez pelo auxílio na correção dos textos em inglês. Ao Dr. Romildo Alves Paes Barreto (Zé Pimentel) pela nossa amizade e pelo sensacional apoio técnico.
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SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS........................................................................................ III
LISTA DE TABELAS....................................................................................... V
RESUMO........................................................................................................ VII
ABSTRACT..................................................................................................... VIII
1. INTRODUÇÃO................................................................................................ 1
2. REVISÃO DA LITERATURA........................................................................... 4
2.1. ESTUDOS SOBRE CALENDULA OFFICINALIS L.............................................. 5
2.1.1. BOTÂNICO..................................................................................................... 5
2.1.2. FITOQUÍMICO................................................................................................ 6
2.1.3. FARMACOLÓGICO......................................................................................... 8
2.1.4 TOXICOLÓGICO............................................................................................ 13
2.2. ESTUDOS TOXICOLÓGICOS PRÉ-CLÍNICOS DE PLANTAS MEDICINAIS........ 14
2.2.1. TOXICIDADE AGUDA..................................................................................... 16
2.2.2. TOXICIDADE SUBCRÔNICA........................................................................... 16
2.3. TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO....................................................... 17
2.3.1. TERATOGÊNESE E EMBRIOFETOTOXICIDADE............................................. 18
3. OBJETIVO..................................................................................................... 23
3.1. GERAL........................................................................................................... 24
3.2. ESPECÍFICO.................................................................................................. 24
4. ARTIGO I: AVALIAÇÃO DO TRATAMENTO SUBCRÔNICO COM O EXTRATO
HIDROALCOÓLICO DE CALENDULA OFFICINALIS L. SOBRE OS PARÂMETROS BIOQUÍMICOS E
HEMATOLÓGICOS EM RATAS......................................................... 25
RESUMO........................................................................................................ 26
ABSTRACT..................................................................................................... 27
INTRODUÇÃO................................................................................................ 27
MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................... 28
RESULTADOS................................................................................................ 30
DISCUSSÃO................................................................................................... 31
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................. 33
5. ARTIGO II: AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE CALENDULA
OFFICINALIS L................................................................................ 39
RESUMO........................................................................................................ 40
ABSTRACT..................................................................................................... 41
INTRODUÇÃO................................................................................................ 41
METODOLOGIA............................................................................................. 42
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
RESULTADOS................................................................................................ 45
DISCUSSÃO E CONCLUSÃO.......................................................................... 46
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................. 49
6. ARTIGO III: AVALIAÇÃO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE CALENDULA OFFICINALIS L.
SOBRE A PERFORMANCE REPRODUTIVA EM RATOS............................................. 59
RESUMO........................................................................................................ 60
ABSTRACT..................................................................................................... 61
INTRODUÇÃO................................................................................................ 61
METODOLOGIA............................................................................................. 62
RESULTADOS................................................................................................ 64
DISCUSSÃO................................................................................................... 64
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................. 66
7. ARTIGO IV: EFEITOS DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE CALENDULA OFFICINALIS L.
SOBRE A PRENHEZ DE RATAS.............................................................................. 72
RESUMO........................................................................................................ 73
ABSTRACT..................................................................................................... 74
INTRODUÇÃO................................................................................................ 74
METODOLOGIA............................................................................................. 75
RESULTADOS................................................................................................ 77
DISCUSSÃO................................................................................................... 79
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................. 81
8. CONCLUSÃO................................................................................................. 89
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................ 91
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LISTA DE FIGURAS Revisão da Literatura
Figura 1 Calendula officinalis L...................................................................... 6 Figura 2 Estrutura da porção aglicona dos glicosídeos de flavonóis de
Calêndula......................................................................................... 7 Figura 3 Estruturas de alguns triterpenos presentes nas flores de
Calêndula......................................................................................... 8
Artigo I
Figura 1 Figura 1: Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula
officinalis (0,25 a 1,0g/kg) por via oral sobre o ganho de massa
corporal em ratas Wistar adultas tratadas por 30 dias consecutivos.
Os valores representam as médias ± e.p.m. (n=10/grupo)................. 35 Figura 2 Figura 2: Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula
officinalis (0,25; 0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre a massa dos
órgãos (g/100g) de ratas Wistar adultas tratadas por 30 dias
consecutivos. Os valores representam as médias ± e.p.m.
(n=10/grupo).................................................................................... 36
Artigo II
Figura 1 Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25
a 1,0g/kg) por via oral sobre o ganho de massa em ratos Wistar
adultos tratados por 30 dias consecutivos Os valores representam
as médias ± e.p.m. (n=10/grupo)...................................................... 53 Figura 2 Figura 2: Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula
officinalis (0,25; 0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre a massa dos
órgãos (g/100g) em ratos Wistar tratados por 30 dias consecutivos.
Os valores representam as médias ± e.p.m. (n=6/grupo). *Indica
estatisticamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido de
Newman-Keuls, p< 0,05). DDR=ducto deferente de rato.................... 53 Figura 3 Fotomicrografia do fígado de rato Wistar controle tratado com água
por via oral por 30 dias (grupo controle). Células hepáticas (H) e o
espaço porta (EP) com aspecto normal. (coloração HE, aumento ±
107x)............................................................................................... 54 Figura 4 Fotomicrografia do fígado de rato Wistar controle tratado com água
por via oral por 30 dias (grupo controle). Hepatócitos (H), células de
Kuppfer (K), os vasos capilares (vc) e a veia centro lobular (V).
(coloração HE, aumento ± 430x)....................................................... 54
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Figura 5 Fotomicrografia do fígado de rato Wistar tratado com extrato
hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (1,0g/kg) por via oral.
por 30 dias. Infiltrado inflamatório (II) nas adjacências do espaço
porta (EP) e acúmulo de células acidófilas (H) – (coloração HE,
aumento 107x)................................................................................. 55 Figura 6 Fotomicrografia do fígado de rato Wistar tratado com extrato
hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (1,0g/kg) por via oral.
por 30 dias. Presença de infiltrado na região periportal (seta) e
hepatócitos acidófilos (H) – (coloração HE, aumento ±
430x)............................................................................................... 55 Figura 7 Fotomicrografia do pulmão de rato Wistar tratado com extrato
hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (1,0g/kg) por via oral
por 30 dias. Bronquíolos (B) com pequena quantidade de infiltrado
inflamatório (II). Epitélio descontínuo em alguns pontos (seta),
sacos alveolares (SA), alvéolos pulmonares (A) intactos – (coloração
HE, aumento ± 107x)........................................................................ 56
Artigo III
Figura 1 Efeito do tratamento por via oral com extrato hidroalcoólico (EHA)
de Calendula officinalis (0,25; 0,5 e 1,0g/kg) sobre o ganho de
massa corporal em ratos tratados por 60 dias consecutivos. Valores
em média ± epm (n=9/grupo)............................................................ 69 Figura 2 Efeito do tratamento por via oral com extrato hidroalcoólico (EHA)
de Calendula officinalis (0,25; 0,5 e 1,0g/kg) sobre a massa dos
órgãos sexuais de em ratos tratados por 60 dias consecutivos. Os
valores representam as médias ± e.p.m. (n=9/grupo)........................ 69 Figura 3 Fotomicrografia do testículo de rato tratado com extrato
hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (1,0g/kg) por via oral
por 60 dias consecutivos. Epitélio germinativo (EG) e do tecido
intersticial (TI) com aspecto normal (coloração HE, ampliação ±
107x)................................................................................................ 70 Figura 4 Fotomicrografia do testículo de rato tratado com extrato
hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (1,0g/kg) por via oral
por 60 dias consecutivos. Porções de 2 túbulos seminíferos com
células germinativas (CG) e espermatozóides na região central (SP)
com aspecto normal (coloração HE, ampliação ±
430x)................................................................................................ 70
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Artigo IV
Figura 1 Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25;
0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre o ganho de massa corporal em
ratas tratadas durante 30 dias consecutivos (n=12/grupo)................ 84 Figura 2 Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25;
0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre o ganho de massa corporal
materno durante o período da gestação em ratas tratadas durante
30 dias consecutivos e toda a gestação (n=12/grupo)........................ 84
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LISTA DE TABELAS
Artigo I
Tabela 1 Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25;
0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre os parâmetros bioquímicos em
ratas Wistar adultas tratadas por 30 dias consecutivos.................... 37
Tabela 2 Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25;
0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre os parâmetros hematológicos em
ratas Wistar adultas tratadas por 30 dias consecutivos..................... 38
Artigo II
Tabela 1 Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25;
0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre os parâmetros hematológicos em
ratos Wistar tratados por 30 dias consecutivos................................. 57
Tabela 2 Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25;
0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre os parâmetros bioquímicos em
ratos Winstar adultos tratados por 30 dias consecutivos................... 58
Artigo III
Tabela 1 Efeito do tratamento por via oral com extrato hidroalcoólico (EHA)
de Calendula officinalis (0,25; 0,5 e 1,0g/kg) sobre os parâmetros
reprodutivos de ratas não tratadas acasaladas com ratos tratados
durante 60 dias consecutivos...........................................................
71
Artigo IV
Tabela 1 Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25,
0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre os parâmetros reprodutivos em
ratas tratadas por 30 dias consecutivos antes do acasalamento e
durante toda a gestação..................................................................... 85
Tabela 2 Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25,
0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre o ganho de massa materno em ratas
tratadas durante o período de pré-implantação (1º ao 6º DDG) e da
gestação (1º ao 20º DDG) e sobre os parâmetros reprodutivos............ 86
Tabela 3 Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25,
0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre o ganho de massa materno em
ratas tratadas durante o período de organogênese (7º ao 14º DDG) e
da gestação (1º ao 20º DDG) e sobre os parâmetros reprodutivos..... 87
Tabela 4 Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25,
0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre o ganho de massa materno em ratas
tratadas durante o período fetal (14º ao 19º DDG) e da gestação (1º
ao 20º DDG) e sobre os parâmetros reprodutivos............................... 88
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RESUMO
Calendula officinalis L., Asteraceae, é cultivada em várias partes do mundo para fins ornamentais e medicinais, sendo conhecida popularmente como Calêndula. Os extratos de suas flores são utilizados como antiinflamatório e cicatrizante (1 a 2g/150mL de água). Em nossa revisão bibliográfica, constatamos carência de informações toxicológicas detalhadas sobre a espécie. Nesse sentido, o trabalho teve como objetivo avaliar a segurança do uso do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis em roedores. Para isso, foram realizados testes de toxicidade aguda por via oral em camundongos e ratos nas doses em progressão geométrica de 0,625 a 5,0g/kg de peso corporal. Efeito da administração sub-crônica do EHA por via oral sobre os parâmetros bioquímico, hematológico, morfológico e reprodutivo nas doses de 0,25; 0,5 e 1,0g/kg por dia. Os resultados obtidos mostram que por via oral o EHA não provocou mortes em doses de até 5,0g/kg nos animais. Os perfis bioquímico e hematológico após o tratamento por via oral com EHA durante 30 dias não sofreram variações, com exceção da uréia e alanina aminotransferase (ALT) que aumentaram significativamente em ambos os sexos. Não foram observadas alterações nas massas relativas e morfologia macroscópica externa dos órgãos analisados, porém registrou-se nos machos uma redução na massa do pulmão. A análise histológica do coração, cérebro e rins não mostrou nenhuma modificação, entretanto, o fígado e pulmão apresentaram infiltrados inflamatórios. Ratas tratadas 30 dias antes e durante a prenhez com EHA não apresentaram alterações nas variáveis reprodutivas: duração da gestação, número de prole/mãe, índice de fertilidade, de gestação, de viabilidade e de lactação, percentual de natimortos e massa corporal no 1°, 4º, 7º, 14º e 21° dias de vida. O tratamento com EHA nos períodos de pré-implantação e organogênese não induziu alterações sobre os parâmetros analisados. Entretanto, o tratamento no período fetal provocou redução no ganho de massa corporal associada à redução da massa das placentas em relação ao grupo controle. Na performance reprodutiva de machos, o tratamento com EHA por 60 dias não alterou a massa corporal e dos órgãos reprodutivos, assim como as variáveis reprodutivas descritas acima. A análise histológica dos testículos não evidenciou nenhum efeito tóxico sobre a espermatogênese. Os resultados encontrados nos levam a concluir que o EHA apresentou baixa toxicidade por via oral e não alterou a capacidade reprodutiva dos ratos e o desenvolvimento pós-natal. Entretanto, há indícios de possível nefro e hepatotoxicidade e toxicidade materna durante o período fetal da gestação, que devem ser analisados posteriormente em maior detalhe. Palavras-Chave: Calendula officinalis L., toxicidade aguda, toxicidade subcrônica, hematologia, bioquímica, toxicologia reprodutiva
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
ABSTRACT
Marigold (Calendula officinalis L., Asteraceae) is cultivated in several parts of the world for ornamental and medicinal purposes. The extracts of C. officinalis flowers are widely used as anti-inflammatory and wound healing (1 to 2g/150ml of water). In our bibliographical review, we verified a lack of detailed toxicological information about the species. For such reason, the aim of the present study was evaluate the safety of the hydroalcoholic extract (HAE) of Calendula officinalis in rodents. For that, it were acomplished the acute toxicity test by oral route in mice and rats in doses from 0,625 to 5,0g/kg. The effect of subchronic daily oral administration of HAE in doses of 0,25; 0,5 and 1,0g/kg per day on biochemical, hematological, morphologic and reproductive parameters in rats. The results showed that HAE failed to cause deaths in doses up to 5,0g/kg. The daily treatment with HAE for 30 days did not provoke biological alterations on biochemical and hematological parameters, except for plasma urea and alanina transaminase (ALT) that increased significantly on both sexes. Alterations on relative weight of organs and macroscopic morphology were not observed, however the lung weight decreased in male rats. While in extract-treated females we observed an increase in spleen and kidney weight when comparing to the control group. Histological analysis of heart, brain and kidneys did not show any modification, however the liver and the lung presented infiltrated inflammatory sites. Female rats treated with HAE for 30 days before and during pregnancy did not present alterations on reproductive parameters: pregnancy time, pup/litter relation, fertility, gestation, viability and lactation index, dead fetuses and pup weight on 1st, 4th, 7th, 14th and 21st
days of life. The treatment with HAE during preimplantation and organogenic periods did not induce alterations. However, the treatment during fetal period provoked a dose-dependent reduction on maternal weight gain related to a reduction of placental weight. In the reproductive male performance trial, treatment with HAE for 60 days did not provoke corporal and sexual organs weight alterations and reproductive parameters. The histological analyses of the testes did not evidence any harzardous effect on espermatogenesis. Based on our results, we conclude that HAE presents low oral toxicity did not alter reproductive performance and offspring development in rats. However, there are signs of nefrotoxicity, hepatotoxicity and maternal toxicity during the fetal period of the pregnancy. Futher studies are needed to confirm that hypothesis. Keywords: Calendula officinalis L., acute toxicity, subchronic toxicity, hematology, biochemistry, reproductive toxicology.
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
1.Introdução
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
1. INTRODUÇÃO
Através dos anos, os seres humanos vêm encontrando na natureza
recursos para satisfazerem suas necessidades básicas, alimentação,
vestimenta e a cura para diversos males que lhes afetam. Substâncias de
origem vegetal têm sido utilizadas desde os tempos antigos como fontes
para o tratamento de doenças (LOACES et al., 2003).
Dados históricos demonstram que foi a partir do uso de plantas
medicinais que a produção de medicamento e o tratamento farmacológico
das doenças deram seus primeiros passos. A terapêutica moderna,
composta por medicamentos com ações específicas sobre receptores,
enzimas e canais iônicos não seria possível sem a contribuição dos
produtos naturais, notadamente das plantas superiores. A razão dessa
afirmação pode ser facilmente comprovada quando se analisa o número de
substâncias obtidas direta ou indiretamente a partir de fontes naturais
(CALIXTO, 2003). A estimativa é de que cerca de 40% dos fármacos
empregados atualmente na terapêutica são provenientes de fontes
naturais, sendo 25% de plantas. Este percentual aumenta ainda mais se
nos restringirmos apenas aos fármacos anticancerígenos e antibióticos
(SHU, 1998).
Das 520 drogas aprovadas pelo Food and Drug Administration no
período de 1983 a 1994, aproximadamente 39% são provenientes de
produtos naturais. No mesmo período, 70% dos agentes anticancerígenos
e aprovados são produtos naturais ou seus derivados (CRAGG et al., 1997).
Apesar dos milhares de anos de conhecimento acumulado, o
número de plantas medicinais estudadas sob a óptica da farmacologia e
toxicologia com o intuito de comprovar o seu uso popular e segurança,
respectivamente, ainda é muito pequeno. Estima-se que das 250 a 500 mil
espécies de plantas existentes no planeta, apenas 15% foi estudada e
somente para algum uso específico (FERREIRA, 1998).
É bem verdade que o número de plantas estudadas cresce a cada
ano. Este fato encontra-se associado ao crescimento do interesse da
indústria farmacêutica pelo uso da biodiversidade como fonte de novos
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
medicamentos (CORDELL, 1995). Atualmente, as maiores indústrias
farmacêuticas mundiais possuem programas de pesquisa na área de
produtos naturais (CALIXTO, 2003).
A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que 80% da
população mundial façam uso de plantas medicinais para o tratamento de
doenças (CRAGG e NEWMAN, 1999). No Brasil, onde o acesso a
medicamentos pela população é baixo e a biodiversidade é alta, presume-
se que o consumo de plantas com fins medicinais seja bastante elevado.
Com isso, as preparações farmacêuticas contendo extratos padronizados
de uma ou mais plantas, conhecidas como medicamentos fitoterápicos,
ganham uma enorme importância. O mercado mundial de fitoterápicos
movimenta cerca de U$ 20 bilhões anuais (CALIXTO, 2000). No Brasil, os
medicamentos fitoterápicos movimentaram R$ 270 milhões em 2001,
cerca de 5,9% do mercado brasileiro de medicamentos, maior do que a
comercialização de medicamentos genéricos, que foi de R$ 226 milhões,
no mesmo ano (CALIXTO, 2003).
Nesse contexto, a avaliação do potencial terapêutico e toxicológico
das plantas medicinais, assim como de seus metabólitos secundários
isolados (flavonóides, terpenos, alcalóides, etc.) são fundamentais para a
obtenção de medicamentos fitoterápicos eficazes e seguros.
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
2.Revisão da Literatura
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Estudos sobre Calendula officinalis L.
2.1.1. Botânico
A família Asteraceae, anteriormente conhecida como Compositae, é
particularmente grande, sendo formada por 1.300 gêneros e cerca de
21.000 espécies. A distribuição geográfica das asteráceas é ampla,
estando presente em todos os habitats, com exceção da Antártida. Isto se
deve à sua elevada taxa de reprodução e ótima adaptabilidade (RUCC,
2004).
Sistematicamente, o gênero Calendula pertence à família
Asteraceae, subfamília Tubiflora, ordem Asterales e classe Magnoliopsida.
Trata-se de um gênero economicamente importante devido ao seu
potencial farmacêutico, cosmético e ornamental (GARCIA et al., 1996).
Calendula officinalis L. (Figura 1) é uma planta originária do
Mediterrâneo e cultivada na Europa a partir do século XII, de onde logo se
estendeu para o resto do mundo. Na região mediterrânea, cresce
espontaneamente nos últimos meses do verão. Sua denominação botânica
é derivada do latim, Kalendulae, que representa o primeiro dia do
calendário romano. Na Roma antiga, acreditava-se que esta planta
florescia sempre nos primeiros dias da maioria dos meses do ano (LUZ et
al., 2001).
Calendula officinalis é uma herbácea anual, com caule ereto,
medindo 35-70cm de altura, com folhas alternas oblongolanceoladas,
inteiras; capítulos florais solitários com 3 a 7cm de diâmetro, terminais e
pedunculados; as flores são de coloração amarelo claro para alaranjado,
linguladas nas margens e tubulares no centro; o invólucro é esverdeado
em forma de platilho de 1,5 a 3cm de diâmetro, o receptáculo é desnudo,
plano ou ligeiramente proeminente; aquênios curvos, providos de
protuberâncias no dorso e crenados na face ventral; papus nulo (CORRÊA,
1978).
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
No Brasil, a planta é conhecida popularmente como Calêndula,
Calêndula-hortense, Maravilha-dos-jardins, malmequer ou verrucária
(CORRÊA, 1978).
FIGURA 1 – Calendula officinalis L.
2.1.2. Fitoquímico
Estudos fitoquímicos realizados com as flores e os receptáculos de
Calêndula confirmaram a presença de um amplo espectro de compostos
químicos, sobretudo das classes dos flavonóides, terpenos e carotenóides
(VALDÉZ e GARCÍA, 1999).
A Farmacopéia Brasileira IV (1988) edição utiliza como marcador
para a droga vegetal os flavonóides totais (≥ 0,4%). Dentre os compostos
isolados, destacam-se os flavonóis 3-O-glicosídeos isoharmnetina 3-
glucosídeo, isoharmnetina 3-rutinosídeo, quercetina 3-glucosídeo
(isoquercetina), isoharmnetina 3- rutinoharmnosídeo, isoharmnetina 3-
glucoharmnosídeo e quercetina 3-triglucosídeo. Todos esses flavonóides
apresentam a quercetina ou a isoharmnetina como porção aglicona
(Figura 2) (VIDAL-OLLIVIER et al., 1989; YOSHIKAWA et al., 2001).
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
O
OR
OH
OR1HO
HO
O
R = H – quercetina R = CH3 – isoharmnetina R1 = Açúcares
FIGURA 2 – Estrutura da porção aglicona dos glicosídeos de flavonóis de Calêndula (VIDAL-OLLIVIER et al., 1989).
Nas flores e receptáculos de Calêndula foram encontrados α, β e γ-
caroteno, violaxantina, auroxantina, anteraxantina, microxantina,
citroxantina, flavocromo, licopeno, 5,6-diidróxi-caroteno, luteolina epóxido
e mutatoxantina (AVRAMOVA et al., 1998; BAKÓ et al., 2002).
Devido ao seu potencial farmacológico, os terpenos presentes na
Calêndula officinalis L. despertam um especial interesse. Verificou-se a
presença de sesquiterpenos (cariofileno epóxi-cetona, pedunculatina,
cadinol) e as saponinas sesquiterpênicas oficinosídeos C, e D. Além dos
triterpenos (Figura 3) monoésteres de faradiol, lupeol, α e β-amirina, ψ-
taraxasterol, arnidiol monoésteres de calenduladiol, monoésteres
maniladiol e helianol (GRACZA, 1987; MARUKAMI et al., 2001; HAMBURGER et
al., 2003).
Também foram isoladas 4 saponinas triterpênicas a partir da fração
butanólica do extrato metanólico das flores de Calêndula, chamadas
Calendassaponinas A, B, C e D (YOSHIKAWA et al., 2001).
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
H
H
HOCH33C
CH3 CH3
OH
CH3
CH3
CH3H3C
HOCH3H3C
CH3 CH3
OH
CH3
CH3
CH2H3C
HOCH33C
CH3 CH3
OH
CH3
CH3
CH2
H3C
HOCH3H3C
CH3 CH3 CH3
CH3
CH3H3C
ArnidiolFaradiol
ψ-Taraxasterol Calenduladiol
FIGURA 3 – Estruturas de alguns triterpenos presentes nas flores de Calêndula (DELLA-LOGGIA et al., 1994).
Outros constituintes presentes nas flores e receptáculos de
Calêndula officinalis L. incluem: óleo essencial, ácidos fenólicos (ácido
ferúlico, salicílico e cumárico), taninos, cumarinas (umbeliferona e
escopoletina), esteróides e polissacarídeos (VALDÉS e GARCÍA, 1999).
2.1.3. Farmacológico
O extrato das flores de Calêndula, nas formas farmacêuticas de
tintura, infuso, gel, creme e pomada são amplamente utilizados como
antiinflamatório e cicatrizante para peles e mucosas (SCHEFFER, 1979).
De acordo com dados etnofarmacológicos, as flores de Calêndula
também são utilizadas como antiséptica, sedativa e para o tratamento de
dismenorréia, gastrite, distúrbios vasculares, hemorróidas, reumatismo e
câncer (BISSET, 1994; ZITTERL-EGLESSER et al., 1997; VALDÉS e GARCÍA,
1999; PARENTE et al., 2003).
Entretanto, seu uso está aprovado pela Comissão E como
antiinflamatório para as mucosas oral e faríngea (uso tópico e interno) e
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
na cicatrização de ferimentos e queimaduras (uso externo) em proporções
de 1 a 2g de flor seca/150mL de água por dia (BLUMENTHAL, 1998).
No Brasil, o uso da Calêndula está regulamentado pela RE n° 89, de
16 de março de 2004, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA) como antiinflamatório e cicatrizante de uso tópico em doses
diárias de 8,8 a 17,6mg de flavonóides (BRASIL, 2004a).
Vários estudos farmacológicos avaliaram a atividade
antiinflamatória e cicatrizante dos extratos das flores de Calêndula. A
aplicação tópica do extrato lipofílico obtido pela extração com CO2
supercrítica de C. officinalis em doses de 0,3 a 1,2mg/orelha promoveu
uma redução de até 71% no edema de orelha de camundongo induzido
por óleo de cróton. A fração triterpênica do mesmo extrato apresentou
uma inibição de até 76% em doses de 0,15 a 1,2mg/orelha sob as mesmas
condições (DELLA-LOGGIA et al., 1990, 1994).
Três triterpenos isolados de Calendula officinalis, ψ-taraxasterol e
dois monoésteres de faradiol, em doses de 0,24 e 0,48mg/orelha
apresentaram atividade anti-edematogênica frente ao modelo de orelha de
camundongo induzido por óleo de cróton de até 86%. O faradiol livre (não
encontrado na planta), obtido por hidrólise, apresentou a mais potente
atividade antiinflamatória, sendo equivalente à da indometacina (ZITTERL-
EGLEER et al., 1997). Outro estudo revelou que triterpenos isolados das
flores de C. officinalis e outras asteráceas apresentam atividade inibitória
frente à inflamação de orelha de camundongo induzida por 12-O-
tetradecanolforbil-13-acetato de até 90% em doses de 0,1 a 0,8mg/orelha
(AKIHISA et al., 1996).
Também utilizando o modelo de edema de orelha de rato induzido
por óleo de cróton, Parente et al. (2003) não encontrou indícios de
atividade antiinflamatória do extrato etanólico de Calêndula administrado
por via oral nas doses de 0,1; 0,3 e 1,0g/kg.
Extrato das flores de Calêndula administrados na dose de
100mg/kg por via oral apresentaram boa atividade inibitória frente ao
edema de pata de rato e infiltração leucocitária induzidos por carragenina
e prostaglandina E1, respectivamente. Entretanto, nenhum foi mais
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
potente do que os compostos sintéticos usuais (SHIPOCHLIEV et al., 1981;
MASCOLO et al., 1987).
Glicosídeos de isorhamnetina isolados das flores de Calêndula
apresentaram atividade inibidora da lipooxigenase de fígado de rato in
vitro (BEZÁKOVA et al., 1996). Entretanto, a atividade antiinflamatória da
planta é atribuída aos seus terpenos, sobretudo os monoésteres de
faradiol, devido à sua prevalência nas flores (DELLA-LOGGIA et al., 1994;
AKIHISA et al., 1996).
O granulado para encapsulamento obtido a partir da associação dos
extratos hidroalcoólicos de Calendula officinalis e Matricaria recutita
apresentou atividade antiinflamatória por via oral em doses de 100 e
250mg/kg frente aos modelos de edema de pata de rato induzidos por
carragenina, dextrana e histamina de 36 e 43%, 50 e 35%, 40 e 68%,
respectivamente. (SARTORI et al., 2003).
Estudos clínicos demonstraram que a tintura e o gel de Calendula
officinalis L. 10 e 2%, respectivamente, são úteis para o tratamento de
queimaduras do sol e do fogo, além de lesões rebeldes, como úlcera
varicosa de evolução crônica. Nesses casos, a droga vegetal acelerou a
cicatrização e reduziu a dor. O processo de cicatrização foi acelerado ainda
mais quando a Calêndula foi associada ao Stryphnodendron barbadetiman
M. (JORGE NETO et al., 1996).
A aplicação externa do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis
acelerou a taxa de epitelização de ratos após incisões cirúrgicas (RAO,
1991). Patrick et al. (1996) demonstraram que o extrato aquoso das flores
de Calêndula é capaz de induzir a neoformação de vasos sanguíneos in
vitro, processo muito importante para a cicatrização.
A associação de pomada de Calêndula 5% com alantoína apresenta
efeito cicatrizante em feridas cutâneas induzidas por cirurgia em ratos. A
combinação estimulou a regeneração fisiológica e a epitelização através do
aumento do metabolismo de glicoproteínas e fibras colágenas durante a
regeneração tissular (KLOUCHECK-POPOVA et al., 1982).
O tratamento durante 5 dias com a combinação Calendula officinalis
e Symphytum officinale acelerou a neoformação óssea e a cicatrização em
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
camundongos submetidos à extração dentária do incisivo superior direito
em relação ao grupo controle, nas mesmas condições (BALDUCCI-ROSLINDO
et al., 1999).
Um estudo clínico randomizado envolvendo 254 mulheres que foram
operadas de câncer de mama e que estavam recebendo tratamento de
radioterapia constatou que a pomada de Calêndula aplicada após cada
sessão de radioterapia reduziu em 41% a ocorrência de dermatite aguda e
ainda reduziu a dor induzida pelo tratamento. A pomada de Calêndula foi
considerada efetiva na prevenção de dermatites agudas nível 2, passando
a ser indicada para pacientes que passam por radioterapia pós-operatória
de câncer de mama (POMMIER et al., 2004).
As atividades citotóxica e antitumoral de Calendula officinalis foram
demonstradas por estudos in vitro e in vivo. Em um ensaio in vitro, 5
extratos das flores de Calêndula apresentaram atividade citotóxica frente a
3 linhagens celulares (MRC5, Hep2, Ehrlich) em concentrações de 0,01 a
0,2g/L. A atividade anti-tumoral foi estudada em camundongos com
carcinoma de Ehrlich. Os animais foram tratados diariamente com cada
um dos 5 extratos, na dose de 25mg/kg. Verificou-se que o extrato rico em
saponinas triterpênicas promoveu um aumento no período de sobrevida
dos camundongos, bem como reduziu o desenvolvimento da ascite
tumoral (BOUCAUD-MAITRE et al., 1988).
Os extratos aquoso e hidroalcoólico, em concentrações de ng/mL
foram capazes de proteger os hepatócitos de ratos frente aos efeitos
genotóxicos e carcinogênicos da dietilnitrosamina. Entretanto, em
concentrações de µg/mL, os extratos apresentaram atividade genotóxica.
Apesar de controversos, ambos os efeitos foram atribuídos aos flavonóides
que, em baixas concentrações, são capazes de inibir enzimas do
metabolismo pré-carcinogênico, mas em altas concentrações, podem atuar
como agentes pró-oxidantes (PÉREZ-CARREÓN et al., 2002).
Alguns ensaios foram realizados com Calendula officinalis para
comprovar a sua atividade antiviral. Tinturas de Calêndula suprimiram a
replicação do vírus influenza A2 e APR-8 (BOGDANOVA et al., 1970). O
extrato orgânico de Calêndula (EOC) em concentrações de 10 a 30µg/mL
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
aumentou a atividade citoprotetora em linfócitos humanos Molt-4
infectados com HIV-1 ao aumentar a viabilidade das células. Além disso, o
mesmo extrato protegeu linfócitos CD4 Molt-4 não infectados em relação
ao contato com células U-937/HIV-1 infectadas. Esse efeito protetor foi
atribuído aos flavonóides que, provavelmente, bloqueiam a adsorção do
vírus e/ou sua internalização interferindo, dessa forma, no ciclo
replicativo do HIV-1. O EOC também apresentou um potente efeito
inibitório da transcriptase reversa do HIV-1 em concentrações de 50, 100
e 200µg/mL, efeito este também atribuído aos flavonóides da planta
(KALVATCHEV et al., 1997).
Estudos de atividade antibacteriana demonstraram que os extratos
aquoso, clorofórmico, etanólico e metanólico não apresentam atividade in
vitro significativa contra bactérias (DOMBERGER e LICH, 1982; RIOS et al.,
1987; ACEVEDO et al., 1993). Entretanto, o óleo essencial isolado das flores
da planta inibiu o crescimento in vitro de B. subtillis, E. coli, K.
pneumonae, P. aeruginosa e C. albicans. Os flavonóides isolados da planta
apresentaram atividade contra S. aureus, Sarcina lútea, E. coli, K.
pneumonae e C. albicans (TARLE e DVORZAK, 1989; JANSSEN et al., 1986).
Yoshikawa et al. (2001) demonstraram que a administração oral da
fração solúvel em 1-butanol do extrato metanólico em doses de 50 a
500mg/kg apresentou efeito hipoglicemiante, inibitório do esvaziamento
gástrico e gastroprotetor em camundongos e ratos. Todos os efeitos foram
atribuídos às saponinas. O calendulosídeo B, isolado dos rizomas de
Calendula officinalis apresentou atividade antiulcerogênica em 3 modelos
experimentais de úlcera (cafeína-arsênica, butadiona e induzida por
ligação pilórica), analgésica e sedativa quando administrada por via oral
em ratos em doses de 5 a 50mg/kg (IATSYNO et al., 1978).
A ação da Calêndula sobre o sistema imunológico ainda não foi
totalmente esclarecida. O extrato hidroalcoólico 70% das flores da planta
apresentou efeito inibitório no ensaio de proliferação mitogênica induzida
por linfócitos em concentrações de 0,1 a 10µg/mL. O mecanismo de ação
desse efeito não está elucidado. Acredita-se que algum constituinte do
extrato possa interagir com as moléculas da superfície do linfócito ou com
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
fatores de crescimento envolvidos na mitose. O extrato também
apresentou atividade estimulatória sobre a reação mista de linfócitos,
ensaio in vitro que envolve a ativação de células T (AMIRGHOFRAN et al.,
2000).
Entretanto, estudo recente realizado por Pérez et al. (2002)
demonstrou que o decócto de Calêndula (100mg/mL) não aumentou a
proliferação de linfócitos em humanos sadios ou portadores de alguma
imunodeficiência celular, nem provocou alterações na expressão do
marcador de linfócito CD2. Segundo os autores, não há indícios para
afirmar que a planta é imunoestimulante.
2.3.4. Toxicológico
A idéia geral de que as drogas vegetais são seguras e livres de efeitos
colaterais é falsa (DIMECH, 2003). Alguns constituintes das plantas
apresentam elevada toxicidade, como os digitálicos, alcalóides
pirrolizidínicos, ésteres de forbol, etc. Entretanto, segundos estudos
clínicos controlados, a incidência de efeitos colaterais é menor com
produtos fitoterápicos do que com drogas sintéticas (DREW e MYERS, 1997).
Dados de toxicidade aguda apontam que a DL50 para o extrato
aquoso de Calendula officinalis por via intravenosa em camundongos é de
375mg/kg (MANOLOV et al., 1964). Boyadzhiev e Vissh (1964)
demonstraram um valor de DL50 respectivamente por vias subcutânea e
intravenosa de 45mg/camundongo e 526mg/100g de rato a partir do
extrato hidroalcoólico das flores de Calêndula.
Estudos de toxicidade crônica com extratos de Calêndula
(150mg/kg) por via oral em ratos e hamster respectivamente por 22 e 18
meses não demonstraram sinais de toxicidade (AVRAMOVA et al., 1988).
Constituintes triterpênicos da Calêndula foram reportados como
substâncias espermicidas, abortivas e antiblastocísticas (MORELLI et al.,
1983).
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
O composto isolado Calendulosídeo B apresentou baixa atividade
hemolítica e não promoveu sinais de toxicidade em ratos tratados durante
60 dias nas doses de 20 a 200mg/kg (IATSYNO et al., 1978).
Saponinas isoladas das flores de Calêndula apresentaram atividade
mutagênica na dose de 400µg/mL no teste de Ames utilizando Salmonella
typhimurium TA98 com ou sem ativação metabólica de mistura S9 (ELIAS
et al., 1990). O extrato hidroalcólico 60% não apresentou atividade
genotóxica no teste de Ames para as linhagens de Salmonella typhimurium
TA 153S, TA 98, TA 1537 e TA 100 nas concentrações de 50 a
500µg/placa. O extrato também apresentou resultado negativo no teste de
micronúcleo de medula óssea de camundongo nas doses de 1g/kg.
Entretanto, o mesmo extrato apresentou atividade genotóxica no ensaio de
segregação mitótica em Aspergillus nidulans diplóide heterozigoto D-30, no
qual provocou alterações no crossing over mitótico e na segregação dos
cromossomos. A diferença entre os resultados in vivo e in vitro pode ser
associada a fatores farmacocinéticos e às diferenças organizacionais e de
complexidade do material genético de eucariontes e procariontes (RAMOS et
al., 1998).
Estudos clínicos constataram a presença de reações de
hipersensibilidade dérmica decorrente da exposição aos produtos
contendo Calendula officinalis em 2,03% dos pacientes (REIDER et al.,
2001). Entretanto, estudo realizado por Bruynzeel et al. 1992 apontou
para a extrema raridade desse fenômeno.
2.2. Estudos toxicológicos pré-clínicos de plantas
medicinais
A toxicidade de uma substância pode ser definida como a
capacidade de causar dano grave ou morte a um dado organismo (DRAIZE
et al., 1944). Para que ocorra esse dano, é necessário que haja uma
interação entre o agente nocivo e o organismo vivo. Essas interações
geram modificações, reversíveis ou não, em nível molecular, celular ou
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
tissular que podem, em casos drásticos, promover a morte do indivíduo
(LOOMIS e HAYES, 1996).
Evidências toxicológicas demonstram que toda substância química é
um agente tóxico em potencial, dependendo apenas das condições de
exposição, como dose administrada ou absorvida, tempo e freqüência da
administração e via de administração (CASTRO, 1993).
Os testes toxicológicos são realizados para se ter dados sobre as
condições em que as entidades químicas produzem efeitos tóxicos, qual a
natureza desses efeitos e quais os níveis seguros de exposição (LOOMIS e
HAYES, 1996).
Por motivos éticos, morais e legais, a obtenção de dados
toxicológicos em seres humanos é bastante limitada. Com isso, as
informações toxicológicas sobre os compostos químicos são obtidas
basicamente a partir de testes toxicológicos pré-clínicos, ou seja, com
animais de laboratórios em condições previamente padronizadas (MORTON,
1998; BOELSTERLI, 2003).
Grande parte dos dados obtidos a partir dos testes toxicológicos pré-
clínicos pode ter valor de aplicação na espécie humana. Desde que sejam
realizados sob condições adequadas e que seja feita à escolha apropriada
da espécie e linhagem animal, via de administração e regime de dosagem
(MORTON, 1998).
O largo uso de plantas como medicamentos tem apontado que as
plantas medicinais não são tão seguras como freqüentemente são
aclamadas. De fato, muitas substâncias extraídas do reino vegetal
apresentam elevada toxicidade, como a estricnina, digitoxina,
tubocurarina, cocaína, entre outras. O medicamento fitoterápico é um
corpo estranho ao organismo e, como todo xenobiótico, os produtos de sua
biotransformação são potencialmente tóxicos e assim devem ser
encarados até que se prove o contrário (LAPA et al., 2000). Na Alemanha,
desde 1978 cerca de quatro mil medicamentos fitoterápicos vêm sendo
submetidos a um rigoroso programa de farmacovigilância e avaliação
toxicológica e muitos deles foram retirados do mercado devido aos seus
efeitos deletérios ao ser humano (KELLER, 1996).
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
No Brasil, o estudo toxicológico pré-clínico de plantas medicinais é
regulamentado pela Resolução n° 90, de 16/03/2004, que norteia alguns
ensaios de toxicidade aguda, subcrônica e crônica com medicamentos
fitoterápicos (BRASIL, 2004).
2.2.1. Toxicidade aguda
Estudos de toxicidade aguda constituem o primeiro teste
toxicológico realizado com um novo produto. A toxicidade aguda avalia os
efeitos tóxicos detectados após a administração de um agente em doses
única ou múltiplas em 24h, tendo como propósito determinar a
sintomatologia a curto prazo após a administração de um composto, bem
como o binômio dose-efeito letal, que é estimada por um parâmetro
denominado dose letal 50%, mais conhecida como DL50 (LITCHFIELD e
WILCOXON, 1949). A DL50 foi desenvolvida por Trevan (1927) com o objetivo
de padronizar biologicamente a potência dos extratos de digitális e outras
drogas. Este parâmetro é estatístico e representa a probabilidade de uma
dose causar efeito letal em metade da população dos animais em estudo
(FOWLER e RUTTY, 1983; PAUMGARTTEN et al., 1989).
Os ensaios de toxicidade aguda são comumente realizados em
camundongos e ratos, embora em certos casos também se utilizam
animais maiores, como coelhos e cães. Recomenda-se a mesma via de
administração utilizada no homem, sendo a via oral a mais comum
(KLAASSEN et al., 1996).
2.2.2. Toxicidade subcrônica
O estudo toxicológico subcrônico avalia a toxicidade de um produto
a partir da administração de doses repetidas e diárias. Os testes
subcrônicos têm como objetivo determinar os níveis nos quais efeitos
tóxicos não são observados e identificar os órgãos mais afetados pela
substância química, bem como o grau de comprometimento dos mesmos
(FAUSTMAN et al., 1994).
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
A via oral constitui a principal via de administração nesse tipo de
teste. Os animais devem ser saudáveis e estar em idade adulta jovem.
Durante o estudo, é necessário que haja observação diária do animal
quanto a alterações de massa corporal, cor e textura dos pêlos, consumo
de água e ração, temperatura corporal, parâmetros respiratórios e
cardiovasculares e quanto a mudanças no comportamento e presença de
anormalidades motoras (BARNES e DOURSON, 1988).
Ao final do ensaio, os animais devem ter o sangue coletado para as
dosagens bioquímica e hematológica e, após eutanásia, exames
morfológicos macro e microscópicos dos principais órgãos.
2.3. Toxicologia do desenvolvimento
Após a fecundação, o desenvolvimento normal do concepto depende
tanto de um ambiente intra-uterino propício quanto de uma herança
genética adequada. A ingestão de certos compostos antes e durante a
gestação pode quebrar essa harmonia, provocando danos no concepto.
O consumo de medicamentos durante a gravidez é bastante comum.
No Reino Unido, cerca de 35% das mulheres consomem medicamentos
pelo menos uma vez durante a gravidez, sendo que 6% delas o fazem no
primeiro trimestre da gestação (RUBIN, 1995). Na Austrália, 43% das
mulheres grávidas consomem medicamentos de venda sob prescrição
médica nos dois últimos trimestres da gestação e o percentual aumenta
para 95% quando se trata de medicamentos de venda livre (HENRY e
CROWTHER, 2000).
Até o início da década de 1960, os estudos envolvendo os possíveis
efeitos nocivos das drogas sobre a gravidez e o concepto não eram
realizados de maneira adequada. Em 1962, mais de 10.000 crianças no
mundo inteiro nasceram com graves malformações nos membros
decorrentes do consumo por gestantes da talidomida, indicada como
sedativo e anti-emético. A partir desse momento, as pesquisas envolvendo
toxicologia do desenvolvimento se tornaram essenciais e de rotina do
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
estudo da segurança de substâncias químicas (CLARK, 1993; WEBSTER e
FREEMAN, 2001).
Após o que ficou conhecido como “O legado da talidomida”, a
toxicologia do desenvolvimento se consolidou como ciência e assumiu seu
importante papel na avaliação da segurança de medicamentos e outros
produtos químicos. É definida como o estudo dos efeitos tóxicos no
organismo em desenvolvimento ocorrendo a qualquer hora durante a vida
do organismo que se submete à exposição a agentes químicos ou físicos
antes da concepção, durante o desenvolvimento pré ou pós-natal até a
puberdade (SCHWETZ et al., 1991).
Os efeitos tóxicos das drogas durante o desenvolvimento podem
promover a morte do concepto, malformações congênitas (teratogênese),
retardo no desenvolvimento intra-uterino e deficiências funcionais. Além
disso, as drogas também podem provocar efeitos deletérios no sistema
reprodutor de indivíduos adultos, bloqueando a gametogênese, evitando a
ovulação, fertilização ou implantação do embrião (SCHWETZ et al., 1991;
BECKMAN, 1997).
Os estudos de avaliação dos efeitos das drogas sobre a reprodução
avaliam os seguintes parâmetros: fertilidade, transporte e implantação do
zigoto, embriogênese, organogênese, função placentária, parto,
desenvolvimento pré e pós-desmame até a maturidade sexual (BARROW,
2003).
2.3.1. Teratogênese e embriofetotoxicidade
Os maiores e mais sérios riscos associados com a exposição a
drogas durante a gestação são a possibilidade de malformações
congênitas, retardo no desenvolvimento e embriofetoletalidade. Os agentes
capazes de promover malformações congênitas são chamados
teratogênicos, enquanto aqueles que produzem retardo no
desenvolvimento, variações na ossificação ou morte do concepto, mas não
promovem malformações são conhecidos como embriofetotóxicos (WEBSTER
e FREEMAN, 2001).
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
Os efeitos deletérios das drogas podem ser promovidos pela ação
direta sobre o feto ou indiretamente, através da ação tóxica sobre o
organismo materno (MENEGOLA et al., 1998). O impacto e a gravidade
desses efeitos estão diretamente relacionados com o período da gestação,
a dose ou magnitude da exposição, diferenças entre as espécies, fatores
genéticos e toxicocinéticos, como metabolismo, transporte placentário e
via de administração. Postula-se que 2-4% das malformações sejam
espontâneas e que menos de 1% sejam induzidas pelo uso de
medicamentos. O percentual aumenta se o uso ilícito de drogas, o tabaco
e o álcool sejam incluídos (BRENT et al., 1993; WEBSTER e FREEMAN, 2001).
De acordo com a sensibilidade aos agentes teratogênicos e
embriofetotóxicos, a gestação pode ser dividida em 3 fases. A primeira
fase, conhecida como pré-implantação, compreende o período que vai
desde a fecundação até a implantação do blastocisto. Na mulher, esse
período vai até o 17° dia de gestação, enquanto que em ratos e
camundongos, até o 6° dia, aproximadamente (FRITZ e GIESE, 1990).
No período de pré-implantação, o embrião é bastante resistente à
teratogênese, encontra-se com células totipotentes, em divisão, sem que
haja acréscimo citoplasmático (FRITZ e GIESE, 1990; ALMEIDA et al., 2000).
Segundo Wilson et al. (1953 e 1977) e Brent et al. (1993), esse estágio
inicial da gestação é caracterizado por “tudo ou nada”, ou seja, a
exposição materna a agentes químicos pode provocar a embrioletalidade
ou não interferir com o desenvolvimento do embrião. Isto se deve ao alto
grau de indiferenciação e capacidade de divisão das células do embrião,
que quando possível promovem a reposição das células mortas, sem que
haja comprometimento do desenvolvimento do embrião. Entretanto,
outros autores afirmam que certas injúrias nesse estágio podem resultar
em malformações ou retardos no desenvolvimento (GENEROSO et al., 1988;
GIAVINI et al., 1990).
Drogas como a ciclofosfamida, nicotina e adriamicina são capazes de
promover deficiência no ganho de peso e embrioletalidade quando
administradas durante o período de pré-implantação em ratas (FABRO et
al., 1984; GIAVINI et al., 1990).
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
O extrato hidroalcoólico das folhas de Coleus barbatus administrado
em ratas nas doses de 220, 440 e 880mg/kg por via oral durante o
período de pré-implantação apresentou efeitos embriotóxicos e de anti-
implantação (ALMEIDA et al., 2000). Estudo com embriões de camundongos
in vitro, demonstrou a ação embriotóxica do extrato aquoso das folhas de
Indigofera suffruticosa nas concentrações de 5 e 10mg/mL no período de
pré-implantação (LEITE et al., 2004).
O extrato aquoso de Ruta graveolens, administrado por via oral nos
primeiros 4 dias da prenhez de camundongos, promoveu alterações no
desenvolvimento normal dos blastocistos e atrasou o transporte dos
embriões no útero (GUTIÉRREZ-PAJARES et al., 2003).
Após a implantação, o embrião inicia o período de organogênese,
que na espécie humana vai do 18° ao 40° dia de gestação, e no rato, do 7°
ao 14° dia. Esse período é caracterizado por uma intensa proliferação e
migração celular, remodelamento tissular e formação rudimentar das
estruturas do corpo. É o período de maior susceptibilidade à ação de
agentes teratogênicos e embriofetotóxicos e no qual o maior número de
malformações podem ser induzidas (BRENT et al., 1993).
Drogas como o ácido valpróico, carbamazepina, talidomida,
isotretinoina, ciclofosfamida, captopril e tetraciclina são reconhecidamente
teratogênicas ao homem (COLLINS e MAO, 1999; MCELHATTON, 2003).
O extrato liofilizado de Rhazya stricta, quando administrado por via
oral em ratas prenhas nas doses de 0,5; 2,0; 5,0 e 8,0g/kg no período da
organogênese apresentou efeito teratogênico e fetotóxico, além de
promover alterações na placenta (RASHEED et al., 1997).
O extrato hidroalcoólico das folhas secas de Peumus boldus e a
boldina apresentaram atividade teratogênica e abortiva em ratas (ALMEIDA
et al., 2000a).
A administração dos extratos da fruta de Jatropha curcas em
metanol, diclorometano e éter de petróleo por via oral durante os estágios
iniciais da organogênese em ratos aumentou o número de reabsorções
fetais em relação ao grupo controle, indicando um possível efeito fetotóxico
(GOONASEKERA et al., 1995).
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
Com o fim da organogênese, tem início o período fetal, caracterizado
por diferenciação e crescimento tissular, maturação fisiológica dos
diferentes sistemas e crescimento ponderal do feto (FRITZ e GIESE, 1990).
Nesse período, a sensibilidade frente a malformações anatômicas é
extremamente baixa, porém a exposição a agentes químicos pode produzir
morte celular e inibição da diferenciação e divisão celular. Essas
alterações podem interferir com a formação dos sistemas nervoso,
endócrino e imunológico, promovendo desordens funcionais e de
comportamento (AUROUX, 1997).
Conforme descrito anteriormente, parâmetros tóxicocinéticos são
fundamentais para determinar o grau de embriofetotoxicidade de um
xenobiótico. Por se localizar entre a mãe e o concepto e ser uma estrutura
responsável pela troca de substâncias entre ambos, a placenta ganha uma
vital importância quando se quer avaliar os riscos de uma substância.
A placenta atua como uma barreira seletiva, pode funcionar como
um reservatório para drogas e ainda é capaz de sintetizar e metabolizar
substâncias. As drogas que têm a capacidade de atravessá-la têm
características semelhantes as que atravessam a barreira hemato-
encefálica, são substâncias lipofílicas, não-polares e de tamanho não
superior a 1000 Ä (ADLER, 1994).
Alterações na estrutura e função placentárias podem provocar
efeitos nocivos para o feto. O etanol, fumo, cocaína, salicilatos e metais
pesados são tóxicos para a placenta e conseqüentemente para o ser em
formação. As drogas podem promover necrose placentária, reduzir o fluxo
sanguíneo ou inibir a passagem de nutrientes pela placenta (PARIZEK,
1964).
Diferenças genéticas e metabólicas entre as espécies e linhagens
também influenciam na resposta embriofetotóxica de uma droga. A
atividade teratogênica da talidomida, tão marcante em humanos, macacos
e coelhos, não é detectada em ratos e camundongos (GAYLOR e CHEN,
1993). Os motivos que levam uma droga a ser teratogênica em uma
espécie e inofensiva em outra são complexos e pouco conhecidos
(STHEPHENS e FILLMORE, 2000).
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
Todas essas variantes, impedem o extrapolamento dos resultados
obtidos com os estudos de toxicologia do desenvolvimento em animais
para o homem. Mesmo assim, constituem uma importante ferramenta de
alerta para que não tenhamos mais desastres como o da talidomida.
Calendula officinalis L. está entre as espécies medicinais mais
utilizadas pela população mundial, sendo amplamente cultivada e
comercializada (Martins, 1995). Os extratos de suas flores podem ser
encontrados nas formas farmacêuticas de tintura, infuso, gel, creme e
pomada. Como descrito anteriormente, a espécie é bem estudada sob o
ponto de vista botânico, fitoquímico e farmacológico. Entretanto, de
acordo com a OMS (WORLD, 2001) e International Journal of Toxicology
(INTERNATIONAL, 2001), existem raros estudos sobre os efeitos toxicológicos
da Calendula officinalis. Em nossa revisão bibliográfica confirmamos
também a escassez de informações toxicológicas sobre a Calêndula. Nesse
contexto, nosso laboratório tem se dedicado nos últimos anos ao estudo
da farmacologia e toxicologia pré-clínica de fitoterápicos e consideramos
atraente a hipótese de avaliar a toxicidade do extrato hidroalcoólico de
Calendula officinalis produzido e comercializado pelo Laboratório Simões-
RJ.
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
3.Objetivo
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
3. OBJETIVO
3.1. Geral
Avaliar a toxicidade pré-clínica do extrato hidroalcoólico (EHA) de
Calendula officinalis, L.
3.2. Específico
• Estimar o valor de DL50 em ratos e camundongos por via oral.
• Investigar o efeito da administração subcrônica do EHA de
Calendula officinalis sobre os parâmetros bioquímicos e hematológicos em
ratos.
• Determinar o efeito da administração subcrônica do EHA sobre a
morfologia e massa dos tecidos em ratos.
• Explorar o efeito da administração subcrônica do EHA durante o
período de gestação em ratas e desenvolvimento da prole.
• Analisar o efeito do EHA durante as fases da gestação em ratas.
• Estudar o efeito da administração subcrônica do EHA sobre a
performance reprodutiva de ratos.
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
4.Artigo I
Artigo submetido à Revista Brasileira de Farmacognosia
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
AVALIAÇÃO DO TRATAMENTO SUBCRÔNICO COM O EXTRATO
HIDROALCOÓLICO DE CALENDULA OFFICINALIS L. SOBRE OS
PARÂMETROS BIOQUÍMICOS E HEMATOLÓGICOS EM RATAS. Silva, E.J.R.1; Aguiar, F.J.S.; Gonçalves, E.S.1; Sousa, I.M.V.; Dimech,
G.S.; Fraga, M.C.C.A.2; Coelho, M.C.O.C.3; Wanderley, A.G.2* 1 Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Departamento
de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco – UFPE,
Recife-PE, Brasil.
2Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal de
Pernambuco – UFPE, Recife-PE, Brasil. 3Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal Rural de
Pernambuco – UFRPE, Recife-PE, Brasil.
Resumo
O efeito da administração oral subcrônica do extrato hidroalcoólico (EHA)
de Calendula officinalis L. foi investigado sobre os parâmetros
hematológicos e bioquímicos em ratas Wistar. Quarenta ratas
(n=10/grupo) foram tratadas durante 30 dias consecutivos com EHA por
via oral nas doses de 0,25; 0,5; e 1,0g/kg e em seguida determinados os
perfis bioquímico e hematológico e a massa dos órgãos. Nossos resultados
mostram que não observamos sinais visíveis de toxicidade ou morte
durante o período de tratamento. Os parâmetros bioquímicos e
hematológicos e massa dos órgãos não foram modificados pela
administração subcrônica do EHA, excetuando-se aumento de 23,6% para
uréia na maior dose e aumento respectivamente de 61,4; 29,9 e 43,7%
para ALT. Na hematologia registramos flutuação dentro dos valores de
referência na contagem diferencial de neutrófilos, linfócitos e monócitos.
Concluímos que a administração subcrônica do extrato hidroalcoólico de
Calendula officinalis não produz efeitos tóxicos em ratas, entretanto, os
aumentos de uréia e alanina aminotransferase (ALT) sugerem inicialmente
possível sobrecarga renal e hepática. Unitermos: Calendula officinalis L.; Asteraceae; tratamento subcrônico; hematologia;
bioquímica; rata.
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
Abstract: Evaluation of hydroalcoholic extract of Calendula officinalis L. on biochemical and hematological parameters in female
rats.
The effect of subchronic oral administration of hydroalcoholic extract
(HAE) of Calendula officinalis L. was investigated on biochemical and
hematological parameters in female Wistar rats. Forty female rats
(n=10/group) were orally treated daily for 30 days with HAE at doses of
0.25; 0.5 and 1.0g/kg and determinated biochemical and hematological
parameters and organ weight. The treatment did not cause any deaths or
clear signs of toxicity in the animals. The administration of HAE failed to
change biochemical and hematological parameters and organ weight,
except for an increase of 23.6% in blood urea nitrogen and 61.4; 29.9 and
43.7% respectively in alanine transaminase (ALT) plasma level. For the
hematological parameters, we registered slight changes in neutrophils,
lymphocyte and monocyte count with were not different from reference
values. In conclusion, the subchronic administration of HAE of Calendula
officinalis did not induce any harzadous effects in female rats, however,
the increase in blood urea nitrogen and ALT suggest a possible renal and
hepatic overload. Keywords: Calendula officinalis L.; Asteraceae; subchronic treatmente; hemathology;
biochemistry; female rat.
Introdução
Calendula officinalis (Asteraceae) é uma herbácea anual originária
da região mediterrânea, sendo amplamente cultivada em várias partes do
mundo para fins ornamentais, cosméticos e medicinais (RAMOS et al.,
1998). No Brasil, a espécie é popularmente conhecida como Calêndula,
Calêndula-hortense, Maravilha-dos-jardins, malmequer ou verrucária.
Formas galênicas preparadas a partir dos extratos das flores de C.
officinalis são amplamente utilizadas como antiinflamatório e cicatrizante
em proporções de cerca de 1,0 a 2,0g de flor seca por 150mL de água ou
8,8 a 17,6mg de flavonóides por dia (SCHEFFER, 1979; BLUMENTHAL, 1998;
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
BRASIL, 2004). Estudos demonstraram que os triterpenos, sobretudo os
monoésteres de faradiol, são os principais responsáveis pela atividade
antiinflamatória da planta (DELLA-LOGGIA et al., 1994; AKIHISA et al., 1996).
Em nossa revisão, verificamos que a Calêndula se encontra entre as
plantas mais utilizadas para fins medicinais, entretanto, detectamos
poucos estudos sobre a segurança do uso do extrato hidroalcoólico (EHA)
de Calendula officinalis. Nesse sentido, o presente trabalho teve como
objetivo avaliar os efeitos da administração subcrônica do EHA sobre os
parâmetros bioquímicos e hematológicos em ratas.
Materiais e Métodos
Animais
Foram utilizadas ratas Wistar, Rattus norvegicus var. albinus com 3
meses de idade, provenientes do Biotério do Departamento de Fisiologia e
Farmacologia. Os animais receberam água e dieta (Labina) ad libitum e
foram mantidos em condições controle de iluminação (ciclo 12h
claro/escuro) e temperatura (23 ± 2°C). O protocolo experimental foi
aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEEA) da
Universidade Federal Pernambuco, processo n° 23076.0011236/2003-44.
Material Botânico
O material botânico utilizado foi constituído pelas flores secas de
Calendula officinalis L. sob a forma EHA (50g do material vegetal para
100ml de solução hidroalcoólica 70%), produzido e fornecido pelo
Laboratório Simões - RJ, Brasil - (lote n° 02.001). Em nosso laboratório, o
EHA foi concentrado até a secura em rota evaporador sob pressão
reduzida para eliminação do solvente orgânico, em seguida o material foi
ressuspenso em água destilada e a concentração final variou entre (350 e
450mg/mL). O material foi dividido em alíquotas e estocado a -20oC.
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
Tratamento dos Animais
Quarenta ratas correspondendo a quatro grupos (n=10/grupo)
foram tratadas durante 30 dias consecutivos por via oral com EHA nas
doses de 0,25; 0,5 e 1,0g/kg (grupo tratado) ou água destilada (grupo
controle). As doses utilizadas no protocolo são respectivamente cerca de
10, 20 e 40 vezes superiores à dose usual. Durante o tratamento, os
animais foram pesados semanalmente e acompanhados quanto a sinais
clínicos de toxicidade, consumo de água e ração. Ao final do tratamento,
os animais foram submetidos a um jejum de 12h e anestesiados com éter.
Em seguida, procedeu-se a coleta de sangue por rompimento do plexo
retro-orbital com auxílio de capilar de vidro (WAYNFORTH, 1980). O sangue
foi dividido em dois tipos de tubo: um com EDTA (parâmetros
hematológicos) e o outro sem anticoagulante (parâmetros bioquímicos).
Parâmetros Bioquímicos
Para análise bioquímica, o sangue foi centrifugado a 3500rpm
durante 10 minutos para obtenção do soro e em seguida determinados os
parâmetros: glicose, uréia, creatinina, aspartato aminotransferase (AST),
alanina aminotransferase (ALT), colesterol total, triglicerídeos, fosfatase
alcalina (ALP), bilirrubina total e direta, proteínas totais, albumina e
globulina. Os ensaios foram realizados em aparelho automático Cobas
Mira (Roche) com kits da Boehringer Ingelheim®.
Parâmetros Hematológicos
Os parâmetros eritrócitos, leucócitos, plaquetas, hemoglobina,
hematócritos e os índices hematimétricos: volume corpuscular médio
(VCM), hemoglobina corpuscular média (HCM) e concentração de
hemoglobina corpuscular média (CHCM) foram determinados
imediatamente após a coleta através do analisador automático de células
hematológicas Coulter STKS. A contagem diferencial de leucócitos foi
realizada com May-Grünwald-Giemsa, em cada caso, 100 células foram
contadas.
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
Análise morfológica macroscópica
Após a coleta do sangue, procedeu-se a eutanásia por
aprofundamento da anestesia etérea e necrópsia para avaliação da
morfologia macroscópica externa dos órgãos. Os órgãos cérebro, coração,
fígado, rim, glândula adrenal, baço, útero e ovário foram cuidadosamente
removidos, dissecados e tiveram sua massa úmida determinada em
balança analítica a qual foi expressa em termos de massa relativa g/100g
(VIJAYALAKSHMI et al., 2000).
Análise Estatística
Os valores foram expressos como média ± erro padrão da média
(epm). As diferenças entre os grupos foram determinadas através da
Análise de Variância (ANOVA), seguida, quando detectada diferença, pelo
teste de Newman-Keuls. O nível de significância para rejeição da hipótese
de nulidade foi sempre ≥ a 5%.
Resultados
O ganho de massa corporal das ratas dos grupos controle e tratado
são mostrados na figura 1. O EHA não alterou de forma significativa o
ganho de massa dos animais. Durante o tratamento, não observamos
sinais clínicos de toxicidade e nenhuma morte foi registrada. Não houve
alteração no consumo de água e ração.
O tratamento subcrônico com EHA nas ratas, de forma geral, não
induziu modificações no perfil bioquímico (Tabela 1). Todos os parâmetros
mantiveram-se dentro da faixa de referência, exceto para o valor da uréia
no grupo tratado com a maior dose que aumentou significativamente em
cerca de 23,6% do valor basal, assim como, a ALT que aumentou
respectivamente em 61,4; 29,9 e 43,7% no grupo tratado em relação ao
grupo controle (Tabela 1).
De maneira semelhante ao resultado obtido nos parâmetros
bioquímicos, observamos que o tratamento com EHA não alterou o perfil
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
hematológico (Tabela 2), contudo, observamos, mesmo dentro dos valores
de referência, pequenas flutuações na contagem diferencial de neutrófilos,
linfócitos e monócitos.
A análise macroscópica externa não revelou nenhuma alteração, a massa
relativa dos tecidos também não foi alterada pela administração do EHA
(Figura 2).
Discussão
Nossos resultados mostraram que a administração sub-crônica do
EHA de Calendula officinalis de forma geral não produziu efeitos tóxicos
em ratas.
Durante o tratamento subcrônico, nenhum sinal clínico visível de
toxicidade foi observado, em adição, a atividade geral das fêmeas não foi
alterada, assim como, o consumo de ração e água. O acompanhamento da
massa corporal do animal é um importante indicador para a avaliação da
toxicidade de uma substância (JAHN e GÜNZEL, 1997), o EHA não alterou o
ganho de massa corporal das ratas, mesmo em doses diárias de cerca de
10, 20 e 40 vezes maiores do que a usual para o tratamento de processo
inflamatório ou como cicatrizante. Nossos resultados estão de acordo com
estudos realizados com os extratos aquoso e etilenoglicólico de Calendula
officinalis e com a saponina terpênica, calendulosídeo B, respectivamente
em ratos e camundongos, os quais também não demonstraram sinais
claros de toxicidade (MANOLOV et al., 1964; RUSSO et al., 1972; IATSYNO et
al., 1978).
De fato, resultados do nosso laboratório (dados não apresentados)
mostram que o EHA em doses de até 5,0g/kg por via oral não produziu
morte em ratos e camundongos de ambos os sexos, por um período de
observação de até 14 dias.
Embora de modo geral o perfil bioquímico dos animais estivesse
dentro da faixa de referência (HARKNESS e WAGNER, 1993), houve exceções
para a uréia e ALT. A alteração verificada nos níveis plasmáticos de uréia
no grupo tratado, apenas com a maior dose pode ser inicialmente
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
interpretada como uma alteração renal. A elevação nos níveis plasmáticos
de uréia e creatinina fornece indícios de sobrecarga renal, insuficiência
renal aguda ou ainda de aumento no catabolismo protéico (VIJAYALAKSHMI
et al., 2000; ADEBAYO et al., 2003).
As análises das enzimas transaminases séricas (ALT e AST) e da
fosfatase alcalina são importantes indicadores de lesões nas células
hepáticas (MARTIN et al., 1981). Uma droga não provoca dano algum no
fígado sem interferir com a atividade normal dessas enzimas
(VIJAYALAKSHMI et al., 2000). A fosfatase alcalina é fundamental para a
formação de constituintes da membrana celular, influenciando na sua
permeabilidade. As transaminases existem em concentrações muito
pequenas no sangue e são liberadas pelos hepatócitos quando estes
sofrem algum tipo de lesão. Os aumentos nos níveis plasmáticos de ALT
observados em nosso estudo, além de serem estatisticamente significantes
em relação ao grupo controle, ficaram acima do nível de referência para a
espécie, situado entre 21-52 UI/L, segundo COIMBRA et al. (1995). Estes
dados fornecem indícios de alterações na função hepática, pois os níveis
séricos de ALT aumentam quando ocorrem alterações na permeabilidade
ou injúria nos hepatócitos. A AST é essencialmente mitocondrial e não é
liberada tão rapidamente quanto a ALT, que é citoplasmática. Isto pode
justificar o fato de termos encontrado alterações significativas apenas nos
níveis de ALT. Além disso, a ALT é um indicador mais sensível de
hepatotoxicidade do que a AST, pois enquanto a primeira é
essencialmente hepática, a segunda também pode ser encontrada em
altas concentrações em outros órgãos, como rins, pulmões e coração (AL-
HABORI et al., 2002).
Quanto ao estudo hematológico, não observamos alterações do perfil
hematológico. A contagem diferencial de neutrófilo, linfócito e monócito
revelou, embora, dentro dos limites de referência (HARKNESS e WAGNER,
1993), pequenas flutuações, sem indicativo de importância clínica.
Baseados em nossos resultados podemos concluir que a
administração subcrônica do EHA de Calendula officinalis não produziu
efeitos tóxicos sobre os parâmetros bioquímicos e hematológicos em ratas.
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
Entretanto, o aumento dos níveis de uréia e ALT apontam para uma
possível sobrecarga renal e hepática respectivamente, as quais devem ser
investigadas em maior detalhe posteriormente.
Agradecimentos
A CAPES e CNPq pelo apoio financeiro, ao Laboratório Simões-RJ
por ceder gentilmente o extrato hidroalcoólico e a Rejane Ferreira da Silva
pelo valioso apoio técnico.
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* Autor para correspondência:
Prof. Dr.Almir Gonçalves Wanderley
Universidade Federal de Pernambuco.
Departamento de Fisiologia e Farmacologia, CCB.
Laboratório de Farmacologia e Toxicologia Pré-Clínica
de Produtos Bioativos.
Av. Prof. Moraes Rego, s/n - Cidade Universitária,
Recife - PE - CEP: 50670-901
E-mail: [email protected]
0 10 20 300
10
20
30
40
50ControleEHA 0,25 g/kgEHA 0,5 g/kgEHA 1,0 g/kg
Tempo (dias)
Gan
ho d
e m
assa
corp
oral
(g)
Figura 1: Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis
(0,25 a 1,0g/kg) por via oral sobre o ganho de massa corporal em ratas
Wistar adultas tratadas por 30 dias consecutivos. Os valores representam
as médias ± e.p.m. (n=10/grupo).
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
0.0 0.2 0.4 0.6
ção
ado
aço
Rim
ebro
mão
enal
tero
ário
ControleEHA 0,25g/kgEHA 0,5g/kgEHA 1,0g/kg
3.2 3.6 4.0
Massa dos órgãos (g/100g)
vOvário
ÚÚtero
rAdrenal
lPulmão
rCérebro
Rim
BBaço
gFígado
aCoração
Figura 2: Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis
(0,25; 0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre a massa dos órgãos (g/100g) de
ratas Wistar adultas tratadas por 30 dias consecutivos. Os valores
representam as médias ± e.p.m. (n=10/grupo).
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
Tabela 1: Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25; 0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre os
parâmetros bioquímicos em ratas Wistar adultas tratadas por 30 dias consecutivos.
Paramêtros X Controle X EHA 0,25g/kg EHA 0,5g/kgx EHA 1,0g/kg
Glicose (mg/dL) 69,1 ± 1,1 69,2 ± 4,0 79,0 ± 3,6 73,8 ± 3,9
Uréia (mg/dL) 41,4 ± 2,3 47,3 ± 1,2 46,2 ± 1,7 51,2 ± 1,6*
Creatinina (mg/dL) 0,50 ± 0,06 0,64 ± 0,04 0,58 ± 0,03 0,62 ± 0,02
Aspartato aminotransferase (U/L) 177,8 ± 13,2 209,5 ± 16,3 153,4 ± 12,9 160,8 ± 4,6
Alanina-aminotransferase (U/L) 45,1 ± 3,0 72,8 ± 3,1* 58,6 ± 3,3* 64,8 ± 2,7*
Colesterol total (mg/dL) 68,6 ± 5,4 74,8 ± 6,7 78,6 ± 9,9 76,2 ± 5,1
Triglicerídeos (mg/dL) 81,8 ± 11,4 64,8 ± 7,4 84,6 ± 8,2 92,5 ± 4,5
Fosfatase alcalina (U/L) 57,6 ± 3,8 79,5 ± 14,0 56,6 ± 6,9 81,8 ± 6,4
Bilirrubina total (mg/dL) 0,19 ± 0,02 0,20 ± 0,01 0,21 ± 0,01 0,23 ± 0,02
Bilirrubina direta (mg/dL) 0,11 ± 0,01 0,10 ± 0,01 0,11 ± 0,01 0,12 ± 0,02
Proteínas totais (g/dL) 7,6 ± 0,2 7,9 ± 0,1 7,6 ± 0,2 8,1 ± 0,1
Albumina (g/dL) 1,7 ± 0,1 1,7 ± 0,1 1,7 ± 0,04 1,8 ± 0,03
Globulina (g/dL) 5,9 ± 0,1 5,8 ± 0,1 6,2 ± 0,2 6,4 ± 0,2
Os valores representam as médias ± e.p.m. de 10 animais. * Indica estatisticamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido de Newman-Keuls, p< 0,05).
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
Tabela 2: Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25; 0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre os
parâmetros hematológicos em ratas Wistar adultas tratadas por 30 dias consecutivos.
Parâmetros Controle EHA 0,25g/kg EHA 0,5g/kg EHA 1,0g/kg
Eritrócitos (106/µL) 7,6 ± 0,1 7,6 ± 0,2 7,8 ± 0,2 7,8 ± 0,1
Hemoglobina (g/dL) 14,8 ± 0,2 15,4 ± 0,1 15,3 ± 0,3 15,6 ± 0,3
Hematócrito (%) 41,2 ± 0,8 42,3 ± 0,4 42,3 ± 1,3 42,6 ± 0,9
VCM (fL) 54,0 ± 0,6 56,0 ± 0,7 53,9 ± 1,3 54,8 ± 0,6
HCM (pg) 19,4 ± 0,2 20,4 ± 0,3 19,6 ± 0,5 20,1 ± 0,2
CHCM (g/dL) 35,8 ± 0,3 36,3 ± 0,1 36,2 ± 0,5 36,7 ± 0,1
Plaquetas (103/µL) 933,88 ± 27,60 938,60 ± 26,82 936,60 ± 32,55 954,50 ± 39,40
Leucócitos (103/µL) 6,7 ± 0,2 7,2 ± 0,9 6,2 ± 0,6 8,4 ± 0,5
Bastonetes (%) 0 0 0 0
Neutrófilos (%) 22,3 ± 2,2 11,0 ± 1,3* 26,6 ± 1,8 16,8 ± 1,9*
Eosinófilos (%) 1,6 ± 0,4 0,8 ± 0,2 1,0 ± 0 1,5 ± 0,3
Basófilos (%) 0,22 ± 0,13 0,40 ± 0,22 0,20 ± 0,17 0,50 ± 0,3
Linfócitos (%) 69,3 ± 1,9 85,2 ± 1,6* 69,2 ± 2,2 79,3 ± 2,4*
Monócitos (%) 6,6 ± 0,6 2,6 ± 0,4* 2,8 ± 0,8* 2,0 ± 0,5*
Os valores representam as médias ± e.p.m. de 10 animais. VCM: Volume Corpuscular Médio, HCM: Hemoglobina Corpuscular Média, CHCM: Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média. * Indica estatisticamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido de Newman-Keuls, p< 0,05).
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
5.Artigo II
Artigo a ser submetido ao Journal of Ethnopharmacology
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE
CALENDULA OFFICINALIS L. Erick J.R. Silvaa, Fábio Aguiara, Liriane B. Evênciob, Mariana M.A. Lyraa,
Maria Cristina O.C. Coelhod, Parviz Afiatpourc, Maria do Carmo C. A.
Fragac, Almir G. Wanderleyc* aDepartamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco – UFPE.
Recife-PE, Brasil. bDepartamento de Histologia e Embriologia, Universidade Federal de Pernambuco – UFPE.
Recife-PE, Brasil. cDepartamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal de Pernambuco – UFPE.
Recife-PE, Brasil. dDepartamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal Rural de Pernambuco –
UFRPE. Recife-PE, Brasil. Resumo
O extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis foi avaliado quanto
à toxicidade aguda por via oral em ratos e camundongos e seus efeitos
subcrônicos sobre os parâmetros hematológicos, bioquímicos e
morfológicos em ratos. Na toxicidade aguda o EHA não provocou morte
nos animais após administrações de até 5,0g/kg. O tratamento por 30
dias com EHA nas doses de 0,25; 0,5; e 1,0g/kg em ratos não produziu
alterações nos parâmetros hematológicos em relação ao grupo controle. No
perfil bioquímico, observamos que o EHA produziu um aumento
significativo nos valores de uréia e alanina aminotransferase (ALT). Os
parâmetros morfológicos do cérebro, rim e coração não sofreram
alterações, entretanto, no pulmão e fígado foram encontrados infiltrados
inflamatórios os quais foram relacionados respectivamente com a gavagem
e possível hepatotoxicidade. Concluímos que o EHA não possui efeitos
tóxicos em ratos, contudo existem evidências de possível toxicidade renal
e hepática. Palavras-chave: Calendula officinalis L.; Asteraceae; tratamento subcrônico; hematologia;
bioquímica; morfologia.
*Contato com o autor: Av. Prof. Moraes Rego, s/n CEP: 50.670-901, Recife-PE, Brasil. Tel:(81)-21268530, Email: [email protected]
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
Abstract
The hydroalcoholic extract (HAE) of Calendula officinalis L. was evaluated
as for the acute toxicity by oral route in rats and mice and for the
subchronic effects on the hematological, biochemical and morphologic
parameters in rats. In acute toxicity test, HAE failed to cause death in the
animals after administrations up to 5,0g/kg. The treatment orally with
EHA at 0.25; 0.5; and 1.0g/kg did not induce hematological alterations in
comparison with control group. In biochemical parameters, we observed
an increase in blood nitrogen level and alanina transaminase (ALT).
Morphologic examination of brain, kidney and heart did not show any
modification, however, inflammatory sites were founded in lung and liver
with were associated with oral gavage and a possible hepatotoxic effect.
HAE was non toxic in rats, although there are evidences of renal and liver
overload. Keywords: Calendula officinalis L.; Asteraceae; subchronic treatment; hematology;
biochemistry; morphology.
1. Introdução
Calendula officinalis L. (Asteraceae) é uma herbácea anual originária
da Europa Meridional. A planta é cultivada em vários países do Velho
Mundo e da América (Garcia et al., 1996), tanto para fins ornamentais
quanto medicinais (Ramos et al., 1998).
As atividades antiinflamatória e cicatrizante das flores de Calendula
officinalis foram demonstradas por vários estudos (Scheffer, 1979; Peyroux
et al., 1981; Shipochliev et al., 1981; Lievre et al., 1992; Della-Loggia et
al., 1990, 1994; Jorga Neto et al., 1996). Outras atividades são atribuídas
às flores da planta, como anti-viral (Kavaltchev et al., 1997) e anti-tumoral
(Boucaud-Maitre et al., 1988). Entretanto, seu uso está aprovado pela
Comissão E (Alemanha) apenas como antiinflamatório para as mucosas
oral e faríngea (uso tópico e interno) e na cicatrização de ferimentos e
queimaduras (uso externo) em proporções de 1 a 2g de flor seca/150mL
de água por dia (Blumenthal, 1998).
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
No Brasil, a espécie é popularmente conhecida como Calêndula, ou
Maravilha-dos-jardins. O Laboratório Simões cultiva e explora
comercialmente a Calêndula sob a forma farmacêutica de pomada, com
indicações antiinflamatória e cicatrizante.
As informações das propriedades farmacológicas do extrato das
flores de Calêndula são amplas, entretanto poucos são os dados
disponíveis sobre a segurança do seu uso. Nesse contexto, o presente
trabalho teve como objetivo avaliar a toxicidade do extrato hidroalcoólico
(EHA) de Calendula officinalis em roedores.
2. Metodologia
2.1. Animais
Foram utilizados ratos Wistar, Rattus norvegicus com 3 meses de
idade e camundongos albinos, Mus musculus adultos (25 a 35g), de ambos
os sexos, provenientes do Biotério do Departamento de Fisiologia e
Farmacologia e do Departamento de Antibióticos da Universidade Federal
de Pernambuco, respectivamente. Os animais receberam água e ração ad
libitum e foram mantidos em condições controles de (ciclo 12h
claro/escuro) e temperatura (23 ± 2°C). O protocolo experimental foi
aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEEA) da
UFPE, processo n° 23076.0011236/2003-44.
2.2. Material Botânico O material botânico utilizado foi constituído pelas flores secas de
Calendula officinalis L. sob a forma EHA (50g do material vegetal para
100ml de solução hidroalcoólica 70%), produzido e fornecido pelo
Laboratório Simões - RJ, Brasil - (lote n° 02.001). Em nosso laboratório, o
EHA foi concentrado até a secura em rota evaporador sob pressão
reduzida para eliminação do solvente orgânico, em seguida o material foi
ressuspenso em água destilada e a concentração final variou entre (350 e
450mg/mL). O material foi dividido em alíquotas e estocado a -20oC.
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
2.3. Toxicidade Aguda
Cinco grupos de camundongos e ratos (n=5/5 macho/fêmea) foram
privados de ração por 12h, em seguida receberam em dose única, por
gavagem, EHA nas doses de 0,625; 1,25; 2,5 e 5,0g/kg ou água destilada
no maior volume (grupo controle) para a determinação da dose letal 50%
(DL50) de acordo com o método descrito por Litchfield e Wilcoxon (1949).
Os animais foram observados diariamente quanto a alterações gerais de
comportamento, sinais clínicos de toxicidade e mortalidade durante o
período de 14 dias.
2.4. Tratamento dos Animais
Quatro grupos (n=10/grupo) de ratos machos foram tratados
durante 30 dias consecutivos por via oral com EHA nas doses de 0,25; 0,5
e 1,0g/kg por dia ou água destilada (grupo controle). As doses utilizadas
no protocolo são respectivamente cerca de 10, 20 e 40 vezes superiores à
dose usual recomendada na literatura (1 a 2g/150mL de água)
(Blumenthal, 1998). Durante o tratamento, a variação de massa corporal
dos animais foi determinada, bem como o consumo de água e ração e os
ratos foram observados quanto a sinais clínicos de toxicidade e atividade
geral. Ao final do tratamento, todos os animais foram submetidos a um
jejum de 12h e anestesiados com éter. Em seguida, procedeu-se à coleta
de sangue por rompimento do plexo retro-orbital com auxílio de capilar de
vidro (Waynforth, 1980). O sangue foi dividido em dois tipos de tubo: um
com EDTA (parâmetros hematológicos) e o outro sem anticoagulante
(parâmetros bioquímicos).
2.5. Parâmetros Hematológicos
Os parâmetros eritrócitos, leucócitos, plaquetas, hemoglobina,
hematócritos e os índices hematimétricos: volume corpuscular médio
(VCM), hemoglobina corpuscular média (HCM) e concentração de
hemoglobina corpuscular média (CHCM) foram determinados
imediatamente após a coleta através do analisador automático de células
hematológicas Coulter STKS. A contagem diferencial de leucócitos foi
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
realizada com May-Grünwald-Giemsa, em cada caso, 100 células foram
contadas.
2.6. Parâmetros Bioquímicos
Para a análise bioquímica, o sangue foi centrifugado a 3500rpm
durante 10 minutos para a obtenção do soro, em seguida determinados os
parâmetros: glicose, uréia, creatinina, aspartato aminotransferase (AST),
alanina aminotransferase (ALT), colesterol total, triglicerídeos, fosfatase
alcalina (ALP), bilirrubina total e direta, proteínas totais, albumina e
globulina. Os ensaios foram realizados em aparelho automático Cobas
Mira (Roche) com kits da Boehringer Ingelheim.
2.7. Análise morfológica macro e microscópica
Após a eutanásia por aprofundamento da anestesia etérea
prodeceu-se a necrópsia (n=6/grupo) para avaliação da morfologia
macroscópica externa dos órgãos. Os órgãos cérebro, coração, fígado, rim,
glândula adrenal, baço, testículo e ducto deferente foram cuidadosamente
removidos, dissecados e tiveram sua massa úmida determinada em
balança analítica a qual foi expressa em termos de massa relativa g/100g
(Vijayalakshmi et al., 2000). Em outro procedimento, os animais
(n=4/grupo) foram perfundidos com formaldeído 10% em solução tampão
neutra e em seguida os órgãos cérebro, coração, pulmão, rim e fígado
foram retirados e imersos em líquido de Bouin e fixados “in totum” durante
48 horas, à temperatura ambiente. As lâminas histológicas foram
processadas de acordo com Lison (1960) e coradas em
hematoxilina/eosina.
2.8. Análise Estatística
Os valores foram expressos como média ± erro padrão da média
(epm). As diferenças entre os grupos foram analisadas através da análise
de variância (ANOVA), seguida, quando detectada diferença, pelo teste de
Newman-Keuls. O nível de significância para rejeição da hipótese de
nulidade foi sempre ≥ a 5%.
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
3.0. Resultados
3.1. Toxicidade aguda
O EHA na dose de até 5,0g/kg administradas por via oral em
camundongos e ratos de ambos os sexos não produziu morte em nenhum
grupo por um período de 14 dias de observação. Os animais não
mostraram sinais clínicos de toxicidade ou alteração comportamental.
3.2. Ganho de massa corporal
O ganho de massa corporal dos ratos dos grupos controle e tratado
são mostrados na figura 1. O tratamento com EHA não alterou o ganho de
massa dos animais, bem como o consumo de água e ração. Durante o
tratamento, não observamos alteração comportamental ou sinais clínicos
de toxicidade. Nenhuma morte foi registrada.
3.3. Perfil Hematológico
O perfil hematológico dos ratos não foi modificado pelo tratamento
com EHA (Tabela 1), contudo, observamos, mesmo dentro dos valores de
referência, variações estatisticamente significativas (cerca de 10% em
relação ao grupo controle) no número de eritrócitos, VCM, HCM e na
contagem diferencial de eosinófilos, basófilos e monócitos.
3.4. Perfil bioquímico
De maneira geral, o tratamento com EHA não promoveu alterações
do perfil bioquímico dos ratos (Tabela 2). Todos os parâmetros
mantiveram-se dentro da faixa de referência, exceto os valores de uréia
que aumentaram significativamente de forma dose dependente em cerca
de 34,3; 38,2 e 50,6% e ALT, em aproximadamente 56,5; 42,2; e 37,3%
para as doses de 0,25; 0,5 e 1,0g/kg, respectivamente, quando comparado
ao grupo controle.
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
3.5. Análise morfológica
A massa relativa dos tecidos não foi modificada pela administração
do EHA (Figura 2). A análise macroscópica externa dos órgãos não revelou
alterações, exceto no pulmão, no qual observamos uma menor massa em
todas as doses do grupo tratado. A análise microscópica não evidenciou alterações histológicas no
coração, rins e cérebro. O parênquima hepático apresentou células de
tamanho normal dispostas em traves codornais com núcleo central de
aspecto eucromático. Disposição vascular de distribuição homogênea
contendo células de Kupffer de forma e distribuição semelhante ao
controle (Figuras 3 e 4). Entretanto, para o grupo tratado com EHA
1,0g/kg, na periferia do lóbulo e nas proximidades do espaço-porta,
notou-se a presença de aglomerado de células hepáticas contendo
citoplasma mais acidófilo e núcleo levemente mais heterocromático.
Observou-se também a presença de um infiltrado inflamatório não muito
intenso no espaço periportal, sendo mais comumente formado por
leucócitos e plasmócitos e algumas células mononucleares características
de reações crônicas (Figuras 5 e 6). Nos pulmões do grupo tratado com
EHA 0,25 e 1,0g/kg observou-se a presença de descontinuidade do
epitélio e circunferência diminuída, com a mucosa apresentando dobras
de constrição. Na conjuntiva ocorre presença de infiltrado inflamatório
contendo muitos linfócitos, plasmócitos e macrófagos, sem alterações no
parênquima (Figura 7).
4.0. Discussão e Conclusão
No ensaio de toxicidade aguda por via oral, o EHA demonstrou-se
seguro, pois utilizando doses até 200 vezes superior à usada na
terapêutica antiinflamatória e cicatrizante não observamos sinal de
toxicidade no período avaliado. Estudo de toxicidade aguda com o EHA de
Calêndula demonstrou uma DL50 de 526mg/100g por via intravenosa em
ratos (Boyadzhiev e Vissh, 1964). Essa ausência de toxicidade por via oral
pode estar relacionada à baixa absorção de vários constituintes do EHA
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
pelo trato gastrintestinal dos animais, impedindo que os níveis séricos
letais sejam atingidos.
No estudo subcrônico, não houve alterações no comportamento dos
animais ou sinal clínico claro de toxicidade. Avramova et al. (1988)
mostraram que a administração crônica de extrato de Calêndula em ratos
e hamsters não produziu toxicidade.
O tratamento com EHA não alterou o perfil hematológico. As
flutuações encontradas no número de eritrócitos, VCM, HCM e na
contagem diferencial de eosinófilos, basófilos e monócitos encontraram-se
dentro dos limites estabelecidos (Harkness e Wagner, 1993) o que sugere
fortemente que estas variações não estão associadas ao tratamento com
EHA.
Em relação ao perfil bioquímico, o EHA não alterou os parâmetros
analisados que se mantiveram dentro dos valores de referência para a
espécie (Harkness e Wagner, 1993; Kaneko, 1997). Entretanto, o aumento
dose dependente dos níveis plasmáticos de uréia pode ser inicialmente
interpretado como sobrecarga renal. A elevação nos níveis plasmáticos de
uréia e creatinina fornece indícios de sobrecarga renal, insuficiência renal
aguda ou ainda de aumento no catabolismo protéico (Vijayalakshmi et al.,
2000; Adebayo et al., 2003).
Os aumentos nos níveis plasmáticos de ALT observado em nosso
estudo, além de serem estatisticamente significantes em relação ao grupo
controle, ficaram acima dos níveis de referência para a espécie, situados
entre 21-52 UI/l (Coimbra et al., 1995). A elevação dos valores das
enzimas transaminases séricas (ALT e AST) são usadas como indicadores
de lesões nas células hepáticas, devido a sua alta concentração nos
hepatócitos (Martin et al., 1981). Entretanto, a ALT é um marcador mais
específico para a função hepática, já que se encontra predominantemente
nos hepatócitos, enquanto a AST também pode ser encontrada em
concentrações elevadas no músculo cardíaco, pulmão e rim (Al-Habori et
al., 2002). Dados do laboratório (artigo submetido) revelaram que o
tratamento com EHA durante 30 dias em ratas também induziu aumento
nos níveis plasmáticos de ALT. A análise microscópica do fígado revelou
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
que o extrato na maior dose provocou um infiltrado inflamatório de
pequena intensidade.
Estes resultados fornecem indícios de sobrecarga hepática, pois
aumentos nos níveis séricos de ALT podem ser provocados por
modificações na permeabilidade da membrana ou lesões celulares (Latha
et al., 1998). Normalmente, flutuações nos níveis de ALT ocorrem junto
com os de AST, entretanto, a AST é essencialmente mitocondrial e não é
liberada tão rapidamente quanto a ALT, que é citoplasmática (Al-Habori et
al., 2002). Isto pode justificar o fato de termos encontrado alterações
significativas apenas nos níveis de ALT.
Por outro lado, estudo realizado por Cordova et al. (2002) com a
fração butanólica do extrato de C. offinicinalis revelou atividade
hepatoprotetora, através de um efeito antioxidante in vitro em células
hepáticas de ratos, onde os terpenos e carotenóides presentes no extrato
atuam como aceptores de radicais livres e inibem a peroxidação lipídica no
fígado. Porém, sabe-se que por motivos farmacocinéticos, as atividades in
vitro e in vivo podem ser diferentes. Pérez-Carreón et al. (2002) observaram
que os extratos aquoso e hidroalcoólico de Calêndula, em baixas
concentrações (ng/mL), apresentaram atividade protetora frente aos
efeitos genotóxicos do agente carcinogênico dietilnitrosamina, porém, em
concentrações mais elevadas (µg/mL), os mesmos extratos apresentam
atividade genotóxica. Esses resultados controversos decorrem da
capacidade dos flavonóides atuarem como anti-oxidantes em baixas
concentrações e, em concentrações maiores, serem pró-oxidantes
(Laughton et al., 1989).
Dessa forma, existe a possibilidade que o efeito hepatotóxico
observado em nosso trabalho pode ser decorrente de uma atividade pró-
oxidante dos flavonóides. As alterações no pulmão podem ter sido produzidas pela gavagem
não tendo relação aparentemente com o EHA, visto que o grupo controle
também foi afetado. Lesões semelhantes foram observados por Carlini et
al. (1988) e Palmeiro et al. (2003) em estudos pré-clínicos com os extratos
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss. e Plantago australis Lam.
respectivamente administrados em ratos durante 60 dias por gavagem.
Nossos resultados mostram que a administração subcrônica do EHA
de Calendula officinalis não produziu efeitos tóxicos sobre os parâmetros
bioquímicos, hematológicos e morfológicos em ratos. Entretanto, o
aumento dos níveis de uréia e ALT e a alteração histológica no fígado
apontam para uma possível sobrecarga renal e hepática respectivamente.
Agradecimentos
CAPES e CNPq pelo apoio financeiro, ao Laboratório Simões-RJ por
ceder gentilmente o extrato hidroalcoólico e a Rejane Ferreira da Silva pelo
valioso apoio técnico.
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Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
0 10 20 300
15
30
45
60ControleEHA 0.25 g/kgEHA 0.5 g/kgEHA 1.0 g/kg
Tempo (dias)
Gan
ho d
e m
assa
corp
oral
(g)
Figura 1: Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis
(0,25 a 1,0g/kg) por via oral sobre o ganho de massa em ratos Wistar
adultos tratados por 30 dias consecutivos Os valores representam as
médias ± e.p.m. (n=10/grupo).
0.0 0.2 0.4 0.6
Controle
EHA 0,25g/kgEHA 0,5g/kg
EHA 1,0g/kg
2.4 2.8 3.2 3.6 4.0
Massa dos órgãos (g/100g)
***
enteDDR
culoTestículo
enalAdrenal
mãoPulmão
ebroCérebro
RimRim
BaçoBaço
adoFígado
açãoCoração
Figura 2: Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis
(0,25; 0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre a massa dos órgãos (g/100g) em
ratos Wistar tratados por 30 dias consecutivos. Os valores representam as
médias ± e.p.m. (n=6/grupo). *Indica estatisticamente diferente do grupo
controle (ANOVA seguido de Newman-Keuls, p< 0,05). DDR=ducto
deferente de rato.
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
H
EP
H
Figura 3: Fotomicrografia do fígado de rato Wistar controle tratado com
água por via oral por 30 dias (grupo controle). Células hepáticas (H) e o
espaço porta (EP) com aspecto normal. (coloração HE, aumento ± 107x).
vc
K
Figura 4: Fotomicrografia do fíga
água por via oral por 30 dias (gru
Kuppfer (K), os vasos capilares (v
HE, aumento ± 430x).
V
H
do de rato Wistar controle tratado com
po controle). Hepatócitos (H), células de
c) e a veia centro lobular (V). (coloração
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
II
EP
H
Figura 5: Fotomicrografia do fígado de rato Wistar tratado com extrato
hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (1,0g/kg) por via oral. por 30
dias. Infiltrado inflamatório (II) nas adjacências do espaço porta (EP) e
acúmulo de células acidófilas (H) – (coloração HE, aumento 107x).
H
Figura 6: Fotomicrografia do fígado de rato Wistar tratado com extrato
hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (1,0g/kg) por via oral. por 30
dias. Presença de infiltrado na região periportal (seta) e hepatócitos
acidófilos (H) – (coloração HE, aumento ± 430x).
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
SA B
IIB
**
A
Figura 7: Fotomicrografia do pulmão de rato Wistar tratado com extrato
hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (1,0g/kg) por via oral por 30
dias. Bronquíolos (B) com pequena quantidade de infiltrado inflamatório
(II). Epitélio descontínuo em alguns pontos (seta), sacos alveolares (SA),
alvéolos pulmonares (A) intactos – (coloração HE, aumento ± 107x).
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
Tabela 1: Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25; 0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre os
parâmetros hematológicos em ratos Wistar tratados por 30 dias consecutivos.
PARÂMETROS CONTROLE EHA 0,25g/kg EHA 0,5g/kg EHA 1,0g/kg
Eritrócitos (106/µL) 7,7 ± 0,1 8,3 ± 0,1* 8,4 ± 0,2* 8,3 ± 0,1*
Hemoglobina (g/dL) 15,4 ± 0,1 15,7 ± 0,1 15,9 ± 0,3 15,5 ± 0,2
Hematócrito (%) 43,1 ± 0,4 43,9 ± 0,3 43,8 ± 1,0 42,4 ± 0,6
VCM (fL) 56,1 ± 0,7 52,5 ± 0,9* 52,0 ± 0,2* 50,8 ± 0,6*
HCM (pg) 20,1 ± 0,3 18,7 ± 0,4* 18,9 ± 0,1* 18,6 ± 0,2*
CHCM (g/dL) 35,8 ± 0,2 35,6 ± 0,3 36,5 ± 0,1 36,5 ± 0,3
Plaquetas (103/µL) 900,54 ± 36,73 980,60 ± 17,35 983,25 ± 10,21 975,40 ± 18,24
Leucócitos (103/µL) 6,9 ± 0,9 6,3 ± 0,2 8,0 ± 0,5 8,0 ± 0,9
Bastonetes (%) 0,18 ± 0,11 0,20 ± 0,17 0 0,20 ± 0,17
Neutrófilos (%) 18,3 ± 2,8 21,2 ± 3,3 21,8 ± 4,6 18,4 ± 4,2
Eosinófilos (%) 0,5 ± 0,2 0,2 ± 0,1 0,3 ± 0,1 1,4 ± 0,2*
Basófilos (%) 0,27 ± 0,13 0* 0* 0*
Linfócitos (%) 76,5 ± 2,8 77,2 ± 3,4 76,8 ± 4,2 74,8 ± 3,1
Monócitos (%) 4,3 ± 0,5 1,2 ± 0,2* 1,0 ± 0,4* 4,8 ± 1,2
Os valores representam as médias ± e.p.m. de 10 animais. VCM: Volume Corpuscular Médio, HCM: Hemoglobina Corpuscular Média, CHCM: Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média. *Indica estatisticamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido de Newman-Keuls, p< 0,05).
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
Tabela 2: Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25; 0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre os
parâmetros bioquímicos em ratos Winstar adultos tratados por 30 dias consecutivos.
PARAMÊTROS CONTROLE EHA 0,25g/kg EHA 0,5g/kg EHA 1,0g/kgx
Glicose (mg/dL) 62,4 ± 3,7 72,0 ± 4,6 77,8 ± 6,1 72,0 ± 6,7
Uréia (mg/dL) 38,7 ± 1,7 52,0 ± 0,8* 53,5 ± 3,2* 58,3 ± 0,10*
Creatinina (mg/dL) 0,45 ± 0,02 0,50 ± 0,04 0,53 ± 0,02 0,48 ± 0,04
Aspartato aminotransferase (U/L) 246,3 ± 9,6 201,4 ± 14,1 225,0 ± 34,4 252,0 ± 21,6
Alanina-aminotransferase (U/L) 48,8 ± 3,3 76,4 ± 5,1* 69,4 ± 2,3* 67,0 ± 3,6*
Colesterol total (mg/dL) 62,4 ± 2,3 66,4 ± 5,3 74,0 ± 1,8 73,4 ± 5,6
Triglicerídeos (mg/dL) 91,9 ± 7,4 116,8 ± 15,7 67,7 ± 6,7 126,5 ± 26,3
Fosfatase alcalina (U/L) 135,7 ± 10,8 121,6 ± 10,1 127,0 ± 12,9 115,0 ± 8,3
Bilirrubina total (mg/dL) 0,20 ± 0,02 0,23 ± 0,02 0,22 ± 0,02 0,21 ± 0,02
Bilirrubina direta (mg/dL) 0,10 ± 0,01 0,11 ± 0,01 0,12 ± 0,02 0,10 ± 0,02
Proteínas totais (g/dL) 7,1 ± 0,1 7,0 ± 0,1 7,2 ± 0,3 7,0 ± 0,1
Albumina (g/dL) 1,5 ± 0,1 1,6 ± 0,1 1,6 ± 0,1 1,5 ± 0,1
Globulina (g/dL) 5,6 ± 0,1 5,5 ± 0,1 5,6 ± 0,1 5,5 ± 0,1
Os valores representam as médias ± e.p.m. de 10 animais. *Indica estatisticamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido de Newman-Keuls, p< 0,05).
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
6.Artigo III Artigo a ser submetido ao Jounal of Ethnopharmacology
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
AVALIAÇÃO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE CALENDULA OFFICINALIS
L. SOBRE A PERFORMANCE REPRODUTIVA EM RATOS Erick J.R. Silvaa, Eduardo S. Gonçalvesa, Gustavo S. Dimecha, Liriane B.
Evênciob, Maria Cristina O.C. Coelhod, Maria C. C. A. Fragac, Parviz
Afiatpourc, Almir G. Wanderleyc* aDepartamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco – UFPE.
Recife-PE, Brasil. bDepartamento de Histologia e Embriologia, Universidade Federal de Pernambuco – UFPE.
Recife-PE, Brasil. cDepartamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal de Pernambuco – UFPE.
Recife-PE, Brasil. dDepartamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal Rural de Pernambuco –
UFRPE. Recife-PE, Brasil.
Resumo
O efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis L.,
Asteraceae, foi investigado sobre a performance reprodutiva de ratos.
Quatro grupos de ratos (n=9/grupo) foram tratados durante 60 dias
consecutivos por via oral com extrato hidroalcoólico de C. officinalis nas
doses de 0,25; 0,5 e 1,0g/kg e água destilada (grupo controle). Foram
avaliados parâmetros reprodutivos, desenvolvimento da prole e a
determinação da massa úmida do testículo, epidídimo, vesícula seminal,
ducto deferente e próstata. O tratamento com EHA não alterou os
parâmetros reprodutivos em relação ao grupo controle e não produziu
modificações macroscópica e histológica no testículo. Nossos resultados
sugerem que o EHA não interferiu com a capacidade reprodutiva de ratos. Palavras-chave: Calendula officinalis L.; rato; performance sexual; toxicologia
reprodutiva.
*Contato com o autor: Av. Prof. Moraes Rego, s/n CEP: 50.670-901, Recife-PE, Brasil. Tel:(81)-21268530, Email: [email protected]
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
Abstract
The effect of hydroalcoholic extract (HAE) of Calendula officinalis L.,
Asteraceae, was investigated on the reproductive performance of mature
rats. Animals were treated orally with HAE at doses of 0,25; 0,5 and
1,0g/kg and distilled water (group controls) for 60 days. Reproductive
parameters, offspring development and weight of testes, epididymys,
seminal vesicle, vase deference and prostate were determinated. The
treatment with HAE did not change reproductive parameters in
comparison with control group and did not induce morphologic
modifications in testes. Our results suggest that HAE did not provoke
modifications on reproductive performance of rats Keywords: Calendula officinalis L.; male rat; sexual performance; reproductive toxicology.
1. Introdução
Calendula officinalis L., Asteraceae, é uma herbácea anual,
amplamente cultivada nas diferentes partes do mundo. No Brasil, ela é
popularmente conhecida como Verrucária, Calêndula e Maravilha-dos-
Jardins, e em países de língua inglesa, como Marigold (Luz et al., 2001).
De acordo com dados etnofarmacológicos, os extratos das flores de
Calêndula são utilizados como antiinflamatório para peles e mucosas,
auxiliar na cicatrização de feridas, antisséptico, sedativo e para o
tratamento de dismenorréia, gastrite, distúrbios vasculares, reumatismo e
câncer (Scheffer, 1979; Bisset, 1994; Valdéz e Garcia, 1999). Vários
estudos farmacológicos confirmaram a atividade antiinflamatória e
cicatrizante dos extratos das flores de Calêndula (Shipochliev et al.; Della-
Loggia et al., 1990, 1994; Zitterl-Eglseer et al., 1997). A Comissão E
(Alemanha) aprovou a utilização das flores de Calêndula como
antiinflamatório e cicatrizante de 1 a 2g de flor seca/150mL de água por
dia (Blumenthal, 1998).
Atualmente, sabe-se que muitas substâncias químicas são capazes
de interferir no sistema reprodutor masculino (Sharp, 1994; Toppari et al.,
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
1996). Dessa forma, a análise da toxicidade reprodutiva em machos deve
fazer parte do processo de avaliação da segurança das plantas medicinais
(Dalsenter et al., 2004). Dados da literatura reportam atividade
espermicida para os constituintes triterpênicos da Calêndula (Morelli et
al., 1983). Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar
os efeitos do tratamento subcrônico do extrato hidroalcoólico (EHA) de
Calendula officinalis L. sobre a performance reprodutiva de ratos. 2. Metodologia
2.1. Animais
Foram utilizados ratos Wistar, Rattus norvegicus, com 2-3 meses de
idade de ambos os sexos, provenientes do Biotério do Departamento de
Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE).
Os animais receberam água e dieta ad libitum e foram mantidos em
condições controles de iluminação (ciclo claro/escuro 12h) e temperatura
(23 ± 2ºC). O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética em
Experimentação Animal da UFPE, processo n° 23076.0011236/2003-44.
2.2. Material Botânico
O material botânico utilizado foi constituído pelas flores secas de
Calendula officinalis L. sob a forma EHA (50g do material vegetal para
100ml de solução hidroalcoólica 70%), produzido e fornecido pelo
Laboratório Simões - RJ, Brasil - (lote n° 02.001). Em nosso laboratório, o
EHA foi concentrado até a secura em rota evaporador sob pressão
reduzida para eliminação do solvente orgânico, em seguida o material foi
ressuspenso em água destilada e a concentração final variou entre (350 e
450mg/mL). O material foi dividido em alíquotas e estocado a -20oC.
2.3. Tratamento dos Animais
Quatro grupos (n=9/grupo) de ratos machos foram tratados
respectivamente com EHA de C. officinalis 0,25; 0,5 e 1,0g/kg por dia e
água destilada (controle) por 60 dias consecutivos. As doses utilizadas
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
nesse estudo correspondem a 10, 20 e 40 vezes à dose utilizada como
antiinflamatório. Durante o tratamento, a variação de massa corporal dos
animais foi determinada e os ratos foram observados quanto a sinais
clínicos de toxicidade e alteração comportamental. Nos dias 55 a 60 do
tratamento, os ratos foram transferidos para gaiolas individuais e
acasalados com fêmeas (1:2) comprovadamente férteis e não tratadas. A
presença de espermatozóides no esfregaço vaginal indicou o sucesso da
cópula e foi admitido como 1o dia de gestação. As ratas foram mantidas
em gaiolas individuais e após o nascimento da prole, foram determinados
os índices reprodutivos: relação prole/mãe, índice de fertilidade (n° de
ratas prenhas/n° de ratas acasaladas), índice de gestação (% de fêmeas
prenhas com todos os fetos vivos), índice de viabilidade (% de sobrevida
no 4º dia de vida), índice de lactação (% de sobrevida do 4º ao 21° dia de
vida), massa corporal no 1°, 4°, 7°, 14° e 21° dia de vida e observação de
aspectos macroscópicos externos e malformação (Elbetieha et al., 1998)
2.4. Massa corporal, dos órgãos e histologia
Após a eutanásia por aprofundamento da anestesia etérea prodeceu-
se a necropsia para avaliação macroscópica externa dos órgãos sexuais.
Os órgãos: testículos, próstata, epidídimo, vesícula seminal e ducto
deferente foram cuidadosamente retirados, dissecados e determinados a
massa úmida em balança analítica e expressa em termos de massa
relativa g/100g (Vijayalakshmi et al., 2000). A vesícula seminal foi pesada
sem fluido. Imediatamente após a determinação da massa, o testículo
direito foi imerso em líquido de Bouin e fixado “in totum” durante 48
horas, à temperatura ambiente. As lâminas histológicas foram preparadas
de acordo com Lison (1960) e coradas em hematoxilina/eosina.
2.5. Análise Estatística
Os resultados foram expressos em média ± erro padrão da média
(epm). A significância estatística entre os grupos tratado e controle foi
determinada através do teste de Análise de Variância seguido por
Newman-Keuls e para os índices de fertilidade, gestação, viabilidade e
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
lactação, para os quais se realizou o teste de qui quadrado (χ2). O nível de
significância para rejeição da hipótese de nulidade foi sempre ≥ a 5%.
3.0. Resultados
O ganho de massa corporal dos grupos controle e tratado durante
os 60 dias de tratamento é mostrado na figura 1. O tratamento com EHA
não provocou alterações no ganho de massa e no comportamento geral
dos animais. Durante o período de tratamento não registramos morte.
Na tabela 1 são apresentados os parâmetros reprodutivos dos
grupos controle e tratado. O EHA não produziu alteração significativa na
performance sexual dos machos. A relação fêmeas acasaladas/prenhas
não foi diferente entre os grupos tratado e controle, bem como a duração
da gestação e a relação feto/mãe. Os parâmetros reprodutivos: índices de
fertilidade, lactação, viabilidade e gestação não foram alterados pelo
tratamento. A prole apresentou um desenvolvimento normal, sem
alterações comportamentais ou no ganho de massa corporal.
As massas relativas do testículo, epidídimo, vesícula seminal,
próstata e ducto deferente dos grupos tratados não foram estatisticamente
diferentes do grupo controle (Figura 2).
A análise histológica do testículo não evidenciou nenhuma
modificação na estrutura do órgão do grupo tratado em comparação com
o grupo controle. Os testículos apresentaram substância intercelular com
características normais, células de Leydig de forma arredondada ou
poligonal com núcleo central e citoplasma acidófilo. O tecido germinativo
apresentou-se com sua diversidade característica, túbulos regulares,
podendo-se visualizar células germinativas e espermatozóides com
morfologia normal (Figuras 3 e 4).
4.0. Discussão
Os ratos tratados com EHA não apresentaram alterações no ganho de
massa corporal em relação aos animais do grupo controle, indicando que
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
o extrato não apresentou efeitos tóxicos gerais durante o período de
tratamento.
Estudos de fertilidade avaliam o resultado do acasalamento após o
período de pré-tratamento em pelo menos um dos sexos. A avaliação da
fertilidade e da conseqüente prenhez fornece importantes informações das
conseqüências funcionais do agente químico sobre o sistema reprodutor
(US EPA, 1996). Esses testes podem ser analisados a partir de parâmetros
como o período de acasalamento, proporção de fêmeas
prenhas/acasaladas, relação prole/mãe e duração da gestação. Esses
dados são importantes indicadores de alterações na fertilidade. Os
resultados demonstraram que o tratamento pré-acasalamento com EHA
não alterou a fertilidade dos ratos.
As massas relativas dos órgãos sexuais dos animais tratados com
EHA não foram diferentes das massas dos animais do grupo controle.
Alterações nas massas desses órgãos fornecem indícios de efeitos tóxicos
sobre o sistema reprodutor masculino. Em ratos adultos, as massas do
testículo e epidídimo são os mais importantes parâmetros (Jahn e Günzel,
1997). Juntos, esses órgãos são responsáveis pela formação e maturação
dos espermatozóides, além da produção de hormônios (Moundipa et al.,
1999). Normalmente, uma redução na massa do testículo ou epidídimo
pode ser provocada por agentes que reduzem a fertilidade (Quian, 1984;
Gupta et al., 2001; Mali et al., 2002). A ausência de alterações na massa
relativa da vesícula seminal nos leva a sugerir que o EHA não alterou a
atividade secretória da glândula, que se encontra sob o controle da
testosterona e prolactina (Dadoune, 1995).
Nossos resultados demonstraram que o EHA não interferiu nas linhagens
espermatogênicas nem alterou o processo de formação dos
espermatozóides. A análise histológica das gônadas é uma ferramenta
fundamental para a identificação de efeitos tóxicos sobre o sistema
reprodutor. O exame morfológico microscópico do testículo tem se
mostrado o mais importante método para a avaliação dos efeitos das
substâncias químicas sobre a espermatogênese (Jahn e Günzel, 1997).
Um composto pode afetar a espermatogênese de maneira direta, sobre as
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
células do túbulo seminífero, ou indireta, através da alteração das funções
hipotalâmicas, das gonadotrofinas ou das células de Leydig (Abdel-Magied
et al., 2001)
Em conclusão, as evidências apontam para uma ausência de efeitos
tóxicos do EHA por via oral sobre a performance reprodutiva em ratos.
Agradecimentos
A CAPES e CNPq pelo apoio financeiro, ao Laboratório Simões pelo
fornecimento do material e a Rejane Ferreira da Silva pelo valioso apoio
técnico.
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Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
0 10 20 30 40 50 600
10
20
30
40
50
60
70ControleEHA 0,25g/kgEHA 0,5gkgEHA 1,0g/kg
Tempo (dias)
Gan
ho d
e m
assa
corp
oral
(g)
Figura 1: Efeito do tratamento por via oral com extrato hidroalcoólico
(EHA) de Calendula officinalis (0,25; 0,5 e 1,0g/kg) sobre o ganho de
massa corporal em ratos tratados por 60 dias consecutivos. Valores em
média ± epm (n=9/grupo).
Test
ícul
o
Ves
. Sem
inal
Duc
. Def
eren
te
Pró
stat
a
Epi
dídi
mo0.00
0.050.100.150.200.250.300.350.400.45
ControleEHA 0,25g/kgEHA 0,5g/kgEHA 1,0g/kg
Mas
sa d
o ór
gão
(g/1
00g)
Figura 2: Efeito do tratamento por via oral com extrato hidroalcoólico
(EHA) de Calendula officinalis (0,25; 0,5 e 1,0g/kg) sobre a massa dos
órgãos sexuais de em ratos tratados por 60 dias consecutivos. Os valores
representam as médias ± e.p.m. (n=9/grupo).
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
EG
I
EG
Figura 3: Fotomicrografia do testículo de rato tratado
hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (1,0g/kg) por via
dias consecutivos. Epitélio germinativo (EG) e do tecido in
com aspecto normal (coloração HE, ampliação ± 107x).
CG CG
S
Figura 4: Fotomicrografia do testículo de rato tratado
hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (1,0g/kg) por via
dias consecutivos. Porções de 2 túbulos seminíferos
germinativas (CG) e espermatozóides na região central (S)
normal (coloração HE, ampliação ± 430x).
T
com extrato
oral por 60
tersticial (TI)
com extrato
oral por 60
com células
com aspecto
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
Tabela 1: Efeito do tratamento por via oral com extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25; 0,5 e
1,0g/kg) sobre os parâmetros reprodutivos de ratas não tratadas acasaladas com ratos tratados durante 60 dias
consecutivos.
VARIÁVEIS REPRODUTIVAS CONTROLE EHA 0,25g/kg EHA 0,5g/kg EHA 1,0g/kg
Fêmeas acasaladas 18 18 18 18
Fêmeas prenhas 18 18 15 17
Duração da gestação (dias)# 21,6 ± 0,4 22,0 ± 0,8 21,4 ± 0,2 21,9 ± 0,4
Relação prole/mãe# 9,3 ± 0,2 8,3 ± 0,7 9,5 ± 0,7 9,6 ± 0,2
Índice de fertilidade (%) 100 100 83,3 94,4
Índice de gestação (%) 100 75 83,3 91,3
Índice de viabilidade (%) 99,1 100 100 99,5
Índice de lactação (%) 100 100 100 100
Massa corporal 1º dia (g)# 6,3 ± 0,4 6,2 ± 0,1 5,6 ± 0,2 5,8 ± 0,1
Massa corporal 4º dia (g)# 10,2 ± 0,1 11,1 ± 0,3 9,3 ± 0,2 9,9 ± 0,1
Massa corporal 7º dia (g)# 14,8 ± 0,4 14,1 ± 0,5 13,7 ± 0,3 15,7 ± 0,3
Massa corporal 14º dia (g)# 27,7 ± 0,3 26,1 ± 0,6 24,5 ± 0,5 27,9 ± 0,3
Massa corporal 21º dia (g)# 44, 7 ± 0,5 44,7 ± 0,9 39,3 ± 1,1 44,7 ± 0,4
# Os valores representam as médias ± erro padrão das médias.
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
7.Artigo IV Artigo a ser submetido à Reproductive Toxicology
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
EFEITO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE CALENDULA OFFICINALIS L.
SOBRE A PRENHEZ DE RATAS Erick J.R. Silvaa, Eduardo S. Gonçalvesa, Gustavo S. Dimecha, Maria B. S.
Maiab, Maria Cristina O.C. Coelhoc, Maria C. C. A. Fragab, Parviz
Afiatpourb, Almir G. Wanderleya,b* a Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco – UFPE.
Recife-PE, Brasil. b Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal de Pernambuco – UFPE.
Recife-PE, Brasil. c Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal Rural de Pernambuco –
UFRPE. Recife-PE, Brasil. Resumo
O extrato hidroalcoólico de (EHA) Calendula officinalis L. foi avaliado
quanto aos efeitos sobre a fertilidade de ratas e desenvolvimento
embrionário nas doses de 0,25; 0,5 e 1,0g/kg por dia por via oral. Na
fertilidade, as ratas foram tratadas durante 30 dias consecutivos antes e
durante a prenhez. Após o nascimento da prole, foram determinados os
parâmetros reprodutivos. Em outro procedimento, as ratas foram tratadas
durante cada uma das três fases da gestação: pré-implantação,
organogênese e fetal. No 20º dia de gestação, as ratas foram sacrificadas
para a avaliação dos parâmetros maternos e fetais. Os resultados
demonstram que o tratamento com EHA não provocou alterações nos
parâmetros reprodutivos da fertilidade e nos períodos de pré-implantação
e organogênese, entretanto, o tratamento no período fetal provocou
alterações na massa da placenta associada à toxicidade materna. Esses
resultados sugerem que o EHA de C. officinalis não interferiu na fertilidade
e desenvolvimento da prole, embora constatamos possível toxicidade
materna durante o período fetal que se refletiu de forma parcial sobre a
prole. Palavras-chave: Calendula officinalis L.; performance reprodutiva; embriotoxicidade;
teratogenicidade; fases da gestação.
* Contato com o autor: Av. Prof. Moraes Rego, s/n CEP: 50.670-901, Recife-PE, Brasil. Tel:(81)-21268530, Email: [email protected]
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
Abstract
The hydroalcoholic extract (HAE) of Calendula officinalis L. was evaluated
for effects on the fertility of female rats and embryogenic development in
the doses of 0,25; 0,5 and 1,0g/kg by oral route. In fertility trial, female
rats were treated for 30 consecutive days before and during pregnancy.
After the birth of the offspring, the reproductive parameters were
evaluated. In another protocol, females were treated during each one of
the three phases of the pregnancy: pre-implantation, organogenesis and
fetal periods. On 20th day of pregnancy, female rats were sacrificed for the
evaluation of the maternal and fetal parameters. The results demonstrated
that the treatment with HAE did not provoke alterations in the
reproductive parameters of fertility and in pre-implantation and
organogenic periods, however, the treatment during fetal period provoked
alterations in placental weight associated to the maternal toxicity. In
conclusion, HAE of C. Officinalis did not interfere with fertility and
offspring development, although we evidenced signs of toxic effects during
fetal period, partially reflected on offspring. Keywords: Calendula officinalis L. (Ham.) Urban; reproductive performance;
embryotoxicity; teratogenicity; pregnancy periods.
1. Introdução
Calendula officinalis L., Asteraceae, é uma herbácea anual originária
da região do Mediterrâneo. Sua denominação botânica é derivada do
latim, Kalendulae, que representa o primeiro dia do calendário romano [1].
Trata-se de um gênero economicamente importante devido ao seu
potencial farmacêutico e ornamental [2]. No Brasil, a espécie é
popularmente conhecida como Calêndula.
Estudos fitoquímicos realizados com as flores de Calêndula
confirmaram a presença de um amplo espectro de metabólitos
secundários, sobretudo das classes dos flavonóides, terpenos e
carotenóides [3-7].
A utilização de extratos das flores de Calendula officinalis está
aprovada pela Comissão E (Alemanha) como antiinflamatório para as
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
mucosas oral e faríngea (uso tópico e interno) e na cicatrização de
ferimentos e queimaduras (uso externo) em proporções de 1 a 2g de flores
secas por 150mL de água [8].
O laboratório Simões (Rio Janeiro - Brasil) cultiva a Calêndula pelo
método de micropropagação e a explora comercialmente como
antiinflamatório e cicatrizante tópico.
Dados da literatura reportam atividade antiblastocística e abortiva
para os constituintes triterpênicos da Calêndula [9]. Nesse sentido, o
presente trabalho procura avaliar o efeito do extrato hidroalcoólico (EHA)
de Calendula officinalis sobre os parâmetros reprodutivos e
desenvolvimento da prole, bem como sobre as diferentes fases da gestação
de ratas.
2. Metodologia
2.1. Animais
Foram utilizadas ratas Wistar, Rattus norvegicus, com 3 meses de
idade, provenientes do Biotério do Departamento de Fisiologia e
Farmacologia da Universidade Federal de Pernambuco. Os animais
receberam água e dieta (Labina) ad libitum e foram mantidos em
condições controles de iluminação (ciclo 12h claro/escuro) e temperatura
de 23 ± 2°C. O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética
em Experimentação Animal (CEEA) da UFPE, processo n°
23076.0011236/2003-44.
2.3. Material Botânico
O material botânico utilizado foi constituído pelas flores secas de
Calendula officinalis L. sob a forma EHA (50g do material vegetal para
100ml de solução hidroalcoólica 70%), produzido e fornecido pelo
Laboratório Simões - RJ, Brasil - (lote n° 02.001). Em nosso laboratório, o
EHA foi concentrado até a secura em rota evaporador sob pressão
reduzida para eliminação do solvente orgânico, em seguida o material foi
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
ressuspenso em água destilada e a concentração final variou entre (350 e
450mg/mL). O material foi dividido em alíquotas e estocado a -20oC.
2.5. Fertilidade
Quatro grupos de ratas (n=12/grupo), tratadas diariamente por via
oral por 30 dias, foram acasaladas e tratadas durante toda a prenhez com
EHA 0,25; 0,5 e 1,0g/kg e água destilada (controle). Essas doses são
aproximadamente 10, 20 e 40 vezes superiores àquela utilizada como
antiinflamatória [8]. O sucesso da cópula foi indicado pela presença de
espermatozóides no esfregaço vaginal e foi admitido como 1º dia de
gestação (DDG). As ratas prenhas foram mantidas em gaiolas individuais.
O ganho de massa das ratas foi acompanhado semanalmente durante o
tratamento e gestação, bem como a atividade geral dos animais. Após o
nascimento da prole, foram determinados os índices reprodutivos:
duração da prenhez, relação prole/mãe, índice de fertilidade (n° de ratas
prenhas/n° de ratas acasaladas), índice de gestação (% de fêmeas prenhas
com todos os fetos vivos), índice de viabilidade (% de sobrevida até o 4° dia
de vida), índice de lactação (% de sobrevida do 4º ao 21° dia de vida),
massa corporal no 1°, 4°, 7°, 14° e 21° dias pós-natal (DPN) e observação
de aspectos macroscópicos externos e malformação [10].
2.6. Fases da gestação
Após a identificação da prenhez (presença de espermatozóides no
esfregaço vaginal) as ratas foram aleatoriamente divididas em grupo
controle (água destilada) e tratado por via oral com EHA (0,25; 0,5 e
1,0g/kg) de Calendula officinalis durante os períodos de pré-implantação
(1º ao 6º DDG), organogênese (7º ao 14º DDG) e fetal (14º ao 19º DDG).
Durante a prenhez, as ratas foram observadas quanto a sinais de
toxicidade. O ganho de massa materno foi determinado durante toda a
prenhez (ganho de massa total) e durante o período de tratamento. No 20o
dia de prenhez, as ratas foram submetidas a eutanásia por inalação
excessiva de éter e os cornos uterinos foram retirados para a avaliação
dos seguintes parâmetros: número de sítios de implantação, reabsorção,
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
corpos lúteos, fetos vivos e mortos e massa das placentas. As massas dos
fetos foram determinadas e examinadas quanto à presença de
malformações macroscópicas externas.
A taxa de perda de pré-implantação foi calculada como: número de
corpos lúteos – número de implantações viáveis/número de corpos lúteos
x 100, e a taxa de perda de pós-implantação foi calculada como: número
de implantações – número de fetos vivos/número de implantações x 100
[11].
2.5. Análise Estatística
A significância estatística entre os grupos tratado e controle foi
determinada através do teste de Análise de Variância (ANOVA) seguido por
Newman-Keuls. Os parâmetros taxa de perda de pré e pós–implantação
foram analisados através do Teste de Kruskal-Wallis. Para os índices de
fertilidade, gestação, viabilidade e lactação, utilizou-se o teste de qui-
quadradro (γ2). O nível de significância para rejeição da hipótese de
nulidade foi sempre ≥ a 5%.
3.0. Resultados
3.1. Fertilidade
O EHA não produziu sinais de toxicidade ou alteração
comportamental durante o período de tratamento. Não observamos
diferenças no ganho de massa corporal antes (Figura 1) e durante a
prenhez (Figura 2) entre os grupos tratado e controle.
O tratamento com EHA não alterou os parâmetros reprodutivos e o
crescimento ponderal da prole (Tabela 1). Não registramos a presença de
malformações externas ou sinais de toxicidade no período pós-natal
avaliado.
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
3.2. Período de pré-implantação
As ratas tratadas do 1° ao 6° DDG não apresentaram nenhum sinal
de toxicidade. O ganho de massa materno durante o período de pré-
implantação e da gestação não sofreu alteração (Tabela 2).
Nos parâmetros reprodutivos (Tabela 2), observamos que a massa
corporal fetal aumentou significativamente nos grupos tratados com 0,25
e 0,5g/kg por dia e a relação prole/mãe diminuiu no grupo que recebeu
0,25g/kg por dia em relação ao grupo controle.
O tratamento não provocou o desenvolvimento de malformações
macroscópicas externas nos fetos, nem alteração no número de
implantações e reabsorções.
3.3. Período de organogênese
No período de organogênese, as ratas tratadas não apresentaram
nenhum sinal de toxicidade. O ganho de massa materno durante o
período de organogênese e da gestação não sofreu alterações (Tabela 3).
O tratamento provocou redução na massa fetal no grupo que
recebeu 0,5g/kg por dia em relação ao grupo controle. Porém, não alterou
o número de reabsorções, fetos vivos ou a perda de pós-implantação. A
massa das placentas também não foi alterada (Tabela 3).
O tratamento durante o período de organogênese com EHA não
provocou o aparecimento de malformações externas.
3.3. Período fetal
As ratas tratadas com EHA 1,0g/kg apresentaram redução no ganho
de massa corporal no período fetal e durante o período de gestação (Tabela
4). Cabe salientar que não houve diferença estatística entre o ganho de
massa do grupo EHA-1,0g/kg (52,5 ± 5,0g) em relação ao grupo controle
(59,0 ± 2,3g) do 1º ao 14º DDG.
O tratamento produziu uma redução na massa fetal e um aumento
no número de corpos lúteos no grupo que recebeu 0,5g/kg em relação ao
grupo controle. A massa das placentas foi reduzida em todos os grupos
tratados em relação ao grupo controle (Tabela 4).
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
O tratamento durante o período fetal não provocou aumento no
número de natimortos, nem alterações no número de reabsorções e taxa
de perda de pós-implantação.
4.0. Discussão
Nossos resultados demonstram que o tratamento com EHA não
alterou o índice de fertilidade do grupo tratado em relação ao grupo
controle. Esse índice reflete a capacidade das fêmeas serem fecundadas, o
que nos leva a sugerir que o EHA não interferiu significativamente nos
processos hormonais que levam à ovulação, como também indica não ter
induzido alterações na função ovariana.
Constatamos que o EHA também não provocou alterações na
relação prole/mãe, na duração da gestação e no índice de gestação. Esses
parâmetros também são importantes para indicar a capacidade das
fêmeas serem fecundadas, bem como de manterem a gestação normal.
O índice de gestação indica o percentual de fêmeas com todos os
fetos vivos [12], refletindo a capacidade das fêmeas fecundadas levarem a
prenhez a termo sem que haja alterações fetais que causem a interrupção
da gestação. Esse índice investiga o surgimento de alterações
morfofuncionais durante a gestação tanto na mãe quanto no feto, as quais
podem provocar a inviabilidade do processo de procriação ou a ocorrência
de partos prematuros [13]. Nossos resultados dão um indicativo de que o
EHA não interfere nos processos de fertilização.
O índice de viabilidade indica a presença de alterações estruturais e
funcionais que não provocaram morte in útero, mas que são incompatíveis
com a vida e provocam morte pré-matura. O EHA não provocou reduções
significativas nesse índice em relação ao grupo controle.
O índice de lactação avalia o aparecimento de alterações
morfofuncionais que são incompatíveis com a vida, mas que só promovem
óbito em longo prazo. Nenhuma morte foi registrada nos grupos tratado e
controle durante o período avaliado.
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
A avaliação do EHA sobre o desenvolvimento embrionário em ratas
foi realizada a partir da administração oral durante as 3 fases distintas da
gestação. Em nossos resultados, não encontramos evidências claras de
que o EHA possa interferir nos processos de pré-implantação e
organogênese. Muitas espécies vegetais são capazes de interferir nos
processos supracitados dos roedores, promovendo aumento da perda de
pré e pós-implantação, retardo no desenvolvimento e morte fetal, além de
malformações [11,14-19].
No período de pré-implantação, o embrião se encontra com células
indiferenciadas em divisão mitótica. Sabe-se que a redução do número de
células no embrião durante essa fase pode provocar retardo na formação
do blastocisto [20], aumento nas perdas de pré e pós-implantação [21]. A
taxa de perda de pré-implantação é o principal parâmetro avaliado nesse
período. Ela estabelece a correlação entre o número de óvulos liberados e
aqueles que, após fecundados, conseguiram sofrer implantação no útero
[11]. Exceto por uma redução pontual na relação feto/mãe na dose de
0,25g/kg, o EHA parece não interferir com o processo normal de
implantação do embrião durante a gestação.
O período de organogênese é o mais susceptível aos agentes
teratogênicos, no qual o maior número de malformações podem ser
induzidas. Esse período caracteriza-se uma intensa proliferação e
migração celular, remodelamento tissular e formação rudimentar das
estruturas do corpo [22]. O tratamento nesse período tem por objetivo
avaliar os possíveis efeitos teratogênicos e embriotóxicos de uma planta. A
redução encontrada na massa dos fetos para a dose intermediária pode
ser considerada uma flutuação estatística, visto que não esteve associada
a outras alterações, como presença de malformações, alterações na massa
da placenta e aumento da taxa de perda de pós-implantação.
O período fetal é caracterizado por diferenciação histológica e
funcional dos diferentes órgãos e sistemas. Os agentes nessa fase podem
provocar alterações funcionais que são capazes de gerar a morte do feto
[23]. A redução da massa corporal materna para o grupo que recebeu a
maior dose pode ser apontada como um sinal de toxicidade decorrente do
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
tratamento com EHA durante esse período. Este parâmetro é importante
para a avaliação da integridade materna [11].
Esse efeito parece ter refletido sobre a placenta que também
apresentou redução de massa em relação ao grupo controle. Os efeitos
tóxicos das drogas podem ser promovidos pela ação direta sobre o feto ou
indiretamente, através da ação tóxica sobre o organismo materno [24].
Entretanto, foi observada redução significativa na massa dos fetos no
grupo tratado com a dose intermediária.
Dessa forma, podemos concluir que o tratamento com EHA durante
os períodos de pré-acasalamento/prenhez, pré-implantação e
organogênese não interferiu com os processos analisados de performance
reprodutiva, fertilidade e desenvolvimento embrionário em ratos. Para o
período fetal, verificamos uma toxicidade materna que parece ter refletido
sobre a massa da placenta de maneira parcial sobre a prole, entretanto
estudos adicionais são necessários para esclarecer esse aspecto.
Agradecimentos
A CAPES e CNPq pelo apoio financeiro, ao Laboratório Simões pelo
fornecimento do material e a Rejane Ferreira da Silva pelo valioso apoio
técnico.
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Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
0 10 20 300
10
20
30
40ControleEHA 0,25g/kgEHA 0,5g/kgEHA 1,0g/kg
Tempo (dias)
Gan
ho d
e m
assa
corp
oral
(g)
Figura 1: Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis
(0,25; 0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre o ganho de massa corporal em
ratas tratadas durante 30 dias consecutivos (n=12/grupo).
0 7 14 210
20
40
60
80ControleEHA 0,25g/kgEHA 0,5g/kgEHA 1,0 g/kg
Tempo (dias)
Gan
ho d
e m
assa
mat
eno
(g)
Figura 2: Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis
(0,25; 0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre o ganho de massa corporal materno
durante o período da gestação em ratas tratadas durante 30 dias
consecutivos e toda a gestação (n=12/grupo).
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
Tabela 1: Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25, 0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre os
parâmetros reprodutivos em ratas tratadas por 30 dias consecutivos antes do acasalamento e durante toda a gestação.
VARIÁVEIS REPRODUTIVAS CONTROLE EHA 0,25g/kg EHA 0,5g/kg EHA 1,0g/kg
Ratas acasaladas 12 12 12 12
Duração da gestação (dias)# 22,4 ± 0,2 21,8 ± 0,4 22,1 ± 0,3 22,7 ± 0,5
Prole/Mãe# 8,6 ± 0,6 8,8 ± 0,9 9,9 ± 0,3 8,3 ± 0,7
% de natimortos 4,5 4,4 2,5 5,0
Índice de fertilidade (%) 100 83,3 91,6 100
Índice de gestação (%) 91,6 90,0 90,1 83,3
Índice de viabilidade (%) 93,5 100 100 100
Índice de lactação (%) 100 100 100 100
Massa corporal 1º dia (g)# 6,4 ± 0,1 6,1 ± 0,2 6,4 ± 0,1 6,2 ± 0,1
Massa corporal 4º dia (g)# 11,4 ± 0,5 10,4 ± 0,5 10,5 ± 0,3 10,5 ± 0,5
Massa corporal 7º dia (g)# 14,8 ± 0,6 14,1 ± 0,5 14,7 ± 0,5 14,9 ± 0,7
Massa corporal 14º dia (g)# 27,7 ± 1,1 25,6 ± 1,4 28,4 ± 0,9 28,9 ± 0,9
Massa corporal 21º dia (g)# 47,5 ± 1,7 43,9 ± 2,4 46,2 ± 2,8 44,0 ± 1,4
# Os valores representam as médias ± erro padrão das médias.
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
Tabela 2: Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25, 0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre o ganho
de massa materno em ratas tratadas durante o período de pré-implantação (1º ao 6º DDG) e da gestação (1º ao 20º
DDG) e sobre os parâmetros reprodutivos.
PARÂMETROS CONTROLE EHA 0,25g/kg EHA 0,5g/kg EHA 1,0g/kg
Fêmeas prenhas 9 9 10 11
Período de pré-implantação (g)# 18,9 ± 2,4 20,1 ± 1,3 15,1 ± 3,5 15,00 ± 4,3
Período da gestação (g)# 84,9 ± 6,8 94,3 ± 5,9 82,7 ± 4,9 90,1 ± 5,6
Número de fetos vivos 89 75 103 112
Número de fetos mortos 1 0 1 0
Relação feto/mãe# 9,9 ± 0,5 8,3 ± 0,4* 10,3 ± 0,3 10,2 ± 0,4
Massa dos fetos (g)# 3,79 ± 0,07 4,01 ± 0,09* 4,08 ± 0,05* 3,78 ± 0,06
Massa das placentas (g)# 0,438 ± 0,012 0,470 ± 0,010 0,461 ± 0,006 0,454 ± 0,008
Número de implantações 90 75 104 112
Número de reabsorções 8 10 3 7
Corpos lúteos# 12,7 ± 0,2 12,1 ± 0,2 12,1 ± 0,1 12,1 ± 0,2
Perda de pós-implantação (%)+ 1,1 0 0,9 0
Perda de pré-implantação (%)+ 9,1 16,7 8,3 8,3
*Indica estatisticamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido de Newman-Keuls, p < 0,05). + Os valores representam as medianas. # Os valores representam as médias ± erro padrão das médias.
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
Tabela 3: Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25, 0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre o
ganho de massa materno em ratas tratadas durante o período de organogênese (7º ao 14º DDG) e da gestação (1º ao
20º DDG) e sobre os parâmetros reprodutivos.
PARÂMETROS CONTROLE EHA 0,25g/kg EHA 0,5g/kg EHA 1,0g/kg
Fêmeas prenhas 5 8 8 8
Período de organogênese (g)# 32,2 ± 7,3 31,6 ± 2,6 33,3 ± 2,2 31,8 ± 2,4
Período da gestação (g)# 100,2 ± 4,8 104,0 ± 7,1 99,8 ± 3,7 105,8 ± 3,2
Número de fetos vivos 58 78 84 83
Número de fetos mortos 0 0 1 2
Relação feto/mãe# 11,6 ± 0,6 9,8 ± 0,6 10,5 ± 0,4 10,3 ± 0,7
Massa dos fetos (g)# 3,93 ± 0,06 4,08 ± 0,06 3,68 ± 0,03* 3,94 ± 0,08
Massa das placentas (g)# 0,520 ± 0,008 0,489 ± 0,007 0,512 ± 0,006 0,499 ± 0,009
Número de implantações 58 78 85 85
Número de reabsorções 4 6 6 8
Corpos lúteos# 12,2 ± 0,2 10,9 ± 0,3 11,3 ± 0,1 11,7 ± 0,1
Perda de pós-implantação (%)+ 0 0 1,2 2,3
Perda de pré-implantação (%)+ 3,8 6,2 4,8 5,9
*Indica estatisticamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido de Newman-Keuls, p < 0,05). + Os valores representam as medianas. # Os valores representam as médias ± erro padrão das médias.
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
Tabela 4: Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25, 0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre o ganho
de massa materno em ratas tratadas durante o período fetal (14º ao 19º DDG) e da gestação (1º ao 20º DDG) e sobre
os parâmetros reprodutivos.
PARÂMETROS CONTROLE EHA 0,25g/kg EHA 0,5g/kg EHA 1,0g/kg
Fêmeas prenhas 6 6 8 6
Período fetal (g)# 48,3 ± 5,4 45,0 ± 5,5 37,3 ± 3,1 31,3 ± 1,7*
Período da gestação (g)# 107,8 ± 4,3 97,7 ± 4,3 90,3 ± 5,8 83,8 ± 5,7*
Número de fetos vivos 59 64 75 59
Número de fetos mortos 0 0 2 1
Relação feto/mãe# 9,8 ± 0,3 10,7 ± 0,2 9,3 ± 0,7 9,8 ± 0,4
Massa dos fetos (g)# 3,96 ± 0,04 4,10 ± 0,09 3,73 ± 0,03* 3,93 ± 0,04
Massa das placentas (g)# 0,484 ± 0,008 0,428 ± 0,007* 0,450 ± 0,007* 0,450 ± 0,008*
Número de implantações 59 64 77 60
Número de reabsorções 2 4 5 6
Corpos lúteos# 11,2 ± 0,3 11,5 ± 0,2 12,3 ± 0,3* 11,7 ± 0,3
Perda de pós-implantação (%)+ 0 0 2,6 1,7
Perda de pré-implantação (%)+ 8,7 7,4 14,3 14,2
*Indica estatisticamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido de Newman-Keuls, p < 0,05). +Os valores representam as medianas. # Os valores representam as médias ± erro padrão das médias.
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
8.Conclusão
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
8. CONCLUSÃO
Baseados em nossos resultados podemos concluir que o EHA de
Calendula officinalis L. apresenta baixa toxicidade por via oral. De
maneira geral, a sua administração subcrônica por via oral não produziu
efeitos tóxicos sobre os parâmetros bioquímicos, hematológicos e
morfológicos em ratos de ambos os sexos. Entretanto o aumento dos
níveis de uréia e ALT verificado nos ratos de ambos os sexos, associado à
alteração histológica no fígado dos machos, aponta para uma possível
sobrecarga renal e hepática, respectivamente.
Em relação ao estudo de toxicidade reprodutiva, os resultados
obtidos sugerem uma ausência de toxicidade por via oral sobre a
performance reprodutiva em ratos. O tratamento com EHA durante os
períodos de pré-acasalamento/prenhez, pré-implantação e organogênese
em ratas também não demonstrou sinais tóxicos sobre a fertilidade das
ratas ou de embriofetotoxicidade. Porém, para o período fetal, verificamos
indícios de toxicidade materna que parecem ter refletido sobre a massa da
placenta de maneira parcial sobre a prole.
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
9.Referências Bibliográficas
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
9.Referências Bibliográficas
Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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